何程秀（查重定稿）

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摘要IgM是鱼体特异性免疫系统重要组成部分，在鱼体应答外源刺激、病原感染中发挥重要作用。本文通过对养殖大黄鱼尾静脉采血，离心获得血清后，用饱和硫酸铵盐析法粗提鱼体血清IgM，再利用ProteinA特异性结合免疫球蛋白分子恒定区特性，进一步采用ProteinA亲核层析柱对粗提液进行了纯化。纯化后的蛋白经冷冻干燥、浓缩、重悬后，采用Bradford试剂盒法对其进行了浓度测定，实验测得的纯化蛋白浓度约为0.5mg/mL。对纯化后的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，结果显示，纯化蛋白不含其他条带，表明其纯度高，不含杂质；纯化蛋白由两条分子量大小分别为约70KDa和30KDa的条带组成，这与鱼类IgM的重轻链分子大小吻合，表明实验纯化得到的即为大黄鱼IgM。综上，采用饱和硫酸铵粗提结合ProteinA亲和层析纯化，能获得较好的大黄鱼血清IgM纯化效果。通过对纯化的大黄鱼血清IgM进行特性分析，将有助于加深对大黄鱼免疫系统的理解。关键词：大黄鱼；盐析；亲和层析；IgM

1AbstractIgM is an important component of fish-specific immune system, which plays an important role in fish response to exogenous stimuli and pathogen infection.Thispassagethroughcollectingbloodfromtailveinoflargeyellowcroakerculture,aftercentrifugationtoobtainserum,usesaltingoutsaturatedammoniumsulfatetoextractedtheserumIgM,andthenusingProteinAspecificbindingimmunoglobulinmolecularhomeostaticregion,thecrudeextractwasfurtherpurifiedbyProteinAnucleophilicchromatographycolumn.Thepurifiedproteinafterfreeze-dringconcentrationandsuspension, theconcentrationofthepurifiedproteinusedtheBradfordkittodetermined,theresultofconcentrationisabout0.5mg/ml.ThepurityandmolecularweightofIgMwascheckedbySDS-PAGE,theobtainedIgMshowedobviouslytwomainbandswiththemolecularweightof70kDaand30kDa,thisisconsistentwiththesizeoftheheavyandlightchainsoffishIgM,indicatingthattheIgMobtainedfrompurificationislargeyellowcroaker;Andthepurifiedproteindoesnotcontainotherbands,indicatingthepurityishighanddoes not contain impurities.Inconclusion,ThecrudeextractionofsaturatedammoniumsulfatecombinedwithProteinAaffinitypurificationcanobtainAbetterpurificationeffectofserumIgMfromyellowcroaker.ThroughcharacteristicanalysisofIgMpurifiedfromtheserumofLargeyellowcroakerwillhelptodeepentheunderstandingoftheimmunesystemoftheyellowcroaker.Keywords:Largeyellowcroaker;Saltingout;affinitychromatography;IgM

2目录1引言11.1大黄鱼的基本概况11.2鱼类免疫球蛋白研究进展11.3鱼类免疫球蛋白纯化方法概述21.3.1盐析法21.3.2凝胶过滤法21.3.3离子交换法31.3.4亲和层析法31.4本课题研究的意义32实验材料与方法42.1实验材料42.1.1实验动物42.1.2实验缓冲液42.1.3实验仪器与设备52.1.4实验试剂52.2试验方法52.2.1大黄鱼血清制备52.2.2大黄鱼血清IgM的饱和硫酸铵粗提52.2.3大黄鱼血清IgM的亲和纯化62.2.4大黄鱼血清IgM的浓缩与浓度测定62.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳分析IgM的特性73实验结果83.1大黄鱼血清IgM的纯化及其浓度测定83.2大黄鱼血清IgM的特性分析104结论与展望104.1结论104.2展望11参考文献12

