《褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：密级：公开专业学位研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的论文题目（中文）抗糖尿病机制研究Studiesontheanti-diabeticmechanismof论文题目（外文）Neu-p11basedonmitochondrialbalance研究生姓名岳颖学位类别药学硕士专业学位领域内分泌代谢药理学学位级别硕士导师姓名、职称张汝学教授论文工作2015年9月至2018年3月起止年月论文提交日期2018年4月论文答辩日期2018年5月学位授予日期校址：甘肃省兰州市 褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究中文摘要目的：探究褪黑素受体激动剂Neu-p11对2型糖尿病（T2DM）大鼠的糖代谢调节作用，并探讨其影响不同组织线粒体平衡的相关机制，寻求防治T2DM新思路，开辟T2DM治疗新途径。方法：1、造模和分组：Wistar（雌性）大鼠70只，适应实验环境10d后，随机抽取10只作为正常对照组，剩余60只大鼠作为造模组。正常对照组给予常规饲料，造模大鼠给予高脂饲料饲养，期间自由饮水。两个月后，造模大鼠采取腹腔注射小剂量STZ（30mg·kg-1），诱导造模组大鼠形成糖尿病模型，血糖值>13.0mmol/L的大鼠视为造模成功，剔除造模组中不合格大鼠，参照血糖和体重均分为糖尿病模型组、阳性药组、Neu-p11低、中、高剂量组，每组9只。2、给药：每天8:30am灌胃给药。正常对照组与模型组给予等量蒸馏水，阳性药对照组给予20mg·kg-1褪黑素，低、中、高剂量给药组分别给予5mg·kg-1、10mg·kg-1、20mg·kg-1的Neu-p11；灌胃体积为1ml·100g-1，持续4w。3、指标测定：每天对各组大鼠体重、摄食、饮水量进行记录，每周固定时间测定大鼠空腹6h血糖（FBG）值；于21天时，测定大鼠葡萄糖耐受量（IPGTT），空腹血糖（FBG），胰岛素含量（INS）；于28天处死大鼠，每组选取1只大鼠，取大脑、肝脏、胰腺制作病理切片（4%多聚甲醛，浸泡）；剩余大鼠断头处死，取血分离血清，摘取肝脏、海马、大腿肌肉，称重分装备用。适量称取肝脏和肌肉组织，蒽酮法测定糖原含量。测定各组大鼠的不同组织内ATP含量及ATP酶活性。4、基因和蛋白测定：采用RT-PCR技术测定大鼠肝脏、海马、肌肉线粒体融合蛋白（Mfn2）及肝糖代谢酶葡萄糖激酶(GK)、葡糖糖-6-磷酸酶(G-6-P)、糖原合成激酶-3（GSK-3）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的mRNA表达量；测定大鼠的不同组织中核呼吸因子（Nrf-1/2）、沉默调节蛋白1（Sirt1）、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）和雌激素相关受体α（ERRα）的mRNA表达量。WesternBlot法测定线粒体分裂蛋白（Drp-1）、过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α（PGC-1α）、线粒体融合蛋白（Mfn2）的相对表达。5、病理切片：采用HE染色法，观察各组大鼠不同组织病理的形态变化。I 结果：1、Neu-p11对T2DM大鼠的糖代谢的影响：与正常组比较，T2DM大鼠FBG、IR指数、糖耐量明显升高，不同组织内ATP含量降低，ATP酶活力有所减弱，模型组大鼠最为显著；与模型组相比，给药组均在不同程度上减轻T2DM大鼠高血糖状态，改善IR，提升葡萄糖耐受性，增加T2DM大鼠的ATP含量和增强ATP酶活力。其中Neu-p11低剂量组降低T2DM大鼠FBG、INS，明显增加IPGTT（P<0.05），褪黑素与低剂量组改善IR（P<0.05），提高T2DM大鼠ATP含量和酶活性（P<0.05）。2、Neu-p11对T2DM大鼠组织基因和蛋白的影响：相较正常组，T2DM大鼠肝脏组织中肝糖代谢酶基因表达异常，PEPCK、G-6-PmRNA表达显著升高（P<0.01），GK、GSK-3βmRNA表达明显降低（P<0.01），肝脏、海马和肌肉组织中Mfn2、AMPK、Sirt1、GCN5和Nrf1mRNA表达显著降低（P<0.01），ERRαmRNA表达升高（P<0.01），其中肌肉组织Nrf2mRNA表达显著升高（P<0.01），肝脏和海马组织内Nrf2mRNA降低（P<0.01），ATP酶mRNA表达显著减少（P<0.05），大鼠各组织中Mfn2、PGC-1α蛋白表达下降，肝脏Drp-1蛋白表达有所增加，海马、肌肉组织中Drp-1蛋白表达降低；与模型组相比，各给药组对T2DM大鼠组织内因子的基因和蛋白表达异常均有所改善，褪黑素与Neu-p11低剂量组上调大鼠Mfn2和GKmRNA的表达（P<0.05），下调PEPCK、G-6-PmRNA的表达（P<0.05）；增加各组织内AMPK、Sirt1、GCN5、Nrf1和Nrf2mRNA的表达，减弱ERRα和肌肉内Nrf2mRNA表达升高的趋势（P<0.05），Neu-p11低剂量组上调大鼠Mfn2、PGC-1α蛋白表达，下调Drp-1蛋白的表达过量，对T2DM大鼠不同组织内ATP酶mRNA的表达有所增加（P<0.05）。3、Neu-p11对T2DM模型大鼠不同组织病理形态的作用：相较于正常组，T2DM大鼠大脑、肝脏和胰腺组织均出现损伤状态，相较模型组，各给药组均可不同程度改善各组织损伤。结论：Neu-p11介导线粒体平衡可改善T2DM大鼠的IR、糖代谢异常及肝糖代谢酶mRNA异常表达，达到降低T2DM大鼠血糖的作用。褪黑素受体激动剂Neu-p11可能通过调节T2DM大鼠各组织线粒体平衡相关因子，维持线粒体功能正常，改善胰岛素抵抗。关键词：2型糖尿病，褪黑素，Neu-p11，肝糖代谢酶，线粒体平衡II Studiesontheanti-diabeticmechanismofNeu-p11basedonmitochondrialbalanceAbstractObjectTostudytheregulatoryeffectandmechanismofanewtypeofmelatoninreceptoragonistNeu-p11onglucosemetabolicthroughtheimpactingthemitochondriabalanceindifferenttissuesintype2diabeticrats,toseeknewideasideaforthetreatmentofT2DMandopneupnewwayofthetreatmentforT2DM.Method1.Moldingandgrouping:After10days’adjustingintheexperimentalenvironment,10of70femaleWistarratswererandomlyselectedasnormalcontrolgroupandtheremainingratswereusedasthemodelgroup.Theratsofnormalcontrolgroupwasgivenregularfeed,andtheotherratswerefedwithhighfatfeedandfreedrinkingwaterduringtheperiod.Twomonthslater,smalldoseofintraperitonealinjectionofSTZ(30mg·kg1)wereadministeredtootherratstoinducethediabeticmodel,andtheratswithbloodglucosevalueover13.0mmol/Lwereusedinthelaterexpeiments.Accordingtothebloodglucoseandbodyweight,theratsweredividedintodiabeticmodelgroup,low,mediumandhighdosesofmelatoninreceptoragonistNeu-p11groups,withhasnineratsofeachgroup.2.Drugadministration:Theexperimentaldrugsweregivenat8:30ameveryday.Thenormalcontrolgroupandthemodelgroupweregiventhesameamountofwater,andthepositivedruggroupwasgiven20mg·kg-1melatonin,andthelow-,medium-andhigh-dosegroupsweregiven5mg·kg-1,10mg·kg-1,and20mg·kg-1ofagonistNeu-p11,respectively,.Thevolumeofgavagewas1ml·200g-1,andthedrugwascontinuouslyadministeredto4w.3.Thedeterminationofindicators:Therats'weight,feedinganddrinkingwaterwererecordeddaily,andthefastingbloodglucose(FBG)levelwasmeasuredeveryweek.Thefastingbloodglucose(FBG),insulin(INS)content,theamountofglucosetolerance(IPGTT)weredeterminedatthe21thdayoftheexperiment;Atthe28thdayoneratineachgroupwereusedastheexecutedrattoobtainthebrain,liverandpancreasandsoakedin4%paraformaldehydeforpathologicalobservation;Therestoftheratswerekilledbyamputation,bloodserumwasseparated,andtheliver,musclesandhippocampuswereextractedandreloaded.Theanthronemethodwasusedtodeterminethecontentofglycogenbytakingappropriateamountofliverandmuscletissue.TheATPcontentandATPaseactivityofdifferenttissuesinratsweredetermined.4.Geneandproteindetermination:RT-PCRmethodwasusedforthedeterminationsofmitochondriafusionprotein(Mfn2),glycogenmetabolismenzymeglucosekinase(GK),enolphosphatetypepyruvatecarboxylase(PEPCK),glucose-6-sugarphosphatase(G-6-P),glycogensynthesiskinase-3(GSK-3)mRNAexpressioninthelivers,thehippocampus,muscleofrats.ThemRNAexpressionlevelsoftheIII activatedproteinkinase(AMPK),silentregulatingprotein1(Sirt1),nuclearrespirationfactor(Nrf-1/2)andestrogenreceptoralpha(ERRalpha)weremeasuredinthetissuesofrats.WesternBlotmethodwasusedtodeterminetherelativeexpressionofcytokines(pgc-1),mitochondrialfusionprotein(Mfn2)andmitochondrialsplitprotein(drp-1).5.Pathologicalobservation:HEstainingwasusedtoobservethemorphologicalchangesofdifferenttissuesindifferentgroups.Results1.EffectsofNeu-p11onglucosemetabolisminT2DMratsComparedwithnormalgroup,fastingbloodglucose(FBG),indexofinsulinresistance(IR)andglucosetoleranceweresignificantlyincreasedinT2DMrats;ATPcontentandATPenzymeactivitywerereducedindifferenttissues,especiallyinmodelgrouprats;Comparedwiththemodelgroup,thehyperglycemiaindrugadministrationgroupwasreducedtosomedegrees,andAlso,IRandglucosetolerancewereimproved,andATPcontentandATPaseactivitywereincreasedinT2DMrats.especiallyinlowdosegroupofNeu-p11,theFBGandINSweresignificantlydecreased,;inmelatoningroupandlow-dosegroup,IPGTTandIRwere(P<0.05)improved(P<0.05),andATPcontentandenzymeactivitywereincreasedinT2DMrats(P<0.05).2.EffectsofNeu-p11ontissuegeneandproteininT2DMrats:Comparedwithnormalgroup,glycogenmetabolismenzymegeneexpressionwereabnormalinlivertissueofT2DMratsPEPCK,G-6-PmRNAexpressionwassignificantlyincreased(P<0.01);GK,GSK-3βmRNAexpressionweresignificantlydecreased(P<0.01);liver,Mfn2,AMPK,Sirt1,GCN5andNrf1mRNAexpressionweresignificantlyreducedinhippocampusandmuscletissue(P<0.01),whileERRαmRNAexpressionwasincreased(P<0.01),espeiallythemuscletissueNrf2mRNAexpressionwassignificantlyincreased(P<0.01)andNrf2mRNAweredecreasedinliverandhippocampaltissues(P<0.01),ATPasemRNAexpressionwassignificantlyreduced(P<0.05).Mfn2andPGC-1αproteinexpressionweredecreased,Drp-1proteinexpressioninliverwasincreased,Drp-1proteinexpressioninhippocampusandmuscle;Comparedwithmodelgroup,tissuefactorandabnormalproteinexpressionofgenewereimprovedinNeu-p11groups,melatoninandMfn2andGKmRNAexpressionwereincreasedinlow-dosegroupofNeu-p11(P<0.05),PEPCKandG-6-PmRNAexpressionweredecreased(P<0.05);IncreaseAMPK,Sirt1,GCN5,Nrf1andNrf2mRNAexpression,abateERRαintissuesandNrf2mRNAexpressinmusclehaveatrendofincreasing(P<0.05),Mfn2andPGC-1αproteinexpressionwereupregulatedinlow-doseNeu-p11group,Drp-1proteinexpressionwasdown-regulated–andthemRNAexpressionofATPenzymewasincreasedindifferenttissueofT2DMratsin(P<0.05).3.EffectsofNeu-p11onphysiologicalmorphologyofdifferenttissuesinT2DMrats:Comparedwithnormalgroup,theliver,brainandpancreastissuewereindamagedstateinT2DMrats;whilemostofthemwereimprovedinthetissuesofNeu-p11treatedgroups,especiallyinlowdosegroupofNeu-p11.IV ConclusionThehypoglucemiceffectofNeu-p11maybemediatedbyimprovingIR,impairedglucosemetabolismandabnormalmRNAexpressionofhepaticglucosemetabolismenzymeinT2DMrats..Melatoninreceptoragonist,neu-p11,showedtheregulatoryeffectsonthemitochondrialbalance-relatedfactorsinvarioustissuesofT2DMratstomaintainnormalmitochondrialfunctionandimproveinsulinresistance.Keywords:type2diabetesmellitus,melatonin,Neu-p11,liverglucosemetabolismenzyme,mitochondrialbalance.V 目录中文摘要......................................................IAbstract....................................................III第一章研究背景...............................................1前言....................................................................................................................................11研究背景........................................................................................................................21.12型糖尿病致病因子及其防治.............................................................................21.2线粒体和2型糖尿病...........................................................................................21.2.1线粒体融合、分裂调节............................................................................31.2.2线粒体生化功能调节................................................................................41.2.3T2DM与不同组织内线粒体功能调节损伤.............................................51.32型糖尿病和肝糖代谢.........................................................................................81.4褪黑素、Neu-p11与线粒体和2型糖尿病........................................................92立题依据......................................................................................................................103研究内容......................................................................................................................114技术路线......................................................................................................................12第二章Neu-p11对T2DM大鼠糖代谢的药效学研究...................................132.1实验材料...................................................................................................................132.2实验方法...................................................................................................................152.3实验结果...................................................................................................................162.3.1FBG水平..........................................................................................................162.3.2IPGTT水平.......................................................................................................172.3.3胰岛素（INS）水平........................................................................................182.3.4肝糖代谢酶mRNA表达.................................................................................192.3.5肝/肌糖原含量.................................................................................................20I 