血浆sCD40L对于不同类型冠心病患者的临床意义

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授予单位代码10089学号或申请号16158中国图书分类号R541.4HebeiMedicalUniversity硕士学位论文学术学位血浆sCD40L对于不同类型冠心病患者的临床意义研究生刘丹亮导师姜云发教授专业内科学二级学院第二医院2018年3月 目录中文摘要·································································································10英文摘要·································································································20英文缩写·································································································40研究论文血浆sCD40L对于不同类型冠心病患者的临床意义前言·································································································50资料与方法······························································································60结果·································································································90附图·································································································11附表·································································································13讨论·································································································15结论·································································································18参考文献·································································································19综述CD40L系统在急性冠脉综合症的研究进展····································25致谢·································································································44个人简历·································································································45 血浆sCD40L对于不同类型冠心病患者的临床意义摘要目的：本课题观察血浆可溶性CD40L(sCD40L)水平在不同类型冠心病(CHD)患者的变化，探讨其与冠脉狭窄程度之间的关系，以及与急性冠脉综合症(ACS)患者TIMI危险积分间的相关关系。方法：本研究选择急性心肌梗死(AMI)30例，不稳定型心绞痛(UA)30例，稳定型心绞痛(SA)30例，对照组30例进行对比研究。入院后于发病24h内抽取静脉血。采用酶联免疫吸附分析法(ELISA法)检测sCD40L浓度。比较各组间sCD40L含量有无差异，并将AMI组中非ST段抬高心肌梗死组（NSTEMI）及UA组的sCD40L含量与TIMI危险积分进行比较。CHD各组sCD40L含量与冠脉造影Gensini积分进行相关性分析。结果：UA组、AMI组sCD40L水平明显高于对照组和SA组(P<0.05)，而UA组与AMI组无显著差异。NSTEMI组及UA组按TIMI危险积分分为≥3分组(n=23)和≤2分组(n=20)，其中≥3分组sCD40L水平明显高于≤2分组(P<0.001)，sCD40L水平与TIMI危险积分正相关(r=0.774，P<0.001)。CHD各组冠脉造影Gensini积分值与sCD40L水平进行相关分析，结果显示无相关性。结论：1.血浆sCD40L水平在UA组、AMI组增高明显。支持冠状动脉AS病变与炎症反应有密切关系，该指标能反映CHD的严重程度，并可能代表着斑块的不稳定状态。2.血浆sCD40L水平与TIMI危险积分呈正相关，sCD40L水平与TIMI危险积分均能反映ACS患者的危险程度，sCD40L水平结合TIMI危险积分对ACS患者的危险分层有一定的临床意义。3.sCD40L水平与冠脉狭窄程度之间无相关性，与斑块稳定性密切相关，而与冠状动脉血管病变狭窄程度无关。关键词：sCD40L；TIMI危险积分；冠心病；急性冠脉综合征；斑块稳定性1 ClinicalsignificanceofplasmasCD40LchangesinpatientswithdifferenttypesofcoronaryheartdiseasesABSTRACTObjective:ToinvestigatetheclinicalsignificanceofplasmalevelsofsolubleCD40L(sCD40L)inpatientswithdifferenttypesofcoronaryheartdiseases,toexploretherelationshipbetweentheconcentrationofsCD40Linplasmaandtheseverityofcoronarystenosis，andthecorrelationbetweenitandTIMIriskscoreinACSpatients.Methods:Thirtynormalsubjectsmadeupthecontrolgroupand90patients,including30withstableanginapectoris(SA),30withunstableanginapectoris(UA)and30withacutemyocardialinfarct(AMI)wereenrolledinthisstudy.NSTEMIandUAcaseswereseparatedinto2groupsbyTIMIriskscore.Thebloodsamplesweredrawnfromvenouswithin24hoursafterhospitalization.ThesCD40LlevelsinplasmaweremeasuredbyELISA.Results:TheplasmalevelsofsCD40LinUApatientsandAMIpatientswerehighercomparedwiththosewithSAandthoseincontrolgroup(P<0.05),withnosignificantdifferencebetweenAMIandUAandbetweenSAandcontrolgroup;ComparedcaseswhoseTIMIriskscore≥3withthosewhosescore≤2showamuchhigherconcentrationofsCD40L(P<0.001),ThereispositivecorrelationbetweentheTIMIriskscoreandtheplasmalevelsofsCD40L(r=0.774,P<0.001).TherewasnocorrelationbetweentheseverityofcoronarystenosisandthesCD40Lvalues.Conclusion:ThesCD40LvaluesinthepatientswithAMIandUAaresignificantlyhigherthanthoseinSAandcontralgroups,whichmayreflectthestabilityofcoronaryatheroscleroticplaque.TheplasmalevelsofsCD40LwereusefultoestimatetheriskofACSpatients.TheplasmalevelsofsCD40LweredecidedbythestabilityofPlaqueratherthanthedegreeofcoronarystenosis.2 Keywords:SolubleCD40ligand(sCD40L);TIMIriskscore;Coronaryheartdisease(CHD);Acutecoronarysyndrome(ACS);Plaquestability3 英文缩写英文缩写英文全称中文全称CHDCoronaryHeartDisease冠状动脉粥样硬化性心脏病ASAtherosclerosis动脉粥样硬化ACSAcuteCoronarySyndrome急性冠脉综合征AMIAcutemyocardialinfarction急性心肌梗死UAUnstableanginapectoris不稳定性心绞痛SAStableanginapectoris稳定性心绞痛sCD40lserumofsolubleCD40lingand可溶性CD40配体TCCholesterol总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯HDLHighdensitylipoprotein高密度脂蛋白LDLLowdensitylipoprotein低密度脂蛋白4 血浆sCD40L对于不同类型冠心病患者的临床意义前言冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD），是指冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，常常被称为“冠心病”。但是冠心病的范围可能更广泛，还包括炎症、栓塞等导致管腔狭窄或闭塞。世界卫生组织将冠心病分为5大类：无症状心肌缺血（隐匿性冠心病）、心绞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭（缺血性心脏病）和猝死5种临床类型。临床中常常分为稳定性冠心病和急性冠状动脉综合征。冠心病是威胁人类健康的主要疾病之一，冠心病成为西方发达国家致死的首因。美国每年冠心病患者约700万例，发生心脏事件约150万例次，每年约50万人死于此病，占人口死亡数的1/3-1/2，占心脏病死亡的50%-75%。在我国，随着生活条件的改善，冠心病的发病率呈上升趋势，是目前中国成人心脏病住院和死亡的第一杀手，是北京市近年来住院量增加最多的疾病，住院平均费用列在各种疾病之首。流行病学研究已经证实高脂血症、吸烟、糖尿病、高血压病是CHD的危险因子，对这些传统的CHD危险因子的有力控制是西方国家近年来CHD死亡率下[1-2]降的主要原因。然而这些传统的危险因子并不能解释所有的冠脉事件，因此，对一些新的危险因素进行识别和研究，对制定防治策略有十分重要的价值。近年来，越来越多的实验证据和流行病学资料表明，炎症反应与冠心病的发生发展密切相关，炎症介质成为动脉粥样斑块形成、进展甚至破裂的始动因素。近年来大量的研究提示，一些炎性标记物在识别心血管事件危险性较高的CHD患者方面可能具有重要的预测价值。CD40是Ⅰ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。CD40L是CD40的配体，属Ⅱ型跨膜蛋白，TNF家族细胞因子。CD40L还以可溶型分子形式(sCD40L)存在，血液循环系统中约95%的sCD40L来自于活化的血小板。在动脉粥样硬化（AS）病变区CD40、CD40L过度表达，CD40-CD40L的相互作用参与了AS发生、发展乃至斑块破裂，血栓形成的过程。本课题观察sCD40L水平在不同类型CHD患者的变化，根据患者冠脉5 造影结果，探讨其与冠脉狭窄程度之间的关系，以及与急性冠脉综合症（ACS）患者TIMI危险积分间的相关关系。资料与方法1病例选择所有病例均选自我院心内科2017年1月~2017年12月期间住院病人，共120例，急性心肌梗死(AMI)30例，不稳定型心绞痛(UA)30例，稳定型心绞痛(SA)30例，对照组30例。1.1入选标准[3-4]依据中华医学会心血管病分会AMI及UA和SA的诊断标准入选，分为以下四组：1）AMI组AMI的诊断标准:必须至少具备下列三条标准中的两条，根据心电图有无ST段抬高分为ST段抬高心肌梗死（STEMI）和非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)：A.缺血性胸痛的临床病史；B.心电图的动态演变；C.心肌坏死的血清心肌标记物浓度的动态改变；2）UA组UA是介于SA和AMI之间的一组临床心绞痛综合症，入选如下亚型：a.初发劳累性心绞痛：病程在2个月内新发生的心绞痛（从无心绞痛或有心绞痛病史但在近半年内未发作过心绞痛）。b.恶化型劳累性心绞痛：病情突然加重，表现为胸痛发作次数增加，持续时间延长，诱发心绞痛的活动阈值明显减低，按加拿大心脏病学会劳力型心绞痛分级（CCSCI-IV）加重1级以上并至少达到Ⅲ级，硝酸甘油缓解症状的作用减弱，病程在2个月之内。