GBT27517-2011 鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法.pdf

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1、ICS11.220B41圆目中华人民共$-n国国家标准GB/T27517—2011鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT—PCR方法AmultiplexRT_PCRmethodtodifferentiatethehighlypathogenicandclassicalporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus2011-11—21发布2012-03-01实施宰瞀髁鬻瓣警糌瞥霎发布中国国家标准化管理委员会“⋯标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖昌GB/T27517—20¨本标准

2、按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAc/Tc181)归口。本标准起草单位:河南省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人:吴志明、闫若潜、张志凌、张健、荆汝顶、刘光辉、赵明军、曹杰伟、钱勇、程俊贞、赵雪丽、张盼。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT—PCR方法GB/T27517—2011本标准规定了检测以基因组非结构蛋白Nsp2编码区缺失30个氨基酸为特征的猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株与非缺失30

3、个氨基酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株复合RT—PCR鉴别诊断方法。本标准适用于疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪血清及临床病料等样品中的病毒核酸检测。2试剂和仪器设备除另有规定外,所用生化试剂均为分析纯。提取RNA所用试剂均应使用无RNA酶的容器进行分装。2.1试剂2.1.1拭子悬液(见附录A),组织悬液(见附录A),以上试剂常温保存。2.1.2阿氏液(见附录A),裂解液(Triz01),1×TAE核酸电泳缓冲液(见附录A),氯仿,0.Olmol/L(pH7.2)的PBS(见附录A),DEPC处理水(见附录A),以上试剂4℃保存。

4、2.1.3异丙醇,75%乙醇,DNA分子量标准,6×电泳上样缓冲液,以上试剂一20℃保存。2.1.4阳性对照、阴性对照(见附录A)。2.1.5复合RT-PCR扩增用上、下游引物序列参见附录B。2.1.6鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT—PCR反应体系组成、说明及使用注意事项参见附录c。2.2仪器设备PCR扩增仪,高速冷冻离心机(离心力在120009以上),核酸电泳仪和水平电泳槽,恒温水浴锅,2℃~8℃冰箱,--20℃冰箱,单道微量移液器(o.5弘L~10pL;2p.L~20pL;20肛L~200pL;100pL~1000pL)

5、,组织匀浆器或研钵,凝胶成像系统(或紫外透射仪),真空干燥器(非必备)。3样品的采集、处理、存放及运输3.1样品采集及处理过程的注意事项采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品处理过程中应戴一次性手套、口罩、帽子。3.2样品的采集及处理3.2.1拭子样品3.2.1.1鼻腔拭子:采样时要将棉拭子深入鼻腔来回刮3~5次,取鼻腔分泌物。标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T27517—20113.2.1.2肛门拭子:将棉拭子深入肛门转一圈沾取粪便。3.2.1.3将鼻腔拭子和肛门拭子一起放入盛有1.0mL拭子悬液的Eppendorf管中,然后

6、将拭子悬液转入无菌Eppendorf管中,4℃条件下5000r/min离一t710min,取上清转入新的无菌Eppendorf管中,编号备用。3.2.2组织样品组织样品采集时应采取有明显病变的淋巴结、扁桃体、肺脏、脾脏、肾脏、胸腺等组织样品。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品0.5g左右于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,再加0.3mL~O.5mLPBS混匀,然后将组织悬液转人无菌Eppendorf管中,4℃条件下5000r/rain离心10min,取上清转入新的无菌Eppendorf管中,编号备用。3.2.3血清或抗凝血用无菌注射器自耳静脉或前腔静

7、脉采集血液3mL~5mL,待血清析出后直接吸取至无菌Eppen—dorf管中,编号备用;用无菌注射器先吸人抗凝剂(阿氏液)2mL~3mL,再自耳静脉或前腔静脉采集等量血液,快速混匀后转入无菌Eppendorf管中,编号备用。3.3存放与运送采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置一70℃冰箱,但应避免反复冻融。采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实验室。4操作方法4.1样品RNA的制备4.1.1取1.5mL灭菌Eppendorf管,每管加入300pL裂解液,然后分别加入待测样品、阴性对照样品、

8、阳性对照样品各100/LL,吸头反复吸打混匀(一份样品换用一个吸头);再加入100pL氯仿,充分颠倒混匀(不宜过于强烈);于4℃条件下,

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