隐匿性乙型肝炎病毒感染与肝细胞肝癌关系的研究

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分类号：R512.6UDC：密级：重庆医科大学硕士学位论文论文题目隐匿性乙型肝炎病毒感染与肝细胞肝癌关系的研究作者姓名郑洁指导教师姓名（职称、单位名称）曾爱中教授重庆医科大学附属第一医院感染科申请学位级别硕士学科、专业名称内科学（传染病学）论文答辩年月2016年5月2016年5月 重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果Ｌ。据我所如，除了文中特别加乂标注和致谢的地方外，论文中不包含其化人己经发表或撰写过的研究成果，化不包含为巧得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作，与我同了明确的说明并亲示谢唐。申请学位论文与资料若有不实乏处一，本人承担切相关责任。：曰期：２＞中．学位论文作者盛名妾ｃｌｋ．１学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定．目Ｐ；研巧生在攻读学位期间论文工作的細识产权单位属重庆医科大学。本人化证毕业离校后，发裘论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学．。学校有权保留并向国家有关部口或机构送巧论文的复印件和磁盘，化许论文被查阅和借阅。学校可（公布学位论文的全部或却分内容（保密巧容除外），，并编入有关数据库进行检索，可Ｌ乂采用影印缩印或其他手段保存论文。保密论文在解密盾适用本段权书。论文作者签名：指导教师签名：日期：Ｊ／ｉｒ＼ 目录英汉缩略语名词对照.............................................................................................................1中文摘要..................................................................................................................................3英文摘要..................................................................................................................................5论文题目：隐匿性乙型肝炎病毒感染与肝细胞肝癌关系的系统评价........................7前言..................................................................................................................................51资料与方法..................................................................................................................92结果............................................................................................................................113讨论............................................................................................................................14全文总结................................................................................................................................17参考文献................................................................................................................................18综述题目：隐匿性乙型肝炎病毒感染与肝细胞肝癌关系的研究进展......................201介绍............................................................................................................................202OBI的概况及机制...................................................................................................213抗HCV抗体阴性肝癌患者中OBI情况.................................................................224OBI作为HCC危险因素可能涉及的机制.............................................................235结论............................................................................................................................26参考文献................................................................................................................................27致谢......................................................................................................................................30攻读硕士学位期间发表的论文..........................................................................................31 