2.3.6肝脏组织形态..................................................................................................212.3.7胰腺组织形态..................................................................................................222.3.8脑组织形态......................................................................................................232.4讨论...........................................................................................................................24第三章Neu-p11对T2DM大鼠不同组织内线粒体平衡的相关机制研究...261实验材料..........................................................262实验方法..........................................................283实验结果..........................................................323.1肝脏组织线粒体平衡相关因子测定结果.........................................................323.1.1肝脏线粒体相关因子mRNA的表达.....................................................323.1.2肝脏ATP含量、ATPMmRNA及其酶活力.........................................333.1.3肝脏组织内PGC-1α、Drp-1、Mfn2蛋白的相对表达........................353.2海马组织线粒体平衡相关因子测定结果.........................................................373.2.1海马线粒体相关因子mRNA的表达.....................................................373.2.2海马ATP含量、ATPMmRNA及其酶活力.........................................383.2.3海马组织内PGC-1α、Drp-1、Mfn2蛋白的相对表达........................393.3肌肉组织线粒体平衡相关因子测定结果.........................................................413.3.1肌肉线粒体相关因子mRNA的表达.....................................................413.3.2肌肉ATP含量、ATPMmRNA及其酶活力.........................................423.3.3肌肉内PGC-1α、Drp-1、Mfn2蛋白的相对表达................................444讨论..............................................................46第四章结语.......................................................................................................481研究结论..........................................................482研究意义..........................................................483展望..............................................................48参考文献..................................................................................................................................49在学期间的研究成果..............................................................................................................57II 致谢..........................................................................................................................................58文献综述..................................................................................................................................59III 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究第一章研究背景前言2型糖尿病（Type2diabetesmellitus,T2DM）是21世纪快速增长的流行病和全球的健康问题。目前，全球约3.5亿人患有此类疾病，欧洲约有600万人患有此类疾病，美国约有2560万人，而中国则约有1.096亿人,而这一数字在未来将持续增长[1][2]。此类疾病给病人、医护人员及国家、国际医疗保健系统带来巨大经济负担。由T2DM产生的相关疾病和并发症，如：心血管疾病、肾病等，导致全世界每年约400万人的死亡，据推测，随着T2DM此类慢性疾病的急剧增加，人类的平均寿命将可能产生本世纪第一次下降[1,3]。从历史的角度看，T2DM被认为是只影响发达繁荣国家的问题所在，而据最新的数据显示，80%的T2DM患者生活在贫穷和发展中国家[2-4]。我国作为世界人口大国，T2DM的现状不容乐观。更令人震惊的是面对T2DM患者人数不断增加，目前却鲜有全面创新的有效治疗策略来控制和对抗这一疾病[5]。众所周知，T2DM致病机制的原因之一是胰岛素抵抗（insulinresistance，IR），然而，IR的机制并未得到彻底研究，这一情况很可能是由于此类疾病的生物学基础鲜为人知[6]。现如今在这一领域的研究中，线粒体功能损伤是否影响IR的发生从而导致T2DM的发生和加剧，是极具争议的问题[7]。线粒体功能状态在T2DM的发生、发展中的作用十分重要，线粒体功能障碍与T2DM的发病机制互为因果，并且造成恶性循环，以线粒体为靶点的药物研发或基因治疗等手段，可能成为未来治疗T2DM的新思路[8]。图1-1T2DM发展形势1 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究1研究背景1.12型糖尿病致病因子及其防治自1916年第一部由ElliotProctorJoslin出版的糖尿病专著诞生以来，数以万计的科研工作者继续投身于糖尿病研究工作，100多年来，糖尿病的研究取得突出的成就，但其复杂的致病机制仍旧未被彻底攻克[9]。T2DM，作为21世纪快速流行且越发严重的长期慢性代谢类疾病，根据现如今的科研水平，能够通过有效的防治干预手段进行防预[10]。但其繁琐复杂的发病机制，致使机体多个重要器官如：脂肪、大脑、骨骼肌、β细胞、肝脏等生理作用备受影响[11,12]。目前，临床使用的药物多为合成药，大多具有一定的不良反应，多治少防，途径单一[13]。糖尿病伴随的并发症，其防治手段也缺乏特异性和有效性。治疗通路未有更大突破，各类药物的机理，集中于胰岛素增敏药，促进β细胞分泌剂，胰岛素辅助剂等[14,15]。迫切需要发现新型、高效、低毒的药物或新的治疗途径，致病机制和靶点。1.2线粒体和2型糖尿病近年来，线粒体功能障碍影响IR、T2DM的发病进展尚未清楚且极具争议，但大量研究已表明，通过某些生活方式干预和药物治疗改善胰岛素敏感性与增加线粒体的生物起源作用和氧化代谢功能是相关连的，增加线粒体质量和功能可能是构成治疗T2DM有效的治疗方法[16,17]。哺乳动物细胞中，线粒体是机体代谢的第一平台和能量生成器，T2DM营养富化的环境对线粒体生成了极大负担和超级化，导致氧化物质氧化不充分，类似甘油二脂、脂肪酸、活性氧等物质沉积[18]。而活性氧加剧诱导线粒体损害，导致胰图1-2线粒体与T2DM图片引自MartinSD,McgeeSL.Theroleofmitochondriaintheaetiologyofinsulinresistanceandtype2diabetes[J].Biochimicaetbiophysicaacta,2014,1840(4):1303-12.2 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究腺β细胞功能缺失，胰岛素分泌缺失，伴随发生核心器官、组织的代谢、能量紊乱失衡。线粒体一个具有动态特性的细胞器，在不同生理过程和机体环境刺激下，不断融合和分裂，二者协同进行，线粒体通过维持动态平衡来保证其功能正常，并通过控制其动力学平衡改变其功能[16,19,20]。研究表明，T2DM及IR发生时，线粒体发生数量、体积减小，密度分布差异，呼吸功能减弱，DNA分布不均，能量供应不足，ATP合成减少，线粒体生物合成下降等现象[18,21,22]。理解线粒体在T2DM中的变化的基因外调节机制，通过研究不同组织内调节其线粒体功能状态，为改善内分泌代谢作用，开启新的研究思路。1.2.1线粒体融合、分裂调节线粒体，一种具有半自主复制特性，受到核基因和线粒体基因双重管控的双层膜封闭式结构的细胞器，其线粒体DNA（mtDNA）是唯一的核遗传物质。线粒体的膜结构形态与线粒体的代谢状态密切相关[23]。低ADP条件下，将纯化线粒体置于其中，其呼吸能量受限，反之，存在高的呼吸活力，并出现“集聚”样的形态[24]。细胞内生存下的线粒体持续高频率的动态稳定，核基因与线粒体基因协作维持了线粒体乃至细胞生命的正常[25,26]。新线粒体的诞生是一个复杂的过程，可以理解为线粒体持续分裂融合的重塑，其形态、网络结构、内在蛋白的不断改变交融，mtDNA不断修复，代谢物质重新排布，高度可塑[23,25]。这一不间断过程，需要大约1000~1500个蛋白的协同合作，才能产生功能全面的细胞器。其中，主要动态行为涉及两个过程，融合和分裂，所涉及蛋白之间存在微妙的平衡[27]。研究发现，在饥饿或空腹状态下，线粒体更倾向于融合状态存活。线粒体融合蛋白（Mitofusin2，Mfn2）同时参与线粒体代谢、膜电位变化和呼吸等途径，是调节线粒体数量的重要因子[28]。Mfn2是一种位于线粒体外膜上的，由757个氨基酸组成的大分子蛋白，参与线粒体膜融合的早期步骤。Mfn2与内膜上的启动蛋白OPA1突变时，会造成细胞因缺乏线粒体融合发生呼吸功能衰竭[29,30]。图1-3线粒体融合分裂图片引自GaoAW,CantóC,HoutkooperRH.Mitochondrialresponsetonutrientavailabilityanditsroleinmetabolicdisease[J].EmboMolecularMedicine,2014,6(5):580.3 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究动力相关蛋白1(Dynamicrelatedprotein1,Drp1)，是细胞溶质内的动力相关蛋白，在营养丰沛的环境中，线粒体则倾向于分裂状态存活[28]。Drp1是主要存在于细胞质的四聚体结构可溶性蛋白，分裂开始时，线粒体定位调节蛋白之一的线粒体分裂蛋白1(Fissionprotein1,Fis1)招募其作用，Drp1转移位置到线粒体外膜，聚集至分裂位点，形成“索链”，改变分子间的距离和角度，Drp1水解GTP并进行收缩行为，最终形成两个独立的线粒体结构[31,32]。由此充分说明，机体内能量代谢平衡涉及线粒体结构的重塑，而线粒体动态融合分裂的平衡，决定机体组织内线粒体的含量、密度、分布等[33,34]。胰岛素敏感性也与Mfn2的mRNA、蛋白表达息息相关，增加Mfn2的表达可以提升T2DM状态下外周组织对胰岛素的敏感性[29]。1.2.2线粒体生化功能调节线粒体成分的协调表达也可以理解为被转录后的机制调节，是通过少量的DNA结合转录因子来实现，如核呼吸因子NRF-1/2和雌激素相关受体（Estrogenrelatedreceptorα，ERRα）[35]。NRFs是第一个被确定的线粒体生物因子的转录因子，NRF-1调控mtRNA转录和复制，同时作为启动子参与DNA的复制，有丝分裂等[36]。NRF-2虽NRF-1相似，但功能与结构无关，NRF-2直接与DNA结合，并与其它调控因子单元形成复合体[37,38]。ERRα以单体、同质二聚体或异质二聚体结构结合到ERR响应元素中(ERRE)位作为目标基因的启动子区域。可以调节自身基因，产生放大线粒体ERR靶基因转录的机制[35,37,39]。图1-4线粒体生物调节图片引自ZamoraM,PardoR,VillenaJA.Pharmacologicalinductionofmitochondrialbiogenesisasatherapeuticstrategyforthetreatmentoftype2diabetes[J].BiochemicalPharmacology,2015,98(1):16-28.4 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究广泛存在于不同组织和细胞中的过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α（Peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma,Coactivator-1α，PGC-1α）是一种作为线粒体生物起源的主要调控因子，诱导线粒体生物发生万能转录。一般情况下，PGC-1α驻留在细胞液中，由GCN5或过剩能源和类固醇受体共激活剂3(SRC3)控制[40,41]。PGC-1α通过相互作用于NRF-1/2、ERRα来激活主要转录因子从而调节线粒体的生物作用，保证细胞核和线粒体基因组的协调表达，提供产生新的功能性线粒体所需的所有成分，增加线粒体的数量和质量[40,42,43]。同时Mfn2与PGC-1α相互作用，PGC-1α可激活Mfn2，反之Mfn2含量降低或功能损伤时，PGC-1α作用减弱，由此调节线粒体动力学平衡[44]。一种NAD+-依赖型去乙酰酶的相关沉默调节蛋白1（Sirt1），通过转录因子的去乙酰化方式，调控多个细胞通路[45]。Sirt1介导PGC-1α去乙酰化，控制线粒体的基因表达、氧化功能，增加线粒体的生物作用，提升胰岛素的敏感性，在肝脏中增强肝脏葡萄糖的生物合成等[42,44,46]。线粒体，细胞产生ATP的主要场所，机体内能量的合成代谢及分解代谢皆集聚于此。也可以解释为细胞将营养物质转变为能量生成ATP及解偶联蛋白介导的产热作用[27,47]。线粒体数量与生物合成伴随营养供应的增加而上调。但富营养的大环境会毁坏这种适应性的调配，导致线粒体负荷超载和功能损失，最终线粒体衰退凋亡[48]。好氧ATP生产需要一种蛋白质网络，又称为电子传递链(ETC)，其结合电化学梯度和氧化磷酸化从ADP转至ATP[8,49,50]。这些蛋白质存在于由线粒体膜包裹的线粒体基质中，线粒体基质又是三羧酸循环(TCA)的循环位点，TCA一种从碳水化合物、脂质和蛋白质衍生而来的代谢产物的基本代谢途径，对机体的正常运转及其重要[51,52]。ATP参与的机体氧化呼吸等生化过程，其合成效率与胰岛素分泌、各组织线粒体功能息息相关[53]。线粒体合成效应器，如：PKA/CREB，AMPK和SIRT1[54]。SIRT1和AMPK可以调控脂肪酸氧化的系列基因表达，此外，在ATP能量限制条件下，作用于PGC-1α，由此提高氧化磷酸化能力和线粒体生物合成[47,53,55]。在T2DM患者中，胰岛素敏感性降低，血糖异常升高，各组织线粒体功能失衡都影响ATP的合成效率及ATP/ADP的比值，由此又加剧IR的发生，形成恶性循环[18,53]。1.2.3T2DM与不同组织内线粒体功能调节损伤T2DM俗称“富贵病”，由此不难理解的是机体内营养成分或能量代谢将被阻碍。作为把控代谢和能量稳态的第一平台，线粒体在IR及T2DM患者中呈现异常，由此涉及的潜在机制、生理功能、生物合成、能量等均改变[16]。与之改变相伴随的是发生线粒体适应性基因外调节机制，不同组织器官内则发生相应动力学信号、生物合成等过程的改变[56]。研究显示，T2DM的发生与线粒体氧化能力，组织内线粒体密度、含量，线粒体5 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究DNA浓度等相关。在T2DM患者和IR患者骨骼肌内线粒体磷酸化水平下降30%，而这一现象的解释是基于PGC-1α线粒体生物发生的关键调控器，以及多个线粒体协同因子，同时发现其骨骼肌内线粒体密度降低38%[57,58]。2002年，Kelly等人的研究，表明肌肉内线粒体功能与IR之间的关系，T2DM患者的骨骼肌线粒体功能失调，线粒体酶NADH:O2还原酶和柠檬酸合成酶(CS)的活性降低，导致骨骼肌中氧化基因表达协调减少，涉及重要调控因子为PGC-1α[59,60]。研究发现，发生肌肉胰岛素抵抗的女性，线粒体代谢基因表达减少的同时，PGC-1α的表达也可能减少[59,61]。骨骼肌内，ATP水平降低的直接作用下，AMPK的磷酸化和活化会引起细胞NAD+/NADH比率的增加；而AMPK可磷酸化PGC-1α，启动SIRT1下游的去乙酰化，AMPK和SIRT1对PGC-1a的乙酰化状态的影响，以及对其他转录调控因子的影响，随后调节线粒体含量及功能代谢[45,62,63]。进一步的证据证明，通过AMPK激活和增加SIRT表达，激活PGC-1α表达，通过协同ERRα、NRF-1/2等因子，可显著提升组织内线粒体DNA及其含量，从而改善胰岛素敏感性和肌肉功能[64]。