B2016073215 吴自昌 毕业论文

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摘要老化皮肤产生过量的活性氧自由基，本研究通过孵育过氧化氢（H2O2）建立小鼠成纤维细胞L929皮肤衰老模型，以羊栖菜多酚提取物为研究对象，实验羊栖菜多酚对H2O2诱导L929细胞氧化损伤的保护作用。结果表明；L929细胞暴露于H2O2后，细胞活力会下降至参照组的41.4%。随添加羊栖菜多酚浓度的升高，L929细胞活力逐渐上升，说明羊栖菜多酚对H2O2诱导的L929细胞氧化损伤具有一定的保护作用。同时研究发现羊栖菜多酚可剂量依赖性降低L929细胞内活性氧自由基含量，提高L929细胞中总抗氧化能力，并可降低细胞内丙二醛含量，缓解细胞氧化损伤。本研究为羊栖菜多酚在抗衰海洋化妆品中的应用提供了理论支撑。关键词：羊栖菜多酚；小鼠成纤维细胞；过氧化氢；氧化损伤

1AbstractInthisstudy,themousefibroblastL929skinagingmodelwasestablishedbyincubationwithhydrogenperoxide(H2O2),andtheprotectiveeffectofSargassumfusiformepolyphenolsonoxidativedamageofL929cellsinducedbyH2O2wasstudied.TheresultsshowedthatCellviabilitydroppedto41.4%ofthecontrolgroupafterexposuretoH2O2.WiththeincreaseoftheconcentrationofSargassumfusiformepolyphenols,theactivityofL929cellsincreasedgradually,whichindicatedthatSargassumfusiformepolyphenolshadaprotectiveeffectontheoxidativedamageofL929cellsinducedbyH2O2.Meanwhile,itwasfoundthatpolyphenolsfromhijikicanreducethecontentofROSinL929cellsinadose-dependentmanner.increasethetotalantioxidantcapacityinL929cells,andreducethecontentofmalondialdehydeincellstorelieveoxidativedamagetocells.ThisstudyprovidestheoreticalsupportfortheapplicationofSargassumfusiformepolyphenolsinanti-agingmarinecosmetics.Keywords：Hijikipolyphenols;mousefibroblasts;hydrogenperoxide;oxidativedamage

2目录1引言11.1皮肤衰老概述11.2褐藻及褐藻多酚概述11.3褐藻多酚的提取和纯化21.4褐藻多酚抑制皮肤衰老活性研究进展21.4.1抗氧化21.4.2抗基质金属蛋白酶31.4.3抗炎31.5研究目的与意义32实验试剂及材料42.1材料及耗材42.2实验仪器42.3试剂配置43实验方法53.1L929细胞的培养53.2羊栖菜多酚对L929细胞的毒性影响53.3羊栖菜多酚对H2O2诱导L929细胞氧化损伤的保护作用53.4羊栖菜多酚对H2O2诱导的L929细胞中ROS的影响63.5羊栖菜多酚对H2O2诱导的L929细胞中抗氧化酶等生化指标的影响64实验结果及分析74.1羊栖菜多酚化合物对L929细胞的毒性影响74.2羊栖菜多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞氧化损伤的保护作用74.3羊栖菜多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞中ROS的影响84.4羊栖菜多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞中抗氧化活性的影响95结论10参考文献12致谢14