重庆医科大学硕士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称OBIocculthepatitisBvirusinfection隐匿性乙型肝炎病毒感染HCChepatocellularcarcinoma肝细胞肝癌ORoddsratio比值比CIconfidenceinterval可信区间dfdegreeoffreedom自由度HBsAghepatitisBvirussurfaceantigen乙肝表面抗原HBV-DNAhepatitisBvirusdeoxyribonucleic乙肝病毒脱氧核糖核酸acidNPCRnestedpolymerase巢式聚合酶链反应chainreactionNBNC-HCChepatitisBvirussurfaceantigen非显性乙肝和丙肝negativeandanti-HCVnegative相关性肝细胞肝癌hepatocellularcarcinomaHCVhepatitisCvirus丙肝病毒RCTsrandomizedcontrolledtrials随机对照试验RRrelativerisk相对危险度cccDNAcovalentlyclosedcircleDNA共价闭合环状DNAHBeAghepatitisBviruseantigen乙肝e抗原RT-PCRreversetranscription逆转录聚合酶链反应polymerasechainreactionpgRNApregenomeRNA前基因组RNAHBsAbhepatitisBsurfaceantibody乙肝表面抗体HBcAghepatitisBcoreantigen乙肝核心抗原mRNAmessengerribonucleicacid信使核糖核酸1 重庆医科大学硕士研究生学位论文HBxAghepatitisBxantigen乙肝病毒X蛋白CpGregionfullofconnectingcytosine磷酸酯键连接的胞嘧啶andguaninebyphosphoesterbond鸟嘧啶密集区URGupregulatedgene上调基因PARD6Gpartitioning-defective-6-有分区缺陷的homolog-gammageneγ同源基因6SERCA1sarco(endo)plasmicreticulum肌浆网/内质网2+2+Ca-ATPase1Ca-ATP酶1miRmicroribonucleicacid微小核糖核酸DNMTdeoxyribonucleic脱氧核糖核酸acidmethyltransferase甲基化转氨酶2 重庆医科大学硕士研究生学位论文隐匿性乙型肝炎病毒感染与肝细胞肝癌关系的系统评价摘要目的：评估隐匿性乙型肝炎病毒感染(occulthepatitisBvirusinfection,OBI)是否会增加肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)发生的风险。方法：2个独立的研究者分别在Medline、Webofscience、Webofknowledge、Cochranelibrary、Embase、Biomedcentral、万方数据库、维普中文科技期刊全文数据库、中国学术期刊全文数据库、中国生物医学文献数据库中检索关于OBI和HCC的文献，截止搜索日期2015.4.14，根据设定的纳入、排除标准筛选研究OBI与HCC关系的前瞻性队列研究或病例对照研究，并对纳入文献进行数据提取和质量评价，用ReviewManager5.3软件对纳入的研究进行Meta分析。结果：本研究最终筛选出6个符合条件的研究,有5个回顾性研究和1个前瞻性研究。回顾性研究的Meta分析纳入的5个研究总共有1764个对象，Meta分析结果表示OBI会增加HCC发生的风险，有统计学意义，比值比（oddsratio，OR）=9.31,95%可信区间（confidenceinterval,CI）=7.18～12.05,P<0.001，异质性X²=5.61,自由度（degreeoffreedom,df）=4(P=0.23),I²=29%。3 重庆医科大学硕士研究生学位论文结论：本研究结果表明OBI会增加HCC发生的风险，对临床有一定的指导意义。关键词：隐匿性乙型肝炎病毒感染，肝细胞肝癌，比值比，Meta分析4 重庆医科大学硕士研究生学位论文ASSOCIATIONBETWEENOCCULTHEPATITISBVIRUSINFECTIONANDTHERISKOFHEPATOCELLULARCARCINOMA:ASYSTEMATICREVIEWABSTRACTObjective:ToassesswhetherocculthepatitisBvirusinfection(OBI)canincreasetheriskofhepatocellularcarcinoma(HCC).Methods:LiteraturesaboutOBIandHCCinrelevantdatabases：Medline,Webofscience,Webofknowledge,Cochranelibrary,Embase,BiomedCentral,WanfangData,VIP,ChineseBiomedicalLiteratureandChinaNationalKnowledgeInternetweresearchedbytwoindependentreviewersrespectively.TheendlineisApril14th,2015.Prospectivecohortstudyorcase-controlstudyaboutOBIandHCCwerescreenedoutbyinclusiveandexclusivecriteria.Qualityoftheincludedliteraturewasevaluatedanddatawereextracted.ReviewManager5.3softwarewasusedforMetaanalysis.Results:Sixresearcheswerescreenedoutinthisstudyfinally,includingfiveretrospectivestudiesandoneprospectivestudy.Fiveretrospectivestudiesof1764patientswereincludedinourstudy.Meta-analysisresultsindicatedthatOBIcanincreasetheriskofHCC(OR=9.31，95%CI=7.18to12.05，P<0.001,heterogeneity(X²=5.61,df=4(P=0.23);I²=29%).Conclusion:OBIcanincreasetheriskofHCC,whichisofclinicalguidingsignificance.5 重庆医科大学硕士研究生学位论文Keywords：occulthepatitisBvirusinfection,hepatocellularcarcinoma,oddsratio,Metaanalysis6 重庆医科大学硕士研究生学位论文隐匿性乙型肝炎病毒感染与肝细胞肝癌关系的系统评价前言众所周知，慢性乙型肝炎和HBV携带者两种形式是慢性HBV感染的主要表现形式，隐匿性乙型肝炎病毒感染(occulthepatitisBvirusinfection,OBI)这一新名词的出现让世界对慢性HBV感染的新形式有了进一步的认识，它是1979年在一位接受输血的患者中首次被发现的[1]，OBI是指外周血中乙肝表面抗原（hepatitisBvirussurfaceantigen，HBsAg）阴性者血清和（或）肝组织中持续存在乙肝病毒脱氧核糖核酸（hepatitisBvirusdeoxyribonucleicacid,HBV-DNA）[2]。