c.静息心绞痛：心绞痛发生在休息或安静状态，发作持续时间相对较长，含硝酸甘油效果欠佳，病程在1个月内。NSTEMI组及UA组根据按其TIMI危险积分（TIMIriskscore）分为2部分≥3分者和≤2分者。6 [5]TIMI危险积分：①年龄≥65岁；②≥3个冠心病危险因素;③冠状动脉造影动脉狭窄≥50%；④心电图ST段改变>0.5mm；⑤24h内症状发作≥2次；⑥血清心脏标志物升高；⑦症状发作7天内服用阿司匹林。每一项积分为1分。3）SA组符合缺血性胸痛症状，且发作情况在近2个月内无明显变化，归入本组。4）对照组可疑CHD住院后，冠状动脉造影检查正常者，排除其他心脏疾病，归入本组。其中，1）、2）、3）组均经冠造证实，且至少有一处狭窄≥50%。1.2有下列情况者不能入选a严重或活动性感染性疾病、b全身免疫性疾病、c结缔组织疾病、d肾功能不全（男性血清肌酐＞2.5mg/dl，女性＞2.0mg/dl）、e肝功能不全（基础肝酶检测＞正常值的3倍）、f肿瘤、g两个月内创伤、手术等、h周围血管栓塞性疾病，脑卒中、i应用炎症抑制药(如非固醇类消炎镇痛药、固醇类和鸦片类药物)2实验器材2.1主要试剂人sCD40LELISA试剂盒武汉华美生物工程有限公司2.2主要仪器设备1）全自动酶标仪（550型）BIO-RAD2）全自动生化分析仪（7170）日立3）恒温震荡水浴箱PRECISION4）-80℃低温冰箱（C-1090）AmericanScientificProducts5）低温离心机（GTR10-1）北京时代北利离心机有限公司6）数字减影机siemenseartiszee33实验方法3.1标本采集AMI组、UAP组、SAP组患者在入院后24小时内采血，对照组患者于清晨空腹采血，所有患者取外周全血约4ml，EDTA抗凝管，即刻1500rpm，7 离心10min，吸管分离（距血球界面＞5mm）血浆装入EP管，储存-70℃冰箱待测sCD4OL。3.2sCD40L的测定本实验采用双抗体夹心ELISA法试剂盒检测sCD40L。往抗人sCD40L单抗包被的微孔板中依次加入待测样品或标准品、生物素化的抗sCD40L抗体，辣根过氧化酶（HRP）标记的亲和素，经彻底洗涤后加入显色剂（四甲基联苯胺，TMB），若反应孔中有sCD40L，则显蓝色，加终止液变黄。在450nm处测吸光度(OD)值，参比波长540nm。sCD40L浓度与OD值之间呈正比，通过绘制标准曲线求出待测样品中sCD40L浓度。1）所有试剂、待测样品平衡至室温。2）记录各孔位置（空白孔、标准品及待测样品），于各孔中每孔分别加入100µl样本稀释液、不同浓度标准品（1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6ng/L）或待测样品，37℃温育120分钟。3）弃去液体，甩干，每孔加入生物素抗体工作液100µl，37℃反应60分钟。4）洗板3次，每孔加入HRP标记的亲和素工作液100µl，37℃反应60分钟。5）洗板5次，每孔加入底物溶液（TMB）90µl，避光37℃温育25分钟(视颜色深浅灵活掌握)。6）向各孔中加入50µl终止液以终止反应。混匀后即刻于酶标仪450nm测定光密度(OD值)，参比波长540nm。7）绘制标准曲线，计算标准方程，通过样品的OD值根据标准方程求出其浓度即得。3.3生化指标的检测：所有患者均常规检查肝功、肾功、心肌酶、血脂、血糖、血尿便常规、肌钙蛋白T及I(TnT及TnI)。3.4冠状动脉造影结果分析所有入选对象均行冠状动脉造影。造影结果由2名有经验的医师分析[6]完成。冠状动脉病变程度评分采用Gensini评分系统，其由两部分组成：①根据冠状动脉狭窄程度确定基本评分：狭窄<50%为1分，50~74%为2分，75~89%为4分，90~98%为8分，99%为16分，100%(完全闭塞)为32分。②根据冠状动脉病变部位确定评分系数：左冠状动脉主干病变的系数为5；8 前降支近段病变的系数为2.5，中段病变的系数为1.5，心尖支病变的系数为1.0，第一对角支病变的系数为1.0，第二对角支病变的系数为0.5；回旋支近段病变的系数为2.5，钝缘支病变的系数为1.0，远段病变的系数为1.0，后降支病变的系数为1.0；右冠状动脉近端、中段及远端均为1.0，左室后支为0.5。进行定量评分时，根据每处冠状动脉的狭窄程度所获得的基本得分值乘以该病变部位的系数，即为该处病变的积分。1例患者如有多处病变，则各病变处的积分累计总和为该患者冠状动脉病变严重程度的总积分。4统计方法检测所得数据用均数±标准差(x±s)表示，各组间差异采用单因素方差分析(one-wayANOVA)及多个样本均数间的两两比较（q检验)，两组独立样本的比较（t检验）。采用直线相关分析sCD40L与冠状动脉造影Gensini积分以及与TIMI危险积分的相关性。以α=0.05作为检验水准。所有数据运用SPSS19.0软件处理。结果1.一般资料对照组、SA组、UA和AMI组一般临床资料比较见(表l)。CHD各组易患因素、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白均无统计学意义。2.各组sCD40L水平的比较sCD40L的标准曲线见图1，UA组、AMI组sCD40L水平明显高于对照组和SA组(P<0.05)，而UA组与AMI组比较无显著差异(P>0.05)，对照组和SA组之间无显著差异(P>0.05)。见表2及图2。3.TIMI危险积分和sCD40L浓度变化及其相关性NSTEMI组及UA组按TIMI危险积分分为≥3分组(n=23)和≤2分组(n=20)；其中≥3分组sCD40L水平明显高于≤2分组，两者相比均有统计学意义，P<0.001。见表3，图3。sCD40L水平与TIMI危险积分相关(r=0.774，P<0.001)，见表4，图4。4.CHD各组sCD40L水平与冠脉造影Gensini积分相关性比较9 CHD各组冠脉造影Gensini积分值与sCD40L浓度值进行相关分析，结果显示均无相关性(见表5)。10 附图0.7y=0.0004x+0.19982R=0.99160.60.50.4OD0.30.20.10020040060080010001200sCD40L(ng/L)图1sCD40L的标准曲线Fig.1ThestandardcurveofsCD40L600.00scd40L500.00400.00300.00sCD40L(ng/L)200.00100.000.00control(a)SA(b)UA(c)AMI(d)图2各组患者血浆sCD40L水平Fig.2PlasmasCD40LlevelineachgroupAcomparedwithbP=0.716,acomparedwithcP=0.046,acomparedwithdP=0.013,bcomparedwithcP=0.019,bcomparedwithdP=0.005,ccomparedwithdP=0.61211 