3大黄鱼血清IgM的纯化及其特性分析1引言1.1大黄鱼的基本概况大黄鱼隶属脊索动物门（Chordata）、脊索动物亚门（Vertebrata）、硬骨鱼纲（Osteichthys）、鲈形亚目（Percoidei）、石首鱼科（Sciaenidae）、黄鱼属（Larimichthys），主要分布在我国东南沿海，是我国海洋主要经济鱼类之一，曾有中国“海洋四大经济鱼类”之称[1]。自上世纪80年代大黄鱼人工繁育技术突破后，大黄鱼网箱养殖发展迅速，大黄鱼已成为我国养殖规模最大的海水养殖鱼类[2]。福建省宁德市是我国大黄鱼产业的发源地和规模最大的养殖基地，据全国渔业年鉴统计，2017年我国大黄鱼养殖产量17.76万吨，其中福建15.05万吨，占全国总产量84.7%[3]。1.2鱼类免疫球蛋白研究进展免疫球蛋白（immunoglobuLin,Ig）具有抗体活性，它是B细胞在抗原的刺激下产生的一种球蛋白，类似于抗体的化学结构。抗体（antibody,Ab）主要存在血清中，它能够对抗原进行特异性识别并结合。一般情况下可以将抗体与免疫球蛋白视为同义词。近年来的研究表明，目前已经从硬骨鱼类分离得到了四种不同的免疫球蛋白，分别是IgM、IgD、IgZ和IgT[4]，软骨中则发现了IgW的纯在[5]。硬骨鱼中最早发现的IgM被认为是鱼血液和黏液中最主要的一类免疫球蛋白[6]。Hordvik和Tian在克隆大西洋鲑和红鳍东方鲀Ig基因时，发现鱼类与人类IgD有一定的同源性，证明该鱼类的免疫球蛋白基因是IgD[7-8]。Danilova等人不仅在斑马鱼中发现了免疫球蛋白IgZ，与此同时还发现了IgZ和IgM、IgD这两种免疫球蛋白是完全不同的[9]。在虹鳟鱼中首次发现免疫球蛋白IgT[4]。在这几种免疫球蛋白中，发现时间最早、研究最多的是IgM，IgM的重链具有较高的保守性，其为四聚体分子，是分子量最大的免疫球蛋白[10]。它在早期机体防御中的起着重要作用，它可以作为B细胞受体与B细胞表面结合或者分泌到其他体液中14

4以发挥抗体功能[11]。另外，除了受到抗原刺激会产生抗体外，在没有受到明显的外源抗原刺激时，在鱼体内也有天然抗体的存在，这些天然抗体在固有免疫和获得性免疫应答中起重要作用[12]。有研究表明，与其他硬骨鱼类相似，大黄鱼也具有IgM等抗体类型。谢方清等[13]对大黄鱼IgM的重链和轻链基因进行了克隆与分析，初步研究了其结构组成。1.3鱼类免疫球蛋白纯化方法概述鱼类IgM的提取纯化到目前为止已经比较成熟，但是大部分纯化实验都是多种办法一起使用。如王先磊等[14]在纯化牙鲆血清IgM时，就通过盐析法，离子交换层析，和凝胶柱层析三种方法一起使用。林天龙等[15]分离纯化欧洲鳗血清IgM的时候使用了三种不同的方法进行血清纯化，分别为盐析法、二次凝胶柱层析法和一次离子交换层析法。到目前为止，分离纯化鱼类免疫球蛋白的方法主要有以下四种，分别为盐析法、凝胶过滤法、离子交换法以及蛋白A亲和层析法，以下对四种方法所利用的原理进行简单的介绍。1.3.1盐析法硫酸铵是盐析中最常用的盐，在温度较低的缓冲液中溶解性会更好。盐析法就是利用加入的中性盐，中和蛋白质表面的电荷并破坏亲水胶体的稳定性，最后导致蛋白质在水溶液中的稳定性变差而沉淀。刘婷婷[16]对红鳍东方鲀（Takifugurubripes）血清IgM的饱和硫酸铵粗提实验证明，50%的饱和硫酸铵粗提的蛋白的浓度更高，所以本实验将采取浓度为50%的饱和硫酸铵进行粗提。硫酸铵盐析法已广泛应用于抗体蛋白初步分离。鱼类Ig的初步提取大多数都是采用盐析法，后面进行的纯化步骤多在此基础上进行。1.3.2凝胶过滤法凝胶过滤法是利用分子筛作用，根据其他蛋白质和Ig的相对分子质量大小的差异性来进行分离的，分子小的能进入胶孔中，分子大的不能进入胶孔中。李亚南[17]用此方法提纯了草鱼的免疫球蛋白，结果显示有较好的分离效果，但实验过程耗时较长。杨桂文等[18]制备鲤鱼血清和皮肤粘液Ig用的也是凝胶过滤法。张福淼等[19]首先通过饱和硫酸铵盐析法进行粗提，然后再结合凝胶过滤法从14

