猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株HNyc15的感染性克隆构建与鉴定

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河南农业大学专业硕士学位论文题目猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株HNyc15的感染性克隆构建与鉴定学位申请人姓名徐晓东导师姓名张许科研究员张龙现教授专业学位类别兽医硕士领域预防兽医学研究方向动物传染病诊断与防治中国郑州2017年06月 分类号密级河南农业大学专业硕士学位论文论文题目：猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株HNyc15的感染性克隆构建与鉴定_____英文题目：ConstructionandIdentificationofInfectiousCloneofNADC30-likePorcineReproductiveand___RespiratorySyndromeVirusstrainHNyc15_____学位申请人：徐晓东_________导师：张许科研究员张龙现教授学位类别：兽医硕士______领域：预防兽医学____研究方向：动物传染病诊断与防治_论文提交学位授予日期：日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书￣学位论猪繁祯勹呼吸综ｆ涵？毐类ＮＡＤＣ３０边株ｔ征￥位｜｜ｃ文题目ＨＮｙ１５的感染性兑降构建与鉴定类别硕士徐晓￥＾张许科张龙现２１＾１１ｆｒ如需保密，解密时间年月日独创性声明木人呈义丨仑文玷在导师指导下进行的研究：丨：作及取Ｗ研宄成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人匕经发表或撰Ｗ过的研究成果；也不？包括为获得河南农＃．火学或其他教育机构的学位或〖止ｉｓ而使ｍ过的材料》指导教师对此进行了小定一丄作的同處对木研宂所做的任何贡献均已夜论文屮做了。ｙ我ｎ明确的说明，并衣小了谢总。特此屮明。研宂生签名：嗓导师签名／系私旅崎Ｉ口期：年ＡｎｆＭ丨｜期：７＜？年Ｈ＞／７／《月石学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农？人学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本－版；学校有权保存提交论文的印刷本和电了＋，并提供「１录检索和阅览服务＃可以采川影印、缩印或扫描等复制手段保存、；丨：编、。学位论文本人Ｍ意河南农［ｋ人学可以用＋Ｈ方式在不同媒体上发表、传捕学位论文的全部或部分容内、业开河《河南农Ｉｋ，本人完企了解人学知识产权保护办法》的有关规定在毕离南一业农业人学后：，就在Ｉ表论文，第位校期间从寧的科研作发的所有署名单为河南农火、南农业火学所学，试验材料、段始数据则，巾报的专利等知识产权均归河有，５承的法律任。扭相应貴注：保密论文用于本授权书。学位在解密后适研名：师签名学院领导签名：宄生签导Ｆ１期：ｆ月闩期Ｉ日期：年日ｆ彡Ｒ厶月日月Ｍｊｆ 致谢谢师恩如山，念离别之伤，百感交集。忆似水年华，叹时光不复，夏至未至。硕士研究生的学习即将结束，回首过去，点点滴滴的记忆霎时涌上心头，两年的学习生活使我受益匪浅。现在我要向他们表达最真挚的谢意。首先感谢我的导师张许科研究员、张龙现教授，他们渊博的知识、博大的胸怀和诲人不倦的师德品质深深地感染了我，不仅使我在为人处事上得到启发，更使我感受到科研的魅力。两位导师对待工作精益求精、一丝不苟的态度，深深的感染并激励了我。在此，特向恩师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！特别感谢国家兽用药品工程技术研究中心主任田克恭教授、李向东博士、谭菲菲博士在我课题选择与试验设计方面的指导。其次感谢国家兽用药品工程技术研究中心给我提供了良好的实验条件和优越的学术环境。再次感谢田克恭教授、李向东博士、谭菲菲博士在实验过程中的指导，感谢他们在百忙之中抽出时间对我的论文认真批改。感谢国家兽用药品工程技术研究中心基因工程室的师姐姬郭彪、李英英、王娟、颜世君、相双双、代珊、白露露，师兄张超林、胡旭乐，感谢中心动物疫苗研究所的师兄白小飞、杨青原、吴洪超、吕超超，师姐汪志艳、程艺等给予的帮助。非常感谢同一课题组的李玉芳、李炎林和师兄常亚飞、师弟张帅、邢广源在工作中给予的协作和无私帮助，感谢他们对课题组研究做出的贡献。感谢我的同门师兄左松、苌生科、周金龙、刘鹏飞，师妹张霞，我们在学习和生活中如同家人一般，互相帮助、互相关爱。感谢参加我论文评阅和答辩的各位专家教授的指导。感谢我的同学河南农业大学牧医工程学院刘营营、刘伯帅、胡苏辉、韦学雷、胡家乐、宋亚伊在学习和生活中对我的关心。感谢院领导老师们的鼓励和关怀；感谢班长肖小帅为班集体做出的贡献，感谢同班同学给予的帮助，感谢2015级全体研究生同学。感谢我的家人对我的支持和理解！不再年轻的父母操劳一生，用勤奋的双手为我们创造幸福，感谢你们在我求学之路上做出的奉献与牺牲！ 目录中文摘要...........................................................................................................................................1英文缩略表.......................................................................................................................................3第一章文献综述.............................................................................................................................41.1猪繁殖与呼吸综合征及其病毒研究进展.................................................................................41.1.1PRRSV病原学........................................................................................................................41.1.1.1PRRSV的分类地位及生物学特性.....................................................................................41.1.1.2PRRSV的细胞嗜性.............................................................................................................51.1.1.3PRRSV基因组结构.............................................................................................................61.1.2PRRSV编码蛋白的结构和功能............................................................................................61.1.2.1非结构蛋白...........................................................................................................................71.1.2.2结构蛋白...............................................................................................................................71.1.3PRRSV流行病学....................................................................................................................81.1.4PRRSV的遗传变异................................................................................................................91.1.5临床症状及致病机理..............................................................................................................91.1.6防控策略................................................................................................................................101.2PRRSV反向遗传学研究进展.................................................................................................101.2.1PRRSV反向遗传学概述......................................................................................................101.2.2PRRSV感染性cDNA克隆的应用......................................................................................111.2.2.1蛋白功能的研究.................................................................................................................111.2.2.2在研究新型疫苗和基因载体的上的应用.........................................................................12第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株的分离与鉴定...................................................132.1引言...........................................................................................................................................132.2材料与方法...............................................................................................................................132.2.1材料........................................................................................................................................132.2.1.1血清及病毒样品.................................................................................................................132.2.1.2细胞.....................................................................................................................................132.2.1.3主要试剂.............................................................................................................................132.2.1.4培养基与主要溶液的配制.................................................................................................142.2.1.5主要仪器设备.....................................................................................................................142.2.2方法........................................................................................................................................142.2.2.1PCR引物的设计................................................................................................................142.2.2.2样品的准备.........................................................................................................................15 