db37t3085-2017高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的rt-pcr鉴别检测技术

《db37t3085-2017高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的rt-pcr鉴别检测技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、ICS65.020.30B41DB37山东省地方标准DB37/T3085—2017高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术IdentificationofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrainandclassicalstrainbyRT-PCR2017-12-29发布2018-01-29实施山东省质量技术监督局本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准rti山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草

2、单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：杜以军、齐静、丛晓燕、陈蕾、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、吋建立。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴别检测技术1范围本标准规定了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和经典毒株的RT-PCR鉴別检测技术的操作要求。本标准适用于高致病性及经典猪繁殖与呼吸综合征的实验室诊断、监测和流行病学调查等。2实验室生物安全要求实验室必须为生物安全II级（BSI-2级）及以上实验室。3规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引

3、用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫4术语与定义下列术语与定义适用于本标准。4.1PCR聚合酶链式反应。4.2SDS十二烷基硫酸钠。5仪器设备和试剂4.1仪器设备5.1.1微量移液器（最大量程分别为10uL>20u【八lOOu【八lOOOuL）,带滤芯的枪头。5.1.220000r/min低温高速离心机。5.1.3电热恒温水槽。

4、5.1.4稳流稳压电泳仪。5.1.5水平电泳槽。5.1.6凝胶成像系统。5.1.7紫外透射反射分析仪。5.1.8电磁炉。4.1.9烧杯(1000mL)。5.1.10电子天平精度为：0.001go5.1.11PCR扩增仪。5.1.12组织匀浆器或研体。5.1.13-20°C冰柜。5.1.142°C〜8匸冰箱。5.2试剂除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。5.2.1Trizolo5.2.2氯仿。5.2.375%乙醇。5.2.4异丙醇。5.2.5AMV反转录酶(200U/uL)。5.2.6RNA酶抑制剂(40U/uL)。5

5、.2.7TaqDNA聚合酶(5U/uL)。5.2.81.0%琼脂糖凝胶：见附录A.1。5.2.950XTAE缓冲液：见附录A.2.1和A.2.2。5.2.10焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水：见附录A.3。5.2.11DNA分子量标准DL2000o5.2.12超纯水：符合GB/T6682,三级。5.2.13引物：上游引物P1:5-AAAGAYCAGATGGAGGAG-3；下游引物P2:5-TRATGGCTTGAGCTGAG-3；斜体代表兼并碱基；经典毒株扩增片段长度大小为766bp,高致病性毒株扩增基因片段大小

6、为676bp。6操作程序6.1样品的采集和处理6.1.1样品的采集临床上猪的脾、肺、淋巴结、血液等，置于-20°C冰柜或液氮中保存。6.1.2样品的处理5.1.2.1収猪的脾、肺、淋巴结等组织约5g于研钵中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研磨;血液3000r/min离心5min,分离血清。5.1.2.2阳性对照处理：髙致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株。6.1.2.3阴性对照处理：灭菌双蒸水。6.2RNA的提取-Trizol法6.2.1向处理好的300PL组织样品或血清中加入800uLTri

7、zol,重复吹打以裂解细胞（或者剧烈振荡），冰上放置10min〜25min。6.2.2加入氯仿200uL,用力振荡30s,室温放置5min。5.2.34°C,12000r/min离心15min,吸取上层液体500uL于1.5mbEP管中。4.2.4加入1.0mL异丙醇，-20°C沉淀RNA至少1h。4.2.54°C12000r/min离心10min,弃上清,用75%的乙醇洗涤沉淀,12000r/min离心5min,彻底弃去上清，白然条件下干燥沉淀，溶于50yLDEPC处理的灭菌双蒸水屮，-20°C贮存，备用。也可选择市

8、售商品化RNA提取试剂盒，完成RNA的提取。6.2.6试验中同时设立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株的疫苗株和经典毒株的疫苗株作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。6.3反转录表1反转录20uL体系序号体系组成体系含量1RXA5uL22.5mmol/LR转录引物（下游引物）1l»L32.5mmol/LdNTPs2uL70°C保温5