5鲈鱼血清中纯化Ig，得到重链和轻链的分子量分别为72kDa和28kDa。1.3.3离子交换法离子交换法分离纯化免疫球蛋白是根据不同的分子电荷进行的，它使带电荷的蛋白结合在带异种电荷的基质上，蛋白与基质之间的结合力的大小会随着pH值的变化和缓冲液中盐浓度的增加而发生改变，结合程度改变后就会导致不同种类的蛋白质被依次洗脱。该方法具有分离效率高，应用范围广的优点。经常和凝胶过滤法合用。伊光辉等[20]则采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析三种方法，提纯斑点叉尾鮰血清Ig。1.3.4亲和层析法亲和层析法的实验原理是蛋白能够和配体发生特异性可逆结合，先将提纯的蛋白质通过共价键反应，然后牢固结合于载体表面的功能团上。所以样品可分为两部分：一部分是未能与层析柱结合的蛋白，直接被平衡缓冲液洗脱下来，另一部分是能与层析柱结合的蛋白，被洗脱缓冲液洗脱下来。该纯化方法具有效率高、操作步骤简单、纯化结果好等优点。但是不能进行大量的分离纯化，比较适用于实验室少量免疫球蛋白的纯化。黄艳青等[21]用甘露糖结合蛋白亲和层析纯化黄颡鱼Ig，也得到高纯度的Ig。经过实验对比结合其他学者的研究经验，本文最后采用亲和层析法来对大黄鱼血清IgM进行分离纯化。张永安等[22]用山羊IgG-琼脂糖亲和层析分离纯化鳜（Sinipercachuatsi）血清免疫球蛋白，测得其重链和轻链分别为72kDa和29kDa。1.4本课题研究的意义IgM是大黄鱼免疫系统的重要组成部分，在鱼体应答外源刺激、病原感染等方面发挥了重要作用。本研究通过对大黄鱼血清IgM进行饱和硫酸铵粗提后，进一步采用ProteinA亲和层析柱对IgM进行了精提。纯化的大黄鱼血清IgM经冷冻干燥浓缩后，其浓度用改良型Bradford试剂盒测定，SDS-PAGE显示纯化的IgM纯度较高，且重轻链大小与预期相符，可用于后续实验。在制备大黄鱼血清IgM的基础上，后续实验拟制备其鼠源多克隆抗体，探究其应答病原感染机制。14

62实验材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物用于获取血清的养殖健康大黄鱼购自于宁德市富发水产有限公司，大黄鱼体质量约为200g左右。2.1.2实验缓冲液（1）0.02M磷酸钠缓冲溶液（BindingBuffer）：称取NaH2PO40.468g，Na2HPO40.867g，调节pH7.0，加超纯水定容至500mL。（2）0.1M柠檬酸（ElutionBuffer）：称取C6H8O7.H2O10.5g，调节pH3~6，加超纯水定容至500mL（NaOH调节pH至3.5左右）。（3）1MTris-HCl（CollectionBuffer）：称取Tris60.5g，调节pH9.0，加超纯水定容至至500mL。（4）20%乙醇（StorageBuffer）：量取20mL无水乙醇，加超纯水定容至100mL。（5）磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline,PBS）：分别称取KCl0.2g，NaCl8g，Na2HPO4▪12H2O2.9g，KH2PO40.2g，加蒸馏水定容至1L后，用0.22μm滤膜过滤除菌。（6）蛋白质电泳缓冲液（Tris-Glybuffer）：称取甘氨酸14.41g，SDS1.0g，Tris3.03g，蒸馏水1000mL；（7）考马斯亮蓝G-250染色液：①固定液：蒸馏水500mL，甲醇400mL，乙酸100mL；②染色液：蒸馏水100mL，加入117.65mL85%磷酸，再加入100g硫酸铵至完全溶解。然后加入G2501.2g，溶解过夜（避光处理），加入甲醇200mL，加入蒸馏水至1000mL，然后用棕色瓶保存；③脱色液：蒸馏水。（8）消毒液：75%酒精。14