图1-5T2DM时肌肉内线粒体调节脑部是具有持续能量需求特性的器官组织，但其几乎无糖原、脂肪、能量等的储存。一般由于其无法利用游离脂肪酸，而只能利用肝糖原分解或间接由其他能量库产生的葡萄糖[65]。认知功能障碍和痴呆是被低估和有所忽略的糖尿病并发症，其原因多由T2DM中慢性高血糖及高胰岛素血症等诱发刺激晚期葡萄糖形成[66]，导致ROS产生过量，蛋白质糖化，氧化应激增加等现象，而线粒体与这些现象关联密切[67]。脑部神经元是具备高能量消耗特性的代谢性细胞，几乎完全依赖线粒体获取能量，文献数据显示，在患有6 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究由T2DM导致的阿兹海默症大鼠脑内线粒体数量减少，海马的PGC-1a水平降低[68,69]。高脂喂养大鼠海马内SIRT1基因表达下降，刺激影响PGC-1a的脱乙酰作用，从而影响线粒体生物起源[70]。而2016年，耶鲁大学的研究者发现，脑部神经元的线粒体可以调控餐后高血糖。当高血糖发生时，大脑神经元细胞内的线粒体可以感知其变化，能够快速做出适应性的形态和功能改变，而这一微小精妙的调节可通过其调节通路作用于其他周围组织，从而调节机体大循环的血糖水平[71,72]。2013年，Pintana等人的研究发现，通过改善IR环境内的脑线粒体功能，可以减弱脑氧化程度，防止认知能力下降[73]。胰岛素和阿托伐他汀的结合治疗T2DM，可通过恢复T2DM大鼠大脑线粒体酶复合物活性，改善线粒体形态肿胀程度，降低对线粒体生物起源的影响，从而改善脑部细胞、树突等病理形态，脑部氧化应激，修复脑部功能[74]。图1-6T2DM时脑部线粒体调节T2DM患者肝脏组织中，ATP合成率降低40%，ATP周转率的降低影响了胰岛素分泌，阻碍了组织对葡萄糖的吸收，T2DM患者体内葡萄糖，不能被有效的利用从而导致血糖升高[75]。肝脏的功能主要由肝实质细胞完成，包括重要的蛋白质合成、碳水化合物代谢、胆汁分泌和解毒等。肝脏在糖代谢中的重要地位，是IR发生的焦点靶器官[76,77]。线粒体在肝脏内的含量丰富，肝脏无法顺利完成或执行脂肪酸、高血糖及高蛋白清除时，势必形成线粒体损伤[78,79]。IR于肝脏和肌肉组织内促进脂质的异位、沉积，这种“超载沉积”被视为是线粒体功能障碍的根本原因，线粒体负荷代谢又成为胰岛β细胞损伤的主因，由此循环。研究数据表示，ZDF大鼠（T2DM基因模型大鼠），特征为IR伴随持续的代谢综合症，其肝脏和大脑组织会产生与氧化还原平衡及线粒体功能障碍相关的并发症[75,80]。Buchner发现，由外周IR，肝胰岛素敏感肥胖和T2DM患者肝脏分离出的线粒体，均存在较高氧通率，这可能与线粒体活动加剧有关。在其肝脏内PGC-1a、NRF1和TFAM的基因表达水平低，ATP含量降低，但其ROS和DNA损失未有升高，可能7 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究与线粒体活动增加产生抗氧化防御功能提升有关[81,82]。图1-7T2DM时肝脏内线粒体调节调节临床研究中显示，肥胖患者、T2DM患者、及Zucker肥胖大鼠检测其Mfn2的mRNA和蛋白表达量与BMI呈负相关，与胰岛素敏感性呈正相关[83]。而当减轻体重后，表达增加，胰岛素敏感性升高，指示出线粒体融合分裂调节异常参与IR的发展。采取运动、耐力训练或者药物治疗等有效手段可以增加肌肉内PGC-1α的表达量，PGC-1α刺激骨骼肌内线粒体Mfn2的转录和表达[74,84]。基于T2DM与各组织内线粒体复杂关系发现，改善线粒体功能可以作为防治IR和T2DM的有效途径，线粒体生物合成、结构变化、动力学调节途径可能提供一种治疗IR和T2DM新的分子机制。1.32型糖尿病和肝糖代谢随着人们生活水平的提高，饮食的富营养化，人体环境现如今处于不断地营养变化中，我们的机体要面对这些变化，必须调整其新陈代谢以维持能量在体内平衡。T2DM，糖代谢异常是其主要发病特点，对于糖尿病病人维持系统的葡萄糖稳态尤为重要[85]。在组织水平上，多个器官参与控制葡萄糖稳态，主要是通过激素的分泌来介导调节葡萄糖的摄取、储存、分布以及它们的新陈代谢（如胰岛素和胰高血糖素）。在胰岛素与抗胰岛素因子比例下降、饥饿、运动等环境中，肝脏将葡萄糖以不同剂量释放进入血液循环，维持血糖在一个狭窄的水平范围[76]，因为它有能力同时消耗在喂食/禁食期间葡萄糖的储存和生产，可见肝脏对葡萄糖稳态的控制起着重要的作用。肝脏内葡萄糖过度生成和肝糖原储存减少导致T2DM患者血糖升高的主要病因之一。肝脏胰岛素抵抗（IR）表现为肝糖代谢平衡紊乱，涉及到糖酵解、糖异生和肝糖原的合成分解等多个途径的异常[86]。葡糖糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G-6-P)是所有参与糖代谢酶糖异生的两大关键酶中之一中极为重要的一类酶。糖原在肝脏组织细胞中水解8 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究生成葡萄糖-1-磷酸，通过异位反应后又转变成为葡萄糖-6-磷酸[87]。葡萄糖-6-磷酸可直接参与糖酵解，若G-6-P活性增强，则会导致肝葡萄糖生成的进一步增加，加重葡萄糖代谢失衡[88]。葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)在肝脏糖酵解过程中，参与葡萄糖的磷酸化，使其转变成葡萄糖-6-磷酸葡萄糖，GK催化第一步反应，加速葡萄糖代谢及糖原的合成[89,90]。糖原合成激酶-3（Glycogensynthasekinase-3,GSK-3）作为糖原合成酶激酶具有多种生物学作用。GSK-3α主要调节肝糖原合成及积累，对肌细胞糖原代谢作用弱；在静息细胞中，GSK-3β可以磷酸化GS的丝氨酸位点，抑制GS活性，减少糖原合成[91,92]。T2DM高血糖时，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvatecarboxylasekinase,PEPCK）活性明显增加，血糖升高，糖异生增快，而肾上腺素、胰高血糖素及糖皮质激素和甲状腺素等可活化升高PEPCK表达量，抑制PEPCK的活性有利于降低高血糖[93,94]。以上关键酶均参与其中并发挥重要作用。图1-8肝糖代谢调节T2DM状态下，肝脏内线粒体融合蛋白（Mitofusin2，Mfn2）可以介导机体细胞能量代谢、信号传导，其缺失及表达下降使得肝细胞线粒体结构形态和功能调节异常，发生肝脏胰岛素抵抗，导致肝糖代谢失衡[78,82]。因此，基于Mfn2介导的肝脏糖代谢变化可作为糖尿病治疗的潜在新型靶点。1.4褪黑素、Neu-p11与线粒体和2型糖尿病褪黑素（Melatonin）是一种可循环性激素，主要在松果体中合成分泌，也存在于其他组织内。它对线粒体功能的维持及机体葡萄糖稳态的维持、T2DM导致的IR等都具有调节作用[95]。一些研究表明，外源性褪黑素可以改善动物肥胖而不影响食物的正常摄入和运动状态。另有一些实验结果证实，褪黑素可以改善不同病因造成的不同组织如：大脑、肝脏，以及心脏和骨骼肌内的线粒体功能障碍和平衡失调，可通过影响信号传导、线粒体呼吸以及氧化应激等来达到改善病症的效果[75,95]。同时证实，褪黑素不仅可以改9 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究善线粒体呼吸功能和减轻氧化应激，还可以直接抑制线粒体渗透性过渡孔（mPTP），涉及到信号传导凋亡与坏死细胞清理[96]。Neu-p11，新型褪黑素受体激动剂，相较褪黑素具有半衰期更长，选择性更高，不良反应小，易合成的优势。本课题组前期研究表明，褪黑素及其受体激动剂Neu-p11可以改善T2DM大鼠的糖脂代谢紊乱，IR，也可改善由于长期应激反应导致的T2DM。由此我们可以大胆假设，褪黑素及Neu-p11是否可以通过介导线粒体平衡及其功能来改善IR和T2DM。2立题依据正常组织细胞内腺苷酸激活蛋白激酶(AMPactivatedproteinkinase，AMPK)磷酸化激活后，诱导沉默调节蛋白1（Sirt1）介导的PGC-1α通路，协同下游靶基因ERRα共同作用，调节Mfn2，影响线粒体融合效率[97]。同时Sirt1/PGC-1α通路，可启动核呼吸因子NRF-1/2，调控线粒体DNA表达，调控线粒体生物合成和氧化磷酸化过程，影响线粒体内ATP合成，ATP酶活性[34,52]。T2DM发生时，线粒体在不同组织中ATP合成的减少，酶活性降低，高糖状态下机体细胞内AMPK活性抑制，表达减少，导致PGC-1α、NRF-1/2的表达减少[98]，生物合成失调，线粒体呼吸作用破坏，Mfn2蛋白表达降低，线粒体融合降低，动态平衡失衡，线粒体功能降低，从而致使外周细胞感受胰岛素的敏感性减弱[99,100]。图1-9立题依据图片引自ZamoraM,PardoR,VillenaJA.Pharmacologicalinductionofmitochondrialbiogenesisasatherapeuticstrategyforthetreatmentoftype2diabetes[J].BiochemicalPharmacology,2015,98(1):16-28.10 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究基于本实验前期研究，已证明褪黑素及褪黑素受体激动剂Neu-p11在高脂和应激T2DM大鼠模型上均能改善其糖脂代谢，且药效作用更为显著的为Neu-p11。同时延伸开展了富含褪黑素中药的药效活性筛选，取得较好的有效药物桑叶，发现桑叶可显著改善T2DM大鼠，基于褪黑素功能作用，探索了桑叶介导T2DM大鼠不同组织的线粒体平衡及功能改善T2DM大鼠IR，降低血糖及其他生理生化功能的作用机制。本课题延续前期科研工作，进一步证实褪黑素及其受体激动剂Neu-p11可以以介导T2DM大鼠不同组织线粒体平衡和肝糖代谢为机制，改善IR等糖尿病生理病症，同时佐证桑叶治疗T2DM大鼠可能是以线粒体平衡和功能等相关蛋白为靶点来作为治疗T2DM的机制。3研究内容本课题主要研究内容有：1、以长期喂养高脂饲料并协同小剂量STZ所建造的T2DM大鼠为模型，研究通过介导线粒体平衡影响T2DM大鼠的糖代谢水平，肝糖代谢关键酶基因的表达，以大鼠血糖与胰岛素水平为依据，评价褪黑素与Neu-p11的药效活性；2、基于线粒体功能平衡改善T2DM的机制理论，研究褪黑素受体激活剂Neu-p11对T2DM大鼠不同组织内线粒体功能及平衡相关蛋白、基因表达，ATP含量及其酶活性的影响。探讨褪黑素及Neu-p11治疗糖尿病的机制靶点。11 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究4技术路线12 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究第二章Neu-p11对T2DM大鼠糖代谢的药效学研究摘要：目的研究褪黑素受体激动剂Neu-p11对线粒体融合蛋白（Mitofusin2，Mfn2）介导2型糖尿病大鼠（T2DM）大鼠肝糖代谢关键基因的调节作用。方法采用长期高脂肪饲养加小剂量链脲佐菌素(STZ，30mg·kg-1，ip)诱导雌性大鼠2型糖尿病动物模型，分为模型组、阳性药对照组和Neu-p11低、中、高剂量组，同时增加正常大鼠为对照组，灌胃给药4周。测定大鼠空腹血糖（FBG），胰岛素含量（INS），葡萄糖耐受量（IPGTT）。采用RT-PCR方法测定肝脏线粒体融合蛋白（Mfn2）及肝糖代谢酶葡萄糖激酶(GK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、葡糖糖-6-磷酸酶(G-6-P)、糖原合成激酶-3（GSK-3）的mRNA表达量。测定肝、肌糖原。观察肝脏、脑、胰腺组织病理形态变化。结果与正常组比较，T2DM大鼠空腹血糖值显著升高，胰岛素抵抗（IR）指数升高，Mfn2和GKmRNA表达下降，PEPCK、G-6-PmRNA表达显著升高（P<0.01）。与模型组相比，Neu-p11低剂量组降低T2DM大鼠INS（P<0.05），褪黑素与低剂量组改善IR（P<0.05），上调大鼠肝脏Mfn2和GKmRNA的表达（P<0.05），下调PEPCK、G-6-PmRNA的表达（P<0.05）；同时，给药组均维持并改善了T2DM大鼠的肝脏、胰岛、脑部海马组织形态。结论Neu-p11可改善由Mfn2介导的T2DM大鼠的胰岛素抵抗、糖代谢异常及肝糖代谢酶mRNA异常表达，达到保护组织形态，治疗糖尿病的作用。关键词：2型糖尿病，褪黑素，Neu-p11，Mfn2、肝糖代谢酶前言2型糖尿病（Type2diabetesmellitus，T2DM）作为威胁人类健康的慢性代谢疾病，发病机制复杂。糖代谢异常是其主要发病特点，其中以肝脏内过度生成葡萄糖和糖原储存减少致使血糖升高为主要病因。肝脏胰岛素抵抗（insulinresistance，IR）表现为肝糖代谢平衡紊乱，涉及到糖酵解、糖异生和肝糖原的合成分解等多个途径的异常，而肝糖代谢的关键酶葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvatecarboxylasekinase,PEPCK）、葡糖糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G-6-P)、糖原合成激酶-3（Glycogensynthasekinase-3,GSK-3）均参与其中并发挥重要作用[1]。近年来T2DM与线粒体功能调节之间的关系成为研究热点之一，认为T2DM的IR，糖脂代谢异常等都与线粒体功能障碍有重要关系[2-3]。线粒体融合蛋白（Mitofusin2，Mfn2）13 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究参与线粒体的融合，与线粒体的结构形态及功能调节变化有着不可分割的联系，可以介导机体细胞能量代谢、信号传导等。T2DM状态下，肝脏内Mfn2的缺失及表达下降使得肝细胞线粒体结构形态和功能调节异常，发生肝脏胰岛素抵抗，导致肝糖代谢失衡[4-5]。因此，基于Mfn2介导的肝脏糖代谢变化可作为新型的糖尿病治疗潜在靶点。2.1实验材料2.1.1实验动物Wistar大鼠，SPF级，60只，体重（160-180）g，雌性，由兰州大学提供，动物合格证号：No:62000800000144，许可证号：SCXK（甘）2016-0001。于室温18~25℃的兰州总医院动物科饲养，定量摄食进水。2.1.2主要药品与试剂表2-1药品与试剂名称批号生产厂商MosheLaudon教授以色列NeurimPharmaceuticalsLtd.Neu-p11惠赠公司褪黑素M5250Sigma公司链脲佐菌素（STZ）S0130Sigma公司柠檬酸20100304天津市大茂化学试剂厂生理氯化钠溶液140402安徽双鹤药业有限公司柠檬酸三钠20090826莱阳市双双化工有限公司血糖测定试剂盒163351中生北控生物科技股份有限公司50%葡萄糖注射液C1506145湖南中南科伦药业有限公司胰岛素放射免疫分析药盒S10950186天津九鼎医学生物工程有限公司PrimescriptRTMasterMixRR036ATakaRa公司TaKaRaMiniBESTUniversalRNA9767TakaRa公司ExtractionKitTaKaRaSYBRPremixExTaq测RR802ATakaRa公司定试剂盒4%多聚甲醛Cat#P1110Solarbio公司蒽酮BCBN2647VSigma公司高脂饲料自备兰州军区兰州总医院动物实验科2.1.3实验仪器表2-2实验仪器14 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究仪器名称生产厂商Sigma3K15低温离心机德国Sigma公司IEC-Micromax离心机美国ThermoElectron公司MG96GLongGenePCR仪杭州朗基科学仪器有限公司ABViiA7RealtimePCR美国AppliedBiosystems公司BP210S电子天平赛多利斯有限公司公司PHS-3B型PH计雷磁仪器公司HP-8453紫外分光光度计美国惠普公司SpectraMaxi3全自动荧光酶标仪美国Molecular公司VitalabISP-21半自动生化分析仪荷兰VitalScientific公司2.2实验方法2.2.1T2DM大鼠模型的建立、分组及给药Wistar雌性60只大鼠，应10d实验环境适后，随机抽取分出10只大鼠作为正常对照组，剩余50只大鼠作为造模组。普通饲料喂养正常对照组，高脂饲料喂养造模大鼠，期间自由饮水。两个月后，建造模型的大鼠空腹16小时后，腹腔注射STZ（30mg·kg-1），依照体重，7天后测取空腹血糖值，根据大鼠血糖状态未达标者再次注射STZ（15mg·kg-1），7天后测取空腹血糖，将血糖值>13.0mmol/l的大鼠视为造模成功，剔除不合格造模大鼠，参照血糖和体重均分为糖尿病模型组、阳性药组、褪黑素受体激动剂Neu-p11低、中、高剂量组，每组9只。每天8:30am灌胃给药。正常对照组与模型组给等量蒸馏水，阳性药褪黑素组给予20mg·kg-1，给药低、中、高剂量组分别给予5mg·kg-1、10mg·kg-1、20mg·kg-1Neu-p11；体积为1ml·100g-1，进行灌胃，持续4w。2.2.2空腹血糖（FBG）的测定分别于第7、14、21，和28天，各组大鼠饮水禁食6h后，采取乙醚麻醉，眼球后静脉丛取血，6000rpm，4min离心，取血清，测取空腹血糖值（Glucoseoxidasemethod，葡萄糖氧化酶法）。2.2.3腹腔糖耐量（IPGTT）水平测定给药d21天，大鼠禁6h食不禁水后，根据大鼠体重腹腔注射50%葡萄糖溶液，注射体积1ml·200g-1。乙醚麻醉大鼠，在时间点为注射前0min，注射后30min、60min和120min，取静脉丛血（眼球后），加入EP管（50U·mL-1，抗凝剂肝素钠），6000rpm，4min离心；用葡萄糖氧化酶法测定四个时间点的血糖值。2.2.4胰岛素（INS）含量的测定及胰岛素抵抗指数（HOME-IR）、胰岛素敏感指数（ISI）的计算血清INS含量采用放免法测定，依照测定试剂盒说明书进行操作。HOME-IR=FBG(mmol·l-1)×INS(mIU·l-1)/22.5ISI=Ln1/[FBG(mmol·l-1)×INS(mIU·l-1)]2.2.5大鼠肝脏组织相关基因表达的测定大鼠处死后，剖取大鼠肝脏组织，称取约20mg，15 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究加BufferRL试剂600ml研磨匀浆，提取肝脏组织中的总RNA。将提取的总RNA反转录为cDNA，反应条件：37℃15min；85℃，5s；-20℃保存。根据线粒体融合蛋白Mfn2，肝脏糖代谢关键酶GK、PEPCK、G-6-P、GSK-3、基因序列涉及引物（如表1）。RT-PCR：反应条件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，31s；40个循环；-20℃保存。每批模板均同时进行内参β-actin和目的基因的扩增反应。表2-3引物序列序号基因上下游引物序列（5'to3'）F5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'1β-actinR5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'F5'-AGCTGTGATGAAGTCCATTGGTTG-3'2GKR5'-TGCATCTTGGGATTCTATGAGGTG-3'F5'-AAAGCATTCAACGCCAGGTTC-3'3PEPCKR5'-CACCACATAGGGCGAGTCTGTC-3'F5'-AACGTCTGTCTGTCCCGGATCTA-3'4G-6-PR5'-CCTCTGGAGGCTGGCATTGTA-3'F5'-TTCTCGGTACTACAGGGCACCA-3'5GSK-3βR5'-GTCCTAGCAACAATTCAGCCAACA-3'F5'-AGCGTCCTCTCCCTCTGACA-3'5Mfn2R5'-TTCCACACCACTCCTCCGAC-3'2.2.6大鼠肝/肌糖原含量测定使用糖原测定试剂盒，分别测定。2.2.6统计学分析采用SPSS22.0软件统计学分析，数据表示方法（±S），组间均数差异分析方法采用单因素方差，显著性使用t检验进行统计学分析，P<0.05表示具有统计学差异。2.3实验结果2.3.1FBG水平与正常组相比，T2DM大鼠FBG值，明显高于正常组（P<0.01）。给药一周，相较16 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究于模型组，Neu-p11组大鼠血糖，产生降低趋势；持续给药，阳性药药效不显著，Neu-p11低剂量组具有持续降低糖尿病大鼠血糖的作用并且空腹血糖值逐渐降低，对比模型组，给药四周后形成差异（P<0.05）。