2.2.2.3提取核酸.............................................................................................................................152.2.2.4反转录.................................................................................................................................152.2.2.5血清样品PCR检测...........................................................................................................162.2.2.6PRRSV的分离与培养.......................................................................................................162.2.2.7细胞培养物的Nsp2基因序列扩增、克隆与测序及比对分析.......................................162.3结果与分析...............................................................................................................................172.3.1血清样品的PCR检测..........................................................................................................172.3.2PRRSV的分离......................................................................................................................182.3.3Nsp2基因序列的拼接及氨基酸同源性分析......................................................................192.4讨论..........................................................................................................................................20第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株全基因序列测定与分析....................................213.1引言...........................................................................................................................................213.2材料和方法...............................................................................................................................213.2.1材料........................................................................................................................................213.2.1.1病毒样品.............................................................................................................................213.2.1.2主要试剂.............................................................................................................................213.2.1.3主要设备.............................................................................................................................213.2.1.4主要溶液配制.....................................................................................................................223.2.2方法........................................................................................................................................223.2.2.1引物设计.............................................................................................................................223.2.2.2提取核酸及反转录.............................................................................................................233.2.2.3全基因扩增、克隆与测序与序列拼接.............................................................................233.2.2.4全基因序列同源性分析.....................................................................................................243.2.2.5全基因序列遗传进化分析.................................................................................................243.2.2.6序列重组分析.....................................................................................................................243.3结果与分析...............................................................................................................................253.3.1PRRSV全基因组扩增、克隆、测序与序列拼接..............................................................253.3.2HNyc15毒株全基因序列同源性分析.................................................................................263.3.3HNyc15株全基因序列遗传进化分析.................................................................................263.3.4HNyc15毒株基因重组分析.................................................................................................273.4讨论...........................................................................................................................................28第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株感染性克隆的构建及鉴定................................294.1引言...........................................................................................................................................294.2材料与方法...............................................................................................................................29 4.2.1材料........................................................................................................................................294.2.1.1病毒和细胞.........................................................................................................................294.2.1.2载体和菌株.........................................................................................................................294.2.1.3主要试剂.............................................................................................................................294.2.1.4细胞培养基及主要溶液配制.............................................................................................304.2.1.5主要仪器设备.....................................................................................................................304.2.2方法........................................................................................................................................304.2.2.1构建策略.............................................................................................................................304.2.2.2引物设计与合成.................................................................................................................314.2.2.3pBluescriptⅡSK(+)载体改造............................................................................................324.2.2.4PRRSVHNyc15株基因组片段的扩增.............................................................................344.2.2.5HNyc15各个片段的克隆和中间质粒的构建..................................................................344.2.2.6HNyc15全长质粒的拼接与测序......................................................................................354.2.2.7病毒的拯救........................................................................................................................404.2.2.8拯救病毒的鉴定................................................................................................................404.2.2.9拯救病毒生物学分析........................................................................................................414.3结果与分析..............................................................................................................................424.3.1pBluescriptⅡSK(+)载体改造...............................................................................................424.3.2HNyc15株各片段RT-PCR扩增结果..................................................................................424.3.3HNyc15株全长cDNA质粒的拼接与测序.........................................................................434.3.4病毒拯救................................................................................................................................444.3.5PRRSVHNyc15株感染性克隆的鉴定................................................................................444.3.5.1拯救病毒的IPMA鉴定.....................................................................................................444.3.5.2拯救病毒的遗传标记鉴定.................................................................................................454.3.6PRRSVHNyc15株拯救病毒的生物学特性........................................................................454.4讨论..........................................................................................................................................46第五章结论...................................................................................................................................47参考文献.........................................................................................................................................48Abstract...........................................................................................................................................55 中文摘要猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)感染引起的一种严重危害世界养猪业的传染性疾病。