72.1.3实验仪器与设备表2-1实验仪器与设备仪器型号厂家多功能超纯水系统Unique-S20厦门锐思捷医用冷藏箱HYC-310青岛海尔电子天平YP802N上海精密电泳仪电源DYY-6C型北京六一制冰机AF100-ASSurTorius磁力搅拌器IKARHbasicIKA抽滤系统JY96-IIN宁新芝士电泳装置Mini-ProteincellBio-Rad冷冻干燥机YB-FD-18上海亿倍蛋白质纯化系统GEAKTAPureAmershampH计Pb-10Sartorius2.1.4实验试剂SDS、Tris、Tris-HC、甘氨酸、聚丙烯酰胺等常规试剂都是购于北京索莱宝科技有限公司；磷酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、盐酸、NaCl等均购于国药试剂有限公司。2.2试验方法2.2.1大黄鱼血清制备把养殖大黄鱼捞出放入磁盘中，用无菌注射器大黄鱼尾部静脉取血，滴入灭菌的10mL的离心管，以室温最大斜面放置1h后，4℃过夜，次日离心（3000rpm20min，4℃），吸取上清液，获大黄鱼血清，-20℃冻存备用。2.2.2大黄鱼血清IgM的饱和硫酸铵粗提取大黄鱼血清，用等体积的PBS把大黄鱼血清稀释，在冰浴条件下缓慢14

8逐滴加入预冷的饱和硫酸铵，在加入饱和硫酸铵的过程中需要用磁力搅拌器不断的进行搅拌，直到当硫酸铵最终的浓度达到50%时，停止加入饱和硫酸铵。然后继续用磁力搅拌器搅拌2h，搅拌结束后放入4℃医用冷藏箱静置过夜。次日通过离心机离心（12000rpm30min），离心过程需在4℃条件下进行。离心结束后弃上清，收集沉淀。用适量0.02M磷酸钠缓冲液把收集起来的沉淀溶解，溶解后加入透析袋中进行透析，直至检测不到SO42-后停止透析。取透析后的溶液再次离心（12000rpm30min4℃)，弃沉淀，收集上清，用于层析纯化。2.2.3大黄鱼血清IgM的亲和纯化（1）试剂准备配制20mM磷酸钠缓冲溶液（BindingBuffer）、0.1M柠檬酸（ElutionBuffer）、1MTris-HCl（CollectionBuffer）、20%乙醇（StorageBuffer）后于抽滤系统中经0.45μm滤膜过滤，备用。(2)纯化步骤如下:①样品准备：经饱和硫酸铵粗提后的样品，于BindingBuffer中透析至无SO42-为止后，12000g30min4°C离心，弃沉淀，收集上清，用于层析纯化。②仪器准备：连接纯化柱、上样器等部件于GEAKTAPure蛋白质层析纯化系统，排除上样器中气泡。③柱平衡：以约5到10个柱体积的BindingBuffer平衡纯化柱（流速1mL/min）；④上样：样品经注射器注入上样器后，上样1mL（流速0.5mL/min）后，孵育1小时。⑤洗脱杂蛋白：用约5到10个柱体积的BindingBuffer缓冲溶液洗脱没有跟亲和层析柱发生结合的杂蛋白（流速1mL/min）。⑥洗脱结合蛋白：用约2-5mL的ElutionBuffer洗脱结合于纯化柱上的结合蛋白（流速1mL/min），根据软件图示收集结合蛋白，并保存于CollectionBuffer中（每mL样品中加入100μlCollectionBuffer）。⑦纯化柱保存：纯化结束后，以5倍柱体积的超纯水把层析柱清洗干净，然后层析柱中用5倍柱体积的20%乙醇充满，放入4°C冰箱保存。14

