资源描述：
《乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤MYC、BCL2基因异常与临床预后分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤MYC、BCL2基因异常与临床预后分析AnalysisofMYC,BCL2geneabnormalitiesandclinicalprognosisinpatientswithDLBCLconcurrentwithhepatitisBvirusinfection作者姓名：刘志何专业名称：内科学指导教师：白欧教授学位类别:医学硕士论文答辩日期：2015年6月3日 前言淋巴瘤起源于淋巴结和淋巴组织，其发生大多与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化的某种免疫细胞恶变有关，是免疫系统的恶性肿瘤。根据组织病理学改变，淋巴瘤可分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkinlymphoma,HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkinlymphoma,NHL）两大类。其中，以NHL为主，占所有淋巴瘤的85%～90%，而NHL中，又以弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuselargeBcelllymphoma,DLBCL）最常见，占NHL的30%～40%。淋巴瘤发病的确切病因尚不清楚，但病毒学说颇受重视，近年来，乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）与淋巴瘤发病之间的关系成为淋巴瘤研究领域的热点，目前已有文献报道HBV是DLBCL发病的潜在病因,同时文献报道乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者临床预后比乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者差。MYC、BCL2基因与DLBCL患者的临床预后密切相关，大多数文献报道伴MYC、BCL2基因异常的DLBCL患者预后差，乙型肝炎病毒阳性DLBCL的不良预后是否与MYC、BCL2基因异常相关是本论文研究的重点。本论文应用荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）技术检测初诊乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的MYC、BCL2基因异常表达情况，并与乙型肝炎病毒阴性患者进行对比分析，同时收集患者的基本临床资料，分析乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组临床特征（性别、年龄、临床分期）和预后相关因素（IPI评分、分子亚型）是否存在差别；进一步探讨乙肝病毒阳性DLBCL患者不良预后是否与MYC、BCL2基因异常表达相关。I 中文摘要乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤MYC、BCL2基因异常与临床预后分析目的：探讨乙型肝炎（乙肝）病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤患者的MYC、BCL2基因异常表达与临床预后相关性。方法：42例初诊弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者，男性26例，女性16例，中位年龄52岁（13～77）；乙型肝炎病毒阳性组17例，乙型肝炎病毒阴性组25例，回顾性分析所有患者的基本临床资料；应用FISH技术对所有患者的病理切片行MYC、BCL2基因检测；分析乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床预后与MYC、BCL2基因异常表达的相关性。实验数据采用SPSS16.0软件分析，P＜0.05有统计学意义。结果：1．基本临床特征性别：乙型肝炎病毒阳性组，男：女为1.8:1.0，乙型肝炎病毒阴性组，男：女为1.5:1.0，两组性别分布无统计学意义（P=0.758）。年龄：乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组均以年龄≤60岁的患者为主，分别为82.4%和84.0%，差异无统计学意义（P=1.000）。临床分期：乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组均以中晚期患者为主，分别为64.7%和52.0%，两组临床分期无显著差别（P=0.414）。2.预后相关因素：IPI分层：乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组IPI≥3分的患者比例分别为41.2%及8.0%，两组中高危/高危患者比例具II 有显著性差异（P=0.029）；分子亚型：乙型肝炎病毒阳性组，non-GCB患者比例为70.6%，高于乙型肝炎病毒阴性组（52.0%），但差异无显著性（P=0.228）。3．MYC、BCL2基因异常：乙型肝炎病毒阳性组，MYC基因异常发生率为23.5%（4/17），BCL2基因异常发生率为29.4%（5/17），其中，MYC基因分离重排发生率为17.6%（3/17），基因缺失发生率为5.9%（1/17）；BCL2基因分离重排发生率为23.5%（4/17），基因缺失发生率为5.9%（1/17）。乙型肝炎病毒阴性组，MYC基因异常发生率为16.0%（4/25），BCL2基因异常发生率为4.0%（1/25），其中，MYC基因分离重排发生率为12.0%（3/25）,基因缺失发生率为4.0%（1/25），BCL2基因异常发生率为4.0%（1/25）。乙型肝炎病毒阳性组，MYC基因异常患者的分子亚型均为non-GCB，而乙型肝炎病毒阴性组，MYC基因异常患者的分子亚型均为GCB。4．生存分析：截至2015年3月，随访超过1年的患者共38例，其中乙型肝炎病毒阳性组13例，乙型肝炎病毒阴性组25例，乙型肝炎病毒阳性组，中位生存时间为39.5个月，乙型肝炎病毒阴性组，中位生存时间为53.7个月。乙型肝炎病毒阳性DLBCL的中位生存时间明显短于乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者，但两组差异无显著性（P=0.931）。结论：1．乙型肝炎病毒阳性组患者临床分期晚、IPI评分高、分子亚型以non-GCB为主。2．乙型肝炎病毒阳性组MYC、BCL2基因异常发生率明显高于乙型肝炎病毒阴性组。3.与伴MYC基因异常的乙型肝炎病毒阴性DLBCL不同，伴MYC基因异常的乙型肝炎病毒阳性DLBCL可能主要来源于non-GCB，提示MYCIII 基因异常导致B细胞激活，可能与乙型肝炎病毒阳性DLBCL的发病机制相关。4.乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者生存期短、预后差，原因可能与其临床分期晚、IPI评分高、分子亚型以non-GCB为主和MYC、BCL2基因异常发生率高有关。关键词：弥漫大B细胞淋巴瘤，荧光原位杂交，乙肝病毒，MYC，BCL2IV AbstractAnalysisofclinicalcharacteristicsandMYC、BCL2geneabnormalitiesinpatientswithDLBCLconcurrentwithhepatitisBvirusinfectionObjective:ToinvestigatetheclinicalcharacteristicsandMYC,BCL2geneabnormalitiesinpatientsdiagnosedwithDLBCLconcurrentwithHepatitisBvirusinfection.Methods:42patientswithDLBCLwereenrolledinthestudy.26patientsweremale,16patientswerefemale;themedianageof42patientswas52years(13～77years);Of42patientswithDLBCL,17patientswithhepatitisBvirusinfection(groupA)and25patientswithouthepatitisBvirusinfection(groupB).Weretrospectivelyanalyzedclinicalcharacteristicsof42patientswithDLBCL.MYC,BCL2geneabnormalitiesofpatientswithDLBCLwereinvestigatedbyfluorescenceinsituhybridizationonformalin-fixedandparaffin-embeddedtissue.ToinvestigatewhetheradvancedclinicalprognosisofDLBCLswithHBVinfectionwereassociatedwithMYCandBCL2geneabnormalities.ThedataofthestudywereanalyzedbySPSS16.0,andP＜0.05wasregardedwithasignificantlydifference.Results:1.Clinicalcharacteristicssex:maletofemale,ingroupAandgroupB,was1.8to1.0and1.5to1.0,respectively,therewasnosignificantlydifferencebetweentwogroups(P=0.758).age:theratiosofpatientswithage≤60years,ingroupAandgroupB,was82.4%and84.0%,respectively,therewasalsonoV significantlydifferencebetweentwogroups(P=1.000).clinicalstages:patientswithadvancedclinicalstageswerepopularbetweentwogroups,theratios,ingroupAandgroupB,was64.7%and52.0%respectively,therewasalsonosignificantlydifference(P=0.414).2.FactorsassociatedwithprognosisIPIscore:theratiosofpatientswithIPI≥3,ingroupAandgroupB,was41.2%and8.0%,respectively,therewassignificantlydifference(P=0.029)。