2012年开始，从我国养猪场分离到一类与2008年在美国分离到的美洲型NADC30毒株有很高的核苷酸相似度的PRRSV毒株，最近几年这类毒株在我国养猪场广泛发现，在我国命名为PRRSV类NADC30毒株。该类毒株具有中等致病力，有研究表明现有的商品化疫苗已经不能提供完全的保护，对我国养猪业造成一定的经济损失。因此，分析该类毒株的遗传演化及分子致病机理具有重要的意义。本论文在对PRRSV类NADC30毒株HNyc15分离鉴定的基础上，进行了分离毒株的全基因组序列测定和进化分析，以期探究该类毒株的变异规律；利用反向遗传操作技术，构建了类NADC30毒株HNyc15的感染性克隆，以期为开展该类毒株致病机理、变异机制等相关研究奠定基础。本研究对河南伊川猪场的血清样品进行PRRSV检测，检测结果显示为PRRSV阳性，且分型检测初步表明其为类NADC30毒株；利用猪肺泡巨噬细胞（Porcinealveolarmacrophages,PAM）进行病毒分离，接种PAM细胞后48h可观察到典型的细胞病变，96h收获细胞培养物；对其做RT-PCR，扩增Nsp2基因片段进行序列测定，Nsp2基因测序结果比对显示，与NADC30毒株Nsp2区域有着相同的131个氨基酸缺失。因此，确定为类NADC30毒株，命名为HNyc15株。本研究根据Genbank上公布的NADC30毒株的全基因序列设计引物，对HNyc15毒株的全基因序列分为12段扩增，将各段基因序列测定结果进行拼接，基于国内外已有毒株的全基因组序列进行比对分析、遗传进化分析、重组分析。全基因序列测定表明，HNyc15毒株基因组全长为15049bp；与已报道的毒株全基因序列对比发现，HNyc15株与LV株、VR-2332株、NADC30株的核苷酸一致性分别为60.4%、85.2%、93.8%；进化分析表明，HNyc15、HENAN-XINX、HNjz15、HENAN-HEB、NADC30属于同一亚群，该亚群大多是由2012年之后在我分离到的类NADC30毒株所组成；软件分析重组情况表明，HNyc15株在ORF2-4区域重组了VR-2332和CH-1a的基因片段。由此推断，我国的类NADC30毒株可能是由美国NADC30株与美洲型毒株经历基因重组和逐渐积累变异而来的。本研究将PRRSV类NADC30毒株HNyc15基因组根据合适的酶切位点分为A、B、C、D、E、F六个片段，设计引物分段扩增，将扩增后的产物插入中间载体pEASY-Bluntsimple构建中间质粒；在pBluescriptⅡSK(+)载体多克隆位点（MCS）的上游插入CMV真核启动子，下游引入用于提高转染效率的丁型肝炎病毒的核酶因子（HDV）及BGH终止信号序列，改造出转录载体pBlue-CMV-HB；利用各片段两端的单一酶切位点将六个片段连入改造后的转录载体pBlue-CMV-HB中构建全长cDNA克隆质粒pBlue-CMV-HNyc15，并在B、C片段连接处通过同义突变引入酶切位点XbaⅠ，作为感染性克隆的遗传标记。转染BHK-21细胞，48h后收获细胞培养上清接种PAM细胞，接种后48h可在显微镜下观察到明显的细胞1 病变。通过IPMA鉴定表明病毒拯救成功，酶切鉴定遗传标记存在于拯救病毒。比较亲本病毒与拯救病毒的多步生长曲线，表明HNyc15拯救病毒与其亲本病毒在PAM细胞上的增殖特性没有显著差异。以上结果表明PRRSV类NADC30毒株HNyc15株感染性克隆构建成功，为研究PRRSV类NADC30毒株的分子生物学以及致病机制提供了技术平台。关键词：猪繁殖与呼吸综合征；类NADC30毒株；HNyc15；序列测定；感染性克隆2 英文缩略表缩写英文名称中文名称Ampampicillin氨苄青霉素ADEantibodydependentenhancement抗体依赖性增强作用bpBasepair碱基对cDNAcomplementary互补DNAdday天DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDulbecco改进的Eagle培养基DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸DTTdithiothreitol二硫苏糖醇EAVEqinearterivirus马动脉炎病毒E.coliEscherichiacoli埃希式大肠杆菌FBSfetalbovineserum胎牛血清ggramorunitofgravityforce克或离心力单位hhour小时IPMAimmunoperoxidasemonolayerassay免疫过氧化物酶单层细胞试验IPTGIsopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代半乳糖苷kbkilobasepair千碱基对Lliter升LDVMouselactatedehydrogenase-elevatingvirus小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒minminute分钟mLmilliliter毫升molmole摩尔ntnucleotide核苷酸ORFOpenreadingframe开放阅读框PAMporcinealveolarmacrophages猪肺泡巨噬细胞PCRPolymerasechainreaction多聚酶链式反应PPRSporcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征porcinereproductiveandrespiratorysyndromePPRSV猪繁殖与呼吸综合征病毒virusRACErapidrapid-amplificationofcDNAendcDNA末端快速克隆rpmrevolutionsperminute转/分钟RNAribonucleicacid核糖核酸RPMI-RoswellParkMemorialInstitute-1640RPMI-1640培养基1640RTreversetranscription反转录Ssecond秒SHFVSimianhemorrhadicfevervirus猴出血热病毒TCID5050%tissuecultureinfectiousdose50%组织培养物感染剂量UTRUntranslatedRegions非翻译区TRSTranscriptionRegulatingSequence转录调控序列X-gal5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷3 第一章文献综述1.1猪繁殖与呼吸综合征及其病毒研究进展猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)感染引起的一种以怀孕母猪流产、早产和死胎等繁殖障碍和仔猪、育肥猪呼吸系统损伤和生长缓慢为主要[1,2]症状的高度接触性传染病，是目前影响猪群健康的重要凶手之一。耳部皮肤发绀是PRRS在临床上的一个标志性特征，因此俗称“蓝耳病”。该病最早于1987年发现于美国，1990[3,4]年以后在欧洲各国流行，在世界范围内给养猪业造成了非常大的经济损失。由于当时该病的发病原因不确定、临床症状也有较大差异，曾被命名为“猪神秘病”、“猪神秘繁殖综合征”等。1992年，国际猪病学术会议将其正式统一命名为“猪繁殖与呼吸综合征”。1996年，PRRS首次在我国报道，并且成功分离到PRRSV毒株，PRRS疫情迅速蔓延[5]全国，成为影响我国生猪产业的重要疫病之一。2006年春末夏初，我国南方一些省份养猪场突然出现大量不明原因的死亡猪只，不同日龄的猪群均有发病，甚至有些经产多胎母猪也出现死亡，临床以“三高”（持续高热、高发病率和高死亡率）为主要特征，在当时给我国养猪业造成巨大经济损失，导致我国的生猪和猪肉价格创历史新高，在世界范围内引起关注。对采集的临床样品进行病理学、免疫组化检测和动物实验，确认PRRSV高致病性变异株为[6]本次猪“高热病”疫情的原发病原。2012年起，一类具有非常独特的遗传背景，与2008年在美国分离到的美洲型NADC30毒株有很高的核苷酸相似度的PRRSV在我国养猪场广泛发现，这类毒株在我国命名为PRRSV类NADC30株。该类毒株具有中等致病力，对我国的[7,8]生猪养殖造成了一定程度的危害。1.1.1PRRSV病原学1.1.1.1PRRSV的分类地位及生物学特性PRRSV是正链RNA病毒，由于其细胞嗜性、生化特性、抗原性及形态特征等与动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)的马动脉炎病毒(Eqinearterivirus,EAV)、猴出血热病毒(Simianhemorrhadicfevervirus,SHFV)、鼠乳酸脱氢酶病毒(Mouselactatedehydrogenase-elevatingvirus,LDV)相似，因此当初将该病毒归为动脉炎病毒科、动脉炎病毒属。1996年在以色列举行的第十届国际病毒学大会上，国际病毒分类委员会把PRRSV及[9]同属的EAV、SHFV、LDV一同归属于尼多病毒目、动脉炎病毒科。在电镜下，纯化的PRRSV直径为50-65nm，有囊膜，表面比较平滑，内部核衣壳为正[10]二十面体对称（见图1-1），核衣壳外面被脂质双层膜环绕，易被脂溶剂溶解，如氯仿、33乙醚等；在氯化铯密度梯度和蔗糖密度梯度中的浮密度分别为1.19g/cm、1.14g/cm。从自然发病猪中分离到的PRRSV没有血凝活性，不能凝集鸡、鹅、牛、马、猪、羊和人的红细胞。4 [10]图1-1PRRSV粒子示意图[10]Fig1-1SchematicstructureofPRRSV1.1.1.2PRRSV的细胞嗜性PRRSV具有严格的宿主细胞特异性，只能在少数细胞上增殖，如已分化的单核巨噬细胞系（包括肺泡巨噬细胞、肺血管内巨噬细胞、外周单核细胞等）。猪的肺泡巨噬细胞是PRRSV感染的首要靶细胞，同时还可感染分布在心脏、胸腺、脾和肾等组织中的间质巨噬[11-13]细胞。PRRSV最早是从猪肺泡巨噬细胞（porcinealveolarmacrophages,PAM）中分离出来的。从6周龄左右的SPF猪的肺脏中分离收集PAM细胞，然后将收集到的PAM细胞转入96孔细胞培养板中加入培养液进行培养，至细胞成单层时接种病料，显微镜下观察直到出现病变，[14]主要表现为细胞变圆皱缩、聚堆和快速崩解。后来研究发现猪的血单核细胞、神经胶质[15]细胞、猪睾丸细胞也能有效繁殖PRRSV。MA104的几个亚细胞系，比如，Marc-145和[16-18]CL2621、HS2H、CRL1171，可在体外用于PRRSV野毒株和疫苗株的繁殖。PRRSV感染Marc-145细胞后，通过流式细胞术检测发现，病毒在细胞中的含量在感染中期明显高[19]于感染早期。除此之外，鸡胚和其它常见的一些细胞系均不能支持PRRSV的增殖，包括猪呼吸道上皮细胞、心脏和肾脏的内皮细胞、髓细胞、鸡的内皮细胞和鸡胚成纤维细胞，以及PK-15、Vero、BHK-21、MDCK等常见的传代细胞系。研究表明，PRRSV通过口、鼻侵入猪体后首先与PAM细胞上的受体结合，然后经内吞作用进入PAM细胞内，最终导致细胞崩解，再通过体液循环导致全身感染发病。目前发现PAM细胞上存在4个PRRSV感染有关的受体：ClusterofDifferentiation163（CDl63）分子，硫酸乙酰肝素(Heparinsulfate，HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin，SN)和CathepsinE(CTSE)5 [20]分子。硫酸乙酰肝素主要作用是介导病毒最初吸附到PAM细胞表面。硫酸乙酰肝素是[21]PRRSV与肺泡巨噬细胞的一个最初结合受体，其相互作用是通过M/GP5复合物介导的。唾液酸粘附素(Sn)的主要作用是介导PRRSV的内吞，主要存在于脾、淋巴结、骨髓、肝、肺等特定组织的亚型巨噬细胞中，而在PRRSV容易感染的细胞系，如非洲绿猴肾细胞（MA-104,Marc-145）则没有。PRRSV的M/GP5蛋白复合物也可与PoSn相互作用，这有利[22-24]于病毒的吸附和内化。CD163受体与病毒包膜蛋白GP2a和GP4相互作用，主要起协[25-26]助SN内吞、病毒脱衣壳和将基因组RNA释放到细胞质中的作用。组织蛋白酶E（CTSE）[27]的主要作用是协助病毒脱衣壳和释放基因组。另外，PRRSV也感染肺血管、淋巴结和脾中的巨噬细胞及胎盘和脐带血内巨噬细胞，但是不能感染血液单核细胞，说明病毒不会在未激活的单核细胞中进行复制，但现在还不清[28]楚是通过哪种途径支持病毒持续在易感细胞中进行复制。还有研究表明，尽管干扰素α(interferon-α,IFN-α)具有抗病毒活性，但是IFN-α能够提高在体外培养的单核细胞唾液酸黏附素的表达，从而导致PRRSV感染单核细胞的能力增强。唾液酸粘附素(Sn)在未被激活的单核细胞中表达水平低甚至不表达，能够不被PRRSV感染，由此提示Sn的表达对于PRRSV[29]感染十分重要。1.1.1.3PRRSV基因组结构PRRSV基因组长度在15kb左右，为不分节段的单股正链RNA；基因组5’端的帽子结[30]构、3’端有poly(A)尾巴对于保持病毒RNA的感染性是必要的。PRRSV共包含10个阅读框（ORF），每个阅读框和相邻的阅读框有部分重叠（见图1-2）。非结构蛋白由ORF1a和1b编码，长约12kb，占整个PRRSV病毒基因组的80%左右，位于病毒基因组5’端非编码区（untranslatedregion,UTR）之后，编码RNA复制酶和转录相关蛋白。而ORF2～7分别编码8个结构蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、ORF5a、M和N蛋白，其中E蛋白[31]是由位于ORF2内部的一个阅读框编码的。在PRRSV的结构蛋白中，GP5、M、N蛋白是主要结构蛋白，而GP2a、2b、GP3、GP4是次要结构蛋白。[10]图1-2PRRSV的基因结构[10]Fig1-2genomeorganizationofPRRSV1.1.2PRRSV编码蛋白的结构和功能目前，PRRSV的每个ORF所编码的蛋白都已确定。根据其功能的不同，可将所编码的蛋白分为非结构蛋白(Nonstructuralprotein,Nsp)和结构蛋白，其中ORF1编码的多聚蛋白参6 与病毒的复制和转录；同时研究发现，ORF1编码的复制酶（Replicase）是唯一参与病毒基因组复制和sgmRNA转录过程的病毒蛋白，其它蛋白则不参与病毒基因组复制和sgmRNA[32]转录。病毒的结构蛋白由ORF2-ORF7编码，其中ORF2-ORF6编码的蛋白具有膜蛋白的特征，而ORF7编码核衣壳蛋白(N蛋白)，其分子量较小且富含碱性氨基酸。1.1.2.1非结构蛋白ORF1编码病毒的非结构蛋白，约占整个PRRSV基因组的80%左右，ORF1通过“核糖体移码”机制翻译产生多聚蛋白pp1a和pp1b。这些多聚蛋白又可被自身水解切割成多达14个非结构蛋白，分别是Nsp1α、Nsp1β以及Nsp2-12。有研究证明，Nsp1α和Nsp1β存在两个类木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶功能域，可以从1a和1ab多聚蛋白上自动将其切割下来。Nsp2是PRRSV基因组中最大的一个非结构蛋白，长度约为3.5kb，也是整个基因组中变异较大的区域。Nsp2主要含3个区域：N末端的半胱氨酸酶区、中部的高变区和C末端一个疏水的转膜区，Nsp2的变异主要发生在中部的高变区，最多可以缺失400个氨基酸，[33]中部高变区的100或200个氨基酸（aminoacid,aa）缺失并不会影响病毒的感染性。