92.2.4大黄鱼血清IgM的浓缩与浓度测定用10ml的离心管收集层析柱上的样品，并做好标记，装入透析袋中用超纯水透析48h，透析期间总共需要换两次超纯水，换水的时间间隔为12h一次。透析结束把样品从透析袋中取出，然后放入50mL试管中，倒入试管体积三分之一的样品，用扎出小孔的封口膜封口，封口后把试管放入冷冻干燥机中，当试管内壁没有明显的水珠并且出现了白色粉末时，结束浓缩过程。浓缩的时间一般需要2天，用PBS缓冲液将经过冻干处理后的样品重悬，保存于-20℃冰箱中。冻干重悬后的IgM的蛋白浓度用改良型Bradford试剂盒测定，选择后采用酶标板法（测定的蛋白浓度在50-300μg/mL）进行测定，具体的操作步骤如下：（1）在酶标板上选择18个孔，分为两个组别，一个是标准组，一个是样品组。（2）标准组：选择其中的12个孔，将同一标准品分别放入两个孔中，每个孔加入相应浓度的BSA标准蛋白质溶液20μL。样品组：经过纯化后的样品按2倍、5倍和10倍分别进行稀释，每个样品做两个孔，其中一个为重复实验。三组不同编号的孔均加入20μL稀释后的样品。（3）分别加入200μLBradford工作液于各个酶标孔中，结束后迅速混匀。（4）在室内温度为27℃的条件下，让各液体充分反应5min后，用0号管作为空白对照组，然后通过仪器测出各个孔的A595值。（5）通过MicrosoftExcel软件绘制出的标准曲线，计算出样品稀释后的蛋白浓度，再分别乘以相对应的稀释倍数，就可以得出纯化后IgM蛋白的浓度。2.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳分析IgM的特性采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对纯化的大黄鱼IgM进行纯净度和分子量大小分析。（1）制胶：采用Mini-Proteincell系统，配制浓度为12%的聚丙烯酰胺分离胶，凝固后加入浓度为5%的聚丙烯酰胺浓缩胶。首先倒入约整个胶面三分之二的分离胶，为了让胶面保持平整，然后在两块玻璃板间倒入蒸馏水。等到分离胶凝固后把蒸馏水倒出，加入浓缩胶，插入点样梳。待浓缩胶聚合后，取出点样梳，取出点样梳后胶块上的点样孔要是平整的，这样就可以保证样品在跑的过程14

10中不会歪斜，有利于后面的实验观察。制备的聚丙烯酰胺凝胶应当天使用，防止水分蒸发影响蛋白分离效果。（2）样品处理：取得到的样品10μL，加入等量SDS-PAGE样品缓冲液（Samplebuffer），放入沸水中煮沸5min，目的是为了让蛋白样品变性。（3）电泳和染色：将夹胶玻璃板放入电泳槽中，并且把夹胶玻璃板固定在电泳槽中。吸取待检测样品16µL小心缓慢的加入到点样孔中，防止枪头把胶块弄破。加样结束后接通电源保持稳流（30mA）。电泳结束后方可切断电源。取出夹胶玻璃板后再取出胶块，把浓缩胶去掉，对分离胶进行染色处理1h，所用的染色液是考马斯亮兰（CBB-G250）,最后进行脱色处理，脱色后观察并拍照记录实验结果。表2-2SDS-PAGE凝胶电泳体系组分12%分离胶（10mL）5%浓缩胶（5mL）蒸馏水3.3mL2.8mL30%Acr-Bis（29：1）Tris-Hcl10%SDS10%Aps4.0mL2.5mL（1.5MpH8.8）100μL100μL0.8mL1.25mL（0.5MpH6.8）60μL60μLTEMED5-10μL5-10μL3实验结果3.1大黄鱼血清IgM的纯化及其浓度测定利用ProteinA14