表2-4Neu-p11对T2DM大鼠空腹血糖的影响（mmol•l-1，±S，n=9）DoseGroup0w1w2w3w4w(mg·kg-1·d-1)Control06.15±1.176.35±0.586.32±0.485.14±0.606.28±0.89Model022.84±7.29**24.20±2.42**25.01±5.93**26.23±4.08**27.55±7.04**MLT2022.43±4.44**23.49±2.53**24.83±4.92**25.31±5.00**27.06±8.11**Neu-L522.83±3.70**22.87±4.52**22.20±3.16**21.91±6.67**20.79±5.58**#Neu-M1022.69±4.08**22.94±6.24**23.29±3.36**24.83±2.51**24.24±5.19**Neu-H2022.13±3.84**22.51±3.67**23.72±4.10**25.40±1.21**25.33±3.90**图2-1Neu-p11对T2DM大鼠空腹血糖的影响（mmol•l-1）注：*P<0.05，**P<0.01，与正常对照组比较；#P<0.05，##P<0.01，与模型组比较。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。2.3.2IPGTT水平腹腔注射50%葡萄糖，30min，各组大鼠血糖达到峰值。相较正常组，T2DM大鼠血糖显著升高（P<0.01），相较模型组，给药各组血糖值同样呈现上升，随时间变化血糖逐渐降低；60min、120min相较模型组Neu-p11低剂量组血糖值下降明显，高剂量与褪黑素组血糖值降低无明显趋势。17 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究表2-5Neu-p11对T2DM的IPGTT的影响（mmol•l-1，±S，n=8~9）-1）Dose血糖值（mmol·lGroup(mg·kg-1·d-1)0mim30min60min120minControl05.14±0.6022.92±6.3014.14±4.787.48±2.11Model026.23±4.08**32.85±1.24**30.23±1.39**28.97±2.13**MLT2025.31±5.00**30.17±3.42**29.96±3.45**27.66±4.39**Neu-L521.91±6.67**28.66±2.73**26.97±2.61**24.26±3.74**Neu-M1024.83±2.51**30.14±4.25**28.04±4.74**25.11±5.21**Neu-H2023.66±1.87**29.44±2.14**27.29±2.72**24.71±3.35**图2-2Neu-p11对T2DM的IPGTT的影响（mmol•l-1）注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。2.3.3胰岛素（INS）水平如表2-6数据显示，相比与正常组，T2DM大鼠胰岛素水平和HOMA-IR均有较大上升，而ISI降低，相较模型组，低剂量对胰岛素抵抗有所缓解，但给药组改善T2DM大鼠的胰岛素敏感程度小。18 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究表2-6Neu-p11对T2DM大鼠胰岛素（INS）水平的影响（μIU•ml-1，±S，n=8~9）DoseINSGroupFBGHOMA-IRISI(mg·kg-1·d-1)(μIU·ml-1)Control06.28±0.896.77±2.561.88±1.21-3.74±0.21Model027.55±7.04**15.83±5.78**19.38±2.02**-6.07±1.02**MLT2027.06±8.11**14.57±2.33**17.52±1.89**-6.13±0.89**Neu-L520.79±5.58**#11.75±3.87**#10.85±2.49**#-5.59±2.11**Neu-M1024.24±5.19**13.53±5.98**14.57±1.82**-6.04±0.82**Neu-H2025.33±3.90**12.24±6.24**13.77±2.82**-5.74±0.76***注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。2.3.4肝糖代谢酶mRNA表达相比较正常组，T2DM大鼠肝糖代谢关键酶和线粒体融合蛋白的mRNA的表达均呈现异常，其中模型组的PEPCK、G-6-PmRNA呈现表达过量趋势（P<0.01），Mfn2、GKmRNA的表达显著降低（P<0.01）；相较模型组，给药组对这PEPCK、G-6-P基因表达过量的趋势有所缓解，其中低剂量效果显著（P<0.05），而对Mfn2、GK的基因表达低剂量具有增加的作用（P<0.05，P<0.01）。表2-7Neu-p11对2糖尿病大鼠肝糖代谢关键酶mRNA表达的影响（n=4）DosePEPCKG-6-PGKGSK-3βGroup(mg·kg-1·d-1)(2-△△Ct)(2-△△Ct)(2-△△Ct)(2-△△Ct)Control00.93±0.100.99±0.121.01±0.121.02±0.12Model01.56±0.05**2.28±0.09**0.53±0.07**0.86±0.13**MLT201.27±0.15**1.72±0.15**##0.68±0.13**0.75±0.16**Neu-L50.79±0.18**#1.57±0.16**##0.85±0.11**#0.88±0.15**Neu-M100.86±0.14**#1.98±0.18**#0.67±0.16**0.79±0.19**Neu-H200.81±0.12**#1.61±0.15**#0.69±0.07**0.62±0.11**32.5#####2#1.5相对表达##1mRNA0.50PEPCKG-6-PGKGSK-3ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H19 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究图2-3Neu-p11对2糖尿病大鼠肝糖代谢关键酶mRNA表达的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。表2-8Mfn2mRNA表达的影响图2-4Mfn2mRNA表达的影响DoseMfn21.2Group(mg·kg-1·d-1)(2-△△Ct)1Control00.91±0.14##0.8Model00.23±0.03***##相对表达0.6MLT200.66±0.17Neu-L50.75±0.12*##mRNA0.4Neu-M100.72±0.07*##0.2Neu-H200.69±0.13*##0ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。2.3.5肝/肌糖原含量相较正常组，模型组大鼠肝/肌糖原含量显著升高（P<0.01）；相对于模型组，褪黑素组和Neu-p11低、中剂量组肝糖原含量呈现降低趋势（P<0.05），褪黑素组和Neu-p11给药组肌糖原含量显著降低（P<0.01）。表2-9Neu-p11对T2DM大鼠糖原含量的影响（mg•100mg-1，±S，n=8~9）Dose肝糖原肌糖原×100Group（mg·kg-1·d-1）(mg·100mg-1)(mg·100mg-1)Control02.49±0.480.93±0.81Model00.71±0.65**2.12±0.54**MLT201.79±0.78**##0.84±0.64**##Neu-L51.47±0.46**##0.86±0.96**##Neu-M100.73±0.69**##1.50±0.96**##Neu-H201.23±0.82**##1.31±0.70*##注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。20 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究2.3.6肝脏组织形态HE染色显示（如图2-5）：肝脏组织，正常组大鼠的肝小叶结构清晰，细胞成多边形，细胞核大而圆，核仁清晰，核周边间隙均匀，细胞索排列规律整齐；模型组的肝组织结构紊乱，细胞核陈列不规律，大部分肝细胞呈现大泡状，胞浆透明且疏松；给药组相较于模型组细胞索排列紧密整齐，肝小叶结构清晰，其中Neu-p11低、中剂量组对肝组织形态改善明显，细胞核色深，核仁清晰，基本无大泡状细胞，褪黑素组和高剂量组出现少量大泡状细胞，肝组织整体形态良好。ABCDEF图2-5肝脏组织HE染色病理切片注：A：正常组，B：模型组，C：褪黑素组D：Neu-p11低剂量组，E：Neu-p11中剂量组F：Neu-p11高剂量组21 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究2.3.7胰腺组织形态胰腺组织HE染色显示（如图2-6）：正常大鼠的胰腺组织结构完整清晰，呈现较清晰的卵型轮廓，体积较大，胰岛内细胞数量较多，清楚有规律的排列，间隙均匀，胞浆充足；T2DM模型大鼠的胰腺组织，胰岛组织结构模糊，间质纤维组织增生及粘液变性，胰岛萎缩，内细胞核排列凌乱；相较模型组，给药组均较好的维持了胰岛形态，改善了T2DM大鼠的胰岛组织的损伤，其中Neu-p11低剂量组胰岛内细胞核清晰，无大量空泡，改善效果显著。ABCDEF图2-6胰腺组织HE染色病理切片注：A：正常组，B：模型组，C：褪黑素组D：Neu-p11低剂量组，E：Neu-p11中剂量组F：Neu-p11高剂量组22 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究2.3.8脑组织形态脑组织切片显示（如图2-7）：正常组海马的神经元细胞排列齐整，细胞紧凑，呈现“锁链”状；模型组的脑组织细胞间空隙增大严重，出现肿胀、胞体固缩，排列失去带状结构，细胞核核仁不清。给药组相较于模型组细胞索排列松散状态有所改善，其中Neu-p11的低剂量、高剂量组对脑组织形态改善明显，排列基本保持，核仁清晰，空泡、大泡状细胞少许，褪黑素组效果稍弱，仍旧维持了海马神经细胞的链状排列。ABCDEF图2-7HE染色病理切片注：A：正常组，B：模型组，C：褪黑素组D：Neu-p11低剂量组，E：Neu-p11中剂量组F：Neu-p11高剂量组23 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究2.4讨论近年研究发现，线粒体功能障碍是T2DM发生IR和代谢失衡的重要原因[101]。线粒体作为一个独立、自主的动态细胞器，其形态、数量与功能有着紧密联系，它不断融合和断裂以维持它在细胞内数量和形态的变化[102]。线粒体发生融合行为时，Mfn2起到外膜融合内膜停靠作用的诱导蛋白，对线粒体结构形态重塑和功能调节维持有重要意义。研究发现，T2DM可造成Mfn2的表达低下，线粒体融合分裂失衡，数量与形态异常，线粒体功能障碍，形成胰岛素抵抗[103,104]。肝脏作为胰岛素和血糖调节的敏感器官，在糖代谢调节中占有重要地位。本实验研究发现，胰岛组织受损导致的高血糖，促使肝脏内Mfn2表达低下，线粒体形态和数量变化紊乱，影响糖酵解、糖异生和肝糖原的合成分解等途径，导致肝脏胰岛素抵抗，诱发肝糖代谢关键酶表达异常[105,106]。有研究者发现，肝细胞内葡萄糖-6-磷酸的形成及最后转化的过程与线粒体有关，同时发现T2DM大鼠肝脏的线粒体接触点会受到干扰，抑制葡萄糖的耐受力[75,107]。而Mfn2作为线粒体的接触点的一部分，若激活其表达水平，则可以预防IR的发生。褪黑素作为一种具有昼夜交替节律的调节激素，对机体内环境稳态、线粒体形态和功能的改善维护有较好效果。褪黑素影响碳水化合物代谢的平衡，可通过减少糖异生和促进糖酵解来维持糖代谢的稳态[96,108]。内源性褪黑素失衡可导致大鼠糖耐量异常和胰岛素抵抗，同时也导致动物体内肝脏和骨骼肌糖原合成的减少。褪黑素半衰期短、容易快速代谢、药效短，不稳定，Neu-p11作为新合成的褪黑素受体激动剂具有半衰期长、选择性高、易合成等特点，有望成为明确的抗糖尿病药物[96,109]。采用小剂量注射STZ，高脂饲料长期喂养大鼠，成功诱发T2DM模型，呈现空腹血糖显著上升，葡萄糖耐受量下降及IR等特点。褪黑素和Neu-p11治疗后，褪黑素和5mg·kg-1·d-1的低剂量Neu-p11可显著改善T2DM大鼠的胰岛素抵抗，且Neu-p11低剂量组对T2DM大鼠具有长效降糖作用，对T2DM大鼠葡萄糖耐受能力也有较好改善。T2DM状态下，大鼠肝脏内过度产生葡萄糖，减少肝糖原储存，其根本原因之一为胰岛素抵抗导致肝脏代谢基因的表达紊乱。其中GK表达降低，致使肝脏糖酵解减弱，糖原合成减少；而PEPCK、G-6-P、GSK-3β表达被激活，糖异生增强，血液中葡萄糖含量升高[28,95,110,111]。同时研究发现，高血糖及胰岛素抵抗患者体内肝脏的线粒体，结构紊乱肿胀，基质密度降低，线粒体融合分裂蛋白基因表达异常，Mfn2的mRNA表达受其影响巨大，显著降低[76,86]。本实验结果显示，长期给予T2DM大鼠Neu-p11，可激活Mfn2的基因表达，改善Mfn2mRNA在T2DM大鼠肝脏内低表达的状态，维持肝脏线粒体的正常形态和功能，改善胰岛素抵抗，增强肝脏胰岛素的敏感性；调节肝糖代谢糖异生、糖酵解等重要途径关键酶mRNA的表达，上调GKmRNA的表达，增强糖酵24 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究解，加速肝糖原的生成，增加肝糖原含量，减少血液中的葡萄糖；下调PEPCK、G-6-P、GSK-3mRNA的表达，抑制糖异生和糖原分解，对肝糖代谢紊乱起到缓解并逐步治疗的效果。高脂饮食诱发的T2DM大鼠，肝脏、胰岛及脑组织HE病理染色显示，肝脏肝细胞会呈现肿胀状，细胞体积增大，易发生脂肪变性和炎细胞浸润[112]。胰岛组织内，胰岛体积萎缩，细胞数量减少，空泡增多[90]。脑组织内，细胞间空隙增大严重，出现肿胀、胞体固缩，排列失去带状结构，细胞核核仁不清。给药组明显改善了2型糖尿病大鼠肝脏、海马及脑的组织形态，肝脏细胞内脂滴沉积少，细胞索排列紧密，空泡减少，维持胰岛细胞的正常形态，边界清晰，细胞数量有所增加，维持了海马神经细胞的链状排列，Neu-p11（5mg·kg-1·d-1）剂量改善效果显著。综上所述，褪黑素与Neu-p11可通过介导T2DM大鼠肝脏Mfn2的mRNA表达来参与改善胰岛素抵抗，影响肝糖代谢酶mRNA的表达，改善T2DM大鼠肝脏、胰岛及脑的组织形态，调节T2DM大鼠的糖代谢异常[111,113,114]。这对后期褪黑素及其受体激动剂基于线粒体功能平衡治疗改善T2DM及IR的机制研究具有指导意义。25 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究第三章Neu-p11对T2DM大鼠不同组织内线粒体平衡的相关机制研究摘要：目的线粒体融合和分裂动态平衡紊乱及由此引起的功能障碍是导致胰岛素抵抗的重要原因。研究褪黑素受体激动剂Neu-p11通过调节线粒体平衡相关因子来改善2型糖尿病（T2DM）的胰岛素抵抗（IR）。方法采用长期高脂肪饲养加小剂量链脲佐菌素(STZ，30mg·kg-1，ip)诱导雌性大鼠为2型糖尿病动物模型，分为模型组、阳性药褪黑素对照组，Neu-p11低、中、高剂量组，增加正常大鼠为对照组，灌胃给药4周后处死，取肝脏、肌肉、海马组织。采用RT-PCR方法测定大鼠腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、沉默调节蛋白1（Sirt1）、核呼吸因子（Nrf-1/2）和雌激素相关受体α（ERRα）等的mRNA表达量；WesternBlot法测定过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α（PGC-1α）、线粒体融合蛋白（Mfn2）的相对表达。测定大鼠各组织内ATP含量及ATP酶活力。结果与正常组相比，T2DM大鼠发生IR，Mfn2、PGC-1α蛋白表达下降，AMPK、Sirt1、Nrf1和Nrf2mRNA表达显著降低，ERRαmRNA表达升高，ATP含量显著减少，ATP酶活力减弱（P<0.01）。与模型组相比，Neu-p11低剂量组降低T2DM大鼠INS（P<0.05），褪黑素与低剂量组改善T2DM大鼠IR（P<0.05）；Neu-p11低剂量组调节大鼠不同组织内Mfn2、PGC-1α蛋白表达，上调AMPK、Sirt1、Nrf1和Nrf2mRNA表达（P<0.05），下调ERRαmRNA的表达，增加T2DM大鼠不同组织内ATP含量与ATP酶活力（P<0.05）。结论褪黑素受体激动剂Neu-p11以调节T2DM大鼠不同组织线粒体平衡相关因子，维持线粒体功能正常，改善胰岛素抵抗，治疗T2DM。关键词：2型糖尿病，褪黑素，Neu-p11，Mfn2、PGC-1α、Sirt1、Nrf-1/2前言线粒体一个具有动态特性的细胞器，是机体细胞最主要的能量代谢器官，在不同生理过程和机体环境刺激下，不断融合和分裂，二者协同进行，线粒体通过维持动态平衡来保证其功能正常[1]。研究表明，2型糖尿病（Type2diabetesmellitus，T2DM）及胰岛素抵（Insulinresistance，IR）时，线粒体发生数量减少，体积减小，线粒体呼吸功能减弱，DNA分布不均，ATP合成减少，线粒体生物合成下降等现象。充分说明线粒体平衡、线粒体功能障碍与T2DM有重要联系。正常组织细胞内腺苷酸激活蛋白激酶(AMPactivatedproteinkinase，AMPK)磷酸化26 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究激活后，诱导沉默调节蛋白1（Sirt1）介导的过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子1α（Peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma,Coactivator-1α，PGC-1α）通路，协同下游靶基因（Estrogenrelatedreceptorα，ERRα）共同作用，调节线粒体融合蛋白（Mitofusin2，Mfn2），影响线粒体融合效率。同时Sirt1/PGC-1α通路，可启动核呼吸因子NRF-1/2，调控线粒体DNA表达，参与线粒体生物合成和氧化磷酸化过程，影响线粒体内ATP的合成及其酶活性。T2DM时，线粒体在不同组织中ATP合成的减少，酶活性降低，高糖状态下机体细胞内AMPK活性抑制，表达减少，导致PGC-1α、NRF-1/2的表达减少，生物合成失调，线粒体呼吸作用破坏，Mfn2蛋白表达降低，线粒体融合降低，动态平衡失衡，线粒体功能降低，从而致使细胞对胰岛素的敏感性减弱[4-5]。本实验采用高脂膳食喂养，加小剂量STZ诱导建立T2DM大鼠模型，着重研究T2DM状态下，不同组织内线粒体平衡的动态变化，功能异常及能量代谢变化。以线粒体融合分裂的动态变化与线粒体功能的关系为基础视角，探究褪黑素受体激动剂Neu-p11不同给药剂量以调节T2DM大鼠的关键器官组织的线粒体平衡相关因子，维持线粒体动态平衡为机制，改善其胰岛素抵抗的作用。1实验材料1.1实验动物体重（160-180）g的雌性Wistar大鼠60只，SPF级，由兰州大学提供，动物合格证号：No:62000800000144，许可证号：SCXK（甘）2016-0001。于室温18~25℃的兰州总医院动物科饲养，定量摄食进水。1.2主要药品与试剂CitricAcid（20120324，大茂化学试剂）；Sodiumcitrate（20130821，双双化工）；PrimescriptRTMasterMix（RR036A，TakaRa公司），SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（20170506，北京索莱宝）TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit（9767，TakaRa公司），ELC超敏发光液（20170506，北京索莱宝），TaKaRaSYBRPremixExTaq(RR802A，TakaRa公司）；10×TBST，SDS，TRIS，甘氨酸，4×蛋白质上样缓冲液（含β-巯基乙醇），脱脂奶粉（20170506，20170629，909C0518北京索莱宝科技有限公司）；小鼠抗β-Actin单抗（中山金桥），小鼠单克隆抗体DRP1（abcam），山羊抗小鼠抗体/辣根酶标记（中山金桥），兔多克隆抗体PGC1alpha（abcam），山羊抗兔抗体/辣根酶标记（中山金桥）；兔单克隆抗体Mitofusin2（abcam）RIPA裂解液（强），100mMPMSF（S7506，碧云天生物技术研究所）；0.45μmPVDF膜（K5PK92821，Immobilon-P@TransferMembranes）1.3实验仪器27 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究表3-1实验仪器仪器名称生产厂商Sigma3K15低温离心机德国Sigma公司IEC-Micromax离心机美国ThermoElectron公司MG96GLongGenePCR仪杭州朗基科学仪器有限公司ABViiA7RealtimePCR美国AppliedBiosystems公司BP210S电子天平赛多利斯有限公司公司Transfersystem半干转仪BIO-RAD公司HP-8453紫外分光光度计美国惠普公司SpectraMaxi3全自动荧光酶标仪美国Molecular公司PowerpacTMBasic基础电泳仪电源和小型垂直电泳槽Trans-Blot@TurboTM公司UVP型全自动数码凝胶图像分析系统美国BioImagingSystems公司2实验方法2.1T2DM大鼠模型的建立、分组及给药60只Wistar雌性大鼠，适应10d实验环境后，随机抽取10只作为正常对照组，剩余50只大鼠作为造模组。