800sCD40L*700600500400sCD40L(ng/L)3002001000TIMI≤2(n=20)TIMI≥3(n=23)图3按TIMI危险积分分组后sCD40L浓度变化Fig.3ChangesofsCD40LconcentrationafterTIMIriskscoregrouping*ComparedwiththelevelofplasmasCD40LinpatientswithgroupTIMI≤2P<0.0011200y=92.969x+91.3032R=0.59971000800600sCD40L(ng/L)4002000012345678TIMIscore图4sCD40L水平与TIMI危险积分的相关性Fig.4ThecorrelationbetweenthesCD40LlevelandtheTIMIriskscore12 附表表1一般资料(x±s)Table1Generalinformation(x±s)对照组SA组UA组AMI组年龄(岁)57.4±10.661.5±8.762.5±8.859.2±12.6性别(男/女)15/1518/1214/1617/13吸烟14141216高血压20241817糖尿病711139家族史5343酗酒7564血糖(mmol/L)5.69±1.835.63±1.106.40±2.276.45±1.87TC(mmol/L)4.14±0.954.13±1.064.35±0.954.50±1.23TG(mmol/L)1.81±1.241.68±1.081.63±0.682.29±2.26LDL-C(mmol/L)2.50±0.642.45±0.752.65±0.692.71±0.81HDL-C(mmol/L)1.13±0.221.12±0.461.10±0.191.12±0.46表2各组患者sCD40L水平的比较(x±s)Table2ComparisonofsCD40Llevelsineachgroup(x±s)对照组aSA组bUA组cAMI组dsCD40L(ng/L)248.80±124.66234.00±100.58331.73±174.64*352.60±212.28*AcomparedwithbP=0.716,acomparedwithcP=0.046,acomparedwithdP=0.013,bcomparedwithcP=0.019,bcomparedwithdP=0.005,ccomparedwithdP=0.61213 表3按TIMI危险积分分组后sCD40L浓度变化(x±s)Table3ChangesofsCD40LconcentrationafterTIMIriskscoregrouping(x±s)TIMI≥3(n=23)TIMI≤2(n=20)t值P值sCD40L(ng/L)484.87±201.53252.30±112.364.575<0.001表4sCD40L水平与TIMI危险积分的相关性Table4ThecorrelationbetweenthesCD40LlevelandtheTIMIriskscore相关系数（r）P值sCD40L0.774<0.001表5冠状动脉的狭窄程度和sCD40L水平相关性分析Table5CorrelationanalysisofthedegreeofcoronaryarterystenosisandthelevelofsCD40LsCD40L组别Gensini积分rPSA组27.43±34.47-0.176P=0.35UA组30.56±29.39-0.081P=0.67AMI组42.65±27.790.188P=0.3214 讨论CHD主要是由冠状动脉粥样硬化病变所致。目前认为，AS是一种炎症过程，促进AS形成的损伤因子主要包括吸烟、高血压、高血糖、氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)等。这些因素都可以造成内皮细胞（ECs）的损伤，提高粘附细胞表面糖蛋白如血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和细胞内粘附分子(ICAM)的表达水平，使单核细胞向ECs粘附、迁移，并转化成为巨噬细胞（Mφ）。吞噬胆固醇，形成脂质条纹，进一步的伤害刺激继续使Mφ、肥大细胞等在斑块内聚集，凋亡使粥样硬化斑块帽处平滑肌细胞减少，激活的Mφ分泌基质金属蛋白酶（MMPs）削弱纤维帽，使斑块易于破裂，斑块的破裂使动脉粥样硬化斑块核暴露于血液中，从而导致血栓形成。所以动脉硬化形成的每个过程都有细胞因子、其他生物活性分子和炎症细胞的参与，量化测定炎性标记物，可以预测急性心血管临床事件[7]的风险。1.sCD40L与CHDCD40是Ⅰ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。CD40不仅表达于B细胞，还表达于与动脉粥样斑块有关的细胞如ECs、平滑肌细胞（SMCs）、Mφ等。CD40L是CD40的配体，属Ⅱ型跨膜蛋+白，TNF家族细胞因子。CD40L除了在活化的CD4T淋巴细胞表达外，在ECs、SMCs、Mφ、血小板等也有表达。不同于CD40，在典型的正常组织和处于静止状态的培养细胞不表达CD40L。除了膜结合型CD40L外，CD40L还以可溶型分子形式(sCD40L)存在于循环中。而循环中的sCD40L[8]主要来自于激活的血小板。CD40系统在AS及ACS中的作用及机制：1、斑块损伤形成的初期：CD40-CD40L相互作用所致的粘附分子和化学趋化因子表达、Th1介导的免疫应答分子在AS斑块形成初期起着重要的[9-18]作用。2、AS进展期：CD40与CD40L的相互作用可通过多种途径参与动脉粥样硬化性损伤的进展。在斑块局部内膜的厚度与斑块相关的细胞CD40表达的程度有明显的相关性。CD40与CD40L的相互作用引起持续[19-28]的吸引炎性细胞，扩大Th1介导的免疫反应，并参与新生血管的形成。3、斑块易损和ACS：CD40与CD40L的相互作用可刺激Mφ产生MMPs，促进细胞外基质降解，弱化纤维帽；CD40-CD40L的相互作用亦参与了粥15 [9,29-35]样斑块的破裂所致的血栓形成。4、sCD40L对ACS的意义循环血中sCD40L可能来源于活化的血小板和激活的T细胞，其中约95%来源于激活的血小板。血小板在斑块破裂或内皮侵蚀部位的粘附和聚集在血栓形成和ACS发展过程中起着关键的作用。一项研究提示ACS患者sCD40L水平与血小板的激活相关，UA患者血浆sCD40L的水平明显高于健康志愿[36][37]者或SA患者，可用于识别再发缺血事件的风险。MIRACL研究通过对UA和非Q波心梗基线sCD40L水平的检测发现，高水平的sCD40L（>第90百分位，>4369pg/mL）是再发心血管事件的危险因素（OR1.86，95%CI1.25~2.77），使用阿托伐他汀治疗是有益的，可降低48%的再发[38]心血管事件的风险。来自于OPUS-TIMI16研究指出血浆sCD40Ls水平位于中位数以上的ACS患者死亡事件和再发心肌梗死（MI）的风险增加，sCD40L与cTnI联合，可提供更好的危险度预测。