Subgroup:patientswithnon-GCBwereprevailingbetweentwogroups,theradios,ingroupAandgroupB,was70.6%and52.0%respectively,therewasnosignificantlydifference(P=0.228).3.MYC,BCL2geneabnormalities:IngroupA,therewere23.5%(4/17)patientswithMYCgeneabnormalitiesand29.4%(5/17)patientswithBCL2geneabnormalities,ofthosepatientswithMYCgeneabnormalities,17.6%(3/17)caseswithMYCgenebreakapartrearrangementand5.9%(1/17)casewithMYCgenedeletion;ofthosepatientswithBCL2geneabnormalities,23.5%(4/17)patientswithBCL2geneabnormalitiesand5.9%(1/17)casewithBCL2genedeletion.IngroupB,therewere16.0%(4/25)patientswithMYCgeneabnormalitiesand4.0%(1/25)patientswithBCL2geneabnormalities,ofthosepatientswithMYCgeneabnormalities,12.0%(3/25)caseswithMYCgenebreakapartrearrangementand4.0%(1/25)caseswithMYCgenedeletion;onepatientwithBCL2geneabnormalitieswasreferredtothepatientwithBCL2genebreakapartrearrangement.IngroupA,4patientswithMYCgeneabnormalitieswerenon-GCB;while4patientswithMYCgeneabnormalitieswereGCBingroupB.4.AstoMarch,2015,therewere38DLBCLsfollowedupmorethan1year.Ofthose,13caseswereingroupAand25caseswereingroupB.Themediansurvivalofpatients,ingroupAandgroupB,was39.5monthsand53.7months,respectively,therewasnodifferencebetweentwogroupsforsurvivaltime(P=0.931).VI Conclusions:1.DLBCLswithHBVinfectionpresentedadvancedclinicalstage,highIPIscoreandprevalentnon-GCBsubset.2.TheratioofMYCandBCL2geneabnormalitiesingroupAwassignificantlyhigherthanthatingroupB.3.DifferentfromDLBCLswithMYCgeneabnormalitiesingroupB,DLBCLswithMYCgeneabnormalitiesingroupAmaybemainlyderivedfromnon-GCB,whichindicatedMYCgeneabnormalitiesmakingBcellactivatingmaybeassociatedwiththepathogenesisofDLBCLswithHBVinfection.4.Dismalsurvivalandadverseprognosisofpatientsmaybeassociatedwithadvancedclinicalstage,highIPIscore,prevalentnon-GCBsubsetandhighincidenceofMYCandBCL2geneabnormalitiesingroupA.Keywords:diffuselargeBcelllymphoma,fluorescenceinsituhybridization,hepatitisBvirus,MYC,BCL2VII 目录第1章绪论..............................................1第2章综述..............................................32.1弥漫大B细胞淋巴瘤..........................................................................32.2弥漫大B细胞淋巴瘤分子亚型..........................................................52.3MYC基因..............................................................................................62.4BCL2基因..............................................................................................92.5我国乙型肝炎病毒流行病学...............................................................102.6乙型肝炎病毒感染与弥漫大B细胞淋巴瘤....................................112.7间期荧光原位杂交技术.......................................................................12第3章材料与方法...........................................143.1材料来源...............................................................................................143.2试剂与来源...........................................................................................143.3主要设备...............................................................................................153.4实验方法...............................................................................................163.4.1制片.................................................................................................163.4.2脱蜡.................................................................................................163.4.3预处理.............................................................................................163.4.4蛋白酶处理.....................................................................................173.4.5PathVysio共变性及洗脱流程.......................................................173.5MYC、BCL2基因检测结果判定......................................................183.6弥漫大B细胞淋巴瘤预后相关因素...............................................203.7乙型肝炎病毒感染的结果判定..........................................................203.8随访......................................................................................................203.9统计学方法..........................................................................................20VIII 第4章结果.............................................214.1临床资料...............................................................................................214.2MYC、BCL2基因异常表达...............................................................234.2.1乙型肝炎病毒阳性与阴性组MYC、BCL2基因表达................234.2.2乙型肝炎病毒阳性与阴性组基因异常与分子亚型分析.............244.3生存分析..............................................................................................244.3.1乙型肝炎病毒阳性与阴性组总体生存分析...............................244.3.2MYC基因异常表达与生存分析................................................254.3.3BCL2基因异常表达与生存分析................................................274.4乙型肝炎病毒阳性与阴性组不良预后因素分析..............................28第5章讨论.............................................295.1乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤临床分期与预后............295.2乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤IPI与预后.....................305.3乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤non-GCB与预后..........315.4乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤MYC基因与预后...........325.5乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤BCL2基因与预后........335.6小结.......................................................................................................335.7研究瞻望................................................................................................34第6章结论.............................................35参考文献.....................................................36作者在学期间所取得的科研成果.................................43致谢.....................................................44IX 英文缩略词表HLHodgkin’slymphoma霍奇金淋巴瘤NHLnon-Hodgkin'slymphoma非霍奇金淋巴瘤DLBCLdiffuselargeB-celllymphoma弥漫大B细胞淋巴瘤FLfollicularlymphoma滤泡淋巴瘤EBEpstein-BarrvirusEB病毒HHV-8humanherpesvirus-8Kaposi肉瘤病毒HBVhepatitisBvirus乙型肝炎病毒HCVhepatitisCvirus丙型肝炎病毒FISHfluorescenceinsituhybridization荧光原位杂交IPIinternationalprognosticindex国际预后指数GEPgeneexpressionprofile基因表达谱GCBgerminalcenterBcells生发中心细胞ABCactivatedBcells活化B细胞GCgerminalcenter生发中心WHOworldhealthorganization国际卫生组织OSoverallsurvival总生存时间LDHlacticaciddehydrogenase乳酸脱氢酶β2-MGbeta2-microglobulinβ2-微球蛋白aaIPIageadjustedinternationalprognostic年龄调整后的国际预index后指数X 第1章绪论淋巴瘤起源于淋巴结和淋巴组织，其发生大多与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化的某种免疫细胞恶变有关，是免疫系统的恶性肿瘤。临床以无痛性、进行性淋巴结肿大为特征，常伴有发热、盗汗、消瘦、肝脾肿大，晚期可伴有贫血、血小板少和恶液质等表现。