近30年，随着巢式聚合酶链反应（nestedpolymerasechainreaction,NPCR)等高灵敏度检测方法的出现，各临床科室中发现越来越多的OBI病例，OBI和临床多个科室密切相关，特别是与涉及肝病、输血、手术、透析等科室密切相关，故明确OBI和肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）的关系对临床有非常重大的意义。慢性乙型肝炎与多种慢性肝脏疾病关系密切是毋庸置疑的，如肝硬化、肝衰竭和HCC。然而，OBI的临床意义却尚有争议。有较多探讨OBI和HCC的关系的前瞻性和回顾性研究，但结果各异，OBI的临床意义尚不明确。因此，本研究旨在明确OBI是否为HCC发生的危险因素，2个独立的研究者分别在国内外多个数据库中检索相关文献，截止搜索日期2015.4.14，参照国内外经典文献，制定了严格的纳入排除标准，筛选研究OBI与HCC关系的前瞻性队列研究或病例对照研究，并对纳入文献进行数据提取和质量评价，对所纳入的研究进行Meta分析使用的是ReviewManager5.3软件。符合纳入排除标准的研究中只有一个为前瞻性研究，相对危险度（relativerisk,RR）=5.21，95%可信区间（confidenceinterval,CI）=3.15～8.61，表明OBI患者有发生HCC的风险。符合纳入排除标准的研究中回顾性研究有5个，Meta分析结果表明OBI会增加HCC发生的风险，有统计学意义，7 重庆医科大学硕士研究生学位论文比值比（oddsratio，OR）=9.31,95%CI=7.18～12.05,P<0.001，异质性X²=5.61,自由度（degreeoffreedom,df）=4(P=0.23),I²=29%。故得出结论：OBI是发生HCC的危险因素。另外，HCC的病因较多，但临床研究中单因素变量几乎不存在，纳入研究时只能尽量排除HCC的其他非研究病因，分析此次纳入的5个回顾性研究，有3个为隐源性HCC，有2个为非显性乙肝和丙肝相关性肝细胞肝癌(hepatitisBvirussurfaceantigennegativeandanti-HCVnegativehepatocellularcarcinoma,NBNC-HCC),故进一步就OBI和隐源性HCC关系做了亚组Meta分析，结果为OR=13.58，95%CI=8.96～20.58,P<0.001)（X²=1.07,df=2(P=0.59);I²=0%），进一步更好地证明了OBI和HCC发生的相关性。故临床医务工作者和血站工作者应重视HBsAg阴性，而血清学抗体阳性的患者，需完善高灵敏度HBV-DNA检测以排除OBI，减少乙肝的血液传播，避免或延缓慢性肝脏疾病进展。8 重庆医科大学硕士研究生学位论文1资料与方法1.1纳入与排除标准1.1.1文献类型前瞻性队列研究或病例对照研究。1.1.2研究对象病例对照研究的研究对象是结合病史特点、体征、生化检查、影像学表现临床诊断的肝细胞肝癌或手术后病理检查确诊的肝细胞肝癌患者。前瞻性队列研究的研究对象是血液HBsAg阴性而血液和（或）肝组织中HBV-DNA阳性者。1.1.3暴露因素血液和（或）肝组织中有HBV-DNA。暴露组定义为血液HBsAg阴性而血液和（或）肝组织中HBV-DNA阳性的对象，非暴露组定义为血液和肝组织中HBV-DNA均阴性的对象。病例组定义为HCC患者，对照组定义为非肝癌患者。1.1.4结局指标临床诊断(第八届全国肝癌学术会议上正式通过的"原发性肝癌的临床诊断与分期标准")或病理诊断的HCC。1.1.5排除标准缺乏对照组，显性HBV感染，合并丙肝病毒（hepatitisCvirus,HCV）感染，研究未提供计算HCC与非HCC中OBI存在的风险评估的数据，研究未提供计算OBI和非OBI发生HCC的风险评估的数据，不全报道，研究不是中文或者英文发表的。1.2文献检索参考Cochrane协作网制定的检索策略，以“occulthepatitisBvirusinfection”、9 重庆医科大学硕士研究生学位论文“hepatocellularcarcinoma”、“隐匿性乙型肝炎病毒感染”、“肝细胞肝癌”为检索词并合并不同的检索方式，检索Medline、Webofscience、Webofknowledge、Cochranelibrary、Embase、Biomedcentral、中国学术期刊全文数据库、万方数据库、中国生物医学文献数据库、维普中文科技期刊全文数据库搜索文献。截止搜索日期2015.4.14。2个研究者间的所有分歧最终都达成了一致意见。1.3文献质量评价和资料提取用一个7点评分系统来评定所纳入研究的研究方法的质量[3](看表1)，包括研究设计，样本大小，HBV-DNA试验的设计，病例的匹配和对照。HBV-DNA试验基于3个方面:第一，在扩增试验中至少使用两套来自HBV基因不同区段的引物，第二，包括合适的阴性对照，第三，检测下限的敏感性。高质量研究是指5分及以上的研究，中等质量研究是指评分为3-4分的研究，低质量研究是指评分为3分以下的研究。文献质量由2名研究员分别进行评估，通过协商或者由第3位研究者介入解决分歧，最终达成一致意见。资料提取内容主要包括：每个研究的年份，地点，参与对象的数量和特征，风险评估或可计算风险评估的数据，样本的类型，HBV-DNA检测方法(引物数量，对照组，灵敏度)。表1Meta分析中纳入研究的质量评价标准Table1Qualitycriteriaofstudiesincludedinthemeta-analysis分值质量参数10研究设计队列病例-对照病例数或暴露者数量≥50<50HBV基因引物≥2个不同基因区引物1个基因区引物检测方法中阴性对照有无检测下限≤50拷贝/ml>50拷贝/ml病例-对照组/暴露-年龄匹配不匹配非暴露组匹配性别匹配不匹配10 重庆医科大学硕士研究生学位论文1.4统计学分析回顾性研究的有效评估值是OR，前瞻性研究的有效评估值是RR，还有各自相应的95%CI。用国际Cochrane协作中心提供的ReviewManager5.3软件对纳入的研究进行定量的Meta分析。用P值和I2值评估研究的异质性。P值小于等于0.10或者I2大于等于50%就表明研究间异质性不能接受。因研究间异质性小，故选择了固定效应模型。用漏斗图来检测发表偏倚的潜在风险，不对称表示存在发表偏倚。2结果2.1检索结果：纳入研究的特征初检出相关文献812篇，经阅读文章题目、摘要，根据纳入排除标准，排除HCV相关、显性HBV感染、无对照组、综述、与HCC无关、去重，剩余20篇文献，查找20篇文献原文，排除如下研究：未提供计算HCC与非HCC中OBI存在的风险评估的数据，未提供计算OBI和非OBI发生HCC的风险评估的数据，合并HCV感染，缺乏对照组。