然而同样来自于OPUS-TIMI16大样本（n=2403）研究发现在为期10个月的随访期内，升高的血浆sCD40L水平与ACS患者的心血管病事[39]件的发生风险缺乏相关性。结果缺乏重复性的原因除了可能与样本量的大小有关外，也可能与该样本经历了2次冻融，检测方法也有所不同有关。目前检测sCD40L有的使用的是血清，有的使用的是血浆。血液在体外凝[36]固时激活的血小板可释放sCD40L入血清，Aukrust等的研究显示UA患者的血小板内所含sCD40L明显减少,再刺激后血小板释放sCD40L比SA和对照组减少,说明UA患者血中所含已经脱颗粒的血小板比例多，因而血浆样本对于检测sCD40L可能更理想。此外，分离的血浆中残存的血小板量的不同也会影响sCD40L的水平，因而样本保存的温度、从取血到分离血浆所间隔的时间、离心速度均应标准化，以排除检测sCD40L时血[40-41]小板因素的影响。富含血小板的血浆经反复的冻融sCD40L的浓度升[42]高，而无血小板的血浆则无此现象。本研究测定在各类型CHD患者中血浆sCD40L的水平，发现AMI组和UA组sCD40L水平明显高于SA组和对照组，而在AMI组和UA组间sCD40L水平未见显著差异，SA组和对照组之间也未见显著差异。CHD患者易损斑块较稳定斑块炎症反应活跃，多种炎症因子表达增加，sCD40L作为炎性标记物，在ACS患者中的含量明显增加。这表明sCD40L水平能够反映CHD患者病情的严重程度。上述结果与前述多项研究一致，支持了16 CD40-CD40L系统可能与动脉粥样硬化的发生发展及斑块破裂导致的并发症的产生密切。故我们可预测高水平的sCD40L可能代表着斑块的不稳定状态,但仍有待于大规模前瞻性研究的证实。2.sCD40L在UA/NSEMI治疗策略中的意义ACS是在动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀的基础上，继发血栓形成的一组临床综合症，包括UA、NSTEMI和STEMI。通过积极的抗血栓治疗以及早期行冠脉成形术，可明显改善患者的预后，然而不是所有的患者都能从中受益，需要识别高危患者。MI溶栓研究提出了ACS患者具有预后性[5]意义的TIMI危险积分。该研究表明，TIMI危险积分高者预示具有死亡、非致死性MI及紧急再血管化的高风险。TACTICS-TIMl18研究中，对ACS患者进行TIMI危险积分，当TIMI危险积分>3时，14天内各种原因引起的[43]死亡和非致死性MI发生率急剧升高。据此提出：当TIMI危险积分>3时，早期介入治疗可使患者明显获益。TIMI危险积分简便易行，便于入院后即刻进行危险分层，决定采取何种治疗措施。[44]CAPTURE研究通过6个月的随访发现血清sCD40L水平>5μg/L的患者死亡风险和非致死性MI的发病风险增加，在冠脉成形术前应用阿西单抗治疗这些患者可降低风险，阿西单抗治疗的益处与sCD40L水平正相关。[45]FRISC研究表明CD40LG基因上-3459AGpolymorphismandpredictmyocardialinfarctionandtheefficacyofantithrombotictreatmentinnon-STelevationacutecoronarysyndrome.ArteriosclerThrombVascBiol,2006,26(7):1667-1673.46.DiStefanoR,DiBelloV,BarsottiMC,GrigoratosC,ArmaniC,Dell'OmodarmeM,CarpiA,BalbariniA.Inflammatorymarkersandcardiacfunctioninacutecoronarysyndrome:differenceinST-segmentelevationmyocardialinfarction(STEMI)andinnon-STEMImodels.BiomedPharmacother,2009,63(10):773-780.47.VirmaniR,KolodgieFD,BurkeAP,FarbA,SchwartzSM.Lessonsfromsuddencoronarydeath:acomprehensivemorphologicalclassificationschemeforatheroscleroticlesions.ArteriosclerThrombVascBiol,2000,20(5):1262-1275.48.BurkeAP,KolodgieFD,FarbA,WeberDK,MalcomGT,SmialekJ,VirmaniR.Healedplaquerupturesandsuddencoronarydeath:evidencethatsubclinicalrupturehasaroleinplaqueprogression.Circulation,2001,103(7):934-940.49.deLemosJA,ZirlikA,SchönbeckU,VaroN,MurphySA,KheraA,McGuireDK,StanekG,LoHS,NuzzoR,MorrowDA,PeshockR,LibbyP.AssociationsbetweensolubleCD40ligand,atherosclerosisriskfactors,andsubclinicalatherosclerosis:resultsfromtheDallasHeartStudy.ArteriosclerThrombVascBiol,2005,25(10):2192-2196.50.YamadaS,SenokuchiT,MatsumuraT,MoritaY,IshiiN,FukudaK,Murakami-NishidaS,NishidaS,KawasakiS,MotoshimaH,FurukawaN,KomoharaY,FujiwaraY,KogaT,YamagataK,TakeyaM,ArakiE.Arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology2018May;38(5):994-1006.24 综述CD40L系统在急性冠脉综合症的研究进展摘要：动脉粥样硬化（AS）是一种缓慢进展的，有免疫系统参与的慢性炎症性病变。在病变区CD40L及其受体过度表达，CD40-CD40L的相互作用参与了AS发生、发展乃至斑块破裂的过程，斑块破裂的发生作为AS过程的终端事件在临床上可能表现为急性冠脉综合症（ACS）。ACS患者循环血中可溶型CD40L（sCD40L）水平升高，循环中约95%的sCD40L来自于激活的血小板，因而，sCD40L有可能作为炎性标记物来预测ACS患者血栓形成的风险。干扰CD40-CD40L之间的相互作用可以减少斑块的形成、延缓斑块的进展，改变斑块的构成，使其更稳定。对CD40-CD40L系统与AS关系的深入的研究，可为ACS的防治提供新的思路。