普通饲料喂养正常对照组，高脂饲料喂养造模大鼠，期间自由饮水。两个月后，造模大鼠16小时禁食后，腹腔注射STZ（30mg·kg-1），7天后空腹血糖值测定，未达标大鼠，再次注射STZ（15mg·kg-1），7天后测定空腹血糖，造模成功大鼠，血糖值应>13.0mmol/l，参照血糖、体重均分为糖尿病模型组、阳性药组、褪黑素受体激动剂Neu-p11低、中、高剂量组，每组9只。每天8:30am灌胃给药。等量蒸馏水灌胃正常对照组与模型组，阳性药组灌胃20mg·kg-1褪黑素，给药低、中、高剂量组灌胃5mg·kg-1、10mg·kg-1、20mg·kg-1褪黑素受体激动剂Neu-p11；灌胃体积1ml·100g-1，持续4w。2.2大鼠肝脏、海马、肌肉组织线粒体相关基因表达的测定2.2.1总RNA的提取参照PrimescriptRTMasterMix，TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit，TaKaRaSYBRPremixExTaq试剂盒操作说明进行实验，具体步骤在实际操作中略有变动。（剖取大鼠肝脏、海马、肌肉组织，称取约20mg）2.2.2RNA的定量及质量检测采用紫外分光光度计，调零时使用RNaseFreedH2O，取总RNA溶液1μl，用RNaseFreedH2O水稀释50倍，加入样品测定260nm、280nm及320nm处的吸光度，计算R=A260/A280，R值基本在1.8~2.0之间，说明提取的RNA质量较好。计算RNA浓度，计算公式为：RNA浓度（μg/μl）=（A260-A320）×0.04×稀释倍数。2.2.3反转录反应以cDNA为模板实时荧光定量，按照SYBRPremixExTaqTMⅡ试剂盒说明书进28 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究行。将提取的总RNA反转录为cDNA，反应条件：37℃15min；85℃，5s；-20℃保存。反应体系如表1所示。表3-2反转录反应体系配置序号试剂名称加入所需量5×PrimeScriptTMRTMasterMix14μl（PerfectRealTime）2TotalRNA1000ng3RNaseFreedH2OUpto20μl2.2.4RT-PCR随机引物的合成宝生物公司设计合成大鼠mRNA序列（参考Genebank数据库），引物序列如表2所示。每批模板均同时进行内参β-actin和目的基因的扩增反应。表3-3引物序列序号基因上下游引物序列（5'to3'）F5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'1β-actinR5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'F5'-CAGCACCGGAGGTCATCTCA-3'2AMPKR5'-GCACGTGCTCATCGTCGAA-3'F5'-GATGTGGCCTCTGGCTACCACTA-3'3ERRαR5'-CGGACAGCTGTACTCGATGCTC-3'F5'-CCTCCTCATTGTTATTGGGTCTTC-3'4Sirt1R5'-GGCATACTCGCCACCTAACC-3'F5'-CACTCTGGCTGAAGCCACCTTAC-3'5Nrf1R5'-TCACGGCTTTGCTGATGGTC-3'F5'-TTGGCAGAGACATTCCCATTTGTA-3'6Nrf2R5'-GAGCTATCGAGTGACTGAGCCTGA-3'F5'-GTCATCGGTGGGATTTGCTTC-3'7GCN5R5'-GATTCATCAGGTGGGTGCCATAG-3'29 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究2.2.4Real-timeRT-PCR反应RT-PCR：反应条件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，31s；40个循环；-20℃保存。使用实时荧光定量PCR仪（ViiA™7DX型）分析PCR的扩增曲线和溶解曲线，计算得出目的基因Ct值及其内参β-actin的Ct值，计算目的基因的相对表达量（按2-ΔΔCt法），反应体系如表3所示。表3-4Real-timeRT-PCR反应体系配置序号试剂加入量（μl）1SYBRPremixExTaqⅡ(2×)102PCRForwardPrimer（10μM）0.83PCRReversePrimer（10μM）0.84ROXPeferenceDye（50×）0.45DNA模板2.06RNaseFreedH2O6.07Total202.3WesternBlot法测定大鼠各组织相关蛋白的表达2.3.1试剂配制10%的过硫酸铵溶液：硫酸铵粉末0.1g，充分溶解于灭菌注射用水中（1mL），漩涡混匀后，4°C冰箱保存，有效期7~30天，最好现用现配。电泳缓冲液：称取甘氨酸粉末18.8g（9.4g），SDS粉末1.0g（0.5g），TRIS粉末3.02g（1.51g），加蒸馏水定容至1000mL（500mL），搅拌混匀后，4°C冰箱保存，最好现用现配，一次性使用。1×TBST缓冲液：10mL10×TBST+90mL蒸馏水，制备为1×TBST，搅拌混匀，4°C冰箱保存。电转缓冲液：称取甘氨酸粉末1.45g（0.725g），无水甲醇100mL（50mL），SDS粉末0.185g（0.0925g），TRIS粉末2.9g（1.45g），使用蒸馏水定容至500mL（250mL），搅拌混匀后，4°C冰箱保存。5%的脱脂奶粉：称取脱脂奶粉末5g(2.5g)，充分溶解于100mL（50mL）的1×TBST溶液后，4°C冰箱保存，最好现用现配。2.3.2组织蛋白的提取取肝脏、海马、肌肉组织，加入RIPA强效裂解液（含1%PMSF）制成约10%的匀浆液，冰浴后，使用匀浆机匀浆，50HZ，60秒，组织液研磨成为无颗粒透明状，静置于冰上（30min），放置于4°C高速冷冻离心机，离心转速为12000rpm，时间为10min，分离上清液至新的EP管中。取部分上清稀释20到60倍后，BCA法测定蛋白浓度。再用RIPA强效裂解液将上清液蛋白浓度稀释，以1:3的比例吸取4×loadingbuffer与稀释后的上清液混合，振荡器混匀，使最终肝脏蛋白浓度为8μg·μl-1，肌肉蛋白浓度为6μg·μl-1，海马蛋白浓度为9μg·μl-1。再置于100°C的沸水水浴锅中，加热变性530 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究min后立即置于冰上，以防止蛋白变性过度。冷却至室温后，离心速度为12000rpm，时间为5min，取得上清液至新的EP管中，分装上清后，-80°C保存。2.3.3分离胶与浓缩胶的配制及电泳首先，将玻璃板清洗干净，配胶装置安装完毕，加入TEMED，立即摇匀，灌胶，完毕后轻缓加入水液封，静置40min。倒掉液封时加入的蒸馏水，用滤纸吸干水分（滤纸不得接触胶面），加入配制的5%浓缩胶，快速插入梳子，静置30min后，将其放入加有电泳液的电泳槽中，慢慢拔掉梳子，采用移液枪上样。胶板胶孔两侧加入参比蛋白Maker指示剂，上样量为肝脏6µL，肌肉8µL，海马6µL。电泳条件：浓缩胶80V的电压，大概需要20min（样品跑至分离胶界面）；分离胶电压120V的电压，大约花费80min（Maker将要跑出），即可终止电泳。表3-5根据目标蛋白分子量，配制分离胶和浓缩胶试剂名称10%分离胶8%分离胶6%分离胶5%浓缩胶总体积10mL1010mL5mL30%丙烯酰胺(29:1)3.3mL2.7mL2.0mL0.83mL1MTris-HCL(PH6.8)0000.625mL1.5MTris-HCL(PH8.8)2.5mL2.5mL2.5mL010%SDS100µL100µL100µL50µL10%过硫酸铵100µL100µL100µL75µLTEMED7µL7µL7µL7.5µLddH2O4.0mL4.7mL5.4mL3.42mL最佳分离范围20~80kDa30~90kDa50~150kDa—2.3.4蛋白转印与曝光电泳结束后，小心将胶片取出，按照参比蛋白Maker指示剂，将胶上带有目的蛋白的部分胶片裁剪下来，进行半干转膜。将半干转膜槽保持水平状态放置，按照从下到上的顺序分别放置滤纸（6层）→PVDF膜→目的胶片→（6层）滤纸（甲醇活化PVDF，15s，放置时每层均用电转液浸润，再用滚动轴滚压排出气泡）开始转膜。由于目的蛋白分子量不同，转膜条件应根据目的蛋白分子设置，PGC-1α：25V，7min；Mfn2：18V，15min；Drp-1：25V，7min。转印膜完毕后PVDF膜取出，将其于封闭液（5%脱脂奶粉，新配制）中放置，室温摇床封闭2h。封闭结后，孵育一抗，一抗浓度分别为：PGC-1α(1:330)、Mfn2（1:330）、Drp-1(1:500)，抗体用1×TBST稀释，摇床孵育2h，4℃过夜。第2天用1×TBST洗涤5次，每次8min；孵育二抗，二抗浓度为1:5000，用1×TBST稀释；室温孵育2h，用1×TBST洗涤5次，每次8min。滴加ECL，曝光使用全自动数码凝胶图像分析系统（Tanon-4200SF），曝光条件为fl1.2，焦距25.8。31 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究曝光图片的灰度扫描测定应用Image-ProPlus6.0软件进行。2.4肝脏、肌肉、海马组织内ATP含量及ATP酶活性的测定肝脏、海马、骨骼肌组织匀浆后，BCA法测定总蛋白含量，单位：gprot，测定结果待用。测定大鼠各组内ATP含量（磷钼酸-比色法），ATP酶活力，表示单位为：U/mgprot。上述均使用试剂盒，操作依照说明书。2.5统计学分析采用SPSS15.0软件进行统计学分析，±S表示各组实验数据，采用单因素方差分析组间均数差异，采用t检验法，进行差异显著性的统计学分析，P<0.05表示具有统计学差异。3实验结果3.1肝脏组织线粒体平衡相关因子测定结果3.1.1肝脏线粒体相关因子mRNA的表达相比较正常组，T2DM大鼠肝脏的AMPK、Nrf1、ERRα、Nrf2、Sirt1、和GCN5mRNA均呈现表达异常，其中模型组的ERRαmRNA呈现表达过量（P<0.01），AMPK、Sirt1、GCN5、Nrf1和Nrf2mRNA表达显著降低（P<0.01）；相较模型组，褪黑素和Neu-p11低剂量组对ERRα基因过量表达的趋势有所缓解（P<0.01），给药组中低剂量对AMPK、Sirt1、GCN5、Nrf1和Nrf2mRNA的基因表达有增加作用（P<0.05）。表3-6Neu-p11对T2DM大鼠肝脏线粒体平衡相关因子mRNA表达的影响（n=4）DoseAMPKERRαSirt1Nrf1Nrf2GCN5Group(mg·kg-△△Ct-△△Ct-△△Ct-△△Ct-△△Ct-△△Ct-1-1(2)(2)(2)(2)(2)(2)·d)Control00.92±0.100.99±0.120.93±0.130.97±0.090.95±0.110.97±0.09Model00.47±0.05**2.35±0.09**0.39±0.09**0.23±0.07**0.45±0.13*0.46±0.07**MLT200.61±0.15**0.77±0.15**##0.67±0.12**#0.57±0.11**0.58±0.14**0.63±0.11**Neu-L50.80±0.18**#0.89±0.16**##0.84±0.16**#0.68±0.13**#0.72±0.16**#0.75±0.09**#Neu-M100.66±0.14**2.02±0.18**#0.64±0.14**0.44±0.11**0.67±0.12**0.53±0.14**Neu-H200.71±0.16**1.49±0.11**#0.68±0.09**0.52±0.17**0.61±0.15**0.68±0.12**32 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究3**2.52相对表达1.5mRNA##1##**#**#**#****0.50AMPKERRαSirt1Nrf1Nrf2GCN5ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-1Neu-p11对T2DM大鼠肝脏线粒体平衡相关因子mRNA表达的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。3.1.2肝脏ATP含量、ATPMmRNA及其酶活力相较正常组，T2DM大鼠肝脏的ATP含量显著降低，其中模型组的ATP含量降低最为明显（P<0.01）；同时ATP酶活力减弱（P<0.01），ATPMmRNA表达减弱，显著低于正常大鼠（P<0.01）。相较模型组，Neu-p11低剂量组对ATP的合成有所改善，ATPMmRNA表达有所增强，ATP酶活力得到提升（P<0.01）。表3-7Neu-p11对T2DM大鼠肝脏ATP酶活力的影响（n=6）DoseNa+K+—ATP酶Mg2+—ATP酶Ca2+—ATP酶Ca2+Mg2+—ATP酶Group(mg·kg-1·d-1)U/mgprotU/mgprotU/mgprotU/mgprotControl00.786±0.0460.805±0.0370.703±0.0460.724±0.016Model00.578±0.029**0.582±0.043**0.472±0.097**0.601±0.083*MLT200.684±0.076**#0.690±0.010**#0.649±0.069**#0.690±0.032*#Neu-L50.740±0.028**#0.729±0.043**#0.672±0.053**#0.710±0.069*#Neu-M100.694±0.087*#0.689±0.092*#0.600±0.060*#0.693±0.065*Neu-H200.708±0.072*#0.663±0.078*#0.643±0.066*#0.687±0.059*33 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究0.90.8###0.7******0.6**U/mgprot0.50.4酶活力（0.30.2ATP0.10Na+K+—ATP酶Mg2+—ATP酶Ca2+—ATP酶Ca2+Mg2+—ATP酶ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-2Neu-p11对T2DM大鼠肝脏ATP含量及ATP酶活力的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。表3-8Neu-p11对T2DM大鼠肝脏ATP含量及ATPMmRNA表达的影响（n=4~6）DoseATPATPMGroup(mg·kg-1·d-1)μmol/gprot(2-△△Ct)Control00.01615±0.00510.93±0.11Model00.00482±0.0028**0.16±0.07**MLT200.00727±0.0018**#0.49±0.06**Neu-L50.01187±0.0031*##0.71±0.19*#Neu-M100.00681±0.0027**0.47±0.13**Neu-H200.00864±0.0019**0.59±0.17**34 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究图3-3Neu-p11对T2DM大鼠肝脏ATP含量及ATPMmRNA表达的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。3.1.3肝脏组织内PGC-1α、Drp-1、Mfn2蛋白的相对表达相比较正常组，T2DM大鼠肝脏里的PGC-1α蛋白表达升高显著，其中模型组的PGC-1α表达增加最为明显（P<0.01）。相较模型组，给药组对PGC-1α过度表达有所改善，Neu-p11高剂量组对其降低作用显著（P<0.01）。β-actinPGC-1α**-actinβ#-1α/PGC图3-4Neu-p11对T2DM大鼠肝脏PGC-1α蛋白的相对表达注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。相比较于正常组，T2DM模型组和Neu-p11中剂量组的大鼠肝脏Mfn2蛋白表达显著升高（P<0.01）。相较模型组，褪黑素组和Neu-p11低、高剂量组对Mfn2过度表达有所改善，其中褪黑素组和Neu-p11低剂量组对其降低作用显著（P<0.01）。β-actinMfn235 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究**-actin#/βMfn2图3-5Neu-p11对T2DM大鼠肝脏Drp-1蛋白的相对表达注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。相比较正常组，T2DM大鼠肝脏的Drp-1表达有所增加，其中Neu-p11中剂量组的Drp-1表达增加显著（P<0.05）。相较模型组，褪黑素组和Neu-p11低剂量组对Drp-1过度表达有所改善，Neu-p11低剂量组对其作用显著（P<0.05）。β-actinDrp-110.9**0.80.70.6#actin-0.51/β-0.4Drp0.30.20.10ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-6Neu-p11对T2DM大鼠肝脏Mfn2蛋白的相对表达注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。36 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究3.2海马组织线粒体平衡相关因子测定结果3.2.1海马线粒体相关因子mRNA的表达相较正常组，T2DM大鼠海马的AMPK、ERRα、GCN5、Sirt1、Nrf1和Nrf2mRNA的表达均呈现异常，其中模型组、Neu-p11低、高剂量的ERRα、给药组GCN5及Neu-p11高剂量组Sirt1mRNA呈现表达过量（P<0.01）；AMPK、Sirt1、GCN5、Nrf1、Nrf2和模型组GCN5mRNA表达显著降低（P<0.01）；相较模型组，褪黑素组和低剂量组ERRα基因表达过量的趋势有所缓解（P<0.01），对AMPK、Sirt1、GCN5、Nrf1和Nrf2mRNA的基因表达有增加作用，其中低剂量增加作用显著（P<0.01）。表3-9Neu-p11对T2DM大鼠海马线粒体平衡相关因子mRNA表达的影响（n=4）DoseAMPKERRαSirt1Nrf1Nrf2GCN5Group(mg·kg-△△Ct-△△Ct-△△Ct-△△Ct-△△Ct-△△Ct-1-1(2)(2)(2)(2)(2)(2)·d)Control00.95±0.090.93±0.080.98±0.110.96±0.090.92±0.140.99±0.09Model00.33±0.06**2.87±0.06**0.64±0.11**0.37±0.05**0.54±0.16*0.26±0.07**MLT200.78±0.11**0.81±0.12**##0.76±0.18**#0.71±0.09**0.70±0.04**1.29±0.11**Neu-L50.90±0.16**#1.48±0.18**##0.93±0.14#0.79±0.13**#1.02±0.15##1.17±0.09##Neu-M100.77±0.09**1.76±0.13**#1.74±0.19**0.46±0.14**0.61±0.07**1.63±0.14**Neu-H200.76±0.14**2.12±0.15**#1.21±0.11**0.21±0.18**0.65±0.11**1.24±0.12**3.5**32.5##2相对表达##1.5##**##**####mRNA1******0.50AMPKERRαSirt1Nrf1Nrf2GCN5ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-7Neu-p11对T2DM大鼠海马线粒体平衡相关因子mRNA表达的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。37 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究3.2.2海马ATP含量、ATPMmRNA及其酶活力相比较于正常组，T2DM大鼠海马的ATP含量有所降低，其中褪黑素组的ATP含量降低明显（P<0.05）；ATP酶活力影响减弱，无显著趋势，ATPMmRNA表达显著降低（P<0.01）。相较模型组，给药组对ATP的合成有所改善，Neu-p11高剂量组对其改善显著（P<0.01），对ATPMmRNA表达降低趋势有所缓解，其中Neu-p11低剂量增加作用显著（P<0.01）。