最后有6个研究符合条件。所纳入研究的相关特征均展示在表2中。在这些研究中，5个来自于亚洲，1个来自意大利。前瞻性研究只有1个，回顾性研究有5个。Meta分析纳入的5个研究总共有1764个对象，所有研究均来源于医院。本研究用我们预先确定的标准来评估所纳入研究的方法学质量，3个是高质量研究，1个是中等质量研究，2个是低质量的研究。11 重庆医科大学硕士研究生学位论文表2Meta分析所纳入研究的特征Table2Characteristicsofthestudiesincludedinthemeta-analysis暴露组或病例组对照组检测方法研究检测下限质量研究及年份国家样本2个及以阴性对类型例数年龄性别处理方式例数年龄性别处理方式（拷贝/毫分层上引物照组升）队列和对照组无HBV-DNA和暴露组无HBV-DNAIkedaetal.2009[4]日本9同前73同前血清++≤50高研究统计学差异阳性统计学差异阴性病例中位年龄43女：90，中位年龄：54女：63，房勇等.2013[5]中国178HCC215CLD血清-+>50低对照（25-74）男：125（35-70）男：115病例中位年龄66女：21，和病例组无女：23，李庆安等.2012[6]中国52HCC60非肝病血清-+>50低对照（47-74）男：31统计学差异男：37病例中位年龄61女：51，和病例组无Chenetal.2009[7]中国222HCC300同前CLD血清++>50高对照（46-75）男：171统计学差异病例中位年龄59女：43，中位年龄：40女：240，CLD和非肝Fangetal.2009[8]中国135HCC518血清++≤50中对照（35-70）男：92（15-82）男：278病Yotsuyanagiet病例中位年龄59女：7，中位年龄：64女：8，日本42HCC42CLD血清++≤50高al.2000[9]对照（55-77）男：35（53-75）男：34CLD:chronicliverdisease，注：有的研究原文未提供组别年龄、性别具体数据，只提及说明病例组或暴露组与对照组年龄、性别有无统计学差异。12 重庆医科大学硕士研究生学位论文2.2Meta分析结果2.2.1前瞻性研究只有一个研究符合纳入标准，RR=5.21(95%CI=3.15～8.61)，表明OBI是HCC发生的危险因素。2.2.2回顾性研究回顾性研究Meta分析结果显示OBI是HCC发生的危险因素，有统计学意义，OR=9.31,95%CI=7.18～12.05,P<0.001，异质性X²=5.61,df=4(P=0.23),I²=29%（图1）。另外，HCC的病因较多，但临床研究中单因素变量几乎不存在，纳入研究时只能尽量排除HCC的其他非研究病因，分析此次纳入的5个回顾性研究，有3个为隐源性HCC，有2个为NBNC-HCC,故进一步就OBI和隐源性HCC关系做了亚组Meta分析（图2），结果为OR=13.58，95%CI=8.96～20.58,P<0.001)（X²=1.07,df=2(P=0.59);I²=0%），更好地证明了OBI和HCC发生的相关性。图1总体森林图（比较HCC与对照组OBI暴露的情况差异,95%可信区间横线、菱形图位于垂直线右侧，表示病例组效应量大于对照组）Figure1Forestpoltoftheoverallstudies(comparingOBIriskinHCCwiththatincontrolgroup).13 重庆医科大学硕士研究生学位论文图2总体森林图（比较HCC与对照组OBI暴露的情况差异，95%可信区间横线、菱形图位于垂直线右侧，表示病例组效应量大于对照组)Figure2Forestpoltoftheoverallstudies(comparingOBIriskinHCCwiththatincontrolgroup).2.2.3发表偏倚总体研究的漏斗图不对称（看图3），表示存在一定程度的发表偏倚，阴性结果的实验未发表可能与漏斗图不对称有关。图3最终所纳入研究的漏斗图Figure3Funnelplotofthefinallyincludedstudy3讨论随着OBI这一新名词的出现，近30年相关研究逐渐增加，特别是NPCR技术的发展，使OBI的研究成为热点，OBI与临床各科室均密切相关，如肝脏病人、献血者、血液透析、器官移植、外科手术患者等，故明确OBI是否有致癌性有重大意义，这个研究评估了医院就诊人群中OBI和HCC的关系。本研究的Meta分14 重庆医科大学硕士研究生学位论文析合并了5个回顾性研究的OR，结果表明OBI发生HCC的风险是对照组的9.31倍，证明了OBI的致癌性，故临床工作中OBI不容忽视。但是该分析纳入的研究多为回顾性研究，缺乏大样本的随机对照试验（randomizedcontrolledtrials,RCTs），OBI的致癌性还需要更多的单因素的标准化RCTs来明确。OBI导致HCC的机制很多。首先，通过免疫介导的机制，CD8+T淋巴细胞特异性直接杀伤表面有病毒抗原的肝细胞，也有自然杀伤细胞、中性粒细胞等的固有免疫作用，同时这些炎症细胞释放细胞因子和趋化因子。OBI引起的轻微但持续的炎症会导致反复的肝细胞坏死和再生，打破了肝细胞增生、分化、凋亡之间的生理平衡，这会增加肝细胞增殖（高细胞增殖指数是HCC发生的危险因素）和不典型增生，因此导致肝纤维化、肝硬化和产生一个致突变的环境[10-12]。其次，OBI是HBV感染后自然病程之一，一些HCC患者肝内总的HBVDNA、共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircleDNA,cccDNA)和HBV转录活性与一些乙肝e抗原（hepatitisBviruseantigen,HBeAg）阴性乙肝相关性HCC没有明显差别。OBI保留了经典HBV感染后致癌机制[10,13-16]，如在脆性位点、重复区及保守区整合进宿主基因组，顺式激活相关基因，增加宿主的染色体不稳定性，导致染色体缺失、染色体易位，改变宿主的基因表达和细胞表型，如乙肝病毒X蛋白即HBxAg（hepatitisBxantigen）、前S蛋白、大或中表面蛋白可反式激活肿瘤发生的信号通路、启动子、增强子、致癌基因，促进增殖，抵抗生长抑制，浸润组织和转移，促进血管生成（HBxAg可引起血管内皮生长因子的过度表达），改变代谢，抵抗凋亡。再次，基因突变，如病毒核心启动子、前S1的C端和前S2的N端突变，形成毛玻璃肝细胞，HBsAg滞留在内质网中，使内质网肿胀、氧化应激、DNA损伤。最后，HBV基因组在不连续的由磷酸酯键连接的胞嘧啶鸟嘧啶密集区（regionfullofconnectingcytosineandguaninebyphosphoesterbond,CpG)位点高甲基化修饰可能也参与HCC的发生发展。这个Meta分析有几个局限。第一，所纳入的部分研究样本量相对有限。第二，所纳入研究大多数是亚洲的，具有局域性。第三，纳入的研究对象可能存在其他影响结果的混杂因素，如有酒精性、脂肪性、淤胆性、淤血性、药物性、自身免疫性、遗传性因素等，只有排除这些因素，这样才能确定OBI在导致肝癌中的直接作用。