在许多PRRSV分离毒株中Nsp2区域经常存在氨基酸缺失，这也是造成PRRSV毒株基因组长度[6,34]差异的一个主要原因。Nsp4具有3C样丝氨酸蛋白酶活性，参与多聚蛋白pplab的水解，[35,36]也有很强的IFN抑制作用。Nsp9和Nsp10在病毒的复制过程中发挥复制酶的功能，Nsp9具有RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRp)活性，作为RNA[37]病毒的复制起点，是病毒复制酶体的主要成分。Nsp10具有ATP酶活性，可以解旋DNA[38]或者RNA。有学者研究表明，ORF1b编码区中的Nsp9和Nsp10基因是我国HP-PRRSV[39]的致死性毒力决定区。Nsp11是套式病毒目的特异性标记，具有核糖核酸内切酶活性，在病毒复制的很多阶段都有参与。在PRRSV中，Nsp11蛋白也具有抑制机体IFN产生的作用[35][40]。Nsp12的变异较大，目前研究发现该蛋白仅在冠状病毒、动脉炎病毒中存在。1.1.2.2结构蛋白PRRSV共有个8结构蛋白。ORF2a、ORF2b和ORF4分别编码E、GP2b、GP3、GP4等小囊膜蛋白；而主要囊膜蛋白GP5、ORF5a，膜基质蛋白M和核衣壳蛋白N分别由ORF5、ORF6和ORF7分别编码。GP2蛋白属于N-糖基化的囊膜蛋白，共含有2个糖基化位点，在PRRSV病毒粒子中含量非常少。GP2可通过二硫键与其它结构蛋白形成同源或异源多聚体，对欧洲型代表株LV的研究证实，GP2的N-糖基化对于病毒复制和侵染性具有重要作用。GP3蛋白由ORF3编码，是一种高度糖基化蛋白。美洲型和欧洲型毒株GP3包含的氨基酸数目不同，分别为254和265个氨基酸，是可溶性的高度糖基化蛋白。GP3的囊膜拓扑结构至今仍不清楚，还在推测当中，而且研究人员对于其在病毒粒子中的作用还存在争议[41]。GP3蛋白具有较强的免疫原性，特别是在细胞免疫方面具有优势，在病毒的致病性、病毒变异等方面有重要的意义。7 美洲型和欧洲型毒株GP4分别含有178个和183个氨基酸，分子量大小为31~35kD，为N-糖基化蛋白，有四个糖基化位点。GP4蛋白可以诱导产生中和抗体，且中和表位在美洲型和欧洲型毒株间不保守。经反向遗传操作试验证实，ORF4基因为PRRSV复制所必需[42]。GP5蛋白由ORF5编码，大小为5kD，是PRRSV最重要的结构蛋白之一。GP5可诱导产生中和抗体，有四个N-糖基化位点，第一个位于超高变区（N32、N33或N34），它存在于多数美洲型和欧洲型PRRSV株；第二个和第三个分别位于N44和N51（美洲型）或者N46和N53（欧洲型），并在所有PRRSV分离株间高度保守；第四个是美洲型毒株特有的[43]位点，位于N30。GP5诱导产生中和抗体，且中和抗体水平较GP4高。另有报道，GP5[44,45]还与PRRSV诱导的细胞凋亡有关，可诱导并引发细胞凋亡。总之，GP5是PRRSV最重要的结构蛋白，可参与细胞受体的结合、细胞凋亡，还与抗体依赖性增强作用和保护性免疫有关。膜基质蛋白(M)的分子量为18-19KD，由ORF6编码，为非糖基化蛋白。M蛋白可与[46]GP5通过二硫键形成异源二聚体，研究表明，该异源二聚体是动脉炎病毒感染所必需的。M蛋白可增强宿主对GP5的免疫反应，增强体液免疫反应，促进中和抗体的产生。核衣壳蛋白(N蛋白)是由ORF7编码的碱性磷酸蛋白，为非糖基化蛋白，分子量为13.8-15KD。N蛋白大约占病毒蛋白总量的20-40%，含量相对较高，具有很强的免疫原性，但是该抗体没有中和活性。试验表明，猪感染PRRSV后，首先产生针对N蛋白的抗体，并且N蛋白抗体在猪体内维持的时间长达一年以上，但是仍不具备中和活性。基于N蛋白的[47,48]这种特性，可以用于本病诊断方法的研究。1.1.3PRRSV流行病学猪是PRRSV的唯一天然宿主，不同日龄、不同品种的猪都可感染该病，野猪也不例外。怀孕母猪和2~28日龄的仔猪最容易感染。被PRRSV感染的猪可以通过多种途径排出病毒，[49]飞沫、唾液、粪便、尿液、血液、精液和乳分泌物等。PRRSV主要经过呼吸道感染，传播速度较快。PRRSV的传播途径主要是直接和间接接触传播，也可以发生垂直传播。PRRSV主要通过引种、动物及其产品的来往贸易进行远距离传播。该病自1987年在美国发现以来，已给养猪业造成了巨大的经济损失。发病猪和带毒猪及亚临床感染的猪群是该病的主要传染源。没有临床症状的带毒猪、感染后恢复健康的猪、被感染的母猪所产仔猪，以及病猪被PRRSV污染的环境和器械工具等在一定时间内都有传染性。该病流行的一个重要原因就是感染猪特别是隐性感染猪混入易感猪群，隐性感染猪遭受应激时会向外排出病毒进而感染易感猪群。由于PRRSV可在扁桃体和猪上呼吸道存活较长时间，因此带毒猪是该病重要的传染源，可导致病毒在猪群中反复传播，很难净化。此外，PRRSV可以经空气水平传播，特别是在短距离内(<3km)，对PRRSV[50]的传播更加有利。有学者在一次PRRSV爆发中发现，距传染源500m以内的猪场45%受8 [51]到感染，而距传染源1~2km的猪场只有2%被感染。PRRSV流行病学的一个重要特征就是持续性感染。在PRRS在猪场暴发一年后，仍然[52]可以在猪体内检测到抗PRRSV的抗体，这表明在猪群中存在持续感染。用美洲株弱毒活[53]疫苗免疫猪群9个月后，仍可在同一猪场的免疫和对照猪群中检测并分离到疫苗毒株，这一现象说明弱毒活疫苗对病毒的传播起一定的作用，这也有可能是导致PRRSV持续感染的原因之一。因此，造成PRRSV持续性感染的因素十分复杂，必须采取综合性的防制措施才能实现PRRS的净化。1.1.4PRRSV的遗传变异PRRSV与其它有囊膜的RNA病毒一样，基因组很容易发生变异。根据系统发育学将PRRSV分为欧洲型和北美型，代表毒株分别为LV株和VR-2332株，二者全基因组序列的核苷酸一致性仅为65%左右。还研究发现，美洲型毒株与欧洲型毒株的ORF1基因序列存在[54]较大的变异，它们的ORFla的核苷酸同源性约为55%，ORFlb的核苷酸同源性约为63%。在PRRSV全长基因组中，Nsp2、GP3和GP5三个蛋白变异最为频繁；M蛋白是最为保守[55,56]的结构蛋白，其氨基酸同源性高达96-100%。正是由于不同PRRSV毒株间的基因序列和抗原差异性，使得PRRSV疫苗的交叉保护力很不理想，这也是目前PRRSV疫苗研发存在的一个重要问题。许多研究表明，PRRSV基因组的遗传变异重组可导致毒株致病力的改变。比如2007年分离到的Em2007株，研究分析为HP-PRRSVWUHI株与国内经典弱毒疫苗株CH-1R的重[57]组毒株，其Nsp2区域不连续性缺失了68个氨基酸；在2015年分离到重组株JL580株，推测可能是由HP-PRRSV09HEN1株与NADC30株重组而来的，重组分析发现JL580株的有两个重组区域，分别在ORF1a、ORF3和ORF4基因内，并通过致病力实验证实JL580株[58]具有较强的致病性。1.1.5临床症状及致病机理PRRSV感染后引起的临床症状的严重程度与感染毒株的种类以及猪体免疫水平和健康水平相关，主要包括：怀孕母猪繁殖障碍、流产、死胎、早产及木乃伊胎，仔猪的呼吸道症状，断奶前仔猪存活率下降，生长迟缓。少数母猪的耳部、乳头、尾部、四肢等躯体末端皮肤发绀，呈蓝紫色，尤其耳尖发绀最明显。猪感染HP-PRRSV后，主要临床症状为体温高热不退（可达到41℃以上）、食欲不振、厌食、精神沉郁；皮肤发绀、眼结膜炎、眼睑水肿等症状。PRRSV通过口、鼻或生殖器官侵入宿主后，最先侵害肺脏和淋巴组织中的巨噬细胞。PRRSV首先与肺泡巨噬细胞上的相关受体结合，经过胞吞作用进入细胞内并迅速增殖。PRRSV在细胞内增殖进入高峰期后，可诱导被感染的巨噬细胞凋亡、破碎，最后崩解。少量存活下来的肺泡巨噬细胞也表现出功能低下，进而继发感染其他呼吸道细菌和病毒，表现出典型的呼吸道症状。同时，肺脏和淋巴组织中的免疫细胞分泌各种细胞因子，引起不同程9 度的间质性肺炎和淋巴结肿大。感染PRRSV的肺泡细胞破碎后，病毒随着血液循环及淋巴循环系统，分布到全身各组织器官的巨噬细胞内，出现病毒血症、全身淋巴结肿大和相关器官不同程度的损伤。病毒进入淋巴组织后，感染组织中的单核细胞和巨噬细胞，可造成持续[10]性感染。PRRS是一种免疫抑制性疾病，经常与其它的病原体混合感染，从而加重临床症状给防治带来更大困难。目前临床上最常见的是PRRSV与圆环病毒(porcinecircovirus,PCV)的混合感染，用PRRSV和PCV2人工感染猪的试验证明PCV2可以加重PRRSV引起的临床病[59]理变化，给养猪业带来了严重的经济损失。造成PRRS难以防治的另一个原因是其抗体依赖性增强作用(antibodydependentenhancement,ADE)，所谓ADE是指某些病毒用相应抗体处理后，其复制或感染能力显著增强。母源抗体和疫苗抗体都会致敏PRRSV靶细胞，引起ADE作用。据报道，在猪肺泡巨噬细胞培养物中加入一定滴度的PRRSV抗体可以显著[60]提高病毒产生的含量。1.1.6防控策略目前，疫苗接种仍是防控该病有效手段之一。不同地区的猪场应结合当地的实际情况，选择合适的疫苗，建立合理的猪场个性化免疫程序，科学免疫接种。首先要加强猪场的管理，切实做好环境卫生的消毒工作，降低其他细菌病或病毒病混合感染的机会。合理搭配营养，提高猪群免疫力。二是要坚持自繁自养，全进全出，如果需要引种，应尽可能从非疫区的PRRSV阴性种猪场引种，种猪引进之前必须进行PRRSV检测，引进后应先隔离饲养，观察无异常后方可与本场猪合群饲养，严禁从疫区引进种猪。三是定期对猪群进行PRRS血清学和病原学检测，监测PRRSV抗体水平。四是按照免疫程序结合抗体监测结果定期对猪群进行疫苗的免疫接种，目前我国市场上用于PRRS防疫的商品化疫苗主要包括灭活疫苗和弱毒活疫苗。灭活疫苗的优点是安全性好，但产生免疫保护比较慢，且保护效果不理想。而弱毒活疫苗能够快速刺激机体产生免疫应答反应，且免疫效果相对持久，因此在PRRSV阳性猪场建议使用PRRS活疫苗进行该病的预防。但是，由于PRRSV的免疫抑制特性，不同毒株之间交叉保护力差，且存在散毒和潜在返强等缺点。现有的PRRS活疫苗对2013年后在[61]我国流行的PRRSV类NADC30毒株的保护作用有限。近年来，研究人员不断致力于基因工程疫苗的研究，已研制出了有较好应用前景的产品，[62-64][65]如DNA疫苗、活载体疫苗和亚单位疫苗。当前PRRSV研究的核心工作是解析病毒蛋白结构与功能之间的相互作用，确定病毒的毒力基因，在此基础上，采用感染性cDNA分子克隆研制出安全高效的常规疫苗或基因工程疫苗，或者通过反向遗传操作技术将基因组部分基因缺失或替换而开发出可用于区分野毒株和疫苗株的基因工程疫苗。1.2PRRSV反向遗传学研究进展1.2.1PRRSV反向遗传学概述在现代病毒学中，反向遗传（Reversegenetics）作为一种热门的分子生物学技术在RNA10 病毒的基础研究中占据不可替代的位置。该技术又称感染性cDNA克隆技术，对于猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在分子水平上研究进程推进具有重要的意义。构建感染性cDNA分子克隆的传统方法就是然后根据全基因组中限制性酶切位点分布将基因组分成几个片段，分别扩增出病毒基因组片段，并依次相连至合适的载体，使PRRSV基因组全长cDNA受控于强的转录启动子，常用的启动子是噬菌体T7，T3，SP6，CMV启动子，构建基因组全长cDNA质粒，转染，拯救出有感染性的病毒粒子。构建感染性分子克隆，首先要获得准确的全长基因组序列。在构建基因组全长cDNA克隆时，反转录过程、基因片段核苷酸的突变、克隆载体的属性都会影响分子克隆的感染活[66]性。1998年，以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）欧洲型LV毒株为材料的感染性克隆[67]技术诞生。构建的方法是在含T7启动子的pOK12载体中插入基因组全长cDNA，然后转染BHK-21细胞，收集BHK-21细胞培养物，接种Marc-145细胞，3天后可在显微镜下观察到细胞病变，证明感染性cDNA克隆转录的RNA具有感染性。随后PRRSVⅡ型VR-2332[68,69]株和在美国分离的PRRSVⅠ型SD01-08株的感染性克隆相继构建成功。近几年，国内[70,71]也构建了许多经典和HP-PRRSV的感染性克隆，该技术在PRRSV的基因组结构与功能及致病机制研究方面取得了广泛应用。有学者利用真核启动子改进了感染性cDNA分子克隆技术，在pCMVmc1质粒中插入[72]全长cDNA克隆，并将真核启动子hMCV代替原来的T7原核启动子，用该重组质粒直接转染Marc-145细胞，转染3d后可在显微镜下观察到细胞病变（CPE），4d后CPE可达60%-70%。相比原核体外转录系统，真核启动子转录系统操作更加方便，转染效率也更高。1.2.2PRRSV感染性cDNA克隆的应用反向遗传为研究病毒复制、致病机制、毒力基因、病毒与宿主细胞的相互作用分子机制、病毒蛋白在体内的功能及研发病毒载体和重组疫苗提供一个有效的技术平台。1.2.2.1蛋白功能的研究有学者利用感染性克隆技术研究病毒基因组结构蛋白基因编码区对于病毒的复制是否[73]必需，通过缺失分析实验证实，ORF7中有34个核苷酸是PRRSV的RNA复制所必需的。有学者以全长cDNA克隆为基础，突变分析得出结论，病毒粒子的包装形成需要膜蛋白基[41]因的表达，囊膜蛋白基因对产生感染性病毒粒子是必须的。通过人工克隆位点MluⅠ和SgrAⅠ在PRRSVNsp2的C端插入增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)，成功拯救病毒，EGFP可以表达，而在后来的传代过程中EGFP因为一个氨基酸从精氨酸突变为半胱氨酸而功能消失，荧光消失，表明Nsp2的C端插入序列对病毒的包装和[74]复制没有影响，但插入的序列很容易突变。有学者通过反向遗传基因替换技术也证实了[75,76]PRRSV的主要毒力基因位于Nsp3~8和GP5基因中。11 1.2.2.2在研究新型疫苗和基因载体的上的应用反向遗传操作平台的建立不仅有助于其分子生物学方面的科学研究，而且潜在的的市场应用价值非常大，可以用于新型基因工程疫苗的研发。市场上现有的PRRSV疫苗分为灭活疫苗和弱毒活疫苗，但灭活疫苗的免疫原性差，对猪的保护效果不佳；活疫苗又存在毒力返强的风险，生物安全性不高。PRRSV反向遗传操作技术的出现给PRRSV疫苗的研发带来了新的技术方法和思路。反向遗传系统在RNA病毒功能基因的研究上有着重要的作用，方便敲除碱基、插入外源基因、突变目的蛋白编码氨基酸等，该技术给病毒起源的探究、致病机制和交叉保护作用提供了一种行之有效的办法。有研究采用随机序列重组的方法产生了一系列免疫突变体PRRSV。将具有免疫原性的不同PRRSV的GP3序列随机重组，然后将重组的GP3序列整合入感染性克隆中，产生包含GP3序列的1个新病毒，并提高交叉中和作用。该方法可快速产生致弱病毒并且有益于[77]研发抗原性易变病毒的疫苗。PRRSV感染性克隆己被用作表达外源基因的载体用于疫苗载体的研究。在PRRSVNsp2的非必需区域插入鸡新城疫病毒核蛋白的B细胞表位和GFP的感染性克隆已被成功构建，然而研究表明在Nsp2区插入绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）的PRRSV拯救[78]毒株在体外传至第7代时GEP不能表达，因此，外源基因能否稳定表达是关键问题。12 第二章猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株的分离与鉴定2.1引言[1,2]PRRS是全世界养猪业中造成严重危害的传染性疾病之一。1996年首次在我国发现[5]该病，其临床特征主要是仔猪呼吸道疾病、生长迟缓和母猪妊娠后期的早产、流产、死胎[19]和木乃伊胎。PRRSV是PRRS的病原体。PRRSV具有严格的宿主特异性和细胞嗜性，猪肺泡巨噬细[79,80]胞（PAM细胞）是其主要靶细胞。病毒的分离与体外培养可用PAM细胞、非洲绿猴肾细胞MA104以及其衍生细胞系（CL262、Marc-145等），其中Marc-145细胞是常用于分离和培养PRRSV的传代细胞系。病毒感染Marc-145细胞的细胞病变（CPE）是以细胞聚堆和脱落为特征。