表3-10Neu-p11对T2DM大鼠海马ATP酶活力的影响（n=6）DoseNa+K+—ATP酶Mg2+—ATP酶Ca2+—ATP酶Ca2+Mg2+—ATP酶Group(mg·kg-1·d-1)U/mgprotU/mgprotU/mgprotU/mgprotControl00.738±0.1930.701±0.1010.862±0.3310.716±0.078Model00.652±0.198**0.810±0.230**0.729±0.137**0.751±0.315MLT200.676±0.102**#0.679±0.174**#0.713±0.099**#0.852±0.134*#Neu-L50.679±0.072**#0.781±0.080**#0.712±0.126**#1.050±0.637*#Neu-M100.671±0.160*#0.612±0.058*#0.634±0.036*#0.640±0.034*#Neu-H200.673±0.133*#0.692±0.079*#0.661±0.045*#0.823±0.029*#1.21）0.8U/mgprot0.6酶活力（0.4ATP0.20Na+K+—ATP酶Mg2+—ATP酶Ca2+—ATP酶Ca2+Mg2+—ATP酶ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-8Neu-p11对T2DM大鼠海马ATP酶活力的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。38 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究表3-11Neu-p11对T2DM大鼠肝脏ATP含量及ATPMmRNA表达的影响（n=4~6）DoseATPATPMGroup(mg·kg-1·d-1)μmol/gprot(2-△△Ct)Control00.584±0.0581.02±0.06Model00.487±0.1570.36±0.08**MLT200.325±0.113*#0.69±0.03**Neu-L50.434±0.1330.88±0.12**#Neu-M100.566±0.2210.43±0.11**Neu-H200.521±0.1720.61±0.20**1.4##1.2表达10.8**mRNA0.6含量及0.4ATP0.20ATPATPMControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-9Neu-p11对T2DM大鼠海马ATP含量及ATPMmRNA表达的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。3.2.3海马组织内PGC-1α、Drp-1、Mfn2蛋白的相对表达相比较于正常组，T2DM大鼠海马的PGC-1α表达显著升高（P<0.05），其中模型组的PGC-1α表达增加明显（P<0.01）。相较模型组，给药组对PGC-1α过度表达有所改善，褪黑素组海马内PGC-1α蛋白表达呈现出低表达，Neu-p11低剂量组对其过度表达改善显著（P<0.05）。β-actinPGC-1α39 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究0.90.80.70.6actin-0.5####1α/β-0.4PGC0.30.20.10ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-10Neu-p11对T2DM大鼠海马PGC-1α蛋白的相对表达注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。相比较正常组，T2DM大鼠海马的Drp-1表达变化差异较小，呈现增加状态。相较模型组，给药组对Drp-1表达有所降低，Neu-p11高剂量显著降低了海马内Drp-1蛋白的表达。β-actinDrp-132.52actin-1.51/β-**##Drp10.50ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-11Neu-p11对T2DM大鼠海马Drp-1蛋白的相对表达注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。40 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究相比较正常组，T2DM模型组大鼠海马的Mfn2表达升高（P<0.05）。相较模型组，给药组对Mfn2表达有所减弱，均呈现低作用趋势，褪黑素和Neu-p11低剂量组降低效果显著（P<0.05）β-actinMfn21.41.21actin-0.8**##0.6Mfn2/β0.40.20ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-12Neu-p11对T2DM大鼠海马Mfn2蛋白的相对表达注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。3.3肌肉组织线粒体平衡相关因子测定结果3.3.1肌肉线粒体相关因子mRNA的表达相比较正常组，T2DM大鼠肌肉的AMPK、ERRα、GCN5、Sirt1、Nrf1和Nrf2mRNA的表达均呈现异常，其中模型组的ERRα、Nrf1和Nrf2mRNA呈现表达过量（P<0.01），AMPK、Sirt1mRNA表达显著降低（P<0.01）；相较模型组，褪黑素和Neu-p11低剂量组对ERRα、Nrf1和Nrf2mRNA基因表达过量的趋势有所缓解（P<0.01），给药组对AMPK、Sirt1mRNA的基因表达有增加作用，其中低剂量增加作用显著（P<0.05）。表3-12Neu-p11对T2DM大鼠肌肉线粒体平衡相关因子mRNA表达的影响（n=4）DoseAMPKERRαSirt1Nrf1Nrf2GCN5Group(mg·kg-1·d-1)(2-△△Ct)(2-△△Ct)(2-△△Ct)(2-△△Ct)(2-△△Ct)(2-△△Ct)Control00.91±0.060.99±0.040.92±0.131.05±0.150.95±0.091.17±0.19Model00.19±0.08**1.47±0.08**0.13±0.09**3.71±0.21**2.31±0.11*2.54±0.13**MLT200.53±0.07**##1.02±0.05#0.54±0.08**#2.37±0.17**1.30±0.09**1.46±0.11**Neu-L50.57±0.11**##0.85±0.07##0.71±0.11**#2.17±0.13**#0.75±0.06**1.35±0.09**#Neu-M100.54±0.12**##0.67±0.14*#0.27±0.11**3.27±0.16**1.88±0.17**1.68±0.14**Neu-H200.71±0.22**##1.09±0.16*#0.56±0.13**3.23±0.21**2.13±0.19**1.49±0.09**41 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究54.5**43.5**3**##相对表达2.5**2####mRNA1.5##1**####**0.50AMPKERRαSirt1Nrf1Nrf2GCN5ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-13Neu-p11对T2DM大鼠肌肉AMPK和ERRαmRNA表达的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。3.3.2肌肉ATP含量、ATPMmRNA及其酶活力相比较正常组，T2DM大鼠肌肉的ATP含量显著降低，其中模型组的ATP含量降低最为明显（P<0.01）。相较模型组，给药组对ATP的合成有所改善，Neu-p11低剂量组对其改善显著（P<0.01）。表3-13Neu-p11对T2DM大鼠肝脏ATP酶活力的影响（n=6）DoseNa+K+—ATP酶Mg2+—ATP酶Ca2+—ATP酶Ca2+Mg2+—ATP酶Group(mg·kg-1·d-1)U/mgprotU/mgprotU/mgprotU/mgprotControl00.716±0.1420.764±0.1530.812±0.2410.756±0.198Model00.582±0.136**0.569±0.130**0.699±0.171**0.631±0.211MLT200.626±0.197**#0.614±0.122**#0.764±0.199**#0.686±0.187*#Neu-L50.688±0.93**#0.711±0.180**#0.732±0.095**#0.669±0.219*#Neu-M100.631±0.104*#0.639±0.090*#0.674±0.136*#0.602±0.161*#Neu-H200.649±0.094*#0.656±0.103*#0.711±0.112*#0.613±0.133*#42 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究0.90.8##*#）0.7***0.6U/mgprot0.50.4酶活力（0.3ATP0.20.10Na+K+—ATP酶Mg2+—ATP酶Ca2+—ATP酶Ca2+Mg2+—ATP酶ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-14Neu-p11对T2DM大鼠肌肉ATP含量及ATP酶活力的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。表3-14Neu-p11对T2DM大鼠肌肉ATP含量及ATPMmRNA表达的影响（n=4~6）DoseATPATPMGroup(mg·kg-1·d-1)μmol/gprot(2-△△Ct)Control00.132±0.0940.90±0.08Model00.068±0.060**0.29±0.11**MLT100.077±0.028**#0.36±0.04**Neu-L50.113±0.133*##0.49±0.05**#Neu-M100.055±0.015**0.46±0.13**Neu-H100.073±0.011**0.43±0.09**43 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究1.41.2表达10.8#mRNA0.6**含量及0.4##ATP**0.20ATPATPMControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-15Neu-p11对T2DM大鼠肌肉ATP含量及ATPMmRNA表达的影响注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。3.3.3肌肉内PGC-1α、Drp-1、Mfn2蛋白的相对表达相比较正常组，T2DM大鼠肌肉的PGC-1α表达有所增加，其中Neu-p11中剂量的PGC-1α表达增加明显（P<0.01）。相较模型组，给药各组对PGC-1α表达增加趋势未产生较大影响，褪黑素组和Neu-p11低剂量组表达增加趋势较弱，中、高剂量组表达增加显著（P<0.01）。β-actinPGC-1α1.2**##10.8actin-0.61α/β-PGC0.40.20ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-16Neu-p11对T2DM大鼠肌肉PGC-1α蛋白的相对表达注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。44 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究相比较正常组，T2DM大鼠肌肉的Drp-1表达产生影响，其中模型组的Drp-1表达升高，其余各组有所降低。相较模型组，给药组对Drp-1表达异常有所作用，褪黑素组和Neu-p11低剂量组明显显著降低其表达（P<0.01）。β-actinDrp-11.0510.95actin-0.9**##1/β-Drp0.850.80.75ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-17Neu-p11对T2DM大鼠肌肉Drp-1蛋白的相对表达注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。相比较正常组，T2DM大鼠肌肉的Mfn2表达显著变化趋势较小，其中模型组的PGC-1α表达增加显著。相较模型组，给药组对Mfn2蛋白表达主要产生降低作用，其中Neu-p11降低效果明显，Neu-p11中剂量组对其降低显著（P<0.01）。β-actinMfn20.50.4**##actin0.3-0.2Mfn2/β0.10ControlModelMLTNeu-LNeu-MNeu-H图3-18Neu-p11对T2DM大鼠肌肉Mfn2蛋白的相对表达注：*P<0.05，**P<0.01，比较于正常对照组；#P<0.05，##P<0.01，比较于模型组。Control：正常对照组；Model：模型组；MLT：褪黑素组；Neu-L：Neu-p11低剂量组；Neu-M：Neu-p11中剂量组；Neu-H：Neu-p11高剂量组。45 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究4讨论以IR为基础发病机制的T2DM，以胰岛素作用于肝脏、大脑、肌肉等周围组织，其主要摄取异常和葡萄糖利用能力降低为主要表现[8,97]。代谢紊乱是IR的主要特点之一，T2DM状态时，机体内糖脂代谢失衡，胰岛素在肝脏、肌肉、脑等主要器官的敏感性降低，作用能力减弱，糖的利用和代谢降低，最终造成能量物质沉积，形成IR的持续发展和加剧恶化[32,115]。线粒体作为机体细胞内最重要的能量器官，联系IR密切。由线粒体内氧化磷酸化为主要途径合成的ATP，参与机体内葡萄糖代谢，脂类代谢及多种代谢途径，因此线粒体功能障碍则会导致机体各组织中ATP合成减少，机体代谢紊乱，形成IR[16,100]。而线粒体形态结构动力稳态与功能调节有密切关系，维持其基本形态及功能的根本在于维持其融合和分裂的微妙平衡[23,77]。研究发现，线粒体融合依赖其主要蛋白之一为线粒体融合蛋白（Mfn2），作用过程复杂，受多个相关因子的共同调节。协调下游的靶基因ERRα，作为线粒体生物氧化的转录因子的PGC-1α，它可以刺激线粒体Mfn2的表达，进而促进其融合和线粒体内的能量代谢[55,103]。T2DM和IR时Mfn2、PGC-1α表达降低，Drp-1表达增加，Mfn2与IR呈现相关性，Mfn2表达低下更容易造成IR的发生[116,117]。本实验结果显示，T2DM大鼠肝脏内Mfn2和PGC-1α的蛋白表达降低，ERRα的mRNA表达异常增加，给予低剂量Neu-p11后，Mfn2、PGC-1α的蛋白及ERRαmRNA的表达异常明显改善。腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK)作为PGC-1α上游重要的激活因子，同样参与线粒体平衡的动态调节，它作为重要的能量调节器，其酶活力极大影响了组织细胞中AMP/ATP的比率，由此影响PGC-1α的表达，参与机体内的能量代谢活动[116,118]。同时Sirt1脱乙酰化，作用在PGC-1α上并激活，促进线粒体生物合成，它在调节细胞生化等方面发挥了重要作用[43,118]。Sirt1/PGC-1α通路，可启动核呼吸因子NRF-1/2，调控线粒体DNA表达，参与线粒体生物合成和氧化磷酸化过程，影响线粒体的正常功能，影响线粒体内ATP的合成及其酶活性[51,52,119]。IR发生时，AMPK、Sirt1表达降低，NRF-1/2表达减少，影响线粒体呼吸作用，进而造成PGC-1α在机体内表达降低，机体ATP合成减少[120]。线粒体作为真核哺乳动物ATP的主要生产者和ROS活性氧物质的细胞来源及靶点，研究发现，高血糖症下，肝脏线粒体含量和对其内源氧化产物的处理发生异常。T2DM大鼠体内的肝脏线粒体的钙潴留力增强，与此同时导致线粒体与琥珀酸作用时产生了较高的膜电位增加了T2DM的严重程度[101,102]。高糖环境损伤线粒体产生的钙环境变化刺激一些脱氢酶变化，造成对ATP合成酶的消极作用。本实验T2DM大鼠肝脏AMPK、Sirt1、Nrf-1/2mRNA表达和ATP含量显著降低，IR显著，胰岛素敏感性降低。给予药物治疗后，AMPK、Sirt1、Nrf-1/2mRNAmRNA表达增加，ATP含量提升，ATP酶活力增加，IR改善明显。Neu-p11通过改善T2DM大鼠肝脏内PGC-1α、Mfn2的表达降低和相关因子ERRα、AMPK、Sirt1、NRF-1/2mRNA的表达异常，增加肝脏ATP的含量，46 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究参与机体代谢，改善IR。线粒体功能的正常调节与其数量、形态和分布不可分割，这都需要通过保持线粒体动力学作用来实现[121]。介入并干预T2DM与IR时线粒体融合与分裂，可能影响线粒体功能，影响其内部的氧化磷酸化生成ATP，参与机体代谢而改善IR，可能是机体改善IR和T2DM的途径之一[66]。T2DM的发生极大可能伴随很多并发症的发生，T2DM大鼠一般存在认知能力下降，记忆力减退等症状，这一现象与T2DM大鼠脑部氧化应激关系密切，而本课题组前期实验已证明褪黑素及Neu-p11可调节T2DM大鼠的氧化应激及认知能力。T2DM及IR发生时，海马内线粒体发生紊乱，氧化应激水平异常，PGC-1α作为氧化应激和线粒体调节中的重要因子，在其中发挥重要作用，与之相关的AMPK、Sirt1，可在氧化应激条件下，连续调节控制PGC-1α及相关蛋白因子的变化[69,122]。高糖的生化环境，抑制Sirt1蛋白表达，降低线粒体代谢功能，细胞内能量缺失，导致细胞死亡，脑部认知功能损伤[72,123]。本实验，T2DM大鼠海马AMPK、Sirt1mRNA表达，ATP含量及酶活力显著降低，线粒体融合分裂蛋白表达异常，Mfn2表达显著降低，给予药物治疗后，Sirt1mRNA和AMPKmRNA表达，ATP含量及酶活力增加明显，蛋白表达有所改善。可以推断，褪黑素及Neu-p11可以通过以Sirt1/PGC-1α为路径，调节线粒体相关因子，影响T2DM大鼠脑部氧化应激水平，改善其认知能力。骨骼肌作为占据餐后葡萄糖消耗80%的主要器官，是T2DM和IR的主要参与者，Chomentowski等发现T2DM患者和发生IR的患者中，肌间纤维线粒体含量较低[60,120]。通过激活T2DM大鼠较低的AMPK基因的表达，增加Sirt1基因表达和PGC-1α蛋白表达，调节线粒体融合分裂平衡，达到改善T2DM和IR状态下的肌肉氧化能力降低，改善葡萄糖代谢[60,124]。本实验结果显示，T2DM大鼠肌肉ERRα、Nrf1和Nrf2mRNA呈现表达过量，AMPK、Sirt1mRNA表达显著降低，ATP含量及酶活力下降明显，Mfn2和PGC-1α蛋白表达降低，Drp-1蛋白表达增加。给予药物治疗后，ERRα、Nrf1和Nrf2mRNA基因表达过量的趋势有所缓解，AMPK、Sirt1mRNA的基因表达有增加作用，ATP含量提升，ATP酶活力增加，Mfn2和PGC-1α蛋白表达有所增加，IR改善明显。由此可以推断Neu-p11可以通过增加肌肉内AMPK、Sirt1mRNA基因表达，激活PGC-1α等相关因子，调节线粒体动态平衡，改善肌肉氧化能力，调节糖代谢。综上所述，褪黑素受体激动剂Neu-p11可以调节T2DM大鼠肝脏、海马及肌肉组织内线粒体平衡及相关因子的作用，调节各组织内ATP的含量和活力，保护和改善各组织器官的正常生理功能，由此作用于机体血糖，胰岛素及生理状态，达到改善IR，降低血糖的效果。47 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究第四章结语本研究证实褪黑素受体激动剂Neu-p11对由高脂饲料联合小剂量STZ诱导的T2DM大鼠模型的高血糖及IR具有良好的改善作用，而其作用可能是通过介导T2DM大鼠各组织内线粒体平衡而发挥。褪黑素受体激动剂Neu-p11通过介导T2DM大鼠组织内线粒体平衡的关键蛋白和相关因子，影响肝糖代谢关键酶基因的表达，肝、肌糖原的合成分解，由此降低T2DM大鼠血糖，改善IR，达到治疗T2DM的效果。1研究结论1、褪黑素受体激动剂Neu-p11可以通过介导T2DM大鼠肝脏内线粒体融合蛋白Mfn2，影响肝糖代谢关键酶mRNA的表达，同时改善各组织的病理状态，达到降低血糖，调节胰岛素的效果。2、褪黑素受体激动剂Neu-p11通过影响各组织内线粒体平衡相关因子蛋白和mRNA，介导线粒体融合蛋白Mfn2与分裂蛋白Drp-1表达，协同对各组织ATP含量及ATP酶基因、ATP酶活力的作用，改善T2DM大鼠的IR，最终达到治疗T2DM的效果。2研究意义1、本研究进一步证实褪黑素受体激动剂Neu-p11对T2DM大鼠的糖代谢紊乱具有调节作用，且Neu-p11药效强于褪黑素，并对其机制进行新的延伸探索，发现通过介导肝脏线粒体平衡影响肝糖代谢酶，改善T2DM大鼠IR的可能性。2、褪黑素受体激动剂Neu-p11可影响T2DM大鼠各组织线粒体平衡相关因子，为线粒体功能障碍与T2DM发生关系提供了新的证据。