淋巴瘤根据病理不同分为霍奇金淋巴瘤（Hodgkinlymphoma,HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkinlymphoma,NHL）。其中，以NHL为主，占85～90%，NHL又据细胞来源不同，将NHL分为B细胞淋巴瘤、T和NK细胞淋巴瘤。各亚型在不同年龄的构成比不同，成人B细胞NHL占85%，T细胞淋巴瘤来源约占5%；儿童B-NHL占35%，而T-NHL占65%。而在NHL中，弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuselargeBcelllymphoma,DLBCL）是最常见的病理类型，约占NHL的30%-40%。淋巴瘤发病的确切病因至今尚不清楚，但病毒学说颇受重视。目前研究认为Epstein-Barr(EB)不仅与HL存在密切关系，而且也是移植后淋巴瘤和AIDS相关淋巴瘤的病因。Burkitt淋巴瘤具有明显地域性，非洲儿童Burkitt淋巴瘤组织传代培养中可分离出EB病毒；80%以上的患者血清中EB病毒抗体滴度明显增高，而非Burkitt淋巴瘤患者病毒抗体滴度增高者仅为14%；普通人群病毒抗体滴度明显增高者发生Burkitt淋巴瘤的机会也明显增多,支持EB病毒感染与Burkitt淋巴瘤的发病有关。日本的成人T细胞白血病/淋巴瘤存在明显的家族聚集现象，且伴地区性流行。20世纪70年代后期，一种逆转录病毒人类T淋巴细胞病毒Ⅰ型（HTLV-I），被证明是成人T细胞白血病/淋巴瘤的病因。另一种逆转录病毒HTLV-Ⅱ近来被认为与T细胞皮肤淋巴瘤（蕈样肉芽肿）的发病有关。Kaposi肉瘤病毒（humanherpesvirus-8，HHV-8）被认为是原发体腔的淋巴瘤的病因。合并HCV感染的边1 缘区淋巴瘤（hepatitisCvirus，HCV），经干扰素和利巴韦林治疗HCV-RNA转阴时，淋巴瘤可获得部分或完全缓解。幽门螺杆菌抗原的存在与胃MALT淋巴瘤发病有密切的关系，抗幽门螺杆菌治疗可改善其病情，幽门螺杆菌可能是该类淋巴瘤的病因。近年来，乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染与淋巴瘤发病率之间的关系成为研究的热点，目前已有文献报道HBV是DLBCL发病的潜在病因，同时文献报道乙肝病毒阳性DLBCL患者临床预后差于乙肝病毒阴性DLBCL患者。DLBCL属B细胞肿瘤范畴。B细胞的发育起始于骨髓内的前体B淋巴母细胞，后者继续分化成为幼稚B细胞而进入血液循环。淋巴结是B细胞遭遇抗原的主要部位，幼稚B细胞在此植入初级滤泡及次级滤泡的套区，在初级免疫反应较晚阶段及次级免疫反应中，这些细胞在抗原刺激下经历母细胞转化并转入生发中心，在生发中心通过MYC、BCL2及BCL6基因的上调及下调来促进B细胞的分化和成熟，而在B细胞分化成熟过程中，基因异常可能会导致淋巴瘤的发生，目前研究发现与DLBCL患者临床预后密切相关的基因主要有MYC、BCL2基因，文献报道，伴MYC和（或）BCL2基因异常的DLBCL患者预后差。本论文应用荧光原位杂交（flurorescenceinsituhybridization,FISH）技术检测初诊DLBCL患者的MYC、BCL2基因异常表达情况，并对所有患者规律随访，同时收集患者的基本临床资料，回顾性分析乙肝病毒阳性组与乙肝病毒阴性组临床特征（性别、年龄、分期）和预后相关因素（IPI评分、分子亚型）是否存在差别；进一步探讨乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者不良预后是否与MYC、BCL2基因异常表达相关。2 第2章综述乙肝病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤临床研究进展2.1弥漫大B细胞淋巴瘤在西方国家，DLBCL是最常见的成人NHL，约占成人淋巴瘤的三分之一。DLBCL为侵袭性淋巴瘤，初诊未经治疗的DLBCL患者的中位生存时[1]间短于1年。因大剂量化疗不增加疗效，反而增加治疗的毒性,所以环磷酰胺、多柔比星、长春新碱及泼尼松（CHOP）联合化疗方案是多年来治疗[2]DLBCL的基石方案。虽然，大部分DLBCL患者起初对含蒽环类药物的[2]化疗方案反应良好，但是，最终仅有不到半数的DLBCL患者被治愈。虽然，R-CHOP方案能使低危和低中危组患者＞70%获得治愈，但是，仍有30%的年轻高危患者不能获得治愈，这部分病人，通过提高化疗剂量与强度，以及自体造血干细胞移植，仍不能改善预后，主要原因可能与疾病异质性、不同的分子亚型及特殊的基因异常表达相关。目前DLBCL患者的治疗选择主要以传统的AnnArbor分期为导向，该分期系统最初是用来评价HL患者[3]的预后，而非NHL患者的预后，所以该分期系统在评价NHL预后方面并[4]不十分准确，为了准确预测NHL患者的预后，国际NHL协作组提议采用含5个独立预后因素（年龄、AnnArbor分期、乳酸脱氢酶、体能状态及结外器官受累数目）的国际预后指标（InternationalPrognosticIndex,IPI）来评价NHL患者的预后，依据IPI标准，将DLBCL患者细分为低危组（≤1个不良预后因子）、低中危组（2个不良预后因子）、中高危组（3个不良预后因子）和高危组（≥4个不良预后因子）(见表2.1)，不同危险组预计5年总3 [5]生存率分别为73%、51%、43%和26%（见图2.1）。IPI在DLBCL患者[6,7]的预后评价作用相继被多项研究证实。表2.1DLBCL国际预后指数危险分层图2.1DLBCL不同IPI危险组生存时间包括IPI预后评估系统在内的所有临床预后评估模型均不能有效地对所有NHL患者进行准确的预后评估。因为，预后评分一致的NHL患者中，4 临床预后仍然存在显著差异，这种现象可能与患者间存在基因异质性有关，已有文献报道基因异常可导致疾病侵袭性增高和肿瘤进展，最终影响患者的临床预后。目前DLBCL不良预后因素繁多，现仅对DLBCL分子亚型、MYC基因、BCL2基因进行简述。2.2弥漫大B细胞淋巴瘤分子亚型DLBCL是一群临床预后具有显著异质性的B细胞肿瘤。根据基因表达谱（geneexpressionprofile,GEP）的不同，可将DLBCL分为生发中心型（germinalcenterBcells,GCB）、活化B细胞型（activatedBcells,ABC）及[8-10][11,12]不能分类型三种分子亚型，相关文献报道，GEP分类中GCB亚型的临床预后明显优于ABC亚型，R-CHOP方案治疗后，3年OS为84%vs56%(P=0.001);5年OS为75%vs30%。虽然，基因芯片技术对DLBCL亚型分析敏感性高、特异性强，但该技术费用高、耗时长，目前基因芯片技术临床应用受限。联合应用多种抗GCB和non-GCB相关特异性蛋白的单克隆抗体进行亚型分类较为普遍，如Hans法、Choi法、Muris法、Nyman法、Natkunam法及Tally法等，目前广泛采用Hans法和Choi法对DLBCL进行亚型分类，本文采用Hans法对DLBCL进行亚型分类，分类标准见图2.2。图2.2DLBCL分子亚型分类（Hans法）[13]Banz等探讨了109例不同分子亚型（Hans法）初诊DLBCL的生存情5 况，结果发现GCB型DLBCL患者的总生存时间明显优于non-GCB型DLBCL[14]患者（如图2.3）；Habara等探讨了39例DLBCL不同分子亚型（Hans法）患者的生存情况，结果发现GCB型DLBCL患者的无进展生存时间明显优于non-GCB型DLBCL患者。综上可知，non-GCB型DLBCL患者临床预后较GCB型DLBCL患者差。图2.3不同分子亚型DLBCL患者生存情况2.3MYC基因MYC基因位于8号染色体长臂（8q24），其编码具有调节细胞生长和增殖功能的转录因子Myc蛋白。细胞转录层面，MYC基因调控大约10%至15%的人类基因，主要涉及细胞生长与增殖、DNA复制、蛋白质的生物合成和能量代谢等方面。MYC基因促进细胞周期从G0期向S期过渡，并且直接或间接的促进CCND2及CDK的表达和抑制细胞周期抑制物的表达[15-18]，最终起到调控细胞周期的作用。伴MYC基因异常的侵袭性淋巴瘤多数来源于生发中心（germinalcenter，GC）细胞，但是，MYC基因在GC形成及维持过程中的作用近期6 [19,20]才被阐明。MYC基因在GC形成初期的成熟B细胞和GC亮区中的部分亚群B细胞中表达。然而，MYC基因在高增殖状态的GC暗区却不表达，这种仅在某些B细胞亚群中表达MYC基因的现象解释了为何先前有些临床试验试图采用体积较大的GC暗区观察MYC表达而最终失败的原因。在GC形成的早期阶段，MYC基因在部分B细胞表达BCL6基因前表达暂时性上调，这种现象似乎是抗原和T细胞最初相互作用诱导产生的，而抗原和T细胞之间的相互作用对于GC的形成是至关重要的，因为抗原与T细胞之间的相互作用被废除后，GC就完全消失了。在GC形成的后期阶段，BCL6基因表达上调，通过直接与MYC基因的启动子结合来抑制MYC基因的表达。MYC基因与BCL6基因表达调控之间的转换与GC暗区的形成密切相关，此时滤泡母细胞在GC暗区转化为高增殖状态的中心母细胞。MYC基因在亮区活化细胞中重新表达，并上调NF-kB和IRF4，下调BCL6基因的表达。MYC基因的再次上调仍然依赖于抗原与T细胞之间的相互作用。亮区中MYC基因阳性细胞似乎是一群对BCR具有选择性的、高亲和力的B细胞，其重新进入GC的暗区进行细胞分裂并进一步获得免疫球蛋白体细胞高频突变；而亮区中MYC基因阴性细胞则可能主要以记忆性B细胞或前体浆母细胞存在于GC；在亮区MYC基因阴性细胞中诱导产生的BLIMP1一方面促进浆细胞的分化，另一方面则通过结合MYC基因启动子[21]来抑制MYC基因的表达。由于GC暗区细胞不表达MYC基因，所以对于GC暗区细胞如何保持高增殖状态的机制提出了质疑。目前有关文献利用GEP技术分别对GC暗区和亮区的细胞进行了研究，研究结果发现暗区和亮区细胞在转录水平存在明显不同。功能强大的转录因子TCF3（E2A）在[22]GC暗区高表达，其上调对GC暗区发挥功能具有重要作用的CCND3和[23]E2F2基因的表达，最终促进细胞增殖。有趣的是，TCF3诱导产生自身[24]负调控因子ID3，而后者是MYC基因的靶点，这些成分可能形成了一个7 具有调控GC暗区和亮区细胞过渡功能的自我调节环路。ID3有助于衰减暗区细胞向亮区转移的过程。亮区MYC基因的表达依赖于ID3因子。细胞分化过程中，任何涉及MYC基因调控环节出现问题，均有可能导致淋巴瘤的发生。t(8;14)(q24;q23)易位（MYC基因易位并排于IGH启动子[25]附近）首次发现于淋巴系肿瘤患者。该易位基因几乎可在所有的地方性Burkitt淋巴瘤患者中发现；特点介于DLBCL及BL的非典型淋巴瘤患者中，约30%-50%的患者伴有该易位基因；还有小部分非特指型DLBCL伴有该易位基因。在非选择性DLBCL患者中，MYC基因重排可见于5%-10%的[26-31]患者，在MYC重排阳性的DLBCL患者中，大约又有20%-30%的患者[32-34]同时存在BCL2和（或）BCL6基因异常，即所谓的双重打击淋巴瘤。[25,26]临床预后方面，伴MYC基因异常的淋巴瘤患者，采用类CHOP样或[28,35]R-CHOP方案化疗效果均不佳（见图2.4）；双重打击淋巴瘤患者，其病[27,32,34,36]情进展快，预后极差，生存期一般短于6个月。+-图2.4MYC与MYCDLBCL患者生存情况8 2.4BCL2基因BCL2基因位于18q21.3，其编码BCL2家族中的BCL2抗凋亡蛋白，[37]该基因于20世纪80年代中期首次在伴t(14;18)易位的患者中发现，导致此易位的原因可能是由于骨髓B淋巴细胞中的IG基因在VDJ重排过程中发生错误编排所致。伴该易位的肿瘤性B淋巴细胞持续表达BCL2抗凋亡蛋白，然而，在正常B细胞分化过程中，GC中的B淋巴细胞不表达BCL2抗凋亡蛋白。GC中绝大部分B淋巴细胞经历细胞凋亡阶段，仅有少部分亲和力高的B淋巴细胞逃避了凋亡，而再次表达BCL2蛋白，这些存活下来的B淋巴细胞作为记忆性B细胞从次级淋巴滤泡中迁出，定植于淋巴结的边缘区。相反，伴t(14;18)易位的肿瘤性B淋巴细胞则具备了抗凋亡的特性，并在GC中呈高增殖状态。如此，t(14;18)易位的病理作用是高表达BCL2[38]抗凋亡蛋白，导致细胞在转录调控层面出现错误。然而，即使处于异常转录状态，BCL2自身的功能和处于正常转录状态时一致。值得注意的是，淋巴瘤细胞表达BCL2蛋白是十分常见的，甚至在无t(14;18)易位的患者中也可见到BCL2蛋白的表达。BCL2基因经常易位至IGH附近，形成经典的t(14;18)(q32;q21.3)易位；罕见易位至IGK及IGL附近，形成[39]t(2;18)(p11;q21.3)及t(18;22)(q21.3;q11)易位。t(14;18)易位见于70-95%的[40,41][42,43]滤泡细胞淋巴瘤及20%-30%的DLBCL。目前，BCL2基因重排和BCL2过蛋白表达对DLBCL患者的预后指导[31,44-49]意义存在争议。