由于PRRSV的基因组差异性很大，不同毒株对同一细胞系的嗜性不同，有的毒株在细胞上培养2天即可观察到细胞病变，有的毒株需要在细胞上盲传2-3代才能观察到病变，甚至还有毒株在细胞上一直不会出现病变，但是可以通过RT-PCR检测到PRRSV阳性。2012年，与2008年在美国发现的美洲型毒株NADC30有很高的核苷酸相似度的新型[7]PRRSV变异株在我国大部分养猪地区流行，对我国养猪业造成一定的经济损失。我们从河南伊川地区的猪群中检测到一头猪为PRRSV阳性，利用PAM细胞从血清样品中分离到1株PRRSV毒株，并对其进行鉴定。2.2材料与方法2.2.1材料2.2.1.1血清及病毒样品血清样品，VR-2332株P4代病毒液、HNjz15株（本实验室分离到的另一株类NADC30病毒）P3代病毒液（用于阳性对照），置于-80℃超低温冰箱中保存备用。2.2.1.2细胞猪肺泡巨噬细胞（PAM）由国家兽用药品工程技术研究中心制备保存。2.2.1.3主要试剂RPMI-1640干粉培养基购自GIBCOTM公司；胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司；ViralNucleicAcidExtractionKit购自Genaid公司；M-MLVRecerseTranscriptase（含5×Buffer）购自Promega公司；pEASY-BluntCloningVector、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；高保真的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase、dNTPMixture、DNAMarker、琼脂糖购自TAKARA公司；GelExtrationMiniKit购自OMEGA公司；2×TaqPCRMasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司；核酸染料购自Biotum公司；IPTG、X-gal、氨苄青霉素（ampicillin,Amp）均购自上海生工生物工程股份有限公司；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出物（YeastExtract）购自OXOID公司；其他普通生化试剂均为国产13 分析纯试剂。2.2.1.4培养基与主要溶液的配制RPMI-1640基本培养基（配制1L）：将一袋RPMI-1640培养基粉剂（10.4g）溶解于900mLddH2O中，加入2gNaHCO3，溶解后定容至1000mL，用pH计调节pH至6.5~6.8（液体呈桔红色），在生物安全柜中用0.22μm滤膜过滤除菌，分装成500mL/瓶，取5mL培养液装于15mL离心管于37℃摇床培养进行无菌检测，其余于4℃保存。RPMI-1640完全培养基（配制100mL）：在89mLRPMI-1640基本培养基中添加1mL青链霉素贮存液（终浓度青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL），10mL胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）。50×TAE电泳缓冲液：称取Tris-base242g，Na2EDTA·2H2O31.7g于1L烧杯中，然后加入800mL的去离子水或纯化水，充分搅拌溶解，再加入醋酸57.1mL，充分混匀，加入去离子水或纯化水定容至1L，PH为8.5，室温保存。1×TAE电泳缓冲液：将50×TAE电泳缓冲液用ddH2O稀释为1×TAE（工作浓度）。1%琼脂糖凝胶的配制：称取1g琼脂糖放于500ml锥形瓶中，加入100ml1×TAE电泳缓冲液，与微波炉中溶解（中高火），室温放置40℃左右，加入10µL染色液混匀。LB液体培养基：将胰蛋白胨（Tryptone）10g、酵母浸出物（YeastExtract）5g、NaCl10g，溶解于1000mLddH2O中，121℃蒸气灭菌20min，4℃保存备用。LB固体培养基：在LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉，121℃蒸气灭菌20min。待培养基温度降至50℃左右，加入相应的抗生素后，铺制平板，待培养基凝固后，倒放置于4℃保存备用。氨苄青霉素（Amp）：用灭菌ddH2O配成贮存浓度50mg/mL，在洁净工作台中用0.22μm滤膜过滤，-20℃保存备用。2.2.1.5主要仪器设备CO2细胞培养箱，购自ThermoScientific公司；生物安全柜，购自美国Nuaire公司；洁净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司；Mini台式离心机，购自德国Eppendorf公司；PCR仪，购自ABI公司，紫外透射分析仪，购自其林贝尔公司；琼脂糖凝胶电泳仪，购自美国Hoefer公司；紫外成像仪，购自美国UVP公司；pH计，购自梅特勒-托利公司；恒温培养箱，购自德国MMM公司；旋涡混合器，购自SCIENTIFICINDUSTRIESINC；恒温水浴箱，购自上海一恒公司；循环水浴箱购自PRIMA公司；倒置显微镜，购自奥林巴斯公司；空气浴震荡摇床，购自美国NBS公司；-20℃冰箱，购自青岛澳柯玛公司；微波炉，购自广东美的公司。2.2.2方法2.2.2.1PCR引物的设计根据PRRSV美洲型毒株VR-2332(AY150564)，使用引物设计软件primerpremierv5.014 设计针对ORF7的检测引物436-F/436-R，特异性扩增片段为436bp；参考PRRSVNADC30株（JN654459）针对Nsp2高变区设计检测引物N681F/N681R，若扩增出681bp的特异性片段，可以初步说明该毒株为类NADC30毒株（表2-1）。表2-1PCR检测引物Table2-1PrimersofPCRdetection引物序列(5’-3’)扩增长度（bp）436-FGAATGGCCAGCCAGTCAATC436436-RGTCGCCCTAATTGAATAGGTGACN681-FCTTTGATTGGGATGTTGTGCT681N681-RCAATGATGGCTTGAGCTGAGT2.2.2.2样品的准备将血清样品经12,000rpm4℃离心10min，上清液使用0.22微米滤器过滤除菌待用。2.2.2.3提取核酸按照核酸提取试剂盒ViralNucleicAcidExtractionKit的操作说明提取总RNA。具体操作步骤如下：（1）取200μL上述处理过的血清样品，转移到1.5mL离心管中，加400μLVBLysisBuffer,漩涡震荡，室温放置10min。（2）向离心管中加450μLADBuffer（加入无水乙醇），剧烈震荡。（3）转移600μL至RNaseyspincolumn中，12,000rpm离心1min，若液体大于600μL，重复离心一次，弃去洗脱液。（4）将RNaseyspincolumn放入一个新的2mL的收集管中，向RNaseyspincolumn中加400μLW1Buffer，12,000rpm离心30s，弃去洗脱液。（5）向RNaseyspincolumn中加600μLWashBuffer，12,000rpm离心30s，弃去洗脱液。（6）12,000rpm空离3min。（7）将RNaseyspincolumn的柱子放在一个新的灭菌的1.5mL的离心管中，加入50μLRNase-free的水于膜上，静止3min，12,000rpm离心1min，离心管中即为RNA样品，可以立即用于反转录反应或者-80℃保存。2.2.2.4反转录按照M-MLVReverseTranscriptase说明书进行。使用20µL反转录反应体系，具体如下：约取11μLRNA与1μLOligo(dT)18混匀，70℃水浴5min，立即冰上冷却5min，得到复性的引物׃模板结合体。瞬时离心后，向其中加入如下反应成分：15 M-MLV5×ReactionBuffer4μL10mMdNTPs1μL40U/μLRNaseinhibitor0.5μL10U/μLM-MLVReverseTranscriptase1μLRNase-FreeddH2Oupto20μL轻弹离心管混匀溶液，42℃水浴反应1h，即得到cDNA模板，然后立即进行PCR反应或置于-20℃储存备用。2.2.2.5血清样品PCR检测反应总体积20μL，436-F/436-R（N681F/N681R）各0.5μL（10pmol/μL），2×TaqPCRMasterMix10μL，cDNA1μL及H2O8μL。反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1kb/min，循环30次；72℃延伸10min。取8μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳。2.2.2.6PRRSV的分离与培养从液氮中取出2支PAM细胞，在37℃水浴中1min内迅速解冻，在生物安全柜中将其移入15mL离心管中，加入9mLRPMI-1640完全培养基，于室温800rpm离心5min，离心结束后，返回生物安全柜中，小心无菌操作弃去培养基，向离心管中加入3mLRPMI1640完全培养基，缓慢轻柔吹打至无肉眼可见细胞团块，移入T25细胞瓶中，补加生长培养基至7mL，于37℃、5%CO2的培养箱培养。在细胞复苏约24h后准备接种血清样品。弃去培养基，用PBS或无血清培养基轻轻洗涤1次。按10%的比例接种过滤除菌的血清样品，于37℃、5%CO2的培养箱中吸附1h，吸附过程中每隔15-20min轻轻水平晃动细胞瓶（切忌用力），令接种液均匀吸附细胞。吸附结束后，弃去样品，用PBS或无血清培养基轻轻洗涤1次，每个T25细胞瓶中补加7mL5%RPMI1640维持培养基，放入37℃、5%CO2的培养箱继续培养。逐天在显微镜下观察细胞病变，至细胞病变效应达80%时，收获细胞培养物。所收获细胞培养物均置于-20℃冻存。2.2.2.7细胞培养物的Nsp2基因序列扩增、克隆与测序及比对分析分别参照2.2.2.3、2.2.2.4的方法提取阳性样品总RNA，反转录，采用PCR方法扩增Nsp2基因，反应条件如下：PCR体系50μL，包括5×PrimeSTARBuffer10μL；2.5mMdNTPmixture4μL；PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL；N681-F/N681-R各1μL(10μM)；cDNA模板1μL；补充水至50μL。反应程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，循环33次；72℃延伸7min。将50μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳纯化，紫外灯下切下目的片段。将上述Nsp2基因扩增产物按照GelExtrationMiniKit按说明书进行纯化，克隆入16 pEASY-BluntCloning载体，取PCR鉴定为阳性的克隆送北京金唯智生物科技有限公司测序。具体操作如下。（1）取1μLpEASY-BluntCloning载体、4μL胶回收产物于25℃水浴中连接20min，反应结束后，将离心管迅速置于冰上。（2）Trans1-T1感受态细胞（50μL）刚刚解冻时加入连接产物，轻弹混匀，冰浴20min。（3）42℃热激30s，立即置于冰上，静置2min。（4）加500μL平衡至室温的LB培养液，200rpm、37℃孵育1h。（5）取8μLIPTG（500mM）、40μL20mg/mLX-gal混合，均匀地涂于回温至室温的琼脂平板上，37℃放置30min。（6）待IPTG、X-gal吸收后，取200μL菌液涂布平板，将平板在37℃恒温培养箱中倒置，培养过夜，观察菌落生长情况。挑选白色的单克隆菌落至10μL无菌ddH2O中，涡旋混合。取1μL混合液用作PCR反应的模板，采用2×TaqPCRMasterMix（TIANGEN）建立20μL反应体系，用M13F/M13R鉴定菌液。PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。挑选鉴定为阳性的克隆，加1mL含氨苄的LB培养液摇菌6h后送金唯智生物科技有限公司进行测序验证。利用DNAstar、MegAlign对测序公司反馈的Nsp2序列进行拼接，并与参考毒株(见表2-2)的Nsp2基因进行序列比对。表2-2Nsp2序列比对参考的序列来源及GenBank登录号Table2-2sequencealignmentofNsp2ofOriginofPRRSVstrainsandGenBankdatabase毒株登录号分离地毒株年份CH-1aAY032626China1996JXA1EF112445China2006JL580KR706343.1China2013HNjz15KT945017.1China2015VR-2332U87392U.S.A1993NADC30JN654459U.S.A20082.3结果与分析2.3.1血清样品的PCR检测从血清样品中抽提RNA，反转录，采用PRRSV检测引物436F/436R做PCR，可扩增出436bp的特异性条带（图2-1），经测序证实为PRRSVORF7基因序列，确定该份血清样品为PRRSV阳性；进而用针对Nsp2高变区的检测引物N681F/N681R做PCR，可扩增出681bp的特异性条带（图2-2），初步说明该分离株为类NADC30株，将该PRRSV分离毒株命名为HNyc15。17 图2-1血清样品的PCR检测Fig.2-1DetectionofserumsamplebyPCR注：1：阳性对照（VR-2332株），2：血清样品，3：阴性对照（ddH2O），M：Marker2000图2-2PRRSV分离株NADC30分型特异性PCR检测Fig.2-2specificdetectionofPRRSVNADC30isolatesbyPCR注：1：阳性对照（HNjz15株），2：血清样品，3：阴性对照（ddH2O），M：Marker20002.3.2PRRSV的分离将经PCR检测阳性的过滤除菌的血清样品接种PAM细胞，在37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞接种血清样品36h后可观察到CPE的出现，48h后可观察到PRRSV典型的CPE，表现为变圆、皱缩、折光性增强、聚堆等，72h细胞逐渐脱落，96h收获细胞培养物。而对照细胞正常（见图2-3）。18 图2-3PRRSV分离株在PAM细胞上的CPE（×200）Fig.2-3CPEofPAMcellsinfectedwithPRRSVisolates(×200)注：A：接种PAM细胞24h，B：接种PAM细胞48h，C：接种PAM细胞72h，D：PAM细胞对照2.3.3Nsp2基因序列的拼接及氨基酸同源性分析将HNyc15Nsp2基因序列测序结果拼接，利用MegAlign与类PRRSV参考株的Nsp2基因的氨基酸序列进行了比对，与我国高致病性PRRSV代表毒株JXA1氨基酸同源性较低，为75.4%；与经典PRRSVVR2332、CH-1a毒株氨基酸相似度为76.0%-77.7%；与NADC30类毒株NADC30、JL580、HNjz15同源性较高，氨基酸相似度为86.3%-94.1%，且在323-433位、485位和501-519位共缺失131个氨基酸（图2-4）。此比对结果进一步表明，HNyc15株为类NADC30毒株。图2-4HNyc15株与参考株Nsp2区域氨基酸序列比对结果Fig.2-4AlignmentsoftheHNyc15andreferencestrainsbasedondeducedaminoacidofNSP2gene19 2.4讨论PRRSV的体外分离和鉴定是研究和防治PRRS的基础和前提，而PRRSV的细胞嗜性相当严格，在体外培养时仅能感染猪肺泡巨噬细胞和源于MA-104的几个亚细胞系(Marc-145、CL2621、HS.2H)。通常情况下，PRRSV的分离鉴定优先使用Marc-145细胞。但是，PRRSV毒株之间的细胞嗜性有较大的差异，并不是所有毒株都可在Marc-145细胞上增殖，有研究[81,82]表明，多数欧洲株PRRSV主要在PAMs上分离。