11亲和层析柱纯化时血清粗提液时，样品可分为两部分：一部分是未能与层析柱结合的蛋白，直接被平衡缓冲液洗脱下来，另一部分是能与层析柱结合的蛋白，被洗脱缓冲液洗脱下来。蛋白洗脱峰值显示，在上样阶段，随着上样量增加，蛋白峰值逐渐提高（图3-1，峰值1）；洗脱未结合蛋白阶段，蛋白峰值逐渐下降至水平，表明杂蛋白洗脱完全；使用ElutionBuffer洗脱结合蛋白阶段，出现第二个蛋白峰值（图3-1，峰值2）。对纯化蛋白经蒸馏水透析48h，冷冻干燥后经PBS重悬，使用Bradford试剂盒测定蛋白浓度，拟合方程为y=0.00201013x+0.418685（R2：0.989）（图3-2），样品稀释2倍、5倍和10倍的信号值分别为0.9374、0.6204和0.4901，通过拟合方程计算出2倍和5倍的蛋白浓度为258.0μg/mL和100.3μg/mL，稀释10倍的小于最小值，不在范围内。计算出蛋白浓度约为0.5mg/mL。图3-1ProteinA亲和层析柱纯化血清粗提液图3-2蛋白标准曲线的制作14

123.2大黄鱼血清IgM的特性分析SDS-PAGE检测结果显示，饱和硫酸铵粗提后的血清虽以IgM为主要成分，但仍包含较多杂质（图3-3，泳道1）。利用ProteinA亲和层析柱纯化得到的蛋白样品纯度很高，两种纯化方法均包含两条主要蛋白条带，条带大小分别约70kDa和30kDa（图3-3，泳道2），分子量大小分别与鱼类IgM的重链和轻链相符合，可判定纯化得到的蛋白为大黄鱼IgM。M：蛋白分子量marker；1：饱和硫酸铵粗提；2：ProteinA亲和纯化图3-3SDS-PAGE电泳结果图4结论与展望4.1结论对鱼体血清IgM纯化前，一般需采用饱和硫酸铵盐析法对血清进行粗提。本实验中，采用饱和硫酸铵盐析法作为纯化大黄鱼血清IgM的第一步，从实验得到的电泳图可以看出，用盐析法粗提取后的IgM仍然含有较多的杂蛋白；在经过盐析纯化为前提的基础上，继续采用Protein14

13A亲和层析法纯化大黄鱼血清IgM，电泳结果显示，从层析柱上洗脱的蛋白条带单一，由两条分子量大小分别约为70KDa和30KDa条带组成，这与鱼体IgM重轻链分子大小相吻合，表明使用饱和硫酸铵粗提结合ProteinA亲和纯化方法能获得高纯度的大黄鱼血清IgM。4.2展望本文采用饱和硫酸铵粗提结合ProteinA亲和纯化方法获得了纯度较高的大黄鱼血清IgM，并通过SDS-PAGE对其进行特性分析。在此基础上，后续将以纯化的大黄鱼血清IgM作为抗原免疫小鼠，制备鼠源多克隆抗体；以制备的鼠抗大黄鱼血清IgM为工具，筛选大黄鱼主要病原菌的免疫原性蛋白，并制备其亚单位疫苗和DNA疫苗，防治病原侵染。14