3、褪黑素受体激动剂Neu-p11通过影响线粒体平衡相关蛋白改善T2DM大鼠的机制研究，为以褪黑素和其受体激动剂为主的T2DM防治药物的发现与研发进一步明确了方向。3展望目前，线粒体功能障碍与T2DM的因果关系争议颇多，但以其为治疗机制的研究极具潜力。本课题组，以前期褪黑素受体激动剂Neu-p11调节T2DM大鼠的糖脂代谢治疗研究为基础，延伸至褪黑素受体激动剂Neu-p11通过介导线粒体平衡为机制，治疗T2DM大鼠的研究，为富含褪黑素及研发褪黑素受体激动剂的中药研发奠定了基础机制研究思路，佐证了富含褪黑素的中药防治T2DM的可行性，为后期富含褪黑素的中药研究提供方向。48 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究参考文献[1]ZhouB,LuY,HajifathalianK,BenthamJ,CesareMD,DanaeiG,etal.Worldwidetrendsindiabetessince1980:apooledanalysisof751population-basedstudieswith4.4millionparticipants[J].Lancet.2016,387(10027):1513.[2]CharlsonFJ,ErskineHE,FerrariAJ,LeungJ,WhitefordHA,AbajobirAA,etal.Global,regional,andnationalincidence,prevalence,andyearslivedwithdisabilityfor310diseasesandinjuries,1990–2015:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2015[J].Lancet.2016,388(10053):1545.[3]SeuringT,ArchangelidiO,SuhrckeM.TheEconomicCostsofType2Diabetes:AGlobalSystematicReview[J].Pharmacoeconomics.2015,33(8):811-31.[4]GaoWG,DongYH,PangZC,NanHR,ZhangL,WangSJ,etal.IncreasingtrendintheprevalenceofType2diabetesandpre‐diabetesintheChineseruralandurbanpopulationinQingdao,China[J].DiabeticMedicine.2009,26(12):1220–7.[5]GroupAC,PatelA,MacmahonS,ChalmersJ,NealB,BillotL,etal.Intensivebloodglucosecontrolandvascularoutcomesinpatientswithtype2diabetes[J].NEnglJMed.2008,358(3):2560-72.[6]VakifahmetoglunorbergH,OuchidaAT,NorbergE.Theroleofmitochondriainmetabolismandcelldeath[J].Biochemical&BiophysicalResearchCommunications.2017,482(3):426.[7]HuangP,YuT,YoonY.MitochondrialclusteringinducedbyoverexpressionofthemitochondrialfusionproteinMfn2causesmitochondrialdysfunctionandcelldeath[J].EuropeanJournalofCellBiology.2007,86(6):289-302.[8]MartinSD,McGeeSL.Theroleofmitochondriaintheaetiologyofinsulinresistanceandtype2diabetes☆[J].BiochimicaEtBiophysicaActa.2014,1840(4):1303.[9]RíosJL,FranciniF,SchinellaGR.NaturalProductsfortheTreatmentofType2DiabetesMellitus[J].PlantaMedica.2015,81(12-13):975.[10]FengYM,ZhaoD,ZhangN,YuCG,ZhangQ,LutgardeT,etal.InsulinResistanceinRelationtoLipidsandInflammationinType-2DiabeticPatientsandNon-DiabeticPeople[J].PlosOne.2016,11(4):e0153171.[11].SamuelVT,ShulmanGI.Mechanismsforinsulinresistance:commonthreadsandmissinglinks[J].Cell.2012,148(5):852-71.[12]AmatiF.Revisitingthediacylglycerol-inducedinsulinresistancehypothesis[J].ObesityReviews.2012,13(SupplementS2):40–50.[13]Inzucchi,SE,JB,Diamant,Ferrannini,Nauck,etal.Managementofhyperglycaemiaintype2diabetes:apatient-centered;approach.PositionstatementoftheAmericanDiabetesAssociation(ADA);andtheEuropeanAssociationfortheStudyofDiabetes(EASD)(vol55,;pg1577,2012)[J].Diabetologia.2013,56(3):680-.[14]MonamiM,DicembriniI,KundisovaL,MannucciE,ZannoniS,NreuB.AMeta-AnalysisOfTheHypoglycemicRiskInRandomizedControlledTrialsWithSulphonylureasInPatientsWithType2Diabetes[J].DiabetesObesity&Metabolism.2014,16(9):833–40.[15]KahnSE,LachinJM,ZinmanB,HaffnerSM,AftringRP,PaulG,etal.EffectsofRosiglitazone,Glyburide,andMetforminonβ-CellFunctionandInsulinSensitivityinADOPT[J].Diabetes.2011,60(5):1552-60.[16]JelenikT,RodenM.MitochondrialPlasticityinObesityandDiabetesMellitus[J].Antioxidants&RedoxSignaling.2013,19(3):258.[17]RitovVB,MenshikovaEV,HeJ,FerrellRE,GoodpasterBH,KelleyDE.Deficiencyof49 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兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究在学期间的研究成果一、发表论文1.岳颖，周珺，贾正平，李茂星，张汝学.影响肝糖代谢的中药活性成分抗糖尿病研究进展.医药导报.2018.37(4):465-470.2.岳颖，周珺，贾正平，李茂星，张汝学.褪黑素及其受体激动剂对Mfn2介导的T2DM大鼠肝糖代谢基因的调节作用.解放军医药杂志.2018.30(3):1-7.3.岳颖，周珺，贾正平，李茂星，张汝学.褪黑素及受体激动剂通过调节肝脏线粒体融合分裂改善T2DM大鼠的胰岛素抵抗.中国糖尿病杂志.已收录。4.ZhouJ,ZhangJ,YingY,etal.Neu-P11,anovelMT1/MT2agonist,reversesdiabetesbysuppressingthehypothalamic-pituitary-adrenalaxisinrats[J].EuropeanJournalofPharmacology,2017,812.5.周珺，张锦，岳颖，等.2型糖尿病大鼠认知行为的改变及新型褪黑素受体激动剂Neu-P11的调节作用[J].解放军医药杂志,2017,29(6):6-9.二、参与项目1.国家自然科学基金面上项目：基于HPA轴活性调节的中西医结合治疗2型糖尿病新方法研究。项目编号：81173620；2.国家自然科学基金项目：从HPA轴角度研究胰岛素抵抗的神经内分泌机制及中药的干预作用。项目编号：30772773.57 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究致谢三年硕士研究生生活即将结束，值此毕业论文完成之际，我谨向所有帮助和关心我的人表示最真挚的谢意和祝福！首先，将最深的谢意献给我的导师张汝学教授，恩师在学术上给了我方向，生活上给了我温暖，行动上给了我勇气，处事上给了我榜样，用他的言传身教，是我学会了许多书本上没有的东西!特别感谢兰州军区兰州总医院药剂科贾正平教授、李茂星和马慧萍教授在我研究生期间给予的悉心指导，热情关怀!特别感谢周珺师姐在实验计划安排及文章撰写和日常生活中给予我的莫大指导与帮助!感谢兰州军区兰州总医院马骏教授、王荣教授、陈丽萍老师等三年来给与我的无私指导和帮助；感谢核医学科安建平主任、医学实验中心惠玲主任、杨霄鹏主任、病理科李双鸣老师、动物实验科牛廷献主任和陆璐老师在实验中给予的重要帮助!感谢课题小组张锦及王登师兄的无私帮助，同时感谢药剂科新药研究室毛婷、马幸福、朱玉婷、高迎春等同学在实验过程中提供帮助和支持，感谢他们在日常生活中为实验室创造的欢乐和谐的气氛!感谢我的父母对我学业的支持和生活的关怀，没有他们的支持就没有我的今天，以后的日子里我会尽我所能回报你们!58 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究附录：文献综述靶向于肝糖代谢的中医药药性分类研究摘要：2型糖尿病是一种常见慢性病，发病率和死亡率逐年增长。西医理论认为肝脏是机体能量平衡、糖脂代谢和胰岛素作用的重要靶器官，调控糖尿病患者的肝脏葡萄糖代谢对维持正常血糖状态十分重要。中医药有几千年的悠久历史，资源丰富，大量研究发现中药或天然药物有效成分可通过调节肝糖代谢达到治疗糖尿病的作用。基于肝糖代谢在糖尿病发生发展中的重要作用，本文以糖异生、糖酵解和糖原合成分解为主的多个代谢途径作为主要靶点，结合中药的四性治则及糖尿病的中医病机理论将靶向于肝糖代谢的中药进行中医药药性分类，旨在将中医、西医理论结合起来，反复对比，寻找异同，探索规律，推动中医药抗糖尿病的进步。关键词：糖尿病；肝糖代谢；关键酶；中医药TargetedtoglycogenmetabolismofmedicinalclassificationresearchoftraditionalChinesemedicineAbstractType2diabetesmellitus(T2DM)isacommonchronicdiseasewhichmorbidityandmortalityincreasedyearbyyear.Westernmedicinetheoryregardsliverasthekeytargetorgansforthebody'senergybalance,glucose-lipidmetabolismandinsulinaction,thereforeregulatingliverglucosemetabolismisacrucialwaytomaintainnormalglucoselevelfordiabetics.TraditionalChinesemedicine(TCM)hasalonghistoryofseveralthousandyearsandabundantresources.NumerousstudieshavefoundthattraditionalChinesemedicineoreffectivecomponentsofnaturalcompoundscouldtreatdiabeteseffectivelythroughregulatingglycogenmetabolism.Basedontheimportantroleplayedbyglycogenmetabolismintheoccurrenceanddevelopmentofdiabetes,themetabolicpathwayofgluconeogenesis,glycolysis,glycogensynthesisandglycogendecompositionisregardasthemaintarget.InordertocombinethetheoriesofwesternandChinesemedicine,comparetheirsimilaritiesand59 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究differences,searchlaws,furtherpromotetheprogressofanti-diabeticusingTCM,thisarticleclassifiesTCMwhichtargetstoliverglucosemetabolismbypropertythroughcombinesthefourtherapeuticprincipleofTCMandpathogenesisofdiabetes.Keywords:diabetes,liverglucosemetabolism，keyenzymes,traditionalChinesemedicine近年来，2型糖尿病呈现迅速增加趋势，糖尿病的高发病率给个人、家庭、社会都带来了沉重的负担，同时2型糖尿病伴随的多种并发症以及高死亡率是目前存在的最主要问题[1,2]。关于2型糖尿病的防治，西医药属于靶点研究，在靶点机制较明确的情况下合成有效的治疗药物，重在“治标”，中医药具有几千年的历史，资源丰富，博大精深，其贵在整体调节，重在“治本”。二者各有侧重各有优势，结合二者的优势，同时“治标”又“治本”才是防治2型糖尿病的最好方式。一、西方医学对糖尿病的认识及肝糖代谢调节靶点西方医学普遍认为，糖尿病的发生可以理解为胰岛素调节异常（如胰岛β细胞缺陷、胰岛敏感性降低等）导致机体糖脂代谢稳态被破坏[3]，碳水化合物代谢机能的缺陷以及机体生理系统为纠正糖代谢失衡所做的努力，促使内分泌系统的过度活化，最终导致内分泌代谢的失控诱发了糖代谢紊乱，高血糖随之发生[4]。而肝脏是机体能量平衡、糖脂代谢和胰岛素作用的重要靶器官，通过调节和控制糖尿病患者肝脏葡萄糖代谢对维持正常血糖状态十分重要，以糖异生、糖酵解和糖原合成分解为主的多个代谢途径作为主要的研究思路[4]，糖代谢过程中的关键酶则成为防治糖尿病的重要靶点[5]。许多具有降血糖作用的中药被发现其有效成分可作为天然的激动剂或抑制剂，作用机制也逐渐明确。下面简要介绍肝脏葡萄糖代谢涉及的几种关键酶。1．葡萄糖激酶(GK)肝脏中的葡萄糖激酶(GK)参与葡萄糖磷酸化，在肝脏糖酵解过程中，GK催化第一步反应使葡萄糖转变成葡萄糖-6-磷酸葡萄糖，加速糖原的合成及葡萄糖代谢[6]；GK在胰腺中是葡萄糖的敏感器，它促进高浓度葡萄糖状态下胰岛β细胞分泌胰岛素[7]。GK通过促进肝脏葡萄糖的代谢和胰岛素分泌的双重作用机制来改善糖耐量异常，提高胰岛细胞功能，降低血糖，改善糖尿病症状[8]。因此研究开发GK的激动剂是治疗2型糖尿病的一个有效途径2.葡糖糖-6-磷酸酶(G-6-P)60 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究葡糖糖-6-磷酸酶(G-6-P)是所有参与糖代谢酶中极为重要的一类酶，是糖异生和糖原分解的最后一步反应的限速酶。糖原在肝脏组织细胞中水解生成葡萄糖-1-磷酸，葡萄糖-1-磷酸通过变位反应后又转变成为葡萄糖-6-磷酸[9]。葡萄糖-6-磷酸可直接参与糖酵解，同时也可进入内质网通过G-6-P水解作用产生葡萄糖，最后释放进入血液，G-6-P又是肝脏组织里糖异生的两大关键酶中之一[9]，若G-6-P活性增强，则会导致肝葡萄糖生成的进一步增加，加重葡萄糖代谢失衡，其基因表达水平和活性的变化直接影响到肝脏内生糖的输出及血糖的变化[10]。肝脏G-6-P活性的异常升高和活性增强是2型糖尿病肝糖输出增加的主要原因，也是肝脏胰岛素抵抗的主要原因[11]。因此，G-6-P是治疗糖尿病的一个重要靶点[12]。3.磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是体内糖原异生的关键酶，也是肝脏糖异生的限速酶之一。糖尿病高血糖时PEPCK活性明显增加，使糖异生增快，血糖升高，而胰高血糖素、糖皮质激素及肾上腺素、甲状腺素等可活化升高PEPCK表达量，因此抑制PEPCK的活性有利于降低高血糖[13]。4.糖原磷酸化酶（GP）糖原磷酸化酶GP是催化糖原降解的关键酶，具有催化糖原的磷酸解作用，GP使糖原分子从非还原端逐个断开，α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，直至临近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前4个葡萄糖基处，葡萄糖通过GP从糖原上释放1-磷酸葡萄糖[14]。抑制GP的活性，可以达到减少糖原降解的目的，减少肝脏葡萄糖的生成，从而起到降低血糖的作用[15]。肝脏中血糖浓度可直接控制GP的活性，葡萄糖与GP结合使其从活化状态变为钝化状态，此外胰岛素和胰高血糖素对糖原磷酸化酶也有调控作用[16]。因此对GP活性和表达的抑制对降低血糖有着重要作用。5.糖原合成激酶-3（GSK-3）糖原合成激酶-3（Glycogensynthasekinase，GSK）作为糖原合成酶(Glycogensynthase，GS)激酶，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，具有多种生物学作用，如：参与细胞信号转导、蛋白质合成、细胞增殖、分化、粘附和凋亡等[17]。GSK-3具有两种异构体，GSK-3α和GSK-3β。GSK-3α主要调节肝糖原合成及沉积，对肌细胞糖原代谢作用弱；在静息细胞中，GSK-3β可以使糖原合成酶（GS）的丝氨酸位点磷酸化，从而抑制GS的活性，减少糖原的合成[18]。同时胰岛素又可间接抑制GSK-3β的活性，胰岛素可通过PI3K/PKB通路使蛋白激酶B(PKB/Akt)活化和聚集，活化的PKB使GSK-3β的丝氨酸位点磷酸化61 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究后失活，阻止GSK-3对底物如真核起始因子2B(eIF2B)、糖原合成酶(GS)的磷酸化，从而激活糖原合成酶，促进糖原合成[19]。GSK-3β的活性增强或异常高表达可导致胰岛素抵抗。近年来的研究中，在2型糖尿病动物模型中，GSK-3β抑制剂通过增加糖原合成、抑制肝脏糖异生而减少葡萄糖输出，从而增强胰岛素敏感性并改善血糖水平[20]。因此，GSK-3β被认为是治疗2型糖尿病新型有效靶点。肝脏糖代谢的过程及所涉及酶如下图1所示：图1肝糖代谢主要路径及关键酶[21-23]二、中医药的特点及药性分类研究我国中医药理论认为糖尿病属“消渴病”范畴，自《黄帝内经》起就对此有所记载。中医药由于它独特的理论体系、悠久的历史经验、丰富的药物资源以及突出的治疗效果，更加受到国内外学者的重视[3]。与西药相比，尽管中药降糖作用相对缓慢，但可促进人体内的整体调节并且降糖作用持久，顾及病程发展和预防病后，具有西药不可替代的作用，逐渐成为治疗糖尿病的主要研究方向[24]。中药,是中医药学理论体系下的概念，抛开中医理论仅能称其为“天然产物”，中药的最大优势是将其按中医药学理论考虑其性[24]能、功效和选配使用。应将中药紧密放入中医药学的理论体系中结合其天然产物的特性，其优势才能真正显现出来，这也是我国中医药的独特魅力。若将中药按西医药学理论考虑其性能、功效和选配使用，不仅不能发挥中医药的优势，而且仍旧会出现西药的[24]弊端。如何有效的将中医、西医结合起来，将中医药有效的应用起来，这是医药学工作者面临的主要问题，解决好这个问题对医药学界将是巨大的进步。62 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究中医药学以阴阳五行学说为基础，其用药也需遵从中药的药性理论。古人用归属法将中药的药性概括为“四气五味”。四气，也叫四性，是指中药具有寒、热、温、凉四种属性，另外还有平性。四气中的寒、凉与温、热仅是程度上的差异，寒、凉属阴，温、热属阳。五味是指酸、甘、苦、辛、咸五种味道，《素问·脏气法时论》曰：“辛散，酸收，甘缓，苦坚，咸软”。对于中医药学而言，无论疾病多么复杂，最终均须以阴、阳统之，治疗上必须遵循“寒者热之、热者寒之”的基本原则，“疗寒以热药，疗热以寒[25]药”。