本实验室从河南伊川地区的猪群中检测到一头猪为PRRSV阳性，用NADC30检测引物（681bp）做RT-PCR，可扩增出681bp的特异性条带，初步说明可能为类NADC30毒株；将血清样品接种PAM细胞进行病毒分离，接种后第一代即可见到PRRSV典型的细胞病变（CPE），96h收获细胞培养物，测定其Nsp2基因序列，通过与其它PRRSV参考毒株比对发现，该分离毒株与美洲型NADC30毒株的Nsp2区域相同位置缺失131氨基酸，确定HNyc15为1株类NADC30毒株。这为进一步开展该毒株的全基因序列测定，分析在我国PRRSV的遗传变异和进化趋势，研究在我国流行的类NADC30毒株的细胞嗜性和分子致病机制奠定了基础。20 第三章猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株全基因序列测定与分析3.1引言猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的一[5]种急性、高度接触性传染病。我国于1996年首次分离到PRRSV，该病在全球范围内流行，[83]严重危害养殖业。PRRSV根据抗原性的差异可分为欧洲型（Ⅰ型）和北美洲型（Ⅱ型）[84]两种基因型，我国主要流行毒株为北美洲型，但新近有学者将国内流行的美洲型PRRSV[85]又分为不同的基因亚型。PRRSV为RNA病毒，由于RNA病毒的RdRp缺少校对功能，导致病毒基因复制不准[86]确，所以PRRSV极易发生变异，不断有新的变异株出现，因此给PRRS的防治带来了巨大的困难。最近几年引起我国不同省份部分猪场怀孕母猪流产或早产的PRRSV类NADC30毒株，其基因组Nsp2区域就存在较大变异。PRRSV的变异方式除了简单的点突[87]变、缺失、插入以外，重组也是广泛存在于PRRSV中的一个重要变异方式，基因重组可[88]以使病毒快速进化，还可以避免因复制错误导致的有害突变。本研究利用临床血清样品，通过三轮全基因测序，获得HNyc15毒株准确的全基因序列，对其进行序列同源性和遗传进化分析，并利用重组分析软件分析其重组情况，以检测病毒基因组的基因重组情况，为构建其感染性克隆，深入研究PRRSV在我国变异机制奠定基础。3.2材料和方法3.2.1材料3.2.1.1病毒样品HNyc15株P1代病毒液。3.2.1.2主要试剂ViralNucleicAcidExtractionKit购自Genaid公司；SuperScript®ⅢRecerseTranscriptase（含5×Buffer）购自invitrogen公司；pEASY-Blunt克隆载体、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；高保真的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase、dNTPMixture、DNAMarker、琼脂糖购自TAKARA公司；GelExtrationMiniKit购自OMEGA公司；2×TaqPCRMasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司；核酸染料购自Biotum公司；IPTG、X-gal、氨苄青霉素（ampicillin,Amp）均购自上海生工生物工程股份有限公司；胰蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出物（YeastExtract）购自OXOID公司；其他普通生化试剂均为国产分析纯试剂。3.2.1.3主要设备Mini台式离心机购自德国Eppendorf公司；PCR仪购自ABI公司；紫外透射分析仪，购自其林贝尔公司；琼脂糖凝胶电泳仪购自美国Hoefer公司；紫外成像仪购自美国UVP公司；恒温培养箱购自德国MMM公司；循环水浴箱购自PRIMA公司；旋涡混合器购自21 SCIENTIFICINDUSTRIESINC；恒温水浴箱购自上海一恒公司；空气浴震荡摇床购自美国NBS公司；冰箱购自青岛澳柯玛公司；微波炉购自广东美的公司。3.2.1.4主要溶液配制参照2.2.1.4溶液配制。3.2.2方法为获得准确的HNyc15株全基因序列，分三次对其全基因组进行测序，即重复3次提取核酸、反转录、全基因扩增、测序的整个过程。3.2.2.1引物设计参考PRRSVNADC30株（GenBankaccessionno.JN654459）全基因序列应用Primer5.0软件设计12对引物（见表3-1）用于全基因扩增，12对引物由金唯智生物科技有限公司合成。表3-1PRRSVHNyc15毒株全基因组序列测定所用引物Table3-1PrimersusedforthegenomicsequencingofPRRSVHNyc15片段长度序号引物名称引物序列(5’-3’)扩增位置(bp)NADC1FATGACGTATAGGTGTTGGCT2-211438bpNADC1RGGAAAGATCGCAGAAAGCCAG419-439NADC2FCAGGGTGTTTRTGGCRGAGG233-25221617bpNADC2RCAGTCAAGGCARGCAGGRTC1830-1849NADC3FGGGCGACTGATGAAGATCTTG1594-161431598bpNADC3RACCAACGGTAAGGTCGCTCTC3171-3191NADC4FCAAGCAGTTCCCTGTCAAGC2815-283441653bpNADC4RGGACGAGGTTTGAGGTAGAGTAG4445-4467NADC5FGCCGRAGYCCCATTGAGCA4153-417151906bpNADC5RAGAGCTGCTGTTAGAAGCCTGAT6036-6058NADC6FTTCCTCCTGTGGAGAATGATGG5874-589561500bpNADC6RTCTTTACCGCTGTCTCAGTAACAAC7349-7373NADC7FCAGGGCCTGACTAAGGAGCAG7275-729571737bpNADC7RCTGCGAGAATCCTGTCACGG8992-9011NADC8FTTTCAGACAGACCCAAAGAAGACA8903-892681501bpNADC8RCCAGGTTGACAGGYGTGCY10385-10403NADC9FCATTCAACCAGATTACAGAGACAAG10084-1010891824bpNADC9RCATAGGATCTTCTGTAATTGCTCAG11883-11907NADC10FCCATTTTGTTTGGCTTCAC11787-11805101760bpNADC10RCAGCTCACATATCGTCARGTT13526-1354622 NADC11FTGTGGTGTATCGTGCCGTT13446-13464111565bpNADC11RGCATGGTTCTCGCCAATTA14992-15010NADC12FGCCCCATTTTCCTCTAGCGACTG14653-1467512368bpNADC12RTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT150203.2.2.2提取核酸及反转录参照第二章2.2.2.3核酸提取步骤。对上述方法制备的RNA进行反转录以合成cDNA。cDNA合成方法按照SupersciptⅢreversetranscriptase产品说明书进行。反转录反应体系为20μL，具体如下：取12.5μLRNA(约1μg）与1μLoligod(T)18(反转录引物）混匀，65℃水浴5min，立即置于冰上冷却5min，得到复性的引物模板结合体，再加入以下反应体系。5×First-strandBuffer4μL10mMdNTP1μL0.1MDTT1μLRRI1μLSupersciptⅢreversetranscriptase1μLRNase-FreeddH2Oupto20μL轻弹离心管混匀溶液，30℃水浴5min，反应结束后50℃水浴1h30min。将合成完的cDNA保存于-20℃。3.2.2.3全基因扩增、克隆与测序与序列拼接用高保真的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase进行全基因组PCR扩增，采用如下50μL体系进行：PrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL5×PrimeSTARBuffer10μL2.5mMdNTPMix4μL10pM上游引物1μL10pM下游引物1μLcDNATemplate1μLddH2O32.5μL反应程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min/kb，循环33次；72℃延伸7min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下切下目的片段。克隆测序具体方法参照第二章2.2.2.7。将测序公司反馈的三轮测序结果比对分析，以确定其准确性，利用DNAMAN软件将12个测序片段进行拼接，获得PRRSV毒株HNyc15的全基因序列。23 3.2.2.4全基因序列同源性分析利用DNAStar软件对HNyc15序列与国内外报道的其它毒株序列（表3-2）比对，进行同源性分析。表3-2参考序列来源及GenBank登录号Table3-2OriginofPRRSVstrainsdownloadedfromGenBankdatabase毒株登录号分离地毒株年份CH-1aAY032626China1996BJ-4AF331831China1996HB-1(sh)2002AY150312China2002HB-2(sh)2002AY262352China2002HEB1EF112447China2006JXA1EF112445China2006HuN4EF635006China2007SY0608EF534357China2007HENAN-HEBKF000088China2012HENAN-XINXKF000084China2013JL580KR706343.1China2013HNjz15KT945017.1China2015VR-2332U87392U.S.A1993P129AF494042U.S.A2002RsepPRRSMLVAF066183U.S.A2005MN184CEF488739U.S.A2008NADC30JN654459U.S.A2008EDRD-1AB288356Japan2008LelystadvirusM96262Netherlands20003.2.2.5全基因序列遗传进化分析利用MEGA6.0绘制遗传进化树，进行系统发育学分析。3.2.2.6序列重组分析采用SimPlotv3.5.1对PRRSVHNyc15株进行基因重组分析。将需要分析的毒株序列作为Query序列，与已报道的参考毒株共同做Simplot分析，找到与每个片段相似度最高的毒株，如果各片段的序列均来自同一个参考毒株，则表明该Query序列没有发生重组；如果各片段的基因序列来自两个或两个以上参考毒株，则表明此Query序列可能是一个重组毒株。24 3.3结果与分析3.3.1PRRSV全基因组扩增、克隆、测序与序列拼接根据所设计的12对特异性引物，采用PT-PCR，对HNyc15毒株基因组进行分段扩增。经1%琼脂糖凝胶电泳，于紫外线下观察到12条与预期片段大小一致的电泳条带（见图3-1）。经回收、连接、转化、克隆、测序、拼接后，获得HNyc15全基因组序列，长度为15049bp。基因组主要包括：5’UTR、ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF7，3’UTR。其中ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白NSP1α、NSP1β、NSP2-NSP12，ORF2a、ORF2b、ORF3-ORF7分别编码结构蛋白GP2a、GP2b（E）、GP3、GP4、GP5、M和N。HNyc15基因组组成见表3-3，GenBank登录号为KT945018。图3-1RT-PCR扩增PRRSVHNyc15全基因组各片段Fig.3-1AmplificationofPRRSVHNyc15genomebyRT-PCR注：1：1-12分别为12对引物扩增片段，M：Marker2000表3-3HNyc15基因组组成及编码蛋白Table3-3CompositionofgenomeandtheencodedproteinsofHNyc15strain氨基酸长度/核苷酸编码蛋白序列位置核苷酸长度/ntaa5’UTR/1-190190/Nsp1α、Nsp1β、ORF1a191-730971192373Nsp3-Nsp8ORF1bNsp8-Nsp127309-1167943711457ORF2aGP211681-12451771257ORF2bE11686-1190722274ORF3GP312304-13068765254ORF4GP412849-13385537178ORF5GP513396-13998603200ORF6M13983-1450752517425 ORF7N14497-148683721233’UTR/14869-15049151/3.3.2HNyc15毒株全基因序列同源性分析利用DNAMAN软件对HNyc15与国内外常见PRRSV代表毒株的全基因序列同源性分析，如图3-2所示，HNyc15毒株同经典毒株VR-2332和HP-PRRSVJXA1的全基因序列相似性分别为85.2%、83.7%，与NADC30的核苷酸相似度分别为93.8%，与本实验室分离得到的类NADC30毒株HNjz15的全基因序列相似性高达92.1%，同欧洲型参考毒株Lelystadvirus核苷酸相似度仅为60.4%(图3-2)。图3-2全基因组核苷酸序列与参考毒株的同源性分析Fig.3-2PercentidentifycomparisonofcompletegenomenucleotidesequencewithPRRSVreferencestrains3.3.3HNyc15株全基因序列遗传进化分析利用MEGA6.0软件对HNyc15全基因序列与国内外报道中常用代表毒株进行系统进化树分析，HNyc15毒株与经典毒株和在中国流行的HP-PRRSV毒株JXA1、HuN4、TJ株未处于同一进化分支不属于同一亚群，而是与美国毒株NADC30、MN184C以及国内毒株HNjz15、HENAN-XINX、HENAN-NEB处于同一遗传进化分支，属于同一亚群（图3-3）。26 图.3-3基于全基因组核苷酸序列的遗传进化分析Fig.3-3Phylogenetictreebasedonthecompletegenomesequence3.3.4HNyc15毒株基因重组分析采用Simplot软件，对代表病毒的全基因组序列进行分析，DistanceOptions选择Kimura。Windowsize设为500bp，stepsize为20bp。将HNyc15作为Query序列，与国内外报道的美洲型代表株（CH-1a、JXA1、VR2332、NADC30）共同做Simplot分析。结果显示，HNyc15株与NADC30株的核苷酸同源性为93.8%，且在ORF2-4区域与VR2332和CH-1a高度同源。表明PRRSVHNyc15全基因组序列中存在基因重组现象，即在ORF2-4区域重组了VR2332和CH-1a的基因序列（见图3-4）。Fig.3-4RecombinationanalysisofPRRSVHNyc15strains.图3-4PRRSVHNyc15株的重组分析27 3.4讨论NADC30毒株是美国学者在2008年分离到的一株PRRSV毒株，其特点是在Nsp2的高[89]变区存在131个氨基酸的不连续缺失(Brockmeieretal2012)。近两年，本实验室分离到大量具有同样缺失特征的PRRSV毒株，这类毒株在国内称之为类NADC30毒株。国内有许多实验室也报道了该类毒株，说明该类毒株已广泛流行于我国养猪场。全基因序列测定与分析是了解病毒基因组结构特征的重要方法之一。通过对获得的HNyc15毒株全基因进行序列比对分析、遗传进化分析，证实了该毒株与NADC30的亲缘关系较近，在Nsp2区域也存在131个氨基酸的不连续缺失。不同地区分离到的类NADC30[90]的核苷酸同源性较低，为88.6%~99.6%。这种流行情况对于研究我国类NADC30毒株的来源具有重要意义。