大多数文献结果显示：伴BCL2基因重排和BCL2蛋白过表达的DLBCL患者，其临床预后差（见图2.5）；Barrans等和Tang等[50,51]人也同样发现伴有BCL2基因重排的DLBCL患者生存期差；然而，另[52,53]有部分文献报道，伴BCL2基因重排的DLBCL患者，其预后较好。9 +-图2.5BCL2与BCL2DLBCL生存情况2.5我国乙型肝炎病毒流行病学乙型肝炎病毒简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb。根据目前所知，HBV就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒肝炎性疾病。1965年由Danna发现，其直径为42纳米。颗粒分为外壳和核心两部分。我国属乙肝病毒（HBV）感染流行区（见图2.6），据最新调查，我国乙肝患病率为34.28%,乙肝表面抗原患病率为7.18％，据此推算我国仍有乙肝表面抗原携带者9300万人，全国已感染过乙肝病毒的近5亿人，估计全国现有慢性乙肝病人约2000万例，其中一部分人将发展成为肝硬化、肝癌、淋巴瘤等疾病。10 图2.6世界慢性乙肝感染分布图（引自http://tieba.baidu.com/p/2580057951）2007年，中山大学徐瑞华教授研究了非霍奇金淋巴瘤与乙肝的关系，结果发现B-NHL患者乙肝表面抗原患病率高达30.2%。2011年中国肿瘤登记年报数据显示，我国淋巴瘤发病率为6.43/10万，且发病率每年以4%的速度增长，据此估计，2014年我国淋巴瘤发病率约为7.55/10万，新发B-NHL病例约7.44万，新发B-NHL中，约1.80万DLBCL患者乙肝表面抗原阳性。因此，关注乙肝阳性DLBCL的临床特点与预后具有重要意义。2.6乙型肝炎病毒感染与弥漫大B细胞淋巴瘤淋巴瘤的确切致病因素不详，但病毒学说颇受重视。近年，乙肝与淋巴瘤发病之间的关系成为国内外研究的热点。[54]国外Dalia等利用Meta分析方法对乙肝与淋巴瘤的发病风险进行了[55]探讨，结果发现乙肝高发国家的DLBCL发病率增高；Marcucci等对肝炎11 与淋巴瘤的流行病学、肿瘤发病机制及治疗策略进行了综述，结果与Dalia报道数据一致，随访14年，乙肝表面抗原阳性患者，其NHL的发病风险为1.74。[56]我国王健民等探讨了乙肝与淋巴瘤患者临床预后之间的关系，结果发现乙肝阳性NHL患者的PFS及OS明显短于乙肝阴性NHL患者（P＜[57]0.001）；徐瑞华等分析了81例乙肝阳性DLBCL患者的临床预后，结果发现乙肝阳性DLBCL患者的临床预后差于乙肝阴性DLBCL患者的临床预[58]后（55.8月vs66.8月）；谢万灼等分析了90例乙肝阳性DLBCL患者的临床预后，结果发现乙肝阳性DLBCL患者的OS率明显低于乙肝阴性DLBCL患者（62.2%vs76.2%，P=0.018）。综上，乙型肝炎病毒与DLBCL的发生密切相关，乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者临床预后差于乙肝病毒阴性DLBCL患者，进一步深入研究将为临床开通新的发展方向。2.7间期荧光原位杂交技术间期荧光原位杂交技术是指利用一段荧光素标记的、已知核苷酸排列顺序的DNA序列去检测待测基因或待测DNA序列的分子生物学方法。该[59,60]检测方法于1969年相继被两个科研机构独立开发应用。该检测技术的优点是可在不改变细胞形态和内部原有结构的基础上检测待测基因的核苷酸序列。自从那时起，间期原位杂交技术通过不断改良陆续被应用于染色体进化、恶性肿瘤及白血病的核型分析及广泛物种的细胞遗传学科学研究方面。1989年，DeLong首次应用荧光素标记的寡核苷酸探针检测单核细胞生物。荧光素标记的探针与放射性核素标记的探针相比，具有安全性高、分辨率高且操作步骤简便的优点。此外，采用多种不同波长荧光素标记的探针可同时检测多个靶基因。在过去的十年间，间期荧光原位杂交技术凭借其灵敏度高且检测周期短的特点，使其在物种进化论、生态学、诊断学12 及环境学研究方面成为强有力的检测工具。目前，间期荧光原位杂交技术在淋巴瘤的辅助诊断和预后评价方面具有举足轻重的作用。例如，在鉴别滤泡淋巴瘤和套细胞淋巴瘤时，可应用该技术行cyclinD1检测；在评价DLBCL患者预后时，可通过检测BCL2、MYC、IGH等基因表达情况，预测患者的生存期。FISH凭借其高灵敏性、高特异性、高安全性及操作周期短的特点被广泛应用于临床及科研的各个领域。本论文应用MYC、BCL2双色分离重排探针检测基因的扩增、分离及缺失。虽然本论文应用的双色分离重排探针可有效检测基因的分离，但不能明确检测的基因分离后与其重排的伙伴基因，所以本论文不能明确伴有一个以上基因分离的患者是否为双重打击淋巴瘤或多重打击淋巴瘤。13 第3章材料与方法3.1材料来源依据2008年世界卫生组织（worldhealthorganization;WHO）关于淋巴造血组织肿瘤分类诊断标准，根据组织形态学、免疫组织化学及外科综合检测结果随机筛选2009年1月至2014年12月的初诊乙肝病毒阳性DLBCL患者17例，初诊乙肝病毒阴性DLBCL患者25例,所有患者均接受R-CHOP或CHOP化疗方案。另外筛选20例淋巴细胞炎性增生患者的病理切片组织建立BCL2、MYC基因的检测阈值。3.2试剂与来源试剂来源BCL2双色分离重排探针美国雅培公司MYC双色分离重排探针美国雅培公司乙肝两对半ELISA试剂检测盒广州健仑生物科技有限公司蛋白酶K储存液20mg/ml美国sigma公司（1）缓冲储存液20×SSC，pH5.3；（2）缓冲液2×SSC，pH7.0±0.2；（3）变性液70%（v/v）甲酰胺/2×SSC,pH7.0-8.0（4）乙醇溶液（70%，85%）（5）甲酰胺洗涤液50%（v/v）甲酰胺/2×SSC,pH7.0-8.0（6）洗涤液0.1%NP-40/2×SSC，pH7.0±0.2；（7）快速洗涤液0.3%NP-40/0.4×SSC，pH7.0-7.5（8）蛋白酶K工作液主要试剂配制：（1）探针配制：探针2μl，杂交缓冲液7μl，去离子水1μl，离心1-314 秒，涡旋混匀后再次短暂离心。将装有以上探针混合物的离心管置于73℃-78℃水浴箱中变性5min后，迅速置于45℃~50℃水浴箱中，避光，杂交前取出。（2）20×SSC（pH5.3）：柠檬酸钠44g，氯化钠88g，去离子水400ml充分溶解，室温下用12MHCL调节pH值至5.3，然后用去离子水定容至500ml，高压灭菌，2～8℃保存。试剂配制6个月，或出现混浊丢弃。（3）2×SSC（pH7.0±0.2）：20×SSC100ml，去离子水800ml充分混匀，室温下10MNaOH调节pH值至7.0±0.2，去离子水定容至1L，2-8℃保存。试剂配制6个月，或出现混浊丢弃。（4）乙醇（70%，85%）：将700ml、850ml无水乙醇分别用去离子水稀释1L，2-8℃保存。使用超过1个月或用于20张玻片杂交后丢弃。（5）0.1%NP-40/2×SSC洗涤液（pH7.0±0.2）：NP-400.4ml，20×SSC40ml，去离子水300ml充分混匀，室温下10MNaOH调节pH值至7.0±0.2，去离子水定容至400ml，2-8°保存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊立即丢弃。（6）0.3%NP-40/0.4×SSC（pH7.0-7.5）：NP-403ml，20×SSC20ml，去离子水950ml充分混匀，室温下10MNaOH调节pH值至7.0～7.5，去离子水定容至1L，2～8℃保存。试剂配制6个月，或出现混浊丢弃。（7）蛋白酶K工作液（200μg/ml）：量取0.4ml蛋白酶K储存液（20mg/ml）溶于40ml2×SSC（pH7.0±0.2）溶液中。3.3主要设备名称产家电热恒温培养箱美国thermo公司电热恒温水浴箱（H.SWX-420133）低温高速离心机德国Eppendorf公司15 Thermobrite原位杂交仪美国自然基因科技公司光学显微镜日本OlympusCH公司FISH电脑分析系统戴尔，FISH2.0软件荧光显微镜OLYMPUSBX-5烤片机KPG-1AFiveeasyPH值指示剂瑞士METTLERTOLEDO公司3.4实验方法于我院病理科选取42例初诊DLBCL患者及10例淋巴结炎性增生患者的术后或穿刺活检的石蜡包埋组织切片，分别对其进行MYC、BCL2基因检测。3.4.1制片制片（该片经福尔马林固定24-48小时）（1）使用切片机切下4－5μm的石蜡片；（2）石蜡片置于40℃的超纯水中；（3）将石蜡片置于事先预备的玻片（positivelycharged）上；（4）风干；（5）56℃烘烤过夜（10-20h）。3.4.2脱蜡（1）室温下将切片置于二甲苯中10min，更换新的溶液重复两次；（2）室温下，使用纯乙醇脱水5min；（3）100％，85％，70％乙醇复水各2min。3.4.3预处理（1）纯水水煮95℃，20min（一定要提前预热）；（2）2×SSC（pH7.0）2min；16 3.4.4蛋白酶处理（1）取出切片，小心吸去玻片上的残余溶液；（2）置于蛋白酶溶液中37℃5-10min（取200μl蛋白酶K存储液于37℃40ml2×SSC（pH7.0）中，根据玻片本身情况可以消化10-30min）；（3）2×SSC（pH7.0）2min；（4）70％、85％，100％乙醇脱水各2min；（5）室温干燥玻片（5min）。3.4.5PathVysio共变性及洗脱流程探针制备：1．探针2μl，杂交缓冲液7μl，去离子水1μl，离心1-3秒，涡旋混匀后再次短暂离心。将装有以上探针混合物的离心管置于73℃-78℃水浴箱中变性5min后，迅速置于45℃-50℃水浴箱中，避光，杂交前取出；2．低速离心-旋转混合-离心探针各2－3秒（注意避光）。变性杂交：1．加10μl（视检测面积和样本本身特性）的探针混合液至杂交区，迅速盖上盖玻片，封胶（不得有气泡）2．将封好的片子放入杂交仪中，盖紧盖子，共变性：75℃，5min杂交孵育14－18小时。杂交后洗涤：1．第一个洗缸准备：Coplin染色缸中加入杂交后洗液（2×SSC/0.3%NP-40），放置至室温；2．第二个洗缸准备：在Coplin染色缸中（2×SSC/0.3%NP-40）加入杂交后洗液。将染色缸放入72±1℃的水浴中30min以上，使杂交后洗液的温度达到72℃±1℃。每批使用前都必须确保杂交后洗液的温度达到17 72℃±1℃。两种洗液使用过一天后就应丢弃；3．挪去树胶，放入室温的第一缸杂交后洗液浸泡除去盖玻片（1-2min）；4．将片子放入73℃±1℃装有杂交后洗液的Coplin染色缸中，漂洗2min。不要同时操作4片以上；5．注意：在洗浴前不能揭去盖玻片。当最后一片进入洗液后，开始计时2min；6．在暗处风干。复染：1．加入10μl（根据检测面积适量调整）DAPI复染，盖上盖玻片。-20℃复染15min；2．结果观察（注意：镜油的渗入会极大的影响荧光信号）；3．在暗处-20℃保存杂交玻片。3.5MYC、BCL2基因检测结果判定1、在HE染色的病理切片上找到癌细胞区域；2、在低倍镜（×10）下，在FISH检测标本上找到与HE染色病理切片上相对应的癌组织区域；3、在×40物镜下整体扫描病理切片，观察病理切片基因表达是否存在异质性问题，或病理标本变性杂交是否符合标准（合格的病理标本75%的细胞核中均有荧光信号）；4、在油镜（×100）下计数癌细胞基因表达情况；5、随机计数100个细胞，记录每个癌细胞基因表达情况；6、在计数癌细胞基因表达类型时，应选择背景清晰、细胞核大小一致、核边界完整、核孤立且无重叠的区域进行细胞计数；7、同时应准确细致观察位于同一细胞不同平面上的信号分布以免遗漏，并注意避免G2期细胞内基因拷贝数目特征可能导致的技术误差。在荧光显微镜下找到癌组织区域，计数100个癌细胞，观察每个细胞18 MYC及BCL2基因的表达情况。基因正常：核内表现为2个黄色信号（图3.1）；基因扩增：核内表现为2个以上黄色信号（图3.2）；基因分离：核内表现为1个黄色信号和1个绿色信号、1个红色信号（图3.3）；基因缺失：核内表现为1个黄色信号或无信号（图3.4）。本论文界定基因异常率大于阈值的为阳性，小于阈值的为阴性。阈值=平均值+3×标准差，平均值与标准差来自20例淋巴结炎性增生患者样本的检测数据，MYC和BCL2基因扩增、缺失及分离阈值见表3.1。本论文，乙型肝炎病毒阳性组，MYC基因扩增4例，BCL2基因扩增4例；乙型肝炎病毒阴性组，MYC基因扩增10例，BCL2基因扩增9例；但因基因拷贝数≤4的基因扩增对临床预后无影响，且本论文所有基因扩增病例的基因拷贝数均≤4，所以，本论文在探讨MYC、BCL2基因异常发生率及MYC、BCL2基因异常与临床预后相关性时，MYC、BCL2基因异常只包括分离与缺失。