关键词：CD40；CD40L；sCD40L；动脉粥样硬化；急性冠脉综合症CD40LigandandItsReceptorinAcuteCoronarySyndromeAbstract:Atherosclerosisisachronicinflammatorydiseaseandimplicatecomponentsoftheimmunesysteminatherosclerosis.RecentworkhasdocumentedoverexpressionofthepotentimmunemediatorCD40anditscounterpartCD40ligand(CD40L)inatheroscleroticlesions.CD40/CD40Linteractionsplayacentralroleintheinitationandprogressionofatheroma,plaqueinstabilityandrupture.Attheextremeendofthisprocessplaqueruptureoccurs,whichmaymanifestclinicallyasanacutecoronarysyndrome(ACS).SolubleCD40L(sCD40L)isfoundtobeelevatedinpatientswithACS.Itisestimatedthat>95%ofthecirculatingsCD40Lisderivedfromplatelets.Hence,sCD40LcouldserveasamarkerofincreasedthromboticriskinACS.InterruptionofCD40/CD40Linteractionsnotonlydiminishedtheformationandprogressionofmouseatheroma,butalsofosteredchangesinlesionbiologyandstructure,whichareassociatedinhumanswith“plaquestabilization.”Itisimportantforfurtherinvestigationoftheintricateinterplay25 ofCD40andCD40Linthepathophysiologyofatherosclerosis.SuchstudiesmightleadtoinsightsintonoveltherapiesandprecautionsforACS.Keywords:CD40ligand;CD40;atherosclerosis;acutecoronarysyndrome在过去的几十年中CD40-CD40L系统在慢性炎性和自身免疫性疾病，及二者兼有的动脉粥样硬化（AS）中所起的重要作用引起了越来越多的[1][2]关注。Mach等发现人类主动脉粥样斑块内有CD40及CD40L的同时表达，且主要位于斑块的“肩部”，即斑块和动脉壁正常组织的分界上，CD40L和CD40主要定位于斑块内的内皮细胞（ECs）、平滑肌细胞（SMCs）+[3]和巨噬细胞（Mφ）上，CD4T淋巴细胞也表达CD40L。Häkkinen等也发现从II型损伤（脂质条纹）到进展的VI型损伤（进展斑块）CD40++和CD40L在T细胞（CD3cells)，Mφ(CD68cells)和SMCs上同时有表达。正常动脉却没有CD40L表达，仅在ECs有少量CD40表达。随后[4]Garlichs等发现急性冠脉综合症（ACS）患者血小板也表达CD40和CD40L。CD40-CD40L相互作用显著影响AS相关细胞的功能，并且与斑块的稳定性密切相关；在动物AS模型中，阻断CD40与CD40L的相互作用不仅减少了斑块的形成、延缓了斑块的进展，而且改变了斑块的构成，[5-9]使其更稳定。体内外的研究表明CD40-CD40L系统参与了AS发生、发展乃至斑块破裂的过程。ACS是在动脉粥样硬化斑块破裂或溃疡的基础上，继发出血或血栓形成的一组临床综合征，它包括不稳定性心绞痛(UA)、非ST段抬高性心肌梗死（NSTEMI）和ST段抬高性心肌梗死（STEMI）。通过积极的抗血栓治疗以及早期行冠脉造影并行血管重建治疗，可明显改善患者的预后，然而不是所有的患者都能从中受益，对用于识别ACS患者新的血栓事件风险和死亡风险的标记物的研究是必须的。在临床上ACS患者循环[10]血中可溶型CD40L（sCD40L）水平升高，而循环中的sCD40L主要来[11]自于激活的血小板。因而对CD40-CD40L系统与AS关系的深入的研究，可为AS及ACS的防治提供新的思路。本文综述了CD40系统在AS及ACS中的作用及由此提示的防治策略。1CD40系统简介26 CD40是一个由277个氨基酸组成的48kDa的Ⅰ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。CD40不仅表达于B细胞，还表达于与动脉粥样斑块有关的细胞如ECs、SMCs、Mφ等。体外实验表明许多的促炎因子如白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-3（IL-3），肿瘤坏死因子-α（TNF-α），粒细胞单核细胞-集落刺激子(GM-CSF)，干扰素-（γIFN-γ）[12]都能促进CD40的表达。CD40L（糖蛋白gp39，CD154）是CD40的配体，由261个氨基酸组成的39kDa的Ⅱ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子（TNF）家族细胞因子。+CD40L除了在活化的CD4T淋巴细胞表达外，在ECs、SMCs、Mφ、血小板等也有表达。不同于CD40，在典型的正常组织和处于静止状态的培养细胞不表达CD40L。除了抗原提呈给T细胞外，许多促炎因子（如IL-1、IL-2、TNF-α、INF-γ）和糖皮质素等可能通过激活的转录因子激动蛋白[12-15]-1(AP-1)和活化T细胞核因子（NF-AT）诱导T细胞上CD40L表达，[16]CD40L也可以通过自身诱导表达。除了膜结合型CD40L外，CD40L还以可溶型分子形式存在，血液循环系统中约95%的sCD40L来自于活化的血小板。体外研究表明，血小板被胶原、凝血酶、ADP激活后CD40L在几秒内迅速移位于血小板表面，随后在数分钟到数小时内被切下来释放[11]入血液，产生一个可溶性的片段sCD40L，这一过程可能与基质金属蛋[17]白酶（MMPs）和肌动蛋白的作用有关。CD40L和sCD40L具有相同三个结构基础使之能产生多种生物学效应。首先是TNF同源结构域，能结合于体CD40。其次是赖-精-谷氨酸序列能结合血小板糖蛋白ⅡⅢb/a（GPⅡⅢb/a）。最后，三聚体结构使之和受体结后能诱导产生各种信号反应。然而，仅膜结合型CD40L可诱导ECs促炎性细胞因子和粘附分子[18]的表达，而sCD40L则无此作用，这提示CD40L与sCD40L的作用机制不完全相同。CD40以同型三聚体形式存在，与CD40L结合后CD40被激活移入胞[19]内（可能通过三种途径移入胞内：脂筏、细胞膜穴样内陷、内涵体），CD40本身不能传递信息，需要TNF受体相关因子（TRAFs）结合于CD40胞浆内区而引发信号传递，CD40胞浆内区有2个TRAFs结合域：1个是TRAF2，3，5结合区，当与TRAF2或3或5结合后也可与TRAF1结合；一个是TRAF6结合区。