3羊栖菜多酚对过氧化氢诱导L929细胞氧化损伤的保护作用研究1引言1.1皮肤衰老概述皮肤衰老是指皮肤功能的老化损害，降低了皮肤对自身的保护和调节的功能。一旦皮肤不能适应当前环境的变化，出现刺激反应，就会导致皮肤表面出现质地、颜色、甚至大小形状上的情况。而皮肤衰老又可分为两种：第一种是外源性老化。外源性老化是指人长时间暴露在光源下，紫外线进入人体皮肤诱发黑色素的形成，从而导致皮肤出现松弛、皱纹色素沉积、因毛细血管扩展产生疾病等现象，这也被称作“光老化”。而内源性老化作为皮肤衰老的第二种，则是由人体自然法则演变衰退而引起的上述情况，内源性老化由年龄、健康等因素决定。衰老是不可避免的，但人类的衰老并不是不可抗拒的，可通过控制饮食，注意营养摄取的方式来调节自身的新陈代谢，以致达到预期的效果[1~6]。1.2褐藻及褐藻多酚概述我国作为一个两面环海的国家，海洋资源丰富多样。我国沿海海藻有800多种，按颜色分类可分为绿藻、红藻、褐藻。褐藻属多细胞藻，是褐藻门中一类大型藻，属高等藻类。海带、羊栖菜等是我们日常生活中常见的褐藻。在色素方面，由于褐藻细胞的叶黄素含量占比较多，所以褐藻呈现出来的是暗褐色或橄榄绿色。其体型较大，在大量繁殖时吸引生物群聚，从而带来丰富的海洋资源，经济价值较大。同时其细胞壁含有浓稠度高的藻胶物质。覆盖生产生活的方方面面，如食用添加剂、服装工业、橡胶工业等，是一种非常重要的海洋资源。褐藻作为我们的日常食物，富含维生素、蛋白质等多种营养成分，除此之外褐藻中还可以提取褐藻多糖和褐藻多酚等活性成分，具有很高的医用价值。褐藻的许多活性成分在人体机体运行功能中发挥着重要作用，如古代中医典籍《本草纲目》便详细记载了海带类具有消肿、消痰等作用，特别适用于甲状腺患者。经现代临床15

4研究，褐藻还有预防脑血栓和持久的降压效果，对人体健康有很好的益处。褐藻胶可制成医学用药和用品，如止血剂、止血纱布、膏基等。褐藻多酚是褐藻中含量较多、以间苯三酚为基本结构单元的一类酚类化合物，是从褐藻中提取的衍生物。不同的褐藻多酚其结构上也有着较大的区别，包括多羟基型、多羟基联苯型、烷基化型等结构。褐藻多酚对褐藻本身起着化学防御作用；对于人体，已有研究表明，通过褐藻多酚形成的蛋白物质可以用来抑制血管紧张素转换酶的生物活性，从而得到血压降低的效果。此外，褐藻多酚的生物活性持续受到应用，人们将其广泛的应用在医学疾病治疗等方面。并且，褐藻多酚还是可食用的天然抗氧化剂，对海洋资源的开发和人类健康以及医药应用等方面具有重要影响[7]。郭奇Error!Referencesourcenotfound.等证明鼠尾藻多酚对沙蚕弧菌、大肠杆菌等其各菌体都有着抑制作用。1.3褐藻多酚的提取和纯化近年来，褐藻多酚提取工艺有着长足进步，除了常用的溶剂提取法，还发展出超声提取、酶解、微生物提取等多种提取方法。此外，分离纯化褐藻多酚的方法也有很多，如溶剂萃取法、树脂分离法、凝胶色谱法等[9~10]。娄燕Error!Referencesourcenotfound.以鼠尾藻作为研究的原材料利用40.2%浓度乙醇提取鼠尾藻多酚，浸出率为1.703%。以大孔吸附树脂柱层析法进行纯化，成功制备了纯度更高的多酚，浓度为43.4％。张丽斌Error!Referencesourcenotfound.等以40%浓度的乙醇初步提取了羊栖菜多酚，浸出率为4.048%，采用树脂分离法对其纯化处理，制得纯度为61.86%的羊栖菜多酚。曲词Error!Referencesourcenotfound.利用50%浓度的乙醇，在液料比为25:1中以70℃浸提8h提取海黍子多酚，多酚含量为2.17mgGA/g，利用无水乙醚和氯仿对其粗提液进行再次萃取，萃取后多酚含量为3.62mgGA/g。利用SephadexLH-20凝胶柱层析法分离纯化获得不同组分多酚活性产物。1.4褐藻多酚抑制皮肤衰老活性研究进展皮肤衰老是由皮肤氧化损伤、炎症和MMP系列的产生引起的。由于多酚类活性物质在治疗疾病和预防人类衰老方面具有良好的利用价值，因此越来越受到人们的重视。陆生和水生植物中存在的一些次生代谢物在抵抗自由基或减少炎症因子方面起重要作用。研究证实，褐藻多酚在预防皮肤衰老中有着重要作用。15