图3.1正常图3.2扩增图3.3分离图3.4缺失19 表3.1MYC、BCL2基因扩增、缺失及分离的阈值扩增（%）缺失（%）分离（%）MYC基因15.34.29.8BCL2基因6.220.08.93.6弥漫大B细胞淋巴瘤预后相关因素目前NCCN指南采用IPI指标评价DLBCL患者的预后，IPI指标包含以下5个因素：(1)年龄＞60岁；(2)分为III期或IV期；(3)乳酸脱氢酶升高；(4)结外病变≥2处；(5)PS≥2分。相关文献报道，不同分子亚型（GCB和non-GCB）、MYC基因、BCL2基因异常亦是DLBCL患者的不良预后因素，本论文主要探讨乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者不良预后是否与上述因素相关。3.7乙型肝炎病毒感染的结果判定本论文所有患者于我院就诊时均采用ELISA法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb，其中，将HBsAg阳性的DLBCL患者划为乙肝阳性组，将乙肝两对半检测结果全部阴性的DLBCL患者划为乙肝阴性组。3.8随访所有患者规律随访，生存时间定义为从随机化开始至患者死亡时间或至随访截止时间。随访截止时间为2015年3月。3.9统计学方法以SPSS16.0统计软件进行数据分析，定量指标采用t检验；定性指标2采用χ检验；单因素生存期分析采用Kaplan-meierLog-rank检测方法，以P<0.05为有统计学意义。20 第4章结果4.1临床资料本文共纳入2009年1月至2014年12月收治的42例初诊DLBCL患者，其中，男性26例，女性16例；中位年龄52岁（13～77岁）；根据乙肝病毒表面抗原检测结果，将初诊DLBCL患者分为乙型肝炎病毒阳性组（17例）与乙型肝炎病毒阴性组（25例）。性别：乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组均以男性患者为主，男：女比例分别为1.8:1.0和1.5:1.0，两组无显著性差别（P=0.758）。年龄：乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组均以年龄≤60岁的患者为主，分别为82.4%和84.0%，两组差别无显著性（P=1.000）。临床分期：乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组均以中晚期患者为主，分别为64.7%和52.0%，两组在临床分期方面，无统计学意义（P=0.414）。IPI评分：乙型肝炎病毒阳性组IPI≥3分的患者占41.2%，明显高于乙型肝炎病毒阴性组的8.0%，两组差异有显著性（P=0.029）。分子亚型：乙型肝炎病毒阳性组non-GCB为70.6%，明显高于乙型肝炎病毒阴性组的52.0%，但差异无显著性（P=0.228）。依据以上资料可知，与乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者比较，乙型肝炎病毒阳性组DLBCL患者的特点为：①男性为主（1.8:1.0）；②年龄≤60岁居多（82.4%）；③Ⅲ/Ⅳ期占主要（64.7%）；④IPI≥3分为主（41.2%）；⑤non-GCB亚型多（70.6%）。乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组患者基本资料见表4.1.21 表4.1乙肝阳性组与乙阴性组基本临床资料乙肝阳性组乙肝阴性组P性别男11150.758女610年龄≤6014211.000＞6034临床分期Ⅰ/Ⅱ6120.414Ⅲ/Ⅳ1113IPI≤210230.029≥372分子亚型GCB5120.228non-GCB121322 4.2MYC、BCL2基因异常表达4.2.1乙型肝炎病毒阳性与阴性组MYC、BCL2基因表达本论文共纳入42例患者，对所有患者的淋巴结病理标本行MYC、BCL2基因检测。结果：乙型肝炎病毒阳性组MYC基因异常占23.5%，BCL2基因异常占29.4%，均高于乙型肝炎病毒阴性组的MYC基因异常（16.0%）和BCL2基因异常（4.0%），两组MYC基因异常差异无统计学意义（P=0.694），而在BCL2基因异常方面，统计学差异显著（P=0.032）。两组MYC、BCL2基因异常情况详见表4.2，两组MYC、BCL2基因异常发生率详见图4.1。表4.2乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组MYC、BCL2基因异常表达情况阳性组（17例）阴性组（25例）P值MYC基因异常分离33缺失11发生率23.5%16.0%0.694BCL2基因异常分离41缺失10发生率29.4%4.0%0.032合计47.1%（8/17）20.0%（5/25）0.063※乙型肝炎病毒阳性组有一患者同时伴有MYC及BCL2基因分离重排23 图4.1乙型肝炎病毒阳性组与乙型肝炎病毒阴性组MYC、BCL2基因异常表达情况4.2.2乙型肝炎病毒阳性与阴性组基因异常与分子亚型分析我们进一步分析了乙型肝炎病毒阳性与阴性组MYC、BCL2基因异常与分子亚型的关系，结果发现：伴MYC基因异常的乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者分子亚型均为non-GCB，伴MYC基因异常的乙型肝炎病毒阴性患者分子亚型均为GCB；而伴BCL2基因异常的乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者中，2例分子亚型为GCB，2例分子亚型为non-GCB，伴BCL2基因异常的乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者中，1例分子亚型为non-GCB。4.3生存分析4.3.1乙型肝炎病毒阳性与阴性组总体生存分析截至2015年3月，有效随访42例，其中，乙型肝炎病毒阳性组死亡5例，存活12例，乙型肝炎病毒阴性组死亡10例，存活15例；随访时间超过1年的患者共38例，其中乙型肝炎病毒阳性组13例，中位随访时间41.5个月（15.1～66.9个月），中位生存时间39.5个月；乙型肝炎病毒阴性组2524 例，中位随访时间44.6个月（18.2～78.0个月），中位生存时间为53.7个月；乙型肝炎病毒阳性DLBCL的中位生存时间较乙型肝炎病毒阴性组短，39.5月vs53.7月，但差异无显著性（P=0.931），生存曲线见图4.2。图4.2乙型肝炎病毒阳性与阴性组生存时间对比4.3.2MYC基因异常表达与生存分析随访时间超过1年的患者共38例，其中，乙型肝炎病毒阳性组13例，乙型肝炎病毒阴性组25例。乙型肝炎病毒阳性组中位随访时间41.5个月，其中MYC基因正常患者9例，截至随访期，中位生存时间未达到，伴MYC基因异常患者4例，截至随访期，中位生存时间9.1个月，乙型肝炎病毒阳性组伴MYC基因异常患者中位生存时间较无MYC基因异常患者短，但差异无显著性（P=0.062）；乙型肝炎病毒阴性组中位随访时间44.6个月，其中MYC基因正常患者21例，截至随访期，中位生存时间53.7个月，伴MYC基因异常患者4例，截至随访期，中位生存时间26.3个月，乙型肝炎病毒阴性组MYC基因异常患者的中位生存时间较无MYC基因异常患者的25 生存时间短（26.3月vs53.7月），但差异无显著性（P=0.588）；乙型肝炎病毒阳性与阴性组伴MYC基因异常患者生存时间分别见图4.3a和图4.3b。图4.3a乙型肝炎病毒阳性组MYC基因异常患者生存分析图4.3b乙型肝炎病毒阴性组MYC基因异常患者生存分析26 4.3.3BCL2基因异常表达与生存分析随访时间超过1年的患者共38例，其中，乙型肝炎病毒阳性组13例，乙型肝炎病毒阴性组25例。乙型肝炎病毒阳性组中位随访时间41.5个月，其中，BCL2基因正常患者8例，截至随访期，中位随访时间未达到，BLC2基因异常患者5例，截至随访期，中位生存时间为31.4个月，乙型肝炎病毒阳性组BCL2基因异常与BCL2基因正常者生存时间无统计学意义（P=0.607）；因乙型肝炎病毒阴性组BCL2基因异常患者仅1例，且目前处于存活状态，所以，乙型肝炎病毒阴性组目前无法根据BCL2基因异常状态分组进行生存分析。乙型肝炎病毒阳性组BCL2基因表达与生存时间分析见图4.4。图4.4乙型肝炎病毒阳性组BCL2基因表达与生存时间分析27 4.4乙型肝炎病毒阳性与阴性组不良预后因素分析本研究结果显示，乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者临床预后较乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者短，且既往文献报道，临床分期晚、IPI评分高、non-GCB亚型及伴MYC、BCL2基因异常的患者临床预后差，所以，我们对本论文乙型肝炎病毒阳性及阴性组上述不良因素进行总结，结果发现：乙型肝炎病毒阳性组Ⅲ/Ⅳ期患者占64.7%、IPI≥3分患者占41.2%、non-GCB分子亚型患者占70.6%及基因异常（MYC、BCL2基因）患者占47.1%，均显著高于乙型肝炎病毒阴性组Ⅲ/Ⅳ期患者的52.0%、IPI≥3分患者的8.0%、non-GCB分子亚型患者的52.0%及基因异常（MYC、BCL2基因）患者的20.0%，详见图4.5。图4.5乙型肝炎病毒阳性与阴性组不良预后因素分析28 第5章讨论本研究明确显示，乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床预后较乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者差，中位生存时间为39.5月vs53.7月。既往文献报道，伴MYC、BCL2基因异常表达的DLBCL患者生存时间短、预后差，所以，我们应用FISH技术检测了17例乙型肝炎病毒阳性及25例乙型肝炎病毒阴性初诊DLBCL患者的MYC、BCL2基因表达情况，结果发现：乙型肝炎病毒阳性组，MYC、BCL2基因异常表达率明显高于乙型肝炎病毒阴性组。同时我们进一步分析了乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床特征，结果发现：乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者临床分期晚、IPI指数高、分子亚型以non-GCB为主。综上，乙型肝炎病毒阳性DLBCL临床预后差于乙型肝炎病毒阴性患者的原因可能与其临床分期晚、IPI指数高、分子亚型以non-GCB为主及MYC、BCL2基因异常表达率高相关。5.1乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤临床分期与预后本论文共纳入42例初诊DLBCL患者，其中，乙型肝炎病毒阳性组17例，乙型肝炎病毒阴性组25例，两组患者虽然性别、年龄、临床分期无统计学差异，但乙型肝炎病毒阳性组Ⅲ/Ⅳ期DLBCL患者比例高于乙型肝炎病毒阴性组（64.7%vs52.0%），既往国内外文献报道，Ⅲ/Ⅳ期初诊DLBCL患者的生存时间较Ⅰ/Ⅱ期DLBCL患者显著缩短。[61]国内文菁菁等对409例DLBCL患者进行了生存预后分析，结果发现AnnArbor分期Ⅲ～Ⅳ期是DLBCL患者OS与PFS的不良预后因素（P＜[62]0.05）；余正平等探讨了106例DLBCL的临床特点、实验室检查、治疗措施以及肿瘤细胞来源与预后的关系，结果发现早期组（Ⅰ/Ⅱ期）和晚期[63]组（Ⅲ/Ⅳ期）患者生存差异有统计学意义（P=0.019）；Gaudio等对111例初诊DLBCL患者进行了生存预后分析，结果发现Ⅲ/Ⅳ期DLBCL患者临29 [64]床预后显著差于Ⅰ/Ⅱ期DLBCL患者（P=0.032）；Kim等分析了123例初诊DLBCL患者的临床特征与预后的关系，结果发现临床分期＞Ⅱ期是OS的独立不良预后因素（P=0.007）。本研究明确显示，乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床预后较乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者差，且乙型肝炎病毒阳性组Ⅲ/Ⅳ期DLBCL患者比例高于乙型肝炎病毒阴性组，提示乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者生存预后差与其临床分期晚相关。5.2乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤IPI与预后IPI评分系统是目前国际NHL协助组强烈推荐的用与评价初诊DLBCL患者临床预后的评分系统，该评分系统包含5个临床预后参数（年龄、AnnArbor分期、乳酸脱氢酶、体能状态及结外器官受累个数），依据IPI标准，将DLBCL患者细分为低危组（≤1个不良预后因子）、低中危组（2个不良预后因子）、中高危组（3个不良预后因子）和高危组（≥4个不良预后因子），[5]不同危险组预计5年总生存率分别为73%、51%、43%和26%。IPI在DLBCL[6,7]患者的预后评价作用相继被多项研究证实。