鸭甲肝病毒1型间接ELISA和CLEIA抗体检测方法的建立.pdf

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1、巧古单化论义鹏甲肝病毒１型间接化ＩＳＡ巧ＣＬＥＩＡ抗体检测方法的建立银凤桂爲爲乂爹二〇—六年六月■２５＋９分类号Ｓ８．６５．６密级公开ＵＤＣ６３６．５硕ｉ学位论文鸭甲肝病毒１型间接化ＩＳＡ和化ＥＩＡ抗体检测方法的建立银凤桂学科专业预防兽医学指导教师刘义军研究员副导师李晶助理研究员论文答辩日期２０１６年５月２１日学位授予日期２０１６年６月３０日答辩委员会主席杨威研究员广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成

2、果。除已特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大一学或其它单位的学位而使用过的材料。与我同工作的同事对本论文的研巧工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即；学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播。，可Ｗ采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇

3、编学位论文本学位论文属于：□保密。，在年解密后适用授权口不保密。＂＂（请在Ｗ上相应方框内打Ｖ）论文作者签名良ｇＭ日期：斗ＷＩ．指导教师签名：＞ｉ豕曰期《本巧］）作者联系电话：电子邮箱：１ＥＬＩＳＡＡ鸭甲肝病毒型间接和化ＥＩ抗体检测方法的建立摘要鸭病毒性肝炎（Ｄｕｃｋｖｉｒａｌｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＤＶＨ）是由鸭肝炎病毒（Ｄｕｄｅｈｅｐａｔｉｔｉｓｖ一ｉｍｓ，ＤＨＶ引起的种高致死率的传染病，主要感染２１日龄ｙＸ内的维鸭，）引起典型的肝炎症状，维鸭死亡率高达８０％１＾上且传播迅速，给养禽业生产造

4、成了极大的损失。在鸭肝炎病毒感染的检测与诊断方面，主要采用病毒分离、病毒中和试验［＾及病毒核酸检测等方法，虽各有优点，但耗时较－，。长无法满足大批量检测的需求因此，本研究选择我国ＤＨＡＶ１流行株的结构蛋白ＶＰ１进行了克隆和原核表达，纯化后的ＶＰ１蛋白作为检测抗原，建立了针对鸭甲肝病毒１型血清抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法和化学发光酶免疫分析ＣＬＥＩＡ快速检测方法。（）１．鸭甲肝病毒１型ＶＰ１基因的克隆与表达－－ＶＰ本研究利用ＲＴＰＣ民技术，ＤＨＡＶ１ＲＮＡ为模板，１基因扩增出，－－－－基因片段长７１４ｂｐ。构建了重组表达质粒ＥＴ２８ａ

5、ＶＰｌ和ＥＴ３２ａＶＰｌ，并ｐｐ－－－摸索其表达条件－：将重组表达质粒ｐＥＴ２８ａＶＰｌ和ｐＥＴ３２ａＶＰｌ分别转化到大肠杆菌表达菌株Ｒ〇ｓｅｔａＤＥ３中，选用不同的ＩＰＴＧ浓度和诱导时间，（）－进行重姐蛋白的诱导表达，表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析鉴定。结果表－－；ＶＰ１基因在Ｔ２８ａ和Ｔ３２ａ均获得表达明昨阳，表达的重组蛋白大小分别－－为：２７ｋＤａ、４７ｋＤａ。本研究选择表达量较高的ＥＴ３２ａＶＰｌ原核表ｐ达质粒，Ｉ－ＶＰｌ重组蛋白进行纯化－利用ＮｉＮＴＡ亲和层析对，ＳＤＳＰＡＧＥ电泳结果显。示纯度达到９５％Ｗ上，

6、可用作检测抗原２．鸭甲肝病毒１型抗体检测间接ＥＬＩＳＡ和ＣＬＥＩＡ方法的建立建立的间接化ＩＳＡ方法和ＣＬＥＩＡ方法，特异性均为１００％；板内重复性－－．．％重复性实验的变实验的变异系数分别为：１．１６％４８％、２．２７％２５５；板间－２－．巧％８．６％２．１８％４．巧％异系数分别为：、；说明这两种方法具有较高的持异性和稳定性，且ＣＬＥＩＡ方法灵敏度和重复性优于间接ＥＬＩＳＡ方法，为一－ＤＨＡＶ１的诊断提供种良好的检测方法。关键词：鸭甲肝病毒１型ＶＰ１基因原核表达间接ＥＬＩＳＡＣＬＥＩＡＩＩＥＳＴＡＢＬＩＳＨＭＥＮＴＯＦＩＮＤ

7、ＩＲＥＣＴＥＬＩＳＡＡＮＤＣＬＥＩＡＦＯＲＤＥＴＥＣＴＩＮＧＴＨＥＡＮＴＩＢＯＤＹＯＦＤＵＣＫＨＥＰＡＴ打ＩＳＡＶＩＲＵＳＴＹＰＥ１ＡＢＳＴＲＡＣＴＤｕｃｋｖｉｒａｌｈｅａｔｉｔｉｓＤＶＨｉｓａｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｏｆｈｉｈｍｏｒｔａｌｉｔｃａｕｓｅｄｐ（）ｇｙｂｄｕｃｋｈｅａｔｉｔｉｓｖｉｍｓＤＨＶｗｈｉｃｈｒｉｍａｒｉｌｉｎｆｅｄｅｄｄｕｃｋｌｉｎｓｗｉｔｈ２１ｄａｓｙｐ（），ｐｙｇｙｏｌｄ．ＤＨＶｌｅａｄｓｔｉｃａｌｈｅａｔｉｔｉｓｓｍｔｏｍｓ

8、ｉｎｄｕｃｋｗｉｔｈ