Nsp2基因在PRRSV遗传和进化中起着重要作用，尤其是高变区，通常作为PRRSV区分不同亚型的标记基因，但是已有学者研究证实2006年起在我国流行的HP-PRRSV毒株[91]Nsp2中不连续缺失30个氨基酸与PRRSV的毒力和致病性无关。而近两年，在我国猪场流行的类NADC30毒株，其Nsp2的高变区存在131个氨基酸的不连续缺失，这些氨基酸的缺失现象对其在我国广泛流行是否产生影响？答案还是未知的。RNA病毒可以在大量重组分子中选择适合自身生存的，通过重组产生适应性强的新毒[92]株或对其自身有利的新型变异株，使其更好的适应宿主和自然环境。在我国流行的毒株主要是美洲型，因此，在国内发现的PRRSV重组毒株主要是美洲型毒株之间的重组。例如，2004年分离到的HB-1(sh)/2002株，推测其亲本株为HB-1/3.9和CH-1a株，其重组区域位[93]于ORF2-ORF4区域中；2009年分离到的Em2007株，分析是由典疫苗株CH-1R和[94]HP-PRRSVWUH1株重组而来的；此外，2015年报道的JL580株是由NADC30与[58]HP-PRRSV重组而来，并通过动物实验表明JL580株具有高致病性。还有研究报道类NADC30毒株均是以NADC30为亲本进行重组，提供重组片段的病毒株有以HP-PRRSV和以VR2332为代表的美洲型毒株，但发生重组的位置存在于编码不同的非结构蛋白和次要结[90]构蛋白（GP2a、GP3、GP4），分别由ORF2a、ORF3、ORF4基因编码）的基因区域。总之，本研究详细地分析了HNyc15株全基因序列，对该毒株的基因组特征进行了比较详细的阐述。丰富了类NADC30毒株的基因组信息，为该类毒株的防控提供了数据支持。28 第四章猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株感染性克隆的构建及鉴定4.1引言感染性克隆技术又称为反向遗传操作技术。1978年首例RNA病毒的感染性克隆诞生，[95]Taniguchi等将Qβ噬菌体cDNA克隆到pCRI载体中，酶切后转染大肠杆菌获得拯救病毒。目前，反向遗传学技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域，已经报道成功构建了很多RNA的全长cDNA克隆，并证明有感染性。比如，微RNA病毒、黄病毒、冠状病毒以及[96-98]动脉炎病毒等。杨汉春等也成功构建了我国高致病性分离株的感染性克隆，并通过基因替换证明Nsp2[91]区域30个氨基酸的缺失与PRRSV的毒力无关。吕键等成功构建了JX143株的感染性克隆，该毒株Nsp2区域自然缺失90个碱基，同时证明拯救的病毒与亲本病毒表现相同的生[99]物学特性。本研究在HNyc15株全基因组序列测定的基础上，构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒HNyc15株的感染性克隆，建立了PRRSV类NADC30毒株的反向遗传操作平台，为研究该类毒株的分子生物学以及致病机理奠定了基础。4.2材料与方法4.2.1材料4.2.1.1病毒和细胞HNyc15株P1代细胞培养物；PAM细胞由本实验室制备保；BHK-21细胞来源于ATCC细胞库，均由本实验室保存；4.2.1.2载体和菌株pEASY-Bluntsimple克隆载体试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；pBluescriptⅡSK(+)载体，pcDNA3.1(+)由本实验室保存；丁型肝炎病毒的核酶因子（HDV）及BGH终止信号序列由金唯智生物科技有限公司合成（pUC57-HDV-BGH）；DH5α感受态细胞购于天根生化科技（北京）有限公司。4.2.1.3主要试剂SuperScriptⅢReverseTranscriptase、Opti-MEMIReducedSerumMedium均购于TMInvitrogen公司；MEM干粉培养基、胰酶为GIBCO公司产品；胎牛血清（FBS）为Hyclone公司产品；PrimeSTARHSDNAPolymerase高保真PCR扩增酶、DNAMarker购于大连宝生物有限公司；点突变试剂盒FastMutagenesisSystem购于北京全式金生物技术有限公司；2×TaqPCRMasterMix、质粒小提试剂盒、DH5α感受态细胞购于天根生化科技(北京)有限公司；GelExtrationMiniKit购于OMEGA公司；RNasin®RibonucleaseInhibitor（RRI）购于Promega公司；T4DNA连接酶和所有限制性内切酶均购于Thermo公司；伊红染液、盐酸、29 辣根过氧化物（HRP）标记的羊抗鼠lgG购自德国Sigma公司，苏木素染液购自北京雷根公司；二甲苯购自天津市凯通公司；中性树胶购自北京中杉金桥公司。4.2.1.4细胞培养基及主要溶液配制MEM培养基的配制：MEM1袋（9.5g），量取非必需氨基酸10mL，称取丙酮酸钠0.11g、碳酸氢钠(NaHCO3)1.5g，加入800mL用高温灭菌的去离子水，用4mmol/LNaOH调节pH到7.2，补加去离子水到1000mL，在生物安全柜中用0.22µm滤杯，利用蠕动泵进行抽滤，置4℃保存。主要溶液配制详见2.2.1.4。4.2.1.5主要仪器设备CO2细胞培养箱购自ThermoScientific公司，生物安全柜购自美国Nuaire公司，Mini台式离心机购自德国Eppendorf公司，PCR仪购自ABI公司，紫外透射分析仪购自其林贝尔公司，琼脂糖凝胶电泳仪购自美国Hoefer公司，紫外成像仪购自美国UVP公司，pH计购自梅特勒-托利公司，恒温培养箱购自德国MMM公司，旋涡混合器购自SCIENTIFICINDUSTRIESINC公司，恒温水浴箱购自上海一恒公司，循环水浴箱购自PRIMA公司，倒置显微镜购自奥林巴斯公司，空气浴震荡摇床购自美国NBS公司，-20℃冰箱购自青岛澳柯玛公司，微波炉购自广东美的公司。4.2.2方法4.2.2.1构建策略根据HNyc15全基因组测序结果，利用DNAStar软件分析HNyc15全基因组序列酶切位点，制定构建策略，如图4-1所示，A与B片段、B与C片段、C与D片段、D与E片段、E与F片段分别通过SacⅠ、XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ、Bsp1407Ⅰ连接，然后通过A片段上游的NotⅠ、F片段下游的PacⅠ连入改造后的pBluescriptⅡSK(+)载体（载体多克隆位点上游引入CMV启动子，下游引入HDV、BGH序列）中。图4-1PRRSV类NADC30毒株HNyc15全长cDNA克隆的构建策略Figure4-1Strategyfortheconstructionofthefull-lengthcDNAcloneofaNADC30-likePRRSVstrain,HNyc15.30 4.2.2.2引物设计与合成根据HNyc15全基因组序列，应用Primer5.0软件设计6对涵盖全基因组序列的引物，由金唯智生物科技有限公司合成，所有片段的上游引物中引入了NotⅠ作为公共酶切位点，将基因组中的第7186位核苷酸C突变成T产生一个原来不存在的XbaⅠ酶切位点，作为拯救病毒的遗传标记，用来区分拯救病毒和亲本毒（表4-1）。表4-1.PRRSVHNyc15株全基因组cDNA片段扩增Table4-1.PrimersforamplificationofHNyc15genome在全基因中的片段引物名称序列(5’-3’)位置ATTTGCGGCCGCATGACGTATAGGTGTTGGF11-20ACTCTATGCCACGR3528GAGAAGAAAACAGGGAGATGGGAGA3504-3528ATTTGCGGCCGCCGAGATGTTAGCAAGACF32333233-3257BGACCGACCR7168CCTGTTCTAGAGAAAGCTTTGCAGCTTCC7168-7192ATTTGCGGCCGCCTGCAAAGCTTTCTCTAGF71737173-7197CAACAGGCR8816GCGTACAGCACAAGATCGTCCGAGT8816-8840ATTTGCGGCCGCTCACATCTGTGTCCAACAF86638663-8687DCCATTTAR11472GGTGTGTTTATACCTCACTGGATCG11472-11496ATTTGCGGCCGCACTGATGGTCTGGAAGGF1117511175-11199EACAAAACGR13209CACACACAGCCACGATGCCCGACAC13209-13233ATTTGCGGCCGCGTCTTAGGCATGGCAACTF1300313003-13023FCGCR15019TTAATTAA(T)30AATTCCGGCCG15009-15049注：斜体部分代表插入的酶切位点；参考pcDNA3.1(+)载体中的CMV启动子序列及丁型肝炎病毒的核酶因子（HDV）及BGH终止信号序列，应用Primer5.0软件设计出pBluescriptⅡSK(+)载体改造引物，由金唯智生物科技有限公司合成；在CMV的上游、BGH的下游分别插入KpnⅠ、SacⅡ，便于连接到pBluescriptⅡSK(+)载体；在扩增CMV的下游引物、HDV的上游引物中插入便于片段连接的NotⅠ、XbaⅠ、PacⅠ作为多克隆位点（表4-2）。31 表4-2.pBluescriptⅡSK(+)质粒改造引物Table4-2.PrimersformutationofpBluescriptⅡSK(+)引物名称序列(5’-3’)KpnⅠCGGGGTACCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC-CMVFCMVRATGCCGACCCTTAATTAAATTCTTTCTAGACGTCCGCGGCCGCAATTGCGGCCGCGGACGTCTAGAAAGAATTTAATTAAGGGTCGGCATGGHDVFCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGSacⅡ-BGHRTCCCCGCGGCCATAGAGCCCACCGCATCCCC根据HNyc15全基因序列，应用Primer5.0软件设计出涵盖6个片段连接处的引物，用于克隆片段连接后的PCR鉴定，由金唯智生物科技有限公司合成（表4-3）。表4-3.质粒构建的鉴定引物Table4-3.Primersofplasmiddetection引物名称序列(5’-3’)扩增长度（bp）AB-FCTTCCTGGAGTTGAAGTGGCCGCTC1761AB-RTACCCTGCGAAAGCACATAGGCTCCCD-FTATGTGCCGACTATCCCAGCGTCTG1918CD-RCCGGTGCGGGAAGGGGCGGGAAATTEF-FTTTCCGTTGGTTAGGGGCAATTTTT2137EF-RTGGCCATCCCCCTTCTTTTTATTTTDE-FTGGCCAGACCGTTTGGTTGCTAGCC2356DE-RGCGAAACGCCTTAGTGGGCGAGTTGCMVC-FTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC2296CMVC-RCACATACGACGACAGGTGATCCTCABC-FTTGCTGAAGGGAAATTGAGGGAAGG2244BC-RCACATACGACGACAGGTGATCCTCA4.2.2.3pBluescriptⅡSK(+)载体改造利用融合PCR改造pBluescriptⅡSK(+)载体的多克隆位点区（MCS），同时在多克隆位点的上游引入CMV启动子，在其下游引入HDV及BGH终止信号序列。分别以pcDNA3.1(+)和pUC57-HDV-BGH为模板，KpnⅠ-CMVF/CMVR和HDVF/BGHR-SacⅡ（表4.1）为引物进行PCR扩增，PCR体系50μL，包括5×PrimeSTARTBuffer10μL；2.5mMdNTPmixture4μL；PrimeSTARTHSDNAPolymerase0.5μL；上、下游引物各1μL(10μM)；模板1μL；补充水至50μL。反应程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，循环33次；72℃延伸7min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下切下目的片段。32 然后回收两个目的片段并作为模板，以KpnⅠ-CMVF/BGHR-SacⅡ为引物进行融合PCR，回收大约1kb的目的产物，送金唯智测序公司测序。然后将测序结果正确的DNA片段通过KpnⅠ、SacⅡ酶切位点连接到pBluescriptⅡSK(+)载体上，通过KpnⅠ、XbaⅠ做双酶切鉴定，将阳性质粒命名为pBlue-CMV-HB（改造后的质粒如图4.2所示）。具体酶切、连接、鉴定步骤如下：融合PCR回收产物及pBluescriptⅡSK(+)载体分别用KpnⅠ、SacⅡ建立50μL双酶切反应体系，如下：10×GreenBuffer5μLKpnⅠ1μLSacⅡ1μLpBluescriptⅡSK(+)5μLH2O至50μL混匀，37℃水浴1h，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收。融合PCR回收产物双酶切反应体系同上。将片段回收产物、pBluescriptⅡSK(+)载体回收产物用T4DNA连接酶做10μL连接反应体系。如下：融合PCR回收产物6μLpBluescriptⅡSK(+)载体回收产物2μL10×T4LigaseBuffer1μLT4DNALigase1μL反应液混匀后，22℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，方法同第二章2.2.2.5。挑选单克隆菌落接入5mL含有氨苄的LB培养液的试管中，37℃，220rpm振荡培养12-16h后使用天根质粒小提试剂盒提取质粒pBlue-CMV-HB。通过KpnⅠ、XbaⅠ对质粒做双酶切鉴定，并用KpnⅠ、XbaⅠ分别单酶切做对照，10μL酶切体系。如下：10×GreenBuffer1μLKpnⅠ0.5μLXbaⅠ0.5μLpBlue-CMV-HB2μLH2O至10μL混匀，37℃水浴1h，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。33 图4-2pBluescriptⅡSK(+)载体改造示意图Fig.4-2.SchematicreconstructionofpBluescriptⅡSK(十)vector4.2.2.4PRRSVHNyc15株基因组片段的扩增按ViralNucleicAcidExtractionKitⅡ说明书提取核酸，参照SupersciptⅢreversetranscriptase产品说明书，以Oligo(dT)18为反转录引物，合成cDNA第一链。反转录反应体系为20μL，具体步骤参照第三章中3.2.2.2。将合成的cDNA保存于-20℃。用高保真的DNA聚合酶PrimeSTARHSDNAPolymerase进行全基因组PCR扩增，采用如下50μL体系进行：PrimeSTARTHSDNAPolymerase0.5μL5×PrimeSTARTBuffer10μL2.5mMdNTPMix4μL10pM上游引物1μL10pM下游引物1μLcDNATemplate1μLddH2O至50μL反应程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min/kb，循环33次；72℃延伸7min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下切下目的条带。4.2.2.5HNyc15各个片段的克隆和中间质粒的构建将上述A-F各目的片段用GelExtrationMiniKit进行纯化，按说明书进行。取1μLpEASY-BluntSimple载体、4μL胶回收产物于25℃水浴中连接20min，转化DH5α感受态细胞，过夜培养后挑选阳性克隆。具体方法如下：在各转化板挑取白色克隆，用经高压灭菌的Tip头轻轻沾取白色菌落，洗脱于10μL无菌ddH2O中作为模板，用pEASY-BluntSimple载体试剂盒自带M13F/M13R引物和2×TaqPCRMasterMix进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落接种于1mL含有氨苄抗性的LB培养液中，置于37℃，220rpm振荡培养，12-16h后送金唯智测序。