当与TRAF1，2，3，5或6结合后而引发进27 一步的信号传递，引发的信号通路及产生的效应因结合TRAF的类型、被[19]激活的细胞种类，以及CD40移入细胞内的机制不同而异。例如，在单核细胞和MφCD40与TRAF6的结合对于激活Src/ERK1/2和IKK/NF-κB促炎性反应通路起着关键的作用，而在ECs和血管SMCs似乎是TRAF2介导了促炎性反应的信号通路。被CD40信号活化的最重要的转录因子是NF-κB，NF-κB移入细胞核继而增加各种粘附分子、细胞因子或趋化因子、生长因子、蛋白水解酶等的表达。2CD40系统在AS中的作用及机制2.1斑块损伤形成的初期CD40-CD40L相互作用所致的粘附分子和化学趋化因子表达、Th1介导的免疫应答分子在AS斑块形成初期起着重要的作用。在人类动脉硬化损伤的初始阶段，触发T淋巴细胞、Mφ、ECs和SMCs上CD4和CD40L表达的确切机制还不清楚，可能的诱发CD40和CD40L表达的因素包括氧化的低密度脂蛋白（ox-LDL）、病原体感染（如肺炎[12,20-22]衣原体）等。研究表明增加实验动物的脂质摄入可促进CD40L表[20]达，在体外培养的人冠状动脉ECs，ox-LDL可通过ECs上的血凝素样[21]氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1受体)引发CD40和CD40L的表达。[22]抗原提呈给T细胞可能是另一个早期促使CD40L表达的途径。CD40L[16]也可加强其自身及其受体的表达。此外，IFN-γ（在AS早期表达的细胞因子）也可诱导CD40及CD40L表达。在早期的斑块形成过程中，CD40和CD40L的相互作用可能起到了促进免疫活性细胞粘附于ECs的作用，外周血单核细胞移入内膜层成为Mφ。该作用在ECs和SMCs上可诱导E-选择素，血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，细胞内粘附分子-1（ICAM）等白细胞粘附分子的表达，在Mφ则促进淋巴细胞相关抗原（LFA-1）、ICAM-1表达，CD40L可加强T细胞粘附于体外培养的ECs上。通过ApoE基因敲除鼠的动物模型的研究[23,24]也证实了在缺乏CD40L的情况下，不仅ICAM-1、或P-选择素的表达减少、免疫活性细胞的粘附减少，而且斑块的面积减小。在人类的粥样斑块内ECs、SMCs、Mφ和T淋巴细胞上的CD40L可引起IL-18、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）、巨噬细胞炎症蛋白-1β（MIP-1β）、正常T细胞表达分泌调节活化因子（RANTES）、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）28 和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等化学趋化因子的过度表达和释放，这些趋化因子可能吸引并引导T淋巴细胞和Mφ在粥样斑块中积聚，并引发慢性炎症反应。例如，伴随着单核细胞和中性粒细胞与ECs的粘附，化[25]学趋化因子如MCP-1促进单核细胞迁移入内皮下。最近通过对CD40和LDL受体双缺陷鼠的研究表明CD40L与单核细胞上β2-整合素（Mac-1）[26]的相互作用介导了单核细胞的粘附，该作用与CD40无关。CD40-CD40L与IFN-γ的作用下激发斑块内辅助T细胞(Th1)免疫反应，通过减少白介素-10（IL-10）、白介素-4（IL-4）受体表达而抑制Th2介导的免疫反应。[27]此外，CD40-CD40L的相互作用也产生活性氧（ROS），使内皮产生的一氧化氮（NO）减少，引起内皮功能障碍促进AS。2.2AS进展期在动脉粥样硬化斑块朝着不同的、复杂的损伤发展的过程中通常涉及到了SMCs迁移和增殖，分泌细胞外基质分子如纤维状胶原和弹力蛋白形成纤维帽；形成的纤维帽覆盖于富含脂质的坏死核（通常由许多Mφ、死亡的或正在死亡的Mφ、细胞碎片如凋亡体和细胞外积聚的脂质构成）表面，代偿性管腔扩大，动脉重塑发生，以及内膜层新的血管形成。此阶段ECs和SMCs进一步表达趋化因子受体如CCR-1（MIP-1α受体）、CCR-2（MCP-1受体）、CCR-5（MIP-1α/β受体）、CXCR-4（SDF-1受体）。尽管CD40L可促进相应的趋化因子表达，但CD40L系统在富含[28]SMCs的纤维帽形成中所发挥的作用仍不确定。有研究表明，sCD40L以及淋巴细胞或血小板来源的膜结合型CD40L均可促进促进体外培养的牛冠状动脉SMCsDNA合成，但不能促进增殖，sCD40L也不诱导SMCs凋亡。这可能与sCD40L与受体作用可诱导多种促有丝分裂信号包括ERK-1/2和p38-MAPK磷酸化，直接刺激Iκ-Bα降解，促进NF-κBp65亚单位移位入核激活NF-κB系统，但不能激活PI-3-激酶途径（PI-3-激酶参[29]与了细胞有丝分裂由S期向M期的转变）有关。用CD40L抗体处理的[8]LDL受体缺陷鼠斑块内SMCs和胶原成分增加，而Mφ减少，这提示在AS的进展过程中，阻断CD40L信号可能产生抗炎活性，而不是抑制有稳定斑块作用的SMCs的增殖。在内膜层新的血管形成通常是由血管外膜层的滋养管长入，这些脆弱的血管内皮周围缺乏支持，易于引起动脉壁内出血。尽管血管形成是由浸29 润的炎性细胞释放的多种细胞因子和生长因子共同作用的结果，但是斑块内新血管形成的机制还不是很清楚。在动脉粥样斑块部位新形成的血管区[2]ECs上有CD40的表达，体外研究发现CD40L可诱导活化的ECs合成[30]和释放多种MMPs，而促进小管样结构形成。ECs上CD40-CD40L的相互作用参与的血管形成可能是通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)实现[31]的。CD40L诱导的血管生成作用可能还涉及到了IL-15、环氧化酶[32-34]（COX-2）和IL-8。CD40L在体外可诱导ECs、SMCs、Mφ表达COX-2，COX-2可通过诱导VEGF而加强纤维生长因子介导的血管形成。然而，最近的研究提示在动脉粥样斑块内微粒（MP，来自于Mφ活化或凋亡释放的亚微粒囊泡）上表达的CD40L通过与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）上CD40相互作用促进体外培养ECs增殖，是通过VEGF和PI3-激酶/AKT[35]实现的，该作用与COX-2、IL-8无关。提示CD40-CD40L的相互作用可能通过多种途径参与了血管新生。2.3斑块易损和ACSAS病变经历了长时期甚至是几十年的默默的不断的进展，直到出现了明显的血流阻塞，缺血发作或触发了血栓形成才会表现出临床症状。