51.4.1抗氧化抗氧化机制有两种途径。首先，褐藻多酚作为氢的供体和自由基作用，有效清除高活性自由基，生成低活性多酚自由基，终止原有的氧化链反应避免产生有害的过氧化物。其次，作为电子给体，它可以与起催化作用的金属离子相互作用，形成稳定的络合物；从而起到抑制和延缓氧化的作用。康静等Error!Referencesourcenotfound.从海带中提取海带多酚后对50只小鼠进行了抗氧化能力研究，结果表明海带多酚不但能使小鼠肝脏及血清中的丙二醛含量降低，还可以增强小鼠的抗氧化能力。欧阳小琨Error!Referencesourcenotfound.等,利用鼠尾藻多酚进行了多酚抗氧化活性研究，其结果证明了鼠尾藻多酚不但对DPPH自由基有着良好的清除能力对羟自由基也有着非常好的清除作用。于曙光Error!Referencesourcenotfound.采用乙醇分别提取了鼠尾藻和海黍子中的多酚类物质，研究了两类褐藻多酚对DPPH自由基的清除能力。结果显示，鼠尾藻多酚对DPPH自由基清除率为95.5%，海黍子多酚清除率则为92.3%。1.4.2抗基质金属蛋白酶抗衰老和抗皱作用与基质金属蛋白酶的活性密切相关。人体皮肤长时间暴露在阳光下，阳光中的紫外线会增加皮肤中MMP的活性和类型（MMP-1，MMP-2等），过量的MMP会降解皮肤中的胶原蛋白，导致皮肤结缔组织结构的大量破坏，从而加速皮肤衰老Error!Referencesourcenotfound.。因此可通过抑制剂的筛选去抑制基质金属蛋白酶的活性；从而延缓皮肤衰老。SugiuraError!Referencesourcenotfound.等证实从鹅掌菜中提取的多酚化合物能够抑制MMP-1、NF-κB和AP-1的表达，同时褐藻多酚化合物可吸收环境中紫外线，当皮肤受到紫外线照射时，多酚可以抑制机体中胶原蛋白的损失，防止产生皱纹。从褐藻腔昆布中分离出的多酚化合物能够保护人永生化表皮细胞HaCaT细胞免受紫外线辐射，避免由辐射造成的细胞损伤和光老化侵害，证明了腔昆布多酚具有光保护作用。Error!Referencesourcenotfound.1.4.3抗炎无论是皮肤的自然衰老或是外源性衰老，都有着炎症的参与。以光老化为例，当UV照射皮肤，会造成皮肤氧化应激，引发炎症，使巨噬细胞浸润，释放MMP，开始降解细胞外基质。炎症是皮肤对外界刺激的一种防御反应，会流失皮肤中的胶原蛋白，破坏肌底弹力，引发皱纹，色斑，皮肤松弛，从而加快皮肤衰老。kimError!Referencesourcenotfound.15

6等研究发现，从腔昆布乙醇提取物中分离的鹅掌菜酚类化合物能够下调小鼠巨噬细胞白血病细胞中促炎因子肿瘤坏死因子TNF-α、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的表达量，证实了褐藻多酚化合物具有良好的抗炎活性，可用于治疗炎症。CoronaError!Referencesourcenotfound.等研究发现，从泡叶藻(Ascophyllumnodosum)中提取的多酚经过分离得到大分子质量的多酚化合物，在人体内经过消化后被分解成3种小分子质量的多酚化合物，从而上调机体内白细胞介素-8(IL-8)抗炎因子的含量，刺激机体产生抗炎反应。1.5研究目的与意义国内对褐藻多酚的研究主要集中于抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗氧化活性等，对于褐藻多酚在化妆品中的应用研究较少。羊栖菜是福建沿海重要的经济褐藻。本研究在课题组前已提取获得羊栖菜多酚的基础上，利用H2O2暴露小鼠成纤维细胞L929,建立皮肤老化模型，研究羊栖菜多酚对L929细胞氧化损伤的保护作用。该研究将为羊栖菜的高值化开发利用和褐藻多酚抗衰老化妆品的研究提供理论支持。2实验试剂及材料2.1材料及耗材羊栖菜采集自浙江省洞头县，RPMI培养基、DPBS/MODIFIED购自HyClone公司，Trypsin-EDTASolution购自生工生物工程(上海)股份有限公司，胎牛血清（FBS）和双抗购自Gibco公司，细胞培养耗材均来自Thermofisher公司，MTS（Promega公司），PMS（Sigma公司），DCFH-DA探针购自Sigma公司，总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒、细胞丙二醛（MDA）测试盒购自南京建成生物工程研究所。2.2实验仪器纯水系统（Milipore公司，Direct-Q3UV），分析天平（SRTORIUS，BSA224S），酶标仪（Tecan，M200Pro），台式离心机（Eppendorf），pH计（METTLERTOLEDO，MID5X），高温蒸汽灭菌锅（ZEALWAY公司，GI54DWS），二氧化碳培养箱（Eppendorf，Galaxy170S），洁净工作台（苏净安泰公司，SW-CJ-1FD），倒置荧光显微镜（Leica公司，DMI8）。15