传统中医认为糖尿尿病的病机是阴虚燥热，阴虚为本、燥热为标，两者互为因果，随着临床经验的进一步丰富和积累，越来越多的医家发现糖尿病的病机绝非单纯用[26]燥热和阴虚，还包含了痰湿之邪，痰湿的形成直接损耗机体阴液，闭阻经络；热毒论，[27]热火炽盛、怫郁结滞而转变成为热毒，导致津液亏损而致病等理论。同时现代中医药研究发现，中药药性与能量代谢有着密不可分的关系，认为调控能量代谢率是温中、散寒、清热功效的重要成因之一，寒热体质和能量代谢水平有关；阴阳和寒热密切相关,提高能量代谢率有助于补阳,而不利于补阴；不同药性的中药对于能量代谢相关的酶的抑制作用不同，例如：脂肪酸合酶（Fattyacidsynthase，FSA）与糖脂代谢的调控有着密切的关系，而温中和散寒药对其有很强的抑制性。糖代谢紊乱作为糖尿病中重要的致病病因，也是能量代谢极为重要的一部分，其中上文涉及的酶在肝糖代谢中意义重大。结合上述中药的四性治则及糖尿病的中医病机理论将作用于肝糖代谢酶的中药进行中医药药性分类，同时探索中药复方独特的“四性五味”的配伍关系在治疗糖尿病时的重要性，将中医、西医理论结合起来，反复对比，寻找异同，探索规律，推动中医药抗糖尿病的进展。1．寒性中药玄参科植物地黄（RehmanniaglutinosaLibosch）性寒，味甘苦，能清热生津，凉血止血，养阴生津。其新鲜或干燥块根中15%的醇提物—地黄寡糖可以提高GK的活性，增加其基因的表达量，同时抑制G-6-P的活性及其基因的表达量来降低糖原分解，减少糖异生，减少肝糖输出，最终达到降低血糖的目的[7]。湖北麦冬，又名山麦冬，性寒，味甘、微苦，归心、肺、胃经，养阴生津、润肺清心。来源于百合科植物湖北麦冬（RadixLiriopisProliferae）的干燥块根，其水提物麦冬多糖可以显著增加GK的基因表达量，抑制G-6-P的活性及其基因的表达量，通过促进葡萄糖消耗和降低糖原分解来起到调节糖代谢的作用。苦丁茶，性大寒，味甘、苦，入肝、胆、胃三经，可以散风热、清头目、除烦渴。63 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究苦丁茶水提物中的100%醇提组分可以提高GK的基因表达量，增加糖酵解，达到降低血糖的目的[13]。同时显著下调G-6-P的基因表达来抑制糖原分解，降低肝脏葡萄糖含量。凤丹皮清热凉血、活血化瘀、滋阴降火，解斑毒，利咽喉，通小便血滞，其不同组分可显著改善GK在2型糖尿病小鼠体内的糖代谢，其中凤丹皮多糖成分能够显著升高GK地同时抑制葡糖糖-6-磷酸酶(G-6-P)在肝脏中的表达水平从而改善耐糖量治疗高血糖[9]。芦荟味苦、性寒，归肝、胃、大肠经，具有清肝泻火、泻下通便、杀虫疗疳之功效。芦荟提取物[28]可增加GK的活性，改善糖代谢紊乱及胰岛素抵抗，但其具体机制尚未明确，待进一步的研究。栎精[29]又称为槲皮素、五羟基黄酮，是一种存在于苹果、绿茶、洋葱、葡萄皮等多种植物中的一种抗氧化物质，通过抑制对G-6-P的两个催化亚基(G6PC)和转运亚基(G6PT)的mRNA的表达，并可逆转由高血糖引起的G-6-P的活性异常，可作为一种G-6-P基因表达和活性的抑制剂用于糖尿病的治疗[29]。牡丹皮，味苦、辛，归心、肝、肾经，清热凉血、活血化瘀，被广泛用于糖尿病的治疗，在高糖诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞模型中，牡丹皮提取物中的多种化合物均可以通过AMPK通路来影响磷酸化GSK-3β，同时抑制G-6-P的活性，增加肝细胞葡萄糖摄取和糖原合成，改善胰岛素抵抗的症状[30]。黄连，味苦性寒，归心、脾、胃、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒之功效，其有效成分异喹啉生物碱—小檗碱[31]（又称黄连素）可增加GK的mRNA的表达，可直接影响GK酶的含量，加强肝脏中糖利用的同时又抑制了肝糖产生，起到直接降低血糖的作用[31]。小檗碱可以通过抑制线粒体作用，升高AMP/ATP值，增强AMPK的活性，间接抑制G-6-P的蛋白表达量，同时抑制了G-6-P的Forkhead蛋白转录因子FOXO1的活性，其转录RNA也大幅度减少，不依赖胰岛素作用的抑制糖异生。栀子,性苦寒、无毒，入心、肝、肺、胃经，能清热泻火、凉血。栀子苷[19]有效作用于糖尿病大鼠，通过抑制G-6-P的活性来起到降低血糖的作用，有治疗2型糖尿病的潜在作用。从粗老绿茶中提取的茶多糖[32]可减弱G-6-P的活性，来达到降低血糖的目的，但其具体机制尚未明确。苦瓜，性苦寒,具有清热解毒,滋养强壮的功效，被证实具有GP活性抑制作用，但其具体作用机制待进一步深入研究[33]。2.平性中药蚕蛹，性平,味甘,无毒,能治风及劳瘦。蚕蛹油[34]是从蚕蛹中提取出来的含有多种高级脂肪酸甘油酯的油状液体，富含α-亚麻酸、油酸、亚油酸等多种人体必需的不饱64 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究和脂肪酸。研究证实，蚕蛹油可促进GK的活性从而改善糖尿病大鼠的代谢异常，降低高血糖。桑枝皮[18]，性平，味微苦，归肝经，有祛风湿、利关节、行水之功效，通过降低G-6-P和PEPCK的mRNA的表达，降低葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)和PEPCK的活性，进而抑制肝糖原的分解和葡萄糖的氧化，降低了内源性葡萄糖的生成，从而改善了肝脏的胰岛素抵抗状态。甘草，性平，味甘，归心、肺、脾、胃经，润肺止咳、补气益肾、调和解毒、缓急止痛，以乙醇为提取剂从其根中提取的甘草黄酮，可显著降低糖尿病肝脏组织中的GSK-3β蛋白的表达量，增强肝组织的糖原合成，由此改善糖尿病的胰岛素抵抗[35]。葡萄籽提取物原矢车菊素B2(procyanidinB2)治疗2型糖尿病可显著抑制凋亡和细胞内氧化产物的产生，同时增加GSK-3β的磷酸化[36]。石榴花酚[37]可影响GSK-3β的活性，以此来达到降低血糖的目的。人参，性平，味甘、微苦，归脾、肺、心经，大补元气、复脉固脱、补脾益气、生津、安神、益智以人参二醇皂苷为底物，利用蜗牛酶转化结合响应曲面分析方法，成功制备的人参皂苷CompoundK[38]，它可有效激活腺苷一磷酸活化蛋白激酶（adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,AMPK）活性，抑制糖异生关键基因G-6-P和PEPCK的表达而抑制肝脏过度糖异生，减少内源性葡萄糖输出，降低空腹血糖。玉米须，性平，味甘、淡，不仅入阳明胃经，而且归肾、肝、胆经,功能是利水消肿、清肝利胆，玉米须多糖[39]可影响GSK-3β的活性，以此来达到降低血糖的目的。3.温性中药葫芦巴，性温味苦，归肾经，温肾壮阳,祛寒除湿。从葫芦巴种子中发现的天然甾体皂苷的糖苷配基—薯蓣皂苷配基[3]可以明显降低血糖，它主要是通过增强GK的活性及葡萄糖的利用率，积极调配G-6-P，抑制其mRNA的活性最终增加糖酵解，达到降糖的目的。葫芦巴中的胡芦巴碱[40]可减弱G-6-P的活性，来达到降低血糖的目的，但其具体机制尚未明确。黄芪，性味甘、微温，归脾、肺经，具有益气升阳、固表止汗，利水消肿和托毒生肌的功效。提取物黄芪苷IV[41]可以降低2型糖尿病状态下的GP的活性，减少了GP的mRNA的表达量，同时也可降低G-6-P的mRNA的表达，降低葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)的活性，进而抑制肝糖原的分解和葡萄糖的氧化，降低了内源性葡萄糖的生成，从而改65 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究善了肝脏的胰岛素抵抗状态。槟榔，性温，味辛、苦，归胃、大肠经，可行气利水、利湿除疸。从槟榔果中提取的生物碱槟榔碱[42]，可以抑制G-6-P及相关的转录因子的过度表达，抑制糖异生的过度活化，发挥降糖作用。其低剂量（1mg/kg）可抑制PEPCK及相关的转录因子PGC-1α、FOXO1的过度表达，抑制糖异生的过度活化，发挥降糖作用。当归[43]味甘、辛，性温，归肝、心、脾经，具有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效。提取物当归多糖、山楂酸[45]等五环三萜化合物是天然、低毒的新型GP抑制剂。4.凉性中药益母草，性凉，味辛、苦，归肝、心包经，活血调经、祛瘀生新、利尿消肿。益母草碱[46]通过降低G-6-P的mRNA的表达，降低葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)的活性，进而抑制肝糖原的分解和葡萄糖的氧化，降低了内源性葡萄糖的生成，从而改善了肝脏的胰岛素抵抗状态。它可改善高血糖下的PEPCK表达紊乱，降低PEPCK的mRNA表达量来达到调节血糖的作用，而对正常状态的PEPCK的mRNA的表达无影响。丹参，味苦，归心、肝经，可活血调经、凉血消痈、安神，提取物中的脂类成分——15,16-二氢丹参酮I[47]通过降低由于胰岛素抵抗引起的G-6-P基因表达异常增多来改善血糖代谢异常。由于胰岛素抵抗可引起PEPCK基因表达异常增多，丹参提取物[47]可显著改善并降低异常增多的PEPCK基因表达量。薏仁，性凉，味甘、淡，归脾、胃、肺经，健脾渗湿，除痹止泻，清热排浓。由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、乳糖、葡萄糖组成的多聚糖——薏仁多糖[48]等均可增加GK的活性，改善糖代谢紊乱及胰岛素抵抗，但其具体机制尚未明确，待进一步的研究。长春花，性凉，味微苦、有毒，归肝、肾经，清热平肝，解毒抗癌。长春花提取物[49]被证实具有GP活性抑制作用，但其具体作用机制待进一步深入研究。5.热性中药单味中药桂皮，大热，味辛、甘，归肾、脾、心、肝经，补火助阳、散寒止痛、活血通经。桂皮可改善糖耐量异常，增加肝糖原的储存，促进GK的活性，调节糖代谢[50]；肉桂性味及功能与桂皮相似，肉桂多酚能够促进GK的活性，提高胰岛素的敏感性，从而促进了肝细胞对葡萄糖的利用，降低血糖水平[51]。6.中药复方由生地、山药、枸杞和山萸肉为基础经提取制成的本草消渴丹，据“滋阴清热，润燥生津”这一治则，可增强GK的活性显著降低血糖[52]。依据“酸克甘”的中药疗法，以66 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究山萸肉、五味子、山楂、乌梅组合而成的酸味复方，对GK具有一定的激动作用，并且促进肝糖原的合成，影响肝脏葡萄糖代谢，达到降低血糖的目的[53]。中医认为“痰瘀互结、毒邪内胜”是胰岛素抵抗IR的病机关键，即2型糖尿病的矛盾焦点，所以治疗重在化痰活血。复方中药中活血化痰作用的胰苏灵，由瓜蒌、制半夏、红花、生山楂、水飞蓟素等组成，可以通过增加GK的活性来实现治疗糖尿病的目的[54]。翻白草具有止血止痢、清热解毒、利尿消肿的功效，可以降低2型糖尿病小鼠血清胰岛素水平，黄芪可以辅助治疗2型糖尿病的胰岛素抵抗，其多种成分在控制糖尿病患者血糖及其并发症上具有积极的作用，芪白合剂由黄芪和翻白草组成[55]，煎煮浓缩成生药，通过影响PEPCK的mRNA表达量来达到治疗糖尿病的目的。中药复方五子降糖方，由菟丝子、女贞子、紫苏子、莱菔子、车前子组成，其中菟丝子平补肾阴肾阳，女贞子平补肝肾之阴，二者合用使肾之阴阳得补，肾气得充，进而蒸腾、气化推动和调节胃之“游溢精气”、脾之“散精”、肺之“通调水道”，使津液输布代谢正常，则痰浊无以内生[56]。紫苏子降气润肠、消痰，莱菔子消食导滞、化痰，车前子渗湿利尿、祛痰。五药配伍使肾虚得补、气机得畅、痰浊得化[56]。五子降糖方可显著升高丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）的磷酸化水平，抑制GSK-3β的蛋白表达[56]。由此推测，五子降糖方的降糖机制可能是通过影响AKT/GSK-3β通路，促进肝糖原合成来实现降低血糖的目的。表1肝脏糖代谢相关酶所涉及的中药分类治疗糖药性分类中药复尿病的寒平温凉热方机制地黄（地黄寡糖）[7]、地黄（单味中本草消[7]肉桂（肉药）、湖北麦冬渴丹（复激动GK[8]桂多酚）（多糖）、苦丁葫芦巴[50]方制剂）活性[13]蚕蛹（蚕蛹薏仁（多糖）、桂皮[52]茶（单味中药）[34]（薯蓣皂[48]、酸味油）[3]、（单味芦荟（单味中药）苷配基）复方（复中药）[28]、凤丹皮（单味[51]方制剂）[9]、[53]中药）、黄连（小檗碱）[31]、抑制地黄（地黄寡糖）桑枝皮（单味葫芦巴丹参（15,16-[7][32]G-6-P活、地黄（单味中中药）、人（葫芦巴二氢丹参酮67 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究性药）[7]、湖北麦冬参（人参皂碱）[40]槟I）[47]、益母（多糖）[8]、栀子苷）[38]、榔（槟榔草（益母草（栀子苷）[15]、碱）[42]、碱）[46]栎精（单味中药）[29]、凤丹皮（单味中药）[9]、苦丁茶（单味中药）[13]、黄连（小檗碱）[31]、绿茶（茶多糖）[32]胰苏灵抑制丹参（15,16-（复方桑枝皮（单味PEPCK黄连（小檗碱）槟榔（槟二氢丹参酮制剂）中药）[18]、人活性[31]、榔碱）I）[47]、益母[54]、芪白参（人参皂[42]、草（益母草[38]合剂（复苷）、碱）[46]方制剂）[55]当归（当归多糖）栀子（栀子苷）[37][43]山楂抑制GP活性苦瓜（单味中药）（山楂长春花（提取[51]、酸）[45]、物）[49]、黄芪（黄芪甲苷IV）[41]、葡萄籽（原矢车菊素B2）抑制[40]、玉米须五子降GSK-3β牡丹皮（单味中[39][54]（多糖）、糖方（复活性药）、甘草（甘草黄方制剂）[35][56]酮）、石榴花（石榴花酚）[37]、四、结语与展望中医药治疗糖尿病历史悠久，具有多途径、多靶点、高效、低毒，有效防治糖尿病并发症等特点，近年来逐渐成为治疗糖尿病的主要研究方向。肝糖代谢途径是一个很好的抗糖尿病靶点，中医药调节肝糖代谢治疗糖尿病的研究也已经有了一定的研究基础和研究成果，但是，值得注意的是中药不同于一般的植物药，中药尤其独特的理论体系和临床用药方法是其最大的魅力。要想使中药治疗糖尿病走向世界，一定要做到中药研究现代化，关键在于：①应该与中医药理论、中医药古籍文献以及中医临床实践密切联系起来，真正做到继承中发展；②应利用先进的科学技术，例如：计算机辅助设计、研发特异性抑制剂等，可对中药产生作用的具体环节、途径、机制、新靶点等进行更加深入68 兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究的探讨；③把握好中药多靶点、多环节、综合作用及功能调节的特点，在明确药物有效成分的有效作用的基础上，考虑多个靶点有效成分的合用，更加发挥了中医药多靶点、多途径的治疗优势；④对糖尿病并发症的防治是中药防治糖尿病的优势所在，对疗效确切、能降低病死率的中药，不能单纯以能否降糖为惟一指标，应着重研究其对糖尿病的预防、综合控制及对并发症的防治机理上。参考文献[1]BrunettiA,ChiefariE,FotiD.Recentadvancesinthemoleculargeneticsoftype2diabetesmellitus[J].WorldJournalofDiabetes,2014,5(2):128-140.[2]InternationalDiabetesFederation.IDFDiabetesAtlasNews.7thEditionoftheDiabetesAtlasreleasedonWorldDiabetesDay,2015http://www.idf.org/sites/default/files/da5/5eDiabetesAtlas_2015.pdf.[3]SaravananG,PonmuruganP,DeepaMA,etal.ModulatoryEffectsofDiosgeninonAttenuatingtheKeyEnzymesActivitiesofCarbohydrateMetabolismandGlycogenContentinStreptozotocin-InducedDiabeticRats[J].CanadianJournalofDiabetes,2014,38(6):409–414.[4]RafaelaR,VictoriaJ,MiwonA,etal.Sterolregulatoryelement-bindingprotein-1(SREBP-1)isrequiredtoregulateglycogensynthesisandgluconeogenicgeneexpressioninmouseliver[J].JournalofBiologicalChemistry,2014,289(9):5510-5517.[5]IrgensHU,KarianneF,JohanssonBB,etal.Glycogenin-2isdispensableforliverglycogensynthesisandglucagon-stimulatedglucoserelease[J].JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,2015,100:767-775.[6]GaoY,ZhangM,WuT,etal.EffectsofD-pinitoloninsulinresistancethroughPI3K/Aktsignalingpathwayintype2diabetesmellitusrats[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2015,63(26)：1-32.[7]张汝学,贾正平,刘景龙,等.地黄寡糖对2型糖尿病大鼠肝脏糖代谢关键酶活性及基因表达的影响[J].中草药,2012,43(2):1184-1187.[8]雷蕾,刘泉,申竹芳.以葡萄糖激酶为靶点的2型糖尿病药物研究现状[J].中国新药杂志,2011(3):213-218.[9]王松笛.凤丹皮降血糖的活性成分研究[D].湖北中医药大学,2012.[10]KumarM,RawatP,KhanMF,etal.PhenolicglycosidesfromDodecadeniagrandifloraandtheirglucose-6-phosphataseinhibitoryactivity☆[J].Fitoterapia,2010,81(6):475-479.69 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兰州大学硕士研究生学位论文褪黑素受体激动剂Neu-p11基于线粒体平衡的抗糖尿病机制研究中英文对照表英文缩写英文全称中文名称T2DMtype2diabetesmellitus2型糖尿病MLTmelatonin褪黑素STZstreptozotocin链脲佐菌素Neu-p11melatoninreceptoragonist新型褪黑素受体激动剂FBGfastingbloodglucose空腹血糖IPGTTintraperitonealglucosetolerancetest腹腔葡萄糖耐量试验ITTinsulintolerancetest胰岛素耐量试验G-6-Paseglucose-6-phosphatase葡萄糖-6-磷酸酶INSInsulin胰岛素IRinsulinresistance胰岛素抵抗PVDFpolyvinglidenefluoride聚偏二氟乙烯ECLenhancedchemiluminesence增强化学发光GKglucokinase葡萄糖激酶PEPCKphosphoenolpyruvatecarboxylasekinase磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶GSK-3glycogensynthasekinase-3糖原合成激酶-3AMPKAMPactivatedproteinkinase腺苷酸激活蛋白激酶PGC-1αPeroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma过氧化物酶体增殖活化受体γERRαestrogenrelatedreceptorα协同下游靶基因共激活因子1αMfn2Mitofusin2线粒体融合蛋白2Drp-1Dynamicrelatedprotein1线粒体分裂蛋白1GCN5Genralcontrolnonderepessible5乙酰基转移酶5HEHematoxylin-eosinstaining苏木素-伊红染色Mfn1Mitofusin1线粒体融合蛋白1mtDNAMitochondrialDNA线粒体DNAPAGEPolyacrylamidegelelectorphoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳SIRT1Sirtuin/silentinformationregulator1沉默信息调节因子NRF1Nuclearrespiratoryfactor1核呼吸因子1NRF2Nuclearrespiratoryfactor2核呼吸因子2ROSReactiveoxygenspecies活性氧SDSSodiumDodecylSulfonate十二烷基苯磺酸钠PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚彬稀酰胺凝胶电泳WBWstern-bloitting免疫印迹法74
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