在ACS和突发心性死亡的患者中无血栓形成而仅仅是由于斑块所导致的狭窄大约占20-30%，由薄帽纤维斑块破裂所致血栓形成约占50-60%，斑块侵蚀所致血栓形成约占20%，由纤维帽破裂致使钙化结节突入管腔所致血[36]栓形成约占2%。其中约60%突发心性死亡的患者经历了大约4次的冠状动脉亚临床斑块破裂或侵蚀继而出现的亚临床冠脉血栓形成和愈合过[37-38]程。胶原纤维的减少使得纤维帽变脆弱，而易于破裂。MMPs可降解细胞[36]外基质而使斑块易损。Libby的研究表明，斑块中重要的间质胶原酶（MMP-1、MMP-8、MMP-13）的过度表达参与了纤维帽的破裂。T细胞表面的CD40L与Mφ上CD40的相互作用激活Mφ，促进斑块中Mφ产生大量的MMPs而影响斑块的稳定性。CD40L和CD40相互作用可以诱导ECs和SMCs释放IL-6、IL-8和IL-1β。另外CD40L也能诱导Mφ表达IL-1β、IL-8、IL-6、IL-12及TNF-α。IL-6、IL-1β可刺激Mφ产生MMPs，促进细胞外基质降解。斑块破裂使得斑块内促血栓形成的物质与血液接触，激活凝血过程。30 CD40L可诱导体外培养的Mφ、ECs和SMCs表达有促凝作用的组织因子[12]（TF），而使血栓调节素表达减少。TF与内皮下基质结合，引起ECs损伤，使局部容易形成血栓。由于血栓调节素与凝血酶结合能启动纤溶系统，因而CD40-CD40L相互作用增强凝血活性的同时抑制了抗凝作用。损伤部位胶原暴露可激活血小板，活化的血小板释放出sCD40L和[39]ROS。在高应力情况下，sCD40L通过GPⅡⅢb/a与纤维蛋白原的结合[40]促进血小板与血小板间的聚集。活化的血小板释放出sCD40L和ROS可进一步激活血小板、ECs、单核细胞、中性粒细胞等。通过CD40-CD40L的相互作用（包括sCD40L以及表达CD40的单核细胞、中性粒细胞、ECs）可激活ECs和单核细胞内炎性基因如NF-κB的表达，导致MCP-1、COX-2[41]合成增加，而形成一个正反馈环路，促进血栓形成。损伤部位血管细胞间的粘附在交织的炎性反应中起着重要的作用，sCD40L和CD40L均可刺激白细胞Mac-1的表达，而Mac-1是一个高度泛化的受体，可与ICAM-1、纤维蛋白原、血小板膜表面糖蛋白Ⅰbα（GPⅠbα）等配体相互[42-44]作用，而促进细胞间牢固的粘附，促进血栓形成。3sCD40L对ACS的意义sCD40L与膜结合型CD40L均可促进AS斑块的不稳定，与膜结合型CD40L不同的是循环血中sCD40L可能来源于活化的血小板和激活的T细胞，其中约95%来源于激活的血小板。血小板在斑块破裂或侵蚀部位的粘附和聚集在血栓形成和ACS发展过程中起着关键的作用。在临床上循环血中sCD40L水平的升高见于高胆固醇血症、糖尿病、缺血发作、ACS患者，[45-49]和经皮冠脉介入术后再狭窄高风险的患者。sCD40L水平较高的健康[50]女性心血管事件的发病风险增加。在一项基于多民族群体的大样本研究中发现血浆sCD40L可能不是一个用来筛查亚临床AS患者的有用工具，可[51]能更适于作为斑块稳定性的标记而不是斑块负荷的标记。ACS患者sCD40L水平与血小板的激活相关，UA患者血浆sCD40L的水平明显高于健康志愿者或稳定性心绞痛（SA）患者，可用于识别再发缺血事件的风[10][49]险。CAPTURE研究通过6个月的随访发现血清sCD40L水平>5μg/L的患者死亡风险和非致死性的心肌梗死（MI）的发病风险增加，在冠脉成形术前应用阿西单抗治疗这些患者可降低风险，阿西单抗治疗的益处与肌钙蛋白T无关，与sCD40L水平正相关，sCD40L可能是一个独立的心血管31 [52]事件风险标记物。MIRACL研究通过对UA和非Q波心梗基线sCD40L水平的检测发现，仅高水平的sCD40L（>第90百分位，>4369pg/mL）才是再发心血管事件的危险因素（OR1.86，95%CI1.25~2.77），使用阿托伐他汀治疗是有益的，可降低48%的再发心血管事件的风险。来自于[53]OPUS-TIMI16的小样本（n=195）研究指出血浆sCD40Ls水平位于中位数以上的ACS患者死亡事件和再发MI的风险增加，sCD40L与肌钙蛋白（cTnI）、C-反应蛋白（CRP）相关性不强，然而sCD40L与cTnI联合，可[54]提供更好的危险度预测。FRISC研究表明CD40LG基因上-3459AGpolymorphismandpredictmyocardialinfarctionandtheefficacyofantithrombotictreatmentinnon-STelevationacutecoronarysyndrome.ArteriosclerThrombVascBiol,2006,26(17):1667-1673.55.DiStefanoR,DiBelloV,BarsottiMC,GrigoratosC,ArmaniC,Dell'OmodarmeM,CarpiA,BalbariniA.Inflammatorymarkersandcardiacfunctioninacutecoronarysyndrome:differenceinST-segmentelevationmyocardialinfarction(STEMI)andinnon-STEMImodels.BiomedPharmacother,2009,63(10):773-780.56.OlenchockBA,WiviottSD,MurphySA,CannonCP,RifaiN,BraunwaldE,MorrowDA.LackofassociationbetweensolubleCD40LandriskinalargecohortofpatientswithacutecoronarysyndromeinOPUSTIMI-16.JThrombThrombolysis,2008,26(2):79-84.57.IvandicBT,SpanuthE,HaaseD,LestinHG,KatusHA.IncreasedplasmaconcentrationsofsolubleCD40ligandinacutecoronarysyndromedependoninvitroplateletactivation.ClinChem,2007,53(7):1231-1234.58.WenzelF,BaertlA,ZimmermannN,HohlfeldT,GiersG,OldenburgJ,41 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个人简历一、一般情况姓名刘丹亮性别男民族汉出生日期1982年02月22日籍贯辽宁省开原市二、个人经历1999.9-2004.7哈尔滨医科大学临床医学系2004.7-至今北京燕化医院心内科三、发表论文1心血管疾病患者死亡原因分析，生物技术世界2016.52急诊PCI时应用替罗非班的临床观察，生物技术世界2016.63比伐卢定联合PCI术对ACS患者的血脂、Scr、Bun及MACE水平的影响，实用心脑肺血管病杂志，2018.5（待刊）45