第四，该Meta分析符合纳入标准的研究多为回顾性研究，不是RCTs。15 重庆医科大学硕士研究生学位论文第五，此次纳入研究多以血清作为标本，这样会漏掉一部分OBI，因为如果以肝组织作为检测标本，加以检测cccDNA，OBI阳性率会升高。最后，我们将所纳入文章限制在有全文和以中文或英文发表，这样我们可能排除了以其他语言发表的高质量的研究。总之，这个Meta分析表明OBI会增加HCC发生的风险，我们期待更多前瞻性关于OBI与隐源性HCC关系的研究来进一步增强该观点的说服力。16 重庆医科大学硕士研究生学位论文全文总结1．OBI为慢性HBV感染的一种新的表现形式，成为近30年肝病研究领域的热点话题之一，相关研究进展迅速，随着NPCR高灵敏度检测方法的出现，临床相关科室中发现越来越多的病例，故明确OBI与HCC的关系意义重大。2．本研究制定了严格的纳入排除标准，筛选出符合条件的研究，最终Meta分析结果表明OBI会增加HCC发生的风险，有统计学意义，OR=9.31,95%CI=7.18～12.05,P<0.001，异质性X²=5.61,df=4(P=0.23),I²=29%，故临床工作中重视HBsAg阴性，而抗体阳性的患者，需完善HBV-DNA以排除OBI。3．本研究尚存在不足，需要更多大样本、多中心、前瞻性、单因素、RCTs、高质量的研究进一步证实OBI与HCC的关系。4．OBI致癌机制类似慢性乙肝，如整合进宿主基因组，顺式激活相关基因或合成蛋白后反式作用于基因组或相关蛋白质，合成有使肝细胞转化能力的HBX蛋白和截短了的preS-S蛋白，影响信号通路，使细胞增殖、凋亡失衡。基因突变和高甲基化修饰机制。持续存在的低载量病毒可导致轻微但持续的炎症坏死，肝细胞循环坏死、再生，加速肝硬化进程，最终导致HCC。17 重庆医科大学硕士研究生学位论文参考文献[1]HoofnaghJH,SeefLB,BalesZB,etal.TheytpeBhepatitisaftertransfusionwithbloodcontainingantibodytohepatitisBcoreantigen[J].NEnglJMed.1978,298(25):1379-1383.[2]CandottiD,AllainJP.Transfusion-transmittedhepatitisBvirusinfection[J].JHepatol2009,51(4):798–809.[3]ShiY,WuYH,WuW,etal.AssociationbetweenocculthepatitisBinfectionandtheriskofhepatocellularcarcinoma:ameta-analysis[J].LiverInt,2012(32):231–240.[4]IkedaK,KobayashiM,SomeyaT,etal.OcculthepatitisBvirusinfectionincreaseshepatocellularcarcinogenesisbyeighttimesinpatientswithnon-B,non-Clivercirrhosis:acohortstudy[J].JViralHepat,2009(16):437–443.[5]房勇，梁爽，陈思佳,等.中国北方地区隐源性肝炎及乙型肝炎表面抗原阴性肝癌患者中隐匿性HBV感染流行状况分析[J].国际免疫学杂志,2013,36(6):472-475.[6]李庆安,肖清华,刘建湘.隐源性HCC肝硬化与隐匿型乙型肝炎感染关系比较[J].中国医药导刊,2012,14(10):1672-1675.[7]ChenCH,ChangchienCS,LeeCM,etal.Astudyonsequencevariationsinpre-S/surface,XandenhancerII/corepromoter/precoreregionsofocculthepatitisBvirusinnon-B,non-ChepatocellularcarcinomapatientsinTaiwan[J].IntJCancer,2009,125(3):621–629.[8]FangY,ShangQL,LiuJY,etal.PrevalenceofocculthepatitisBvirusinfectionamonghepatopathypatientsandhealthypeopleinChina[J].JInfect,2009,58(5):383–388.[9]YotsuyanagiH,ShintaniY,MoriyaK,etal.Virologicanalysisofnon-B,non-ChepatocellularcarcinomainJapan:frequentinvolvementofhepatitisBvirus[J].JInfectDis,2000,181(6):1920–1928.[10]HashemiSJ，HajianiE，MasjedizadehA，etal.OcculthepatitisBinfectioninpatientswithcryptogeniclivercirrhosisinsouthwestofiran.JundishapurJ18 重庆医科大学硕士研究生学位论文Microbiol,2015,8(3):e16873.[11]CovoloL,PollicinoT,RaimondoG,etal.OcculthepatitisBvirusandtheriskforchronicliverdisease:Ameta-analysis[J].DigestiveandLiverDisease,2013,45(3):238-244.[12]KondoR,NakashimaO,SataM,etal.PathologicalcharacteristicsofpatientswhodevelophepatocellularcarcinomawithnegativeresultsofbothseroushepatitisBsurfaceantigenandhepatitisCvirusantibody[J].HepatolRes,2014,44(11):1039-1046.[13]Morales-RomeroJ,VargasG,Garcia-RomanR.OccultHBVinfection:afacelessenemyinlivercancerdevelopment[J].Viruses,2014,6(4):1590-1611.[14]ChenL,ZhaoH,YangX,etal.HBsAg-negativehepatitisBvirusinfectionandhepatocellularcarcinoma[J].DiscovMed,2014,18(99):189-193.[15]LeeJJ,KwonOS.OcculthepatitisBvirusinfectionandhepatocellularcarcinoma[J].KoreanJGastroenterol,2013,62(3):160-164.