新发鸭生长迟缓病毒ELISA抗体检测方法的建立及传代致弱研究

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：密级：论文编号中国农业科学院学位论文新发鸭生长迟缓病毒ＥＬＩＳＡ抗体检测方法的建立及传代致弱研究ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎＥＬＩＳＡｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙｔｏＮｏｖｅｌＤｕｃｋＧｒｏｗｔｈＲｅｔａｒｄａｔｉｏｎＶｉｒｕｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅＡｔｔｅｎｕａｔｉｏｎＴｈｉｓＶｉｒｕｓｂＳｅｒｉａｌＰａｓｓａｅｙｇ硕士研究生：池秋燕指导教师：李泽君研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物及其分子生物学培养单位上海兽医研究所研究生院２０１８年５月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文新发鸭生长迟缓病毒ELISA抗体检测方法的建立及传代致弱研究DevelopmentofanELISAforDetectionofAntibodytoNovelDuckGrowthRetardationVirusandResearchontheAttenuationThisVirusbySerialPassage硕士研究生：池秋燕指导教师：李泽君研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物及其分子生物学培养单位：上海兽医研究所研究生院2018年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationDevelopmentofanELISAforDetectionofAntibodytoNovelDuckGrowthRetardationVirusandResearchontheAttenuationThisVirusbySerialPassageM.S.Candidate：QiuyanChiSupervisor：ProfessorZejunLiMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2018 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日 学 摘要鸭生长迟缓疫病是近年来我国新出现的传染性疾病，以发病鸭精神萎靡、生长发育迟缓为主要特征。该病主要发生在樱桃谷肉鸭，发病日龄集中在10～25日龄，少数鸭群于5～14日龄也有发病。该病一年四季均可发生，整体的发病率在15%以下。早期从发病鸭体内分离到一株未知RNA病毒，病毒粒子直径在70～100nm之间，有囊膜，命名为鸭生长迟缓病毒（Anhui2株）。该病毒人工感染不致死鸭子，但可在鸭群之间进行水平传播，引起鸭子生长缓慢，残次率增高。本研究以鸭生长迟缓病毒Anhui2毒株作为免疫抗原，分3次免疫6周龄的BALB/c小鼠，小鼠血清的抗体效价可以达到1:10000以上，将效价最高小鼠加强免疫后，取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合，获得抗Anhui2毒株的杂交瘤细胞。经过间接ELISA的筛选和3次连续的亚克隆，得到2株能稳定分泌抗Anhui2株的杂交瘤细胞株，分别命名为1-5和3-6G。通过效价的测定，两株单抗的细胞上清效价均为1:1000，腹水效价分别为1:10000和1:1000。经中和实验测定，2株杂交瘤细胞均具有中和活性，并且特异性良好。以Anhui2全病毒为包被抗原，筛选1-5单抗为使用单抗。对阻断ELISA各条件进行优化，最终确定了Anhui2全病毒作为抗原的最佳包被浓度为1.5µg/mL，待检血清最佳稀释度为1:10，作用时间为37℃1h。单抗中和效价为1:10000其最佳稀释度为1:20，作用时间为37℃1h。酶标二抗的工作浓度为1:3000，作用时间为37℃1h，建立了检测鸭生长迟缓病毒抗体的阻断ELISA方法。对316份阴性鸭血清样品检测结果进行统计学分析，计算出阴性鸭血清样品的平均抑制率(X)为1.9%，标准差(SD)为8.0%，规定本方法的判定标准为当阻断率PI≥25.9%时判为抗体阳性；PI≤17.9%时判定抗体阴性；17.9%