既往国内外文献报道，IPI≥3分的患者中位生存期明显短于IPI≤2分的患者。[65]国内徐海燕等探讨了198例初诊DLBCL的临床特征及预后影响因素，结果发现IPI高危是影响DLBCL预后的不良预后因素（P＜0.0001）；[62]余正平等对106例DLBCL患者进行了生存预后分析，结果发现低中危组患者中位生存时间为50个月，明显高于中高危组患者的27个月，且两组[66]中位生存时间统计学差异显著（P=0.016）；Sehn等等探讨了365例初诊DLBCL患者IPI分层与临床预后的关系，结果发现IPI≥3分的患者中位生[67]存期明短于IPI≤2分的患者（50个月vs80个月）；Ziepert等探讨了1062例初诊DLBCL患者IPI预后分层与临床预后的关系，结果发现IPI≥3分的患者3年总生存率明短于IPI≤2分的患者（60%vs80%）。本研究明确显示，乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床预后较乙型肝炎病毒阴性DLBCL患30 者差，且乙型肝炎病毒阳性组IPI≥3分的患者比例为41.2%，显著高于乙型肝炎病毒阴性组的8.7%，两组差异具有显著性（P=0.029），提示乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者临床预后差与其IPI评分高相关。5.3乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤non-GCB与预后DLBCL是一群临床预后具有显著异质性的B细胞肿瘤。目前根据CD10、BCL6及MUM1蛋白分子的表达与否，DLBCL可分为GCB及non-GCB两个亚型。既往国内外文献报道，non-GCB分子亚型中位生存时间显著差于GCB分子亚型，R-CHOP方案治疗后，3年OS为84%vs56%(P=0.001);5年OS为75%vs30%。[68]国内李燕等探讨了168例初诊DLBCL患者免疫学标记的预后价值，以及利妥昔单抗对免疫组化标记预后意义的影响，结果发现化疗组中GCB型和non-GCB型的5年OS率分别为69.0%和38.6%，差异有统计学意义[69]（P=0.011）；蔺莉等研究了70例初诊DLBCL相关因素与临床预后的关系，结果发现GCB型DLBCL治愈率显著高于non-GCB组（P＜0.05）；Banz[13]等探讨了109例不同分子亚型（Hans法）初诊DLBCL的生存情况，结果发现GCB型DLBCL患者的总生存时间明显优于non-GCB型DLBCL患者[14]（P=0.007）；Habara等探讨了39例DLBCL不同分子亚型（Hans法）患者的生存情况，结果发现GCB型DLBCL患者的无进展生存时间明显优于non-GCB型DLBCL患者（P=0.022）。本研究明确显示，乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床预后较乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者差，且乙型肝炎病毒阳性组，non-GCB型DLBCL患者比例为70.6%，显著高于乙型肝炎病毒阴性组患者的52.0%，提示乙型肝炎病毒阳性DLBCL临床预后差与其患者以non-GCB分子亚型为主相关。31 5.4乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤MYC基因与预后MYC基因位于8号染色体长臂（8q24），其编码产生具有调节细胞生长和增殖功能的转录因子Myc蛋白。在细胞转录层面，MYC基因的调控主要涉及细胞生长与增殖、DNA复制、蛋白质的生物合成和能量代谢等方面。[70,71]目前，DLBCL中MYC基因异常检出率国内外报道不一。国外文献[72,73]报道MYC基因异常发生率为5%～14%，而国内文献报道MYC基因异常发生率为5.49%～38.0%；本论文乙型肝炎病毒阳性组MYC基因异常发生率为23.5%；乙型肝炎病毒阴性组MYC基因异常发生率为16.0%，与国内外报道一致。[17,18]既往文献报道，伴MYC基因异常的侵蚀性淋巴瘤多数来源于GCB。我们结果显示乙型肝炎病毒阳性组MYC基因异常患者的分子亚型均为non-GCB，与报道的普通DLBCL的GCB亚型为主不相符，提示乙型肝炎病毒阳性DLBCL的发病机制之一，可能与非生发中心B细胞异常激活、MYC基因异常表达相关。既往文献报道，伴MYC基因异常表达的DLBCL患者预后不良。国内[72]严峰对39例DLBCL患者进行了MYC基因检测，同时探讨了MYC基因与DLBCL临床预后的关系，结果发现伴MYC基因异常的DLBCL患者[26]临床预后明显差于MYC基因阴性的DLBCL患者；国外Savage等分析了MYC基因与DLBCL临床预后的关系，结果同样发现伴MYC基因异常的患者临床预后不佳。本研究明确显示，乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床预后较乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者差，且乙型肝炎病毒阳性组MYC基因异常发生率显著高于乙型肝炎病毒阴性组（23.5%vs16.0%），提示乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者临床预后差可能与其MYC基因异常发生率高相关。32 5.5乙型肝炎病毒阳性弥漫大B细胞淋巴瘤BCL2基因与预后BCL2基因为原癌基因，位于18q21.3，编码BCL2抗凋亡蛋白。该基因于20世纪80年代中期首次在伴t(14;18)易位的患者中发现。BCL2蛋白过表达导致肿瘤细胞凋亡受阻，同时亦可使肿瘤细胞对化疗耐药。t(14;18)(q32;q21)被认为是FL的主要致病机制。国外文献报道该类型[48]BCL2基因重排类型可见于85%的FL和至少30%的DLBCL患者，而国[68,69]内文献报道大约5.9%～25.5%的DLBCL患者伴有t(14;18)易位。本论文分析了42例初诊DLBCL患者的BCL2基因表达情况，结果乙型肝炎病毒阳性组，29.4%的DLBCL患者伴基因异常，显著高于乙型肝炎病毒阴性组的4.0%，差异具有显著性（P=0.032）。我们进一步研究了乙型肝炎病毒阳性与阴性组BCL2基因异常与分子亚型的关系，结果发现伴BCL2基因异常的乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者中，2例分子亚型为GCB，2例分子亚型为non-GCB，伴BCL2基因异常的乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者中，1例分子亚型为non-GCB，综上，提示BCL2基因异常与DLBCL分子亚型无特殊相关性。[29,42-47]目前，大多数文献结果显示：伴BCL2基因重排和BCL2蛋白过表达的DLBCL患者，其临床预后差；Barrans等和Tang等也同样发现伴有[48,49]BCL2基因重排的DLBCL患者生存期差。本研究明确显示，乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床预后较乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者差，且乙型肝炎病毒阳性组BCL2基因异常发生率显著高于乙型肝炎病毒阴性组，提示乙型肝炎病毒阳性组DLBCL患者临床预后差可能与其BCL2基因异常发生率高相关。5.6小结本论文主要探讨了乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者临床预后差的原因，33 结果发现：乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者临床预后差与其临床分期晚、IPI评分高、分子亚型以non-GCB为主和MYC、BCL2基因异常发生率高有关。进一步分析发现伴MYC基因异常的乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者分子亚型均为non-GCB，提示MYC基因异常表达可能与乙肝病毒阳性DLBCL的发病机制相关。5.7研究瞻望本研究明确显示，乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床预后较乙型肝炎病毒阴性DLBCL患者差，其中与预后密切相关的主要因素包括①IPI分层高危；②以non-GCB分子亚型为主；③MYC、BCL2基因异常表达率高。但因本研究样本量少，且为单中心回顾性研究，因此，相关的几个不良预后因素的相互关系及权重尚不明确，下一步研究将探讨乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者的临床分期晚、IPI评分高及分子亚型以non-GCB为主是否与MYC、BCL2基因异常表达相关，临床尚需进一步扩大样本量证实。34 第6章结论1．乙型肝炎病毒阳性组患者临床分期晚、IPI评分高、分子亚型以non-GCB为主。2．乙型肝炎病毒阳性组MYC、BCL2基因异常发生率明显高于乙型肝炎病毒阴性组。3.与伴MYC基因异常的乙型肝炎病毒阴性DLBCL不同，伴MYC基因异常的乙型肝炎病毒阳性DLBCL可能主要来源于non-GCB，提示MYC基因异常导致B细胞激活，可能与乙型肝炎病毒阳性DLBCL的发病机制相关。4.乙型肝炎病毒阳性DLBCL患者生存期短、预后差，原因可能与其临床分期晚、IPI评分高、分子亚型以non-GCB为主和MYC、BCL2基因异常发生率高有关。35 参考文献[1]FisherRI,MillerTP,O'ConnorOA.Diffuseaggressivelymphoma[J].ASHEducationProgramBook,2004,2004(1):221-236.[2]FisherRI,GaynorER,DahlbergS,etal.Comparisonofastandardregimen(CHOP)withthreeintensivechemotherapyregimensforadvancednon-Hodgkin'slymphoma[J].NEnglJMed,1993,328(14):1002-1006.[3]CarbonePP,KaplanHS,MusshoffK,etal.ReportofthecommitteeonHodgkin'sdiseasestagingclassification[J].CancerRes,1971,31(11):1860-1861.[4]RosenbergS.ValidityoftheAnnArborstagingclassificationforthenon-Hodgkin'slymphomas[J].CancerTreatRep,1977,61(6):1023-1027.[5]Apredictivemodelforaggressivenon-Hodgkin'slymphoma.Theinternationalnon-Hodgkin'slymphomaprognosticfactorsproject[J].N.EnglJMed,1993,329:987-994.[6]NicolaidesC,FountzilasG,ZoμmbosN,etal.Diffuselargecelllymphomas:identificationofprognosticfactorsandvalidationoftheInternationalNon-Hodgkin'sLymphomaPrognosticIndex.AHellenicCooperativeOncologyGroupStudy[J].Oncology,1997,55(5):405-415.[7]WilderRB,RodriguezMA,MedeirosLJ,etal.Internationalprognosticindex‐basedoutcomesfordiffuselargeB‐celllymphomas[J].Cancer,2002,94(12):3083-3088.[8]AllzadehA,ElsenM,DavisR,etal.DistincttypesofdiffuselargeB-celllymphomaidentifiedbygeneexpressionprofiling[J].Nature,2000,403(6769):503-511.[9]RosenwaldA,WrightG,ChanWC,etal.Theuseofmolecμlarprofilingtopredictsurvivalafterchemotherapyfordiffuselarge-B-celllymphoma[J].NEnglJMed,2002,346(25):1937-1947.