14参考文献[1]张彩兰,刘家富,李雅璀,等.福建省大黄鱼养殖现状分析与对策[J].上海海洋大学学报,2002(01):77-83.[2]这条深受欢迎的海水鱼,现在野生海捕量已不足万吨,谁能养殖出“野生”大黄鱼谁就是赢家[J].当代水产,2018(1):92-93.[3]王凡,廖碧钗,孙敏秋,等.福建大黄鱼产业发展形势分析[J].中国水产,2019(03):45-49.[4]HansenJD,LandisED,PhillipsRB,etal.DiscoveryofauniqueIgheavychainisotype(IgT)inrainbowtrout:ImplicationsforadistinctiveBcelldevelopmentalpathwayinteleostfish[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2005,102(19):6919-6924.[5]DooleyH,FlajnikMF.Sharkimmunitybitesback:affinitymaturationandmemoryresponseinthenurseshark,Gangliocytomacirratum[J].EuropeanJournalofImmunology,2005,35:936-945.[6]LobbCJ,ClemLW.Themetabolicrelationshipsoftheimmunoglobulinsinfishserum,cutaneousmucus,andbile[J].Journalofimmunology,1981,127:1525-1529.[7]HordvikI,ThevarajanJ,SamdalI,etal.MolecularcloningandphylogeneticanalysisoftheAtlanticsalmonimmunoglobulinDgene[J].ScandinavianJournalofImmunology,1999,50(2):202-210.[8]TianJY,SunBJ,LuoYP,etal.DistributionofIgM,IgDandIgZinmandarinfish,SinipercachuatsilymphoidtissuesandtheirtranscriptionalchangesafterFlavobacteriumcolumnarstimulation[J].Aquaculture,2009,88(1/2):14-21.[9]DanilovaN,BussmannJ,JekoschK,eta1.Theimmunoglobulinheavy-chainlocusinzebrafish:identificationandexpressionofapreviouslyunknownisotype,immunoglobulinZ[J].natureimmunology,2005,6(3):295-302.[10]WilsonMR,WartGW.Fishimmunoglobulinandthegenesthatencodethem[J].AnnualReviewofFishDiseases,1992,2:20l-221.[11]SalinasI,ZhangYN,SunyerJO,etal.MucosalimmunoglobulinsandBcellsofteleostfish[J].DevelopmentalandComparativeImmunology,2011,35(12):1346-1365.[12]SinyakovMS,DrorM,ZhevelevHM,etal.Naturalantibodiesandtheirsignificanceinactiveimmunizationandprotectionagainstadefinedpathogeninfish[J].Vaccine,2002,20:3668-3674.14

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16致谢大学四年的学习时光已经接近尾声，毕业论文的完成意味着我的大学生活即将结束。从开始进入课题到论文的顺利完成，一直都离不开老师，同学以及师弟师妹们给与我的帮助，在这里请接受我最诚挚的谢意。首先，我想向我的指导老师何亮银老师表达最真挚的敬意和谢意。本论文是在他的悉心指导和要求下完成的，何亮银老师在我对理论知识了解不深，学习不够透彻的时候耐心的给我讲解实验原理及各种相关知识，老师不仅在理论上给予了我很大的帮助，在实验过程中更是给了我精心的指导和关怀，从最基本的实验操作，到我对实验过程中产生的疑问和困难，老师都及时的和我进行交流沟通，并帮助我解决实验过程中所遇到的问题，培养了我发现问题，思考问题并解决问题的能力。此外，亮银老师对待科研、工作严谨认真的态度，思考、处理问题充满逻辑性、条理性都对我产生很大的影响，值得我努力学习。其次我要感谢实验室的同学及师弟师妹们，在平时的学习中，有你们的陪伴和督促让我对自己的实验更加严格和细心。感谢张宇同学和田文贞师妹在实验过程中给与我的帮助，和我一起分析失败的原因，谢谢你们热心的帮助让我的实验更加顺利的完成。另外感谢学校提供的平台，实验仪器及设备以及良好的学习环境才能够让我的实验顺利完成。我还要借此机会感谢生命科学学院以及学院的各位老师和同学们的关心。正是因为有你们的支持和照顾才能让我的求学之路更加顺利。感恩之余，诚恳地请各位老师对我的论文多加批评指正，使我及时完善论文的不足之处。最后再一次感谢在毕业设计中给予我帮助的老师和同学们，谢谢你们!14