[16]PollicinoT,CacciolaI,SaffiotiF,etal.HepatitisBvirusPreS/Sgenevariants:pathobiologyandclinicalimplications[J].JHepatol,2014,61(2)：408-417.19 重庆医科大学硕士研究生学位论文文献综述隐匿性乙型肝炎病毒感染与肝细胞肝癌关系的研究进展慢性乙型肝炎是肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）发生的主要危险因素已是公认的定论，那么隐匿性乙型肝炎病毒感染（occulthepatitisBvirusinfection,OBI）与HCC的相关性如何，却尚有争议，此文综合国内外临床研究和动物研究结果，总结出：OBI是HCC发生的重要危险因素。OBI保留有显性HBV感染类似的致癌机制，如整合进宿主基因组，顺式激活相关基因或合成蛋白后反式作用于基因组或相关蛋白质，如合成有使肝细胞转化能力的HBxAg和截短了的preS-S蛋白，影响信号通路，使细胞增殖、凋亡失衡。其次，持续存在的低载量病毒可导致轻微但持续的炎症坏死，肝细胞循环坏死、再生，加快肝硬化的形成，最终导致HCC。最后，病毒突变及甲基化修饰也参与HCC的发生。1介绍全世界曾感染过HBV者至少有20亿人，其中慢性HBV感染者至少2.4亿人,HCC每年新发病例超过60万例[1]，HCC作为全世界排名第五常见的肿瘤，在男性中，其病死率继肺癌之后已跃居第二，超过80%发生在非西方国家，其主要危险因素有慢性病毒感染、酒精、铁超载、黄曲霉素B1、代谢因素、水源化学致癌物质和水藻污染、遗传因素、免疫监视功能异常等。在HBV流行地区，大多数HCC由HBV感染引起。HCC在乙肝流行的国家如东南亚、撒哈拉以南非洲发生率更高。HBV已被WHO列为人类主要致癌物质之一。然而，OBI（即HBV-DNA基因组以低载量存在于血液和（或）肝组织中，临床不能检测出血液HBsAg）的致癌性尚不明确，临床中OBI病例不少见，故明确OBI与HCC的关系意义重大。多个研究表明OBI可能会导致肝硬化和（或）进一步的HCC。在这篇文章中，我们就0BI的相关情况及其在HCC中的作用机制做一综述。20 重庆医科大学硕士研究生学位论文2OBI的概况及机制早在20世纪70年代OBI已经被认识到，但是从1999年一篇有里程碑意义的研究发表后其才被进一步广泛了解。检测技术的进步，通过逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）扩增，对总HBVDNA、cccDNA、中间产物前基因组RNA(pregomicRNA,pgRNA)的量都可以比较准确地检测[2]。如前所述，OBI的特点是HBsAg阴性，而在肝组织和（或）血液中可检测到HBV-DNA，典型的OBI其病毒复制活性被强烈地抑制[3]。它可以进一步被分为血清学阳性和阴性。血清学阳性是HBcAb（+），伴或不伴乙肝表面抗体（hepatitisBsurfaceantibody,HBsAb）（+），然而，血清学阴性是两者皆阴性。有部分患者除了HBV-DNA外，血清学标志物全阴性[4]。OBI的流行情况各地不同，与所使用检测方法的特异性及灵敏度不同有一定关系。关于OBI的形成，有很多机制已经被提出，以解释OBI的存在[5-7]。首先，基因突变是HBV感染者中检测不到HBsAg原因之一。HBsAg重要免疫显性区中亲水区的突变可降低免疫识别，即抗原表位改变，转录调控区和编码区突变，如Y100C位点替换，可使病毒复制能力低下和减少HBsAg表达、分泌，S基因G458A、G145R突变影响DNA折叠、信使核糖核酸（messengerribonucleicacid，mRNA）拼接和输出，导致HBsAg不表达，前S1区缺失影响病毒包装，HBsAg滞留在内质网中。Pre-C/C区突变抑制病毒复制。拉米夫定治疗后耐药突变Q563S,V539I,M204I和L180M/M204I可以减少聚合酶对底物的亲和力，降低复制活性。第二，有时HBV-DNA可在急性HBV感染后，HBsAg血清转化为HBsAb后在肝组织中被检测到。这些病人多有针对乙肝核心抗原（hepatitisBcoreantigen,HBcAg）、HBsAg和HBeAg特异性IgM抗体。第三，HBsAg/HBsAb免疫复合物的形成可影响HBsAg的检测。第四，宿主因素如免疫因素，体液免疫和细胞免疫作用于病毒外壳蛋白是主要机制，所以免疫抑制时病毒可以再度活跃。OBI中细胞因子I型干扰素、转化生长因子、肿瘤坏死因子α、白细胞介素均升高，可以抑制病毒复制，CD8+T淋巴细胞、NK细胞和病毒清除有关，维生素D3及其受体在宿主免疫应答中起重要作用（促进单核巨噬细胞产生细胞因子），HBV特异性T淋巴21 重庆医科大学硕士研究生学位论文细胞存在也说明免疫因素参与其中。第五，共同感染因素，如HCV共同感染时可加速HBsAg的清除，影响HBVDNA复制，HCVRNA与HBVDNA是负相关的关系，可能是其核心蛋白通过丝氨酸116和99的磷酸化起作用的，其阻止多聚酶与HBVDNA序列的结合、抑制mRNA的合成、抑制pgRNA的衣壳化，另外非结构蛋白NS2蛋白也参与抑制HBV，它有蛋白水解活性。第六，急性感染后的窗口期。第七，检测HBsAg的技术灵敏度和特异性不高。第八，与cccDNA结合的组蛋白脱乙酰化可以减少P300转录激活因子的聚集，抑制病毒复制，磷酸酯键连接的胞嘧啶鸟嘧啶密集区（regionfullofconnectingcytosineandguaninebyphosphoesterbond，CpG）岛的甲基化修饰可以抑制病毒复制，抑制基因表达，HBVDNA有3个CpG岛，分别是横跨多聚酶区的ATG、S和X位点。最后，cccDNA的持续存在使HBV可以终生存在于宿主体内。HBV基因与宿主基因整合时C区基因丢失，使病毒处于低复制状态长期存在于肝细胞内。3抗HCV抗体阴性肝癌患者中OBI情况表1中近年的7个回顾性研究中[2,8-13]，隐源性HCC患者中，OBI流行率为30.77%到76.2%。HCC中OBI的流行率均明显高于对照组。仅有1个前瞻性研究[14]，结果表明OBI者发生HCC的风险明显高于对照组，并且在多变量分析中，OBI是HCC发生的独立危险因素。在土拨鼠模型中，HsAg阴性的土拨鼠，肝组织中持续低水平的病毒血症可以导致连续的肝损害和HCC的发生[15]。综上，在回顾性研究中，HCC与非HCC相比，前者有更高的OBI流行率。相应地，在前瞻性研究中，OBI中HCC的发生率明显高于HBV-DNA阴性者，这和Shi等的Meta分析的结论是相似的，OBI是HCC发生的重要危险因素，OBI特别是合并其他损伤因素如HCV感染、酗酒时，会加重肝脏损伤[16-17]。