[10]WrightG,TanB,RosenwaldA,etal.Ageneexpression-basedmethodtodiagnoseclinicallydistinctsubgroupsofdiffuselargeBcelllymphoma[J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(17):9991-9996.[11]AlizadehAA,EisenMB,DavisRE,etal.DistincttypesofdiffuselargeB-celllymphomaidentifiedbygeneexpressionprofiling[J].Nature,2000,403(6769):503-511.[12]LenzG,WrightG,DaveS,etal.Stromalgenesignaturesinlarge-B-celllymphomas[J].NEnglJMed,2008,359(22):2313-2323.[13]ReberR,BanzY,GaramvölgyiE,etal.Determinationofthemolecularsubtypesof36 diffuselargeB-celllymphomasusingimmunohistochemistry[J].SwissMedWkly,2013,143:w13748.[14]HabaraT,SatoY,TakataK,etal.GerminalcenterB-cell-likeversusnon-germinalcenterB-cell-likeasimportantprognosticfactorforlocalizednodalDLBCL[J].JournalofClinicalandExperimentalHematopathology,2012,52(2):91-99.[15]MeyerN,PennLZ.Reflectingon25yearswithMYC[J].NatRevCancer,2008,8(12):976-990.[16]DangCV.MYConthepathtocancer[J].Cell,2012,149(1):22-35.[17]KellerUB,OldJB,DorseyFC,etal.MyctargetsCks1toprovokethesuppressionofp27Kip1,proliferationandlymphomagenesis[J].EMBOJ,2007,26(10):2562-2574.[18]BuenoMJ,MalμmbresM.MicroRNAsandthecellcycle[J].BiochimBiophysActa,2011,1812(5):592-601.[19]CaladoDP,SasakiY,GodinhoSA,etal.Thecell-cycleregμlatorc-Mycisessentialfortheformationandmaintenanceofgerminalcenters[J].NatImmunol,2012,13(11):1092-1100.[20]Dominguez-SolaD,VictoraGD,YingCY,etal.Theproto-oncogeneMYCisrequiredforselectioninthegerminalcenterandcyclicreentry[J].NatImmunol,2012,13(11):1083-1091.[21]LinY,WongK-k,CalameK.Repressionofc-myctranscriptionbyBlimp-1,aninducerofterminalBcelldifferentiation[J].Science,1997,276(5312):596-99.[22]VictoraGD,Dominguez-SolaD,HolmesAB,etal.IdentificationofhμmangerminalcenterlightanddarkzonecellsandtheirrelationshiptohμmanBcelllymphomas[J].Blood,2012,120(11):2240-2248.[23]SchmitzR,YoungRM,CeribelliM,etal.Burkittlymphomapathogenesisandtherapeutictargetsfromstructuralandfunctionalgenomics[J].Nature2012,490(7418):116-120.[24]SeitzV,ButzhammerP,HirschB,etal.DeepsequencingofMYCDNA-bindingsitesinBurkittlymphoma[J].PLoSOne,2011,6(11):e26837.[25]BoermaE,SiebertR,KluinPM,etal.Translocationsinvolving8q24inBurkittlymphomaandothermalignantlymphomas:ahistoricalreviewofcytogeneticsinthelightoftodaysknowledge[J].Leukemia,2009,23(2):225-234.[26]KlapperW,StoeckleinH,ZeynalovaS,etal.GermanHigh-GradeNon-Hodgkin’sLymphomaStudyGroup.StructuralaberrationsaffectingtheMYClocusindicateapoor37 prognosisindependentofclinicalriskfactorsindiffuselargeB-celllymphomastreatedwithinrandomizedtrialsoftheGermanHigh-GradeNon-Hodgkin’sLymphomaStudyGroup(DSHNHL)[J].Leukemia,2008,22(12):2226-2229.[27]NiitsuN,OkamotoM,MiuraI,etal.ClinicalfeaturesandprognosisofdenovodiffuselargeB-celllymphomawitht(14;18)and8q24/c-MYCtranslocations[J].Leukemia,2009,23(4):777-783.[28]SavageKJ,JohnsonNA,Ben-NeriahS,etal.MYCgenerearrangementsareassociatedwithapoorprognosisindiffuselargeB-celllymphomapatientstreatedwithR-CHOPchemotherapy[J].Blood,2009,114(17):3533-3537.[29]ObermannE,CsatoM,DirnhoferS,etal.AberrationsoftheMYCgeneinunselectedcasesofdiffuselargeB-celllymphomaarerareandunpredictablebymorphologicalorimmunohistochemicalassessment[J].JClinPathol,2009,62(8):754-756.[30]YoonS,JeonY,PaikJ,etal.MYCtranslocationandanincreasedcopynμmberpredictpoorprognosisinadμltdiffuselargeB-celllymphoma(DLBCL),especiallyingerminalcentre‐likeBcell(GCB)type[J].Histopathology,2008,53(2):205-217.[31]KramerM,HermansJ,WijburgE,etal.ClinicalrelevanceofBCL2,BCL6,andMYCrearrangementsindiffuselargeB-celllymphoma[J].Blood,1998,92(9):3152-3162.[32]JohnsonNA,SavageKJ,LudkovskiO,etal.LymphomaswithconcurrentBCL2andMYCtranslocations:thecriticalfactorsassociatedwithsurvival[J].Blood,2009,114(11):2273-2279.[33]UedaC,NishikoriM,KitawakiT,etal.CoexistentRearrangementsofc-MYC,BCL2,andBCL6GenesinaDiffuseLargeB-CellLymphoma[J].IntJHematol,2004,79(1):52-54.[34]AukemaSM,SiebertR,SchuuringE,etal.Double-hitB-celllymphomas[J].Blood,2011,117(8):2319-2331.[35]BarransS,CrouchS,SmithA,etal.RearrangementofMYCisassociatedwithpoorprognosisinpatientswithdiffuselargeB-celllymphomatreatedintheeraofrituximab[J].JClinOncol,2010,28(20):3360-3365.[36]SnuderlM,KolmanOK,ChenY-B,etal.B-celllymphomaswithconcurrentIGH-BCL2andMYCrearrangementsareaggressiveneoplasmswithclinicalandpathologicfeaturesdistinctfromBurkittlymphomaanddiffuselargeB-celllymphoma[J].AmJSurgPathol,2010,34(3):327.[37]TsujimotoY,GorhamJ,CossmanJ,etal.Thet(14;18)chromosometranslocations38 involvedinB-cellneoplasmsresμltfrommistakesinVDJjoining[J].Science,1985;229(4720):1390-1393.[38]SetoM.GeneticandepigeneticfactorsinvolvedinB-celllymphomagenesis[J].CancerSci,2004,95(9):704-710.[39]SwerdllowS,CampoE,HarrisNL.WHOclassificationoftμmoursofhaematopoieticandlymphoidtissues:France:IARCPress,2008,2008.[40]RowleyJD.Chromosomestudiesinthenon-Hodgkin'slymphomas:theroleofthe14;18translocation[J].JClinOncol,1988,6(5):919-925.[41]HorsmanDE,GascoyneRD,CouplandRW,etal.Comparisonofcytogeneticanalysis,southernanalysis,andpolymerasechainreactionforthedetectionoft(14;18)infollicμlarlymphoma[J].AmJClinPathol,1995,103(4):472-478.[42]WeissLM,WarnkeRA,SklarJ,etal.Molecμlaranalysisofthet(14;18)chromosomaltranslocationinmalignantlymphomas[J].NEnglJMed,1987,317(19):1185-1189.[43]LipfordE,WrightJJ,UrbaW,etal.Refinementoflymphomacytogeneticsbythechromosome18q21majorbreakpointregion[J].Blood,1987,70(6):1816-1823.[44]vanImhoffGW,BoermaE-JG,vanderHoltB,etal.Prognosticimpactofgerminalcenter–associatedproteinsandchromosomalbreakpointsinpoor-riskdiffuselargeB-celllymphoma[J].JClinOncol,2006,24(25):4135-4142.[45]DePaepeP,AchtenR,VerhoefG,etal.LargecleavedandimmunoblasticlymphomamayrepresenttwodistinctclinicopathologicentitieswithinthegroupofdiffuselargeB-celllymphomas[J].JClinOncol,2005,23(28):7060-7068.