GBT27517-2011鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法.pdf

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1、ICS11．220B41圆目中华人民共$-n国国家标准GB／T27517—2011鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT—PCR方法AmultiplexRT_PCRmethodtodifferentiatethehighlypathogenicandclassicalporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus2011-11—21发布2012-03-01实施宰瞀髁鬻瓣警糌瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“⋯标准分享网www.bzfxw

2、.com免费下载刖昌GB／T27517—20¨本标准按照GB／T1．12009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAc／Tc181)归口。本标准起草单位：河南省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：吴志明、闫若潜、张志凌、张健、荆汝顶、刘光辉、赵明军、曹杰伟、钱勇、程俊贞、赵雪丽、张盼。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT—PCR方法GB／T27517—2011本标准规定了检

3、测以基因组非结构蛋白Nsp2编码区缺失30个氨基酸为特征的猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株与非缺失30个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株复合RT—PCR鉴别诊断方法。本标准适用于疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪血清及临床病料等样品中的病毒核酸检测。2试剂和仪器设备除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂均应使用无RNA酶的容器进行分装。2．1试剂2．1．1拭子悬液(见附录A)，组织悬液(见附录A)，以上试剂常温保存。2．1．2阿氏液(见附录A)，裂解液(Tr

4、iz01)，1×TAE核酸电泳缓冲液(见附录A)，氯仿，0．Olmol／L(pH7．2)的PBS(见附录A)，DEPC处理水(见附录A)，以上试剂4℃保存。2．1．3异丙醇，75％乙醇，DNA分子量标准，6×电泳上样缓冲液，以上试剂一20℃保存。2．1．4阳性对照、阴性对照(见附录A)。2．1．5复合RT-PCR扩增用上、下游引物序列参见附录B。2．1．6鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT—PCR反应体系组成、说明及使用注意事项参见附录c。2．2仪器设备PCR扩增仪，高速冷冻离

5、心机(离心力在120009以上)，核酸电泳仪和水平电泳槽，恒温水浴锅，2℃～8℃冰箱，--20℃冰箱，单道微量移液器(o．5弘L～10pL；2p．L～20pL；20肛L～200pL；100pL～1000pL)，组织匀浆器或研钵，凝胶成像系统(或紫外透射仪)，真空干燥器(非必备)。3样品的采集、处理、存放及运输3．1样品采集及处理过程的注意事项采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品处理过程中应戴一次性手套、口罩、帽子。3．2样品的采集及处理3．2．1拭子样品3．2．1．1鼻腔拭子：采样时要将棉拭子

6、深入鼻腔来回刮3～5次，取鼻腔分泌物。标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27517—20113．2．1．2肛门拭子：将棉拭子深入肛门转一圈沾取粪便。3．2．1．3将鼻腔拭子和肛门拭子一起放入盛有1．0mL拭子悬液的Eppendorf管中，然后将拭子悬液转入无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r／min离一t710min，取上清转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。3．2．2组织样品组织样品采集时应采取有明显病变的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏、胸腺等组织样品

7、。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品0．5g左右于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，再加0．3mL～O．5mLPBS混匀，然后将组织悬液转人无菌Eppendorf管中，4℃条件下5000r／rain离心10min，取上清转入新的无菌Eppendorf管中，编号备用。3．2．3血清或抗凝血用无菌注射器自耳静脉或前腔静脉采集血液3mL～5mL，待血清析出后直接吸取至无菌Eppen—dorf管中，编号备用；用无菌注射器先吸人抗凝剂(阿氏液)2mL～3mL，再自耳静脉或前腔静脉采集等量血液，快速混匀后转入无

8、菌Eppendorf管中，编号备用。3．3存放与运送采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。4操作方法4．1样品RNA的制备4．1．1取1．5mL灭菌Eppendorf管，每管加入300pL裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品各100／LL，吸头反复吸打混匀(一份样品换用一个吸头)；再加入100pL氯仿，充分颠倒混匀(不宜过于强烈)；于4℃条件下，