22 重庆医科大学硕士研究生学位论文表1HCC中OBI流行率（回顾性研究）Table1PrevalenceofOBIinpatientswithandwithoutcryptogenicHCC对照组OBI流行研究年份国家标本HCC中OBI流行率%P值率%X2=15.55李庆安等[8]2012中国血清30.77（16/52）3.33（2/60）P<0.001Wong等[2]2011中国肝组织72.7（24/33）无无Hassan等[9]2011埃及肝组织76.2（16/21）无无X2=89.24Fang等[10]2009中国血清70.4（95/135）10.6(38/359)P<0.001X2=79.15Chen等[11]2009中国血清40.5（90/222）8（24/300）P<0.001X2=18.53Pollicino等[12]2004意大利肝组织67.6（23/34）17.9(7/39)P<0.001Yotsuyanagi等X2=22.922000日本血清47.6（20/42）2.4(1/42)[13]P<0.0014OBI作为HCC危险因素可能涉及的机制HBV相关性HCC是由直接和间接机制共同作用导致的。首先，间接机制：通过免疫介导的机制，CD8+T淋巴细胞特异性直接杀伤表面有病毒抗原的肝细胞，也有NK细胞、中性粒细胞等炎症趋化的固有免疫作用，同时这些炎症细胞释放趋化因子和细胞因子[7,14]。OBI引起的轻微但持续的炎症会导致反复的细胞坏死和再生，增加肝细胞增殖（高细胞增殖指数是肝癌发生的危险因素）和不典型增生，打破了肝细胞增生、分化、凋亡之间的生理平衡，因此导致纤维化、肝硬化和产生一个致突变的环境[18-19]。Matsuoka和他的同事们在204位有丙肝合并隐匿性乙肝和264位仅感染HCV者中研究了OBI在肝癌中的可能作用，发现前者有更高程度的炎症细胞浸润和肝细胞不规则再生[20]。Covolo等的Meta23 重庆医科大学硕士研究生学位论文分析提示OBI与慢性肝病有关[18]。Wong等在肝癌合并慢性乙肝和OBI中定量分析由cccDNA转录的pgRNA,在这个研究中，在OBI或合并肝癌者中由每个cccDNA分子所产生的pgRNA的拷贝数明显低于慢性乙肝者，这说明在不明原因肝癌合并OBI者中HBV转录活性低[2]。因此，尽管在肝癌中和OBI相关联的病毒复制能力和合成蛋白的能力在很低水平，但仍保持有转录活性。在一个土拨鼠模型中，HsAg阴性的土拨鼠，肝组织中持续低水平的病毒血症可以导致连续的肝损害和肝癌的发生[5]。直接机制：OBI是HBV感染后自然病程之一，一些肝癌患者肝内总的HBVDNA、cccDNA、pgRNA和HBV转录活性与一些HBeAg阴性乙肝相关性肝癌没有明显差别。OBI保留了经典HBV感染后致癌机制[3,14,21-24]。Patricia等的研究结果第一次证明即使血清标志物阴性，非常少量的嗜肝DNA病毒持续存在，都会整合到宿主肝细胞和免疫细胞基因组，保留致瘤潜力[15]。隐匿性乙肝也整合进宿主基因组，85–90%HBV相关的肝癌中可以发现HBV-DNA的整合，大多数整合发生在脆性位点或者是重复区，控制细胞信号转导和细胞凋亡、增殖，插入调节区或编码区的HBV-DNA可顺式改变所表达的蛋白质，整合后基因可表达促进肿瘤发生的蛋白质，异常表达的蛋白质可通过抑制细胞凋亡蛋白酶-3、依赖Fas抗体的细胞凋亡，妨碍DNA修复等，导致细胞凋亡障碍，如HBV-DNA与细胞周期素A整合、端粒酶反转录酶基因位点的整合等，前者使错配或合成不完整的DNA丧失修复时间而直接进入细胞周期引起异常的细胞增殖。整合导致宿主基因重排，宿主基因重排后可以增加宿主的染色体不稳定性，导致染色体缺失（常在相同的位点发生，包括1p,2q,4q,5q,6q,8p,10q,11p,16p,16q,17p和22q）、染色体易位，可能刺激细胞的致癌基因，如HBVpreS/S在3’端截短后整合入宿主基因，编码可以反式激活c-Ha-ras、c-myc及c-fos致癌基因的中表面蛋白，特异性激活c-Raf-1/MEK/Erk2信号转导通路,导致更强的细胞增殖，也可使抑癌基因失活，如HBx与抑癌基因p53结合，促进恶变转化，故整合可改变宿主的基因表达和细胞表型，可反式激活肿瘤发生的信号通路，促进增殖，抵抗生长抑制，浸润组织和转移，促进血管生成（HBxAg可引起血管内皮生长因子的过度表达），改变代谢，抵抗凋亡。组蛋白结构及其修饰的动态变化在调控HBV转录和翻译中也起重要作用。羧基端截短的大或中表面蛋白影响细胞本身信24 重庆医科大学硕士研究生学位论文号通路，有转录激活作用。羧基端截短的HBxAg通过蛋白-蛋白相互作用引起启动子、增强子转录激活，可以激活致癌基因c-myc和c-jun、转换生长因子、转录因子、环磷酸腺苷表达,调控细胞信号转导，细胞增殖、衰老、凋亡，炎症免疫反应，HBx表达促进HBV相关肝癌的发生，一方面通过转录上调p1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ来诱导细胞周期进展,另一方面通过下调Notch1信号通路来抵抗生长抑制作用。王文等发现了如下几种乙肝病毒基因X区相关的高表达蛋白，细胞增殖上调基因（upregulatedgene,URG)4、URG7、URG11、URG12表达的上调因子和下调基因Sui1表达的下调因子，URG4和URG11能够加快肿瘤细胞增殖，URG7具有反抗自然衰老死亡的作用，URG12和Sui1与蛋白翻译有关，在病程中血清中出现多个针对上述5种蛋白的抗体阳性的患者，则发生HCC的风险很高。大表面蛋白转基因鼠能自发性发生肝癌，大表面蛋白通过活化Src/PI3K/Akt信号通路促进HCC发生。另外，PollicinoT等的研究中的肝癌患者血清学阴性、无肝硬化，通过HBV-AluPCR检测整合的X区，其内含有高度保守增强子Ⅱ/核心启动子，基因整合可定位于有分区缺陷的γ同源基因6(partitioningdefective6homologgammagene，PARD6G)的上游，PARD6G在肿瘤组织中有过度表达[25]。Gozuacik等的研究中肝癌患者（无肝硬化，HBsAg-）肝细胞中的cis基因（顺式作用元件）通过基因整合被激活，特别是与HBx相关的肌浆网/内质网Ca2+-ATP酶1（Sarco(endo)plasmicreticulumCa2+-ATPase1，SERCA1）编码基因中cis的激活[6]。这些研究结果为隐匿性乙肝保持了一些在显性HBV感染中所见到的导致肝癌形成的致癌作用提供了证据。肝癌中的有些隐匿性乙肝和病毒变异有关[5,7]，包括有致癌活动的前S2缺陷和（或）核心启动子突变（T1762A、G1764A和A2962G），导致氨基酸改变后，病毒复制活性较野生型高。X区突变菌株，突变后激发细胞增殖，决定肿瘤性转化，没有了野生型凋亡和抗增生的作用，HBX羧基端的截短可上调Wnt-5a基因，该基因在肝癌细胞中表达。preS2突变的II型毛玻璃肝细胞，其LHBs沉积在细胞边缘，有更高的增殖活性，preS突变蛋白会导致环氧酶2和细胞周期素A过度表达,引起肝细胞增生。前S1/S2突变可导致HBsAg滞留在内质网中，使内质网肿胀、氧化应激、DNA损伤，这些会导致严重的肝脏损伤，使肝细胞易发生转化。Sinn等通过随访44位前S区有突变的慢性HBV感染者，平均随访7.2年（1-7.8年不25 重庆医科大学硕士研究生学位论文等），24个发生了肝癌，统计学分析证明前S区突变与肝癌密切相关[26]。