分子排阻色谱法标准操作规程

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1、分子排阻色谱法标准操作规程共2页第1页文件编号：09—C—083—03替代号：09—C—083—02变更内容：2010年版《中国药典》的执行，标准发生变更。起草人：日期：年月日审核人：日期：年月日批准人：日期：年月日颁发部门：印制份数：生效日期：年月日分发至：总经理（）生产副总经理（）质量副总经理（）行政副总经理（）行政部（）生产部（）设备动力维修车间（）质管部（）物资储备科（）1目的：建立分子排阻色谱法标标准操作规程，使操作规范、准确。2范围：适用于药品蛋白质多肽的分子量测定。3职责：质检员按此规程进行

2、操作。。4引用标准：《中国药典》2010年版。5工作原理：分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶（Sephadex）和聚丙烯酰胺凝胶（Sepharose）等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸206文件编号：09—C—083—03共2页第2页的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，

3、最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。6.测定法6.1分子量测定法一般适用于蛋白质多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法，选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外，对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇（DTT）和十二烷基硫酸钠（SDS）处理，以打开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离，以

4、对照品分子量（Mw）的对数值对相应的保留时间（tR）制得标准曲线的线性回归方程lgMw=a+btR，供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。6.2生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一的特点，故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指标。在测定生物大分子聚合物分子量与分子量分布时，选用与供试品分子结构与性质相同或相似的对照品十分重要。按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用分子量对照品和适宜的G

5、PC软件，以对照品重均分子量（Mw）的对数值对相应的保留时间（tR）制得标准曲线的线性回归方程lgMw—a+btR，供试品采用适宜的GPC软件处理结果，并按下列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。206Mn=∑RIi／∑（RIi／Mi）Mw=∑（RIiMi）／∑RLD=Mw/Mn。式中Mn为数均分子量；Mw为重均分子量；D为分布系数；RLi为供试品在保留时间i时的峰高；舰为供试品在保留时间i时的分子量。6.3高分子杂质测定法高分子杂质系指供试品中含有分子量大于药物分子的杂质，通常是药物在生产或贮存过程中

6、产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能产生过敏反应的高分子按各品种项下规定的色谱条件进行分离。6.4定量方法6.4.1①主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规定。一般用于高分子杂质含量较低的品种。6.4.2面积归一化法同高效液相色谱法项下规定。6.4.3限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分，一般用于混合物中高分子物6.4.4自身对照外标法一般用于SephadexG-IO凝胶色谱系统中β内酰胺抗生素中高分子杂质的检查。在该分离系统中，除部分寡聚物外，β内酰胺抗生素中高分子杂

7、质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰，以供试品自身为对照品，按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量。2066.5SephadexG-IO的处理方法色谱柱的填装装柱前先将约15g葡聚糖凝胶Sepha—dexG-lO用水浸泡48小时，使之充分溶胀，搅拌除去空气泡，徐徐倾人玻璃柱，一次性装填完毕，以免分层，然后用水将附着玻璃管壁的SephadexG-lO洗下，使色谱柱面平整，新填装的色谱柱要先用水连续冲洗4～6小时，以排出柱中的气泡。供试品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直接将

8、供试品加在床的表面（此时，先将床表面的流动相吸干或渗干，立即将供试品溶液沿着色谱管壁转圈缓缓加入，注意勿使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗入固定相后，再沿着色谱管壁转圈缓缓加入3～5ml流动相，以洗下残留在色谱管壁的供试品溶液）。7.对仪器的一般要求分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一般分常压、中压和高压。在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中，通常采用高效分子排阻色谱法（HPSEC）。应选用