72.3试剂配置①L929完全培养基：RPMI培养基中含1%双抗，10%FBS。②L929饥饿培养基：RPMI培养基中含1%双抗，3%FBS。③DPBS：称取0.2gKCl，8.0gNaCl，0.2gKH2PO4，1.15g磷酸氢二钠溶解于约1L蒸馏水中，调pH值至7.35，加入100mg六水氯化镁至充分溶解，再加入133mgCaCl2•2H2O（或99.5mgCaCl2）至充分溶解，定容至终体积1L。④MTS储液：84mgMTS溶解于42mLDPBS中，完全溶解后，0.22μm滤膜过滤，避光-20℃保存。⑤PMS储液：9.2mgPMS粉末溶解于10mLDPBS中，0.22μm滤膜过滤，避光-20℃保存。⑥MTS/PMS工作液：取2.0mLMTS储液与100μLPMS轻柔混匀，避光并可储存于-20℃，每管储液可反复冻融10次。3实验方法3.1L929细胞的培养将L929细胞冻存管迅速置于37℃恒温水浴锅中。融解后将细胞冻存液加入事先准备好的4mLRPMI完全培养基中（10%血清和1%双抗），用移液管轻柔吹打均匀，1500rpm离心3min。吸取2mL的RPMI完全培养基充分吹打沉淀细胞使其混匀，移入培养瓶中，加入10mL的RPMI完全培养基，摇匀，于无菌培养箱（37℃、5%CO2）中。当细胞密度约为90%且细胞状态良好时进行传代和后续实验。吸弃培养瓶中的RPIM完全培养基，加入2mLPBS进行清洗残余的培养基2次。每个培养瓶中加2mL胰酶消化液，37℃消化2min，用手轻拍培养瓶使细胞悬浮。加入2mL培养基终止消化，离心收集细胞，以1:3的比例传代培养。3.2羊栖菜多酚对L929细胞的毒性影响L929细胞按1×105cfu/mL的密度接种到96孔板上，过夜培养并饥饿处理12h后，吸弃96孔板中的培养基，加入不同浓度梯度含多酚的RPMI培养基（3%血清和1%15

8双抗）。用RPMI培养基（3%血清和1%双抗）将多酚母液（10mg/ml）稀释成以下浓度：96、48、24、12、6、3、1.5、0.75μg/ml。用0μg/ml做空白对照，每个浓度设置6个复孔。在细胞培养箱孵育1d后进行细胞活性检测。吸弃96孔板中的液体，每孔加入100μlRPMI饥饿培养基和20μl的MTS/PMS工作液，将细胞板放于细胞培养箱中孵育2h，酶标仪中检测波长490nm处的吸光值。3.3羊栖菜多酚对H2O2诱导L929细胞氧化损伤的保护作用参照3.2将细胞传至96孔板中，饥饿处理后，用RPMI培养基（3%血清和1%双抗）将多酚母液（10mg/ml）稀释成以下浓度：48、24、12、6、3、1.5μg/ml。并设置空白组（0μg/ml）和模型组，空白组和模型组均加入不含多酚的RPMI（3%血清、1%双抗）培养基。孵育培养24h后吸弃96孔板中培养基，空白组加入新鲜的RPMI（3%血清、1%双抗）培养基，模型组和多酚组加入含200μMH2O2的RPMI培养基，放入细胞培养箱中处理3h，随后进行细胞活性检测。3.4羊栖菜多酚对H2O2诱导的L929细胞中ROS的影响参照3.2将细胞传至96孔板中，饥饿处理12h。吸弃96孔板中的培养基，加入不同浓度梯度含多酚的RPMI培养基（3%血清和1%双抗）。用RPMI培养基（3%血清和1%双抗）将多酚母液（10mg/ml）稀释成以下浓度：48、24、12、6、3μg/ml。并设置空白组（0μg/ml）和模型组，空白组和模型组均加入不含多酚的RPMI（3%血清、1%双抗）培养基。将96孔板放于细胞培养箱孵育24h。吸弃96孔板中培养基，用提前在37℃水浴锅中预温好的PBS洗涤3次，每孔加入100μmol终浓度为20μmol/L的DCFH-DA、含10%血清的无酚红RPMI培养基，放入细胞培养箱中孵育30min。弃去培养基，PBS重复洗涤3次，空白组加入新鲜含10%血清的无酚红RPMI培养基，模型组和多酚组加入H2O2终浓度为400mM的含10%血清的无酚红RPMI培养基，放置于细胞培养箱中孵育1h后在倒置显微镜下进行镜检。3.5羊栖菜多酚对H2O2诱导的L929细胞中抗氧化酶等生化指标的影响将L929细胞按2×105cfu/ml的密度接种到60mm培养皿中，每个培养皿4ml细胞液，过夜培养后，吸弃培养皿中的RPMI完全培养基，加入含有3%血清、1%双抗的15