Kao等通过研究得出：肝癌组较慢性HBV感染者有更多发生核心启动子和前S区缺失突变，缺失主要集中在前S1的C端和前S2的N端，所有这些缺失包含T和B细胞的表位，其中B细胞表位在前S2第1-6位氨基酸处缺失和分泌功能区的缺失与肝癌密切相关[27]。Chen等表明在肝癌合并隐匿性乙肝者和显性HBV感染合并肝癌者比较，前者中HBV有不同的病毒学特征，例如，在preS2区更频繁地观察到M1I和Q2K，在HBsAg阴性的HCC合并OHB者较HBsAg阳性HCC对照组更频繁观察到增强子II区G1721A的出现[11]。这些突变基因被推荐为肝癌合并OBI有用的病毒学标志物。C基因型S区密码子182是不成熟的终止密码，大大促进了肝癌的进展。肝癌合并OBI者和非OBI者比较，前者有更高频率的HBV高甲基化，而且这有可能导致HBsAg不表达。此外，HBV基因组在肝癌合并隐匿性乙肝者较非肿瘤性肝组织表现出更高的甲基化水平。因此，HBV基因组在不连续的CpG位点高甲基化参与HCC的发生，那些位点在隐匿性疾病肿瘤细胞中循环甲基化。因此，提出DNA甲基化酶的补充连同cccDNA微型染色体和组蛋白的后天修饰会明显抑制OBI的转录和复制。HBVDNACpG岛的甲基化可以上调基因表达[3]。HBx抑制微小核糖核酸（microribonucleicacid,miR）152诱导脱氧核糖核酸甲基化转氨酶（deoxyribonucleicacidmethyltransferase，DNMT）1表达，以DNMT1RNA3’端为靶点,引起mRNA和转氨酶水平明显降低，HBx过度表达可引起DNMT1和DNMT3A升高，HBV感染细胞及肝癌细胞中DNMT1,DNMT3A和DNMT3B均升高。5结论正如表1所揭示和上述讨论的，在大多数调查的研究中，尤其是来自亚洲的研究表明，OBI会增加HCC发生的风险。尽管关于OBI和HCC的关系研究了十余年，关于OBI在HCC发生发展中所起作用的资料仍是有限的，关于发病机理和临床意义仍有很多没有解答的问题，仍需要更多的大样本前瞻性研究。26 重庆医科大学硕士研究生学位论文参考文献[1]CroaqhCM,LubelJS.NaturalhistoryofchronichepatitisB:Phasesinacomplexrelationship[J].WorldJournalofGastroenterology,2014,20(30):10395-10404.[2]WongDK,HuangFY,LaiCL,etal.OcculthepatitisBinfectionandHBVreplicativeactivityinpatientswithcryptogeniccauseofhepatocellularcarcinoma[J].Hepatology,2011,54(3):829-836.[3]Morales-RomeroJ,VargasG,García-RománR.OccultHBVInfection:AFacelessEnemyinLiverCancerDevelopment[J].Viruses,2014，6(4)：1590-1611.[4]ShiY,WuYH,WuW,etal.AssociationbetweenocculthepatitisBinfectionandtheriskofhepatocellularcarcinoma:ameta-analysis[J].LiverInt,2012,32:231–240.[5]HuangX,HollingerFB.OcculthepatitisBvirusinfectionandhepatocellularcarcinoma:asystematicreview[J].JournalofViralHepatitis,2014,21（3）:153–162.[6]PollicinoT,SaittaC.OcculthepatitisBvirusandhepatocellularcarcinoma[J].WorldJGastroenterol,2014,20（20）:5951-5961.[7]KimYS.Definition,diagnosis,andprevalenceofocculthepatitisBvirusinfection[J].KoreanJGastroenterol,2013,62(3):143-147.[8]李庆安,肖清华,刘建湘.隐源性HCC肝硬化与隐匿型乙型肝炎感染关系比较[J].中国医药导刊,2012,14(10):1672-1675.[9]HassanZK,HafezMM,MansorTM,etal.OccultHBVinfectionamongEgyptianhepatocellularcarcinomapatients[J].VirolJ,2011,8(1):90.[10]FangY,ShangQL,LiuJYetal.PrevalenceofocculthepatitisBvirusinfectionamonghepatopathypatientsandhealthypeopleinChina[J].JInfect,2009,58(5):383–388.[11]ChenCH,ChangchienCS,LeeCM,etal.Astudyonsequencevariationsinpre-S/surface,XandenhancerII/corepromoter/precoreregionsofocculthepatitisBvirusinnon-B,non-ChepatocellularcarcinomapatientsinTaiwan[J].IntJCancer,2009,125(3):621–629.27 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重庆医科大学硕士研究生学位论文致谢时间飞逝，转眼间又到了毕业季，3年前的我刚走出大学的校门，位于医学漫漫长路的起点，经过在重庆医科大学3年的专业知识学习和临床轮转，感谢带教老师的谆谆教诲。让我对感染科相关疾病有了更加深入的理解，实现了从课本到临床知识应用的转换，基本掌握了内科各科室常见病、多发病、危急重症的基本诊疗规范，达到轮转要求。感谢我的导师曾爱中教授，他和蔼可亲，学识渊博，临床技能扎实，在我面临选择的十字路口，是他引导我找到了学习的方向，是他每周督促我们学习感染科相关领域研究进展及英文文献，不断充实自己、提升自己，使我上升了一个新台阶。感谢我的师兄师姐、师妹们，在我询问她们任何问题时，她们都是乐于给我解答，让我在学习的路途上少走弯路，让我走得更快、更远，我们是一个和谐、团结、积极乐观向上的团队，大家相互感染，相互学习，共同进步。感谢各位专家百忙之中来聆听我的答辩，对我的毕业论文提出宝贵的意见和建议。感谢我的家人，我远隔家乡来重庆读书，家人的温暖让我更加充满学习的动力，无论我高兴或悲伤，家永远是我最温馨的港湾。30 重庆医科大学硕士研究生学位论文攻读硕士学位期间发表的论文[1]郑洁,曾爱中.隐匿性乙肝与肝细胞肝癌关系的研究进展.重庆医科大学学报,2015,40(3):321-324.[2]郑洁,曾爱中.隐匿性乙肝与肝细胞肝癌关系的系统评价.重庆医科大学学报,2015,40(11):1445-1449.31