[46]BarransSL,CarterI,OwenRG,etal.Germinalcenterphenotypeandbcl-2expressioncombinedwiththeInternationalPrognosticIndeximprovespatientriskstratificationindiffuselargeB-celllymphoma[J].Blood,2002,99(4):1136-1143.[47]GascoyneRD,AdomatSA,KrajewskiS,etal.PrognosticsignificanceofBcl-2proteinexpressionandBcl-2generearrangementindiffuseaggressivenon-Hodgkin'slymphoma[J].Blood,1997,90(1):244-251.[48]HermineO,HaiounC,LepageE,etal.Prognosticsignificanceofbcl-2proteinexpressioninaggressivenon-Hodgkin'slymphoma.Grouped'EtudedesLymphomesdel'Adμlte(GELA)[J].Blood,1996,87(1):265-272.[49]HillME,MacLennanKA,CunninghamDC,etal.PrognosticsignificanceofBCL-2expressionandbcl-2majorbreakpointregionrearrangementindiffuselargecellnon-Hodgkin'slymphoma:aBritishNationalLymphomaInvestigationStudy[J].Blood,39 1996,88(3):1046-1051.[50]BarransSL,EvansPA,O’ConnorSJ,etal.Thet(14;18)isassociatedwithgerminalcenter-deriveddiffuselargeB-celllymphomaandisastrongpredictorofoutcome[J].ClinCancerRes,2003,9(6):2133-2139.[51]TangS,VisserL,HepperleB,etal.Clinicalsignificanceofbcl-2-MBRgenerearrangementandproteinexpressionindiffuselarge-cellnon-Hodgkin'slymphoma:ananalysisof83cases[J].JClinOncol,1994,12(1):149-154.[52]VitoloU,GaidanoG,BottoB,etal.Rearrangementsofbcl-6,bcl-2,c-mycand6qdeletioninB-diffuselarge-celllymphoma:clinicalrelevancein71patients[J].Ann.Oncol,1998,9(1):55-61.[53]KawasakiC,OhshimaK,SuzμmtyaJ,etal.Rearrangementsofbcl-1,bcl-2,bcl-6,andc-mycindiffuselargeB-celllymphomas[J].Leuk.Lymphoma,2001,42(5):1099-1106.[54]DaliaS,ChavezJ,CastilloJJ,etal.HepatitisBinfectionincreasestheriskofnon-Hodgkinlymphoma:Ameta-analysisofobservationalstudies[J].Leuk.Res,2013,37(9):1107-1115.[55]MarcucciF,MeleA.Hepatitisvirusesandnon-Hodgkinlymphoma:epidemiology,mechanismsoftumorigenesis,andtherapeuticopportunities[J].Blood,2011,117(6):1792-1798.[56]ChenJ,WangJ,YangJ,etal.ConcurrentInfectionofHepatitisBVirusNegativelyAffectstheClinicalOutcomeandPrognosisofPatientswithNon-Hodgkin’sLymphomaafterChemotherapy[J].PloSone,2013,8(7):e69400.[57]WangF,XuR,LuoH,etal.ClinicalandprognosticanalysisofhepatitisBvirusinfectionindiffuselargeB-celllymphoma[J].BMCcancer,2008,8(1):115.[58]XieW,ZhouD,HuK,etal.ClinicalanalysisandprognosticsignificanceofhepatitisBvirusinfectionsfordiffuselargeB-celllymphomawithorwithoutrituximabtherapy[J].Experimentalandtherapeuticmedicine,2013,6(1):109-114.[59]PardueML,GallJG.MolecμlarhybridizationofradioactiveDNAtotheDNAofcytologicalpreparations[J].ProcNatAcadSci,1969,64(2):600-604.[60]JohnHA,BirnstielML,JonesKW.RNA-DNAhybridsatthecytologicallevel[J].Nature,1969,223(5206):582-587.[61]文菁菁,周佳丽,刘志彬,等.409例初治弥漫大B细胞淋巴瘤患者的生存预后分析[J].中华血液学杂志,2014,35(4):318-324.40 [62]余正平,丁家华,陈宝安,等.影响弥漫大B细胞淋巴瘤预后的主要危险因素分析[J].中华血液学杂志,2012,32(12):830-835.[63]GaudioF,GiordanoA,PerroneT,etal.HighKi67indexandbulkydiseaseremainsignificantadverseprognosticfactorsinpatientswithdiffuselargeBcelllymphomabeforeandaftertheintroductionofrituximab[J].Actahaematologica,2010,126(1):44-51.[64]KimMK,BaeSH,BaeYK,etal.BiologicalcharacterizationofnodalversusextranodalpresentationofdiffuselargeB-Celllymphomausingimmunohistochemistry[J].ClinicalLymphomaMyelomaandLeukemia,2011,11(5):403-408.[65]徐海燕,张凤春,林玉梅.198例弥漫大B细胞淋巴瘤临床特征及预后因素分析[J].上海交通大学学报(医学版),34(11):1618.[66]SehnLH,BerryB,ChhanabhaiM,etal.TherevisedInternationalPrognosticIndex(R-IPI)isabetterpredictorofoutcomethanthestandardIPIforpatientswithdiffuselargeB-celllymphomatreatedwithR-CHOP[J].Blood,2007,109(5):1857-1861.[67]ZiepertM,HasencleverD,KuhntE,etal.StandardInternationalprognosticindexremainsavalidpredictorofoutcomeforpatientswithaggressiveCD20+B-celllymphomaintherituximabera[J].JournalofClinicalOncology,2010,28(14):2373-2380.[68]李燕,杨明珍.弥漫大B细胞淋巴瘤免疫组化标记的预后意义及利妥昔单抗对其影响临床研究[J].中国实用内科杂志,2014,34(2):187-190.[69]蔺莉,张煦,崔杰,等.70例弥漫大B细胞淋巴瘤的预后分析[J].兰州大学学报:医学版,2010,36(1):74-77.[70]KlapperW,StoeckleinH,ZeynalovaS,etal.StructuralaberrationsaffectingtheMYClocusindicateapoorprognosisindependentofclinicalriskfactorsindiffuselargeB-celllymphomastreatedwithinrandomizedtrialsoftheGermanHigh-GradeNon-Hodgkin'sLymphomaStudyGroup(DSHNHL)[J].Leukemia,2008,22(12):2226-2229.[71]JohnsonNA,SavageKJ,LudkovskiO,etal.LymphomaswithconcurrentBCL2andMYCtranslocations:thecriticalfactorsassociatedwithsurvival[J].Blood,2009,114(11):2273-2279.[72]严峰.Bcl-6,P53蛋白,c-myc基因易位检测在弥漫大B细胞淋巴瘤中的临床意义[J].41 中国临床医学,2011,18(2):257-259.[73]梁艳,潘毅,房爱菊,等.弥漫性大B细胞淋巴瘤C-MYC基因异常分析[J].中国肿瘤临床,2013,40(9):513-516.[74]姜乃可,岑岭,周民,等.弥漫大B细胞淋巴瘤中Bcl-2基因表达及t(14;18)易位的研究[J].临床血液学杂志,2012,25(5):587-589.[75]张宏伟,陈振文,李素红,等.t(14;18)在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的检测及临床意义[C].中国会议,2011:126.42 作者在学期间所取得的科研成果作者简介：刘志何，男，(1987～),汉族，生于山东省临沂市；2012年7月毕业于潍坊医学院，获医学学士学位，同年9月考入吉林大学白求恩第一临床医学院攻读医学硕士学位。攻读硕士期间发表学术论文3篇。科研成果：LiuZ,LiuC,GuoW,BAIO*,etal.ClinicalAnalysisof152CasesofMultiplePrimaryMalignantTumorsin15,398PatientswithMalignantTumors[J].PLoSOne,2015,10(5):e0125754.刘志何,刘春水,李薇,白欧*，等.应用荧光原位杂交技术检测初治慢性淋巴细胞白血病患者的分子遗传学异常[J].中国老年学杂志.2015,35(5):1239-1241.阚随随,刘春水,刘志何,白欧*，等.26例初诊伴髓外浸润的多发性骨髓瘤临床分析[J].中国实验诊断学,2015,03:122-124.*为通讯作者43 致谢时光茬冉，三年研究生生活即将结束，这三年，是磨砺青春、挥洒书生意气的三年，也是承受师恩，增长学识的三年。在论文完成之际，谨向所有给予过我关心、支持和帮助的师长、同学和朋友表示深深的谢意!首先，衷心感谢我的导师白欧教授三年来对我的关爱和指导，您孜孜不倦的教导和潜移默化式的熏陶，让我的收获受益终生。谆谆教侮，终身受益；师恩难忘，铭记于心。感谢李薇主任，您严谨的学风、兢兢业业的态度和与时俱进的精神，时刻影响着我，必将激励着我在今后的人生道路上不断进取。感谢刘春水老师在临床实践工作中对我的指导与教诲。感谢吉林大学第一医院病理科王银萍主任在实验中给予的帮助和指导。感谢吉林大学第一医院FISH检测室白晶老师、王立群老师在试验中给予的帮助和指导。感谢吉林大学第一医院肿瘤中心临床数据办公室何华老师，在本论文数据分析方面给予的帮助和指导。感谢在转科期间，崔久嵬老师、刘子玲老师、赵恒军老师、杨雷老师、陈晓老师、王楠娅老师给予的无私帮助和悉心指导。感谢肿瘤中心全体老师，护士和同学们对我的帮助与支持！感谢各位专家在百忙之中抽出宝贵时间参加我的毕业答辩！感谢我的家人、朋友对我无微不至的关怀和无私的奉献！44