9RPMI培养基，放入培养箱中饥饿培养12h。实验分为正常组、模型组、多酚给药组。吸弃培养皿中的培养基，将多酚母液用3%的RPMI培养基稀释成12、6、3、1.5μg/ml四个浓度梯度，每个梯度设置4个平行样，正常组和模型组均加入不含多酚的RPMI（3%血清、1%双抗）培养基。将培养皿置于细胞培养箱孵育24h。吸弃培养皿中培养基，正常组加入新鲜的RPMI（3%血清、1%双抗）培养基，模型组和多酚加药组加入H2O2终浓度为400mM的3%血清、1%双抗的RPMI培养基，放入细胞培养箱中培养3h后，弃去细胞培养上清，每个培养皿用1mlPBS洗涤一次，然后每个培养皿加1mlPBS用细胞刮刮下细胞，用移液枪将细胞转移到1.5ml离心管中，3500rpm离心20min，收集细胞沉淀，利用细胞破碎仪破碎细胞并收集上清液，采用南京建成生物工程研究所总抗氧化能力（T-AOC）测试盒和细胞丙二醛（MDA）测定试剂盒进行测定。4实验结果及分析4.1羊栖菜多酚化合物对L929细胞的毒性影响用不同浓度的多酚化合物（0-96μg/ml）处理L929细胞24h后检测细胞活性，以确定多酚化合物对L929细胞的毒性影响，结果如下图所示，与对照组相比，在0.75-24μg/ml范围内的多酚浓度对L929细胞无毒性影响，当多酚浓度超过24μg/ml时，L929细胞的活力相比对照组开始出现明显差异，当多酚浓度达到96μg/ml时，细胞活力仅为对照组的30%左右，因此，在后续实验中我们采用0-24μg/ml的多酚浓度。图1多酚化合物对L929细胞毒性的影响15

104.2羊栖菜多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞氧化损伤的保护作用为检测多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞氧化损伤是否具有保护作用，我们将L929细胞饥饿处理12h后，用不同浓度的多酚化合物（1.5-48μg/ml）与L929细胞共孵育24h，然后将细胞暴露在200μmol/L的双氧水中3h，暴露结束后检测细胞活性，结果如下图所示，与对照组相比，细胞暴露于H2O2后，细胞活力下降至对照组的41.4%，但是，用多酚化合物预处理细胞后，相比于H2O2模型组细胞活力逐渐上升，在1.5-12μg/ml的浓度范围内，随着多酚浓度增加L929细胞活力逐渐上升，呈现浓度依赖关系。当多酚浓度达到12μg/ml时，细胞活力相比于对照组为76.6%，说明多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞氧化损伤具有保护作用。图2多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞氧化损伤的保护作用4.3羊栖菜多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞中ROS的影响机体中的活性氧自由基包括过氧化氢、羟自由基、超氧阴离子。当机体中的ROS含量过高时，这些活性氧自由基会破坏生物体的正常细胞、组织以及活性物质。DCFH-DA是一种可以自由进出细胞的荧光染料，当DCFH-DA进入细胞后被水解成DCFH，DCFH会被胞内ROS氧化生成DCF，通过对DCF荧光的检测评价胞内ROS含量。本实验镜检结果显示，与对照组细胞相比，模型组细胞内的荧光强度显著增强，说明H2O2能够显著增加细胞内的ROS含量，经过羊栖菜多酚预处理后的L92915

11细胞中的荧光强度显著降低，这说明多酚能有效减少细胞内的活性氧的水平，且呈现剂量依赖性。图3多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞中ROS的影响4.4羊栖菜多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞中抗氧化活性的影响T-AOC是衡量细胞内总抗氧化能力的指标，细胞内丙二醛（MDA）的含量可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。我们通过测定L929细胞中T-AOC和MDA评价羊栖菜多酚对H2O2诱导的L929细胞中抗氧化能力的影响。结果如下图所示，与对照组相比，将细胞暴露于H2O2中3h后，细胞内T-AOC显著降低，细胞清除氧自由基的能力显著减弱，从图中可以看出，经过多酚化合物与细胞共孵育24h后再将细胞暴露于H2O2中，细胞中的T-AOC均随着多酚浓度增加而逐渐升高，细胞清除氧自由基的能力逐渐增强，说明多酚化合物能够提高L92915

12细胞中抗氧化活性。同时，细胞中丙二醛（MDA）的含量测定结果显示，经过H2O2诱导后，细胞内MDA的含量显著升高，H2O2刺激引发细胞内出现脂质过氧化作用，而细胞内的氧化损伤通过多酚化合物预处理细胞后得到了缓解，从图中可以看出，用多酚预处理细胞后，细胞内丙二醛MDA的含量随着多酚浓度的升高而逐渐降低，呈现剂量依赖性，说明多酚能够保护细胞免受氧化损伤。图4多酚化合物对H2O2诱导的L929细胞中T-AOC和MDA的影响5结论15

13本研究明确了羊栖菜多酚对小鼠成纤维细胞L929无毒性浓度为24μg/mL。当细胞暴露于200μMH2O2中3h，细胞活力下降至对照组的41.4%。预孵育羊栖菜多酚24h后，在1.5-12μg/ml的浓度范围内，与H2O2模型组相比随着多酚浓度增加其细胞活力逐渐上升。同时，本研究发现孵育羊栖菜多酚后，L929细胞内ROS含量随着多酚浓度增加显著降低，细胞中T-AOC活力逐渐升高，MDA含量逐渐降低，说明羊栖菜多酚可增强L929细胞的抗氧化活性，缓解L929细胞氧化损伤。综上所述，羊栖菜多酚对H2O2诱导的L929细胞氧化损伤具有良好的保护作用。15

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16致谢人的一生中会发生许许多多的事，不管是好是坏它都是一种经历，而人生中走的最快的则是时间，一去不复返，让人来不急感叹！转眼间，我的大学生活已接近了尾声，随着这篇毕业论文的完成，也就证明着我垓离开这个我生活了快4年的“家”，4年的努力与付出，将画上完美的句号。回首走过的岁月，心中感慨良多。首先，诚挚的感谢我的指导老师郑昇阳导师和陈贝导师。本课题的选题和研究过程中我得到了陈贝导师的悉心指导，因我自己基础知识较薄弱，在试验过程中出现了许多问题，而陈贝导师不但没有嫌我麻烦，反而是平易近人，和蔼可亲的对我进行讲解，告诉我对与错和如何去改进它，从而获得更好更准确的实验数据；郑昇阳导师在繁忙的教学工作中仍然挤出了时间多次询问我的研究进展，审查和修改我的论文，为我指点迷津，开阔研究思路。昇阳老师，“强硬”的专业知识，一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，还教我为人。两位导师渊博的专业知识，严以律己，诲人不倦的高尚师德，宽以待人的崇高风范，平易近人的人格魅力对我影响深远。我的论文从选题到完成，每一步都倾注了导师的大量心血，在此，容我再次向两位导师表示崇高的敬意和衷心的感谢。其次，感谢福建省水产研究所水产加工研究室刘智禹主任和实验室中的陈红红师姐。感谢主任给我提供了那么好的一个实验室，让我能更好地完成我的实验，谢谢红红师姐在我刚去实验室时面对那么多的仪器及一些看不懂的药品作用一脸茫然的我到最后能正常去运用它们的我这之间的教导及在实验过程中对我的帮助。最后，我还想感谢教过我的每一位老师和我的父母。感谢老师们对我的教育培养，虽历时三载，却给以终生受益无穷之道。感谢父母，生我养我，给我的一却，我让你们操心了!最后，我想对你们说一声“你们！辛苦了”。15