将金唯智反馈的6个片段的序列信息进行分析，与HNyc15的全基因序列比对，对无34 点突变的阳性菌液扩大培养后提取质粒，将其分别命名为pEBS-A、pEBS-B、pEBS-C、pEBS-D、pEBS-E、pEBS-F。质粒小量提取按天根质粒小提试剂盒说明书步骤进行，具体如下：（1）柱平衡步骤：在吸附柱CP3中加500μL的平衡液BL，12,000rpm，1min，弃去管中废液。（2）将5ml菌液转移至离心管中，12,000rpm，1min，保留沉淀，弃去上清。（3）向离心管中加入250μL溶液P1，涡旋振荡，悬浮沉淀。（4）加入250μL溶液P2，缓慢上下颠倒8次。（5）加入350μL溶液P3，立即缓慢地上下颠倒8次，12,000rpm离心10min。（6）将上一步的上清液转移到吸附柱CP3中，勿吸出沉淀。12,000rpm离心60s，弃去收集管中的废液。（7）加入600μLPW漂洗液于吸附柱中，12,000rpm离心60s，弃去收集管中的废液。（8）重复操作步骤7。（9）将吸附柱12,000rpm离心2min，弃去液体。（10）滴加50μL洗脱液EB于吸附柱吸附膜中央，静置2min，12,000rpm离心2min收集溶液。4.2.2.6HNyc15全长质粒的拼接与测序PRRSVHNyc15株基因组全长cDNA连接的策略见图4.1。将4.2.2.5中得到的中间质粒pEBS-A、pEBS-B、pEBS-C、pEBS-D、pEBS-E、pEBS-F，将其分别通过SacⅠ、NdeⅠ、Bsp1407Ⅰ酶切位点两两连接，分别得到重组质粒pEBS-AB，pEBS-CD和pEBS-EF；然后将质粒pEBS-CD和pEBS-EF通过BamHⅠ酶切位点连接得到重组质粒pEBS-CDEF，将pEBS载体酶切替换为pBlue-CMV-HB载体，得到pBlue-CMV-CDEF；最后将质粒pEBS-AB和pBlue-CMV-CDEF通过XbaⅠ酶切位点连接得到包含全长cDNA的质粒pBlue-CMV-ABCDEF。具体连接步骤如图4.3所示。35 图4-3PRRSVHNyc15株全长cDNA连接示意图Fig4-3Assemblyofthefull-lengthcDNAcloneofPRRSVHNyc15strain（1）使用A片段两端的NotⅠ和SacⅠ将连接于pEBS-A质粒上的A片段切下，再经T4DNA连接酶连接于pEBS-B切下的载体上，具体酶切反应体系如下：10×GreenBuffer5μLNotⅠ1μLSacⅠ1μLpEBS-B/pEBS-A5μL/5μLH2O至50μL37℃水浴反应1h后，反应液用琼脂糖凝胶电泳检测，条带位置正确后切胶回收A片段和pEBS-B载体。将回收产物按以下比例连接：HNyc15A片段回收产物6μLpEBS-B载体回收产物2μL10×T4DNALigaseBuffer1μLT4DNALigase1μL反应液混匀后，22℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，方法如前所述。使用引物AB-F/AB-R（表4-3）作菌落PCR鉴定，反应总体积20μL，AB-F/AB-R各0.5μL（10pmol/μL），2×TaqPCRMasterMix10μL，模板1μL及H2O8μL。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。取8μLPCR36 扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳。选取阳性克隆接入5mL含有氨苄的LB培养液的试管中，37℃，220rpm振荡培养12-16h后使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，命名为pEBS-AB。将质粒pEBS-AB用NotⅠ和SacⅠ做双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒置-20℃保存，用于后续连接。（2）使用C片段两端的NotⅠ和NdeⅠ将连接于pEBS-C质粒上的C片段切下，再经T4DNA连接酶连接于pEBS-D切下的载体上，具体酶切反应体系如下：10×GreenBuffer5μLNotⅠ1μLNdeⅠ1μLpEBS-D/pEBS-C5μL/5μLH2O至50μL37℃水浴反应1h后，反应液用琼脂糖凝胶电泳检测，条带位置正确后切胶回收C片段和pEBS-D载体。将回收产物按以下比例连接：HNyc15C片段回收产物6μLpEBS-D载体回收产物2μL10×T4DNALigaseBuffer1μLT4DNALigase1μL反应液混匀后，22℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，方法如前所述。使用引物CD-F/CD-R（表4-3）作菌落PCR鉴定，反应总体积20μL，CD-F/CD-R各0.5μL（10pmol/μL），2×TaqPCRMasterMix10μL，模板1μL及H2O8μL。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。取8μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳。选取阳性克隆接入5mL含有氨苄的LB培养液的试管中，37℃，220rpm振荡培养12-16h后使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，命名为pEBS-CD。将质粒pEBS-CD用NotⅠ和NdeⅠ做双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒置-20℃保存，用于后续连接。（3）同时使用E两端的NotⅠ和Bsp1407Ⅰ将连接于pEBS-E质粒上的E片段切下，再经T4DNA连接酶连接于pEBS-F切下的载体上，具体酶切反应体系如下：10×GreenBuffer5μLNotⅠ1μLBsp1407Ⅰ1μLpEBS-F/pEBS-E5μL/5μLH2O至50μL37℃水浴反应1h后，反应液用琼脂糖凝胶电泳检测，条带位置正确后切胶回收E片段和pEBS-F载体。将回收产物按以下比例连接：37 HNyc15E片段回收产物6μLpEBS-F载体回收产物2μL10×T4DNALigaseBuffer1μLT4DNALigase1μL反应液混匀后，22℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，方法如前所述。使用引物EF-F/EF-R（表4-3）作菌落PCR鉴定，反应总体积20μL，EF-F/EF-R各0.5μL（10pmol/μL），2×TaqPCRMasterMix10μL，模板1μL及H2O8μL。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，循环30次；72℃延伸10min。取8μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳。选取阳性克隆接入5mL含有氨苄的LB培养液的试管中，37℃，220rpm振荡培养12-16h后使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，命名为pEBS-EF。将质粒pEBS-EF用NotⅠ和Bsp1407Ⅰ做双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒置-20℃保存，用于后续连接。（4）使用C、D片段两端的NotⅠ和BamHⅠ将连接于pEBS-CD质粒上的C、D片段切下，再经T4DNA连接酶连接于pEBS-EF切下的载体上，具体酶切反应体系如下：10×GreenBuffer5μLNotⅠ1μLBamHⅠ1μLpEBS-EF/pEBS-CD5μL/5μLH2O至50μL37℃水浴反应1h后，反应液用琼脂糖凝胶电泳检测，条带位置正确后切胶回收CD片段和pEBS-EF载体。将回收产物按以下比例连接：HNyc15CD片段回收产物6μLpEBS-EF载体回收产物2μL10×T4DNALigaseBuffer1μLT4DNALigase1μL反应液混匀后，22℃连接1h,转化DH5α感受态细胞，方法如前所述。使用引物DE-F/DE-R（表4-3）作菌落PCR鉴定，反应总体积20μL，DE-F/DE-R各0.5μL（10pmol/μL），2×TaqPCRMasterMix10μL，模板1μL及H2O8μL。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，循环30次；72℃延伸10min。取8μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳。选取阳性克隆接入5mL含有氨苄的LB培养液的试管中，37℃，220rpm振荡培养12-16h后使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，命名为pEBS-CDEF。将质粒pEBS-CDEF用NotⅠ和BamHⅠ做双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒置-20℃保存，用于后续连接。（5）使用XbaⅠ和PacⅠ将连接于pEBS-CDEF质粒上的CDEF片段切下，再经T4DNA38 连接酶连接于之前改造好的pBlue-CMV-HB载体上，具体酶切反应体系如下：10×GreenBuffer5μLXbaⅠ1μLPacⅠ1μLpBlue-CMV-HB/pEBS-CDEF5μL/5μLH2O至50μL37℃水浴反应1h后，反应液用琼脂糖凝胶电泳检测，条带位置正确后切胶回收FEDC片段和pBlue-CMV-HB载体。将回收产物按以下比例连接：HNyc15CDEF片段回收产物6μLpBlue-CMV-HB载体回收产物2μL10×T4DNALigaseBuffer1μLT4DNALigase1μL反应液混匀后，22℃连接1h,转化DH5α感受态细胞，方法如前所述。使用引物CMVC-F/CMVC-R（表4-3）作菌落PCR鉴定，反应总体积20μL，CMVC-F/CMVC-R各0.5μL（10pmol/μL），2×TaqPCRMasterMix10μL，模板1μL及H2O8μL。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，循环30次；72℃延伸10min。取8μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳。选取阳性克隆接入5mL含有氨苄的LB培养液的试管中，37℃，220rpm振荡培养12-16h后使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，命名为pBlue-CMV-CDEF。将质粒pBlue-CMV-CDEF用XbaⅠ和PacⅠ做双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒置-20℃保存，用于后续连接。（6）使用AB两端的NotⅠ和XbaⅠ将连接于pEBS-AB质粒上的AB片段切下，再经T4DNA连接酶连接于pBlue-CMV-FEDC载体上，具体酶切反应体系如下：10×GreenBuffer5μLNotⅠ1μLXbaⅠ1μLpBlue-CDEF/pEBS-AB5μL/5μLH2O至50μL37℃水浴反应1h后，反应液用琼脂糖凝胶电泳检测，条带位置正确后切胶回收AB片段和pBlue-CDEF载体。将回收产物按以下比例连接：pBlue-CDEF载体回收产物6μLHNyc15AB片段回收产物2μL10×T4LigaseBuffer1μLT4DNALigase1μL反应液混匀后，22℃连接1h，转化DH5α感受态细胞，方法如前所述。39 使用引物BC-F/BC-R（表4-3）作菌落PCR鉴定，反应总体积20μL，BC-F/BC-R各0.5μL（10pmol/μL），2×TaqPCRMasterMix10μL，模板1μL及H2O8μL。反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s，循环30次；72℃延伸10min。取8μLPCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳。选取阳性克隆接入5mL含有氨苄的LB培养液的试管中，37℃，220rpm振荡培养12-16h后使用天根质粒小提试剂盒提取质粒，命名为pBlue-CMV-ABCDEF。将质粒pBlue-CMV-ABCDEF用NotⅠ、XbaⅠ做双酶切鉴定，将鉴定阳性的质粒置-20℃保存，用于转染。使用全长测序引物（参见表3-1）对连接到pBlue-CMV-HB载体的HNyc15全基因进行序列测定。4.2.2.7病毒的拯救DNA转染用天根质粒小提试剂盒提取全长质粒，测定浓度。按LipofectamineLTX&PLUS™Reagent说明书进行DNA转染，具体步骤如下：（1）确定细胞密度：BHK-21细胞在含有5%FBSMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层约60%-80%左右时进行转染；（2）质粒DNA的稀释：在1.5mlEP管中加入150μL的Opti-MEM，然后加入3μgpBlue-CMV-ABCDEF质粒和3μLPLUS试剂，轻柔吹打混匀；标记为混合液Ⅰ。（3）在新的1.5mlEP管中中加入150μL的Opti-MEM和9μLLTX转染试剂，温和混匀；标记为混合液Ⅱ。（4）将混合液Ⅰ加入混合液Ⅱ中，轻柔混匀后，室温孵育20min；得到的混合液标记为混合液Ⅲ。（5）将六孔板的BHK-21细胞用Opti-MEM洗一次后每孔加入混合液III，同时补Opti-MEM约700μL，放入37℃、5%的CO2培养箱孵育4h后，将转染混合物弃去，加入2ml含5%FBS的EMEM培养基，继续置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。病毒拯救上述质粒转染BHK-2148h后，收获其细胞培养物，冻融一次，8000rpm离心1min后取上清1mL接种至PAM细胞，置于37℃、5%CO2的培养箱中吸附1h；随后补加4%FBS1640维持培养液，继续置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。每日观察细胞状态，待细胞病变达80%时，收获细胞培养物冻融一次，分装冻存，命名为rHNyc15，标记为P0代。按上述方法取细胞上清接种至新的PAM细胞进行传至P3代。4.2.2.8拯救病毒的鉴定免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）鉴定将P3代HNyc15和P3代rHNyc15接种在铺5满单层PAM细胞的24孔细胞培养板（孔内放上爬片）（1.1×10个细胞/孔）；接种后待细胞病变约为50-70%时，弃掉细胞培养上清，用PBS洗涤3次，室温干燥10min；每孔加350μL80%冷丙酮固定20min（4℃进行），用PBS洗涤3次；每孔加350μL0.25%Trition（PBS配制）作用10min后弃去，PBS洗涤3次，弃去PBS后将细胞板甩干净，然后将爬片取出40 进行后续试验。具体步骤如下：（1）爬片的固定：取出爬片，滴一滴中性树胶于载破片中央，将细胞爬片反面盖在中性树胶上，使两者粘贴牢固；（2）爬片与抗体作用：用免疫组化笔在细胞爬片周围画圈，防止单抗溢出。滴加40倍稀释的PRRSV单抗于爬片表面，湿盒内37℃孵育1h，甩去一抗，PBS洗涤3次，每次3min；滴加100倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，湿盒内37℃孵育30min，甩去二抗，PBS洗涤3次，每次3min；（3）显色：滴加DAB至爬片上，室温下避光显色4min（显微镜下控制显色时间），水洗，苏木素复染10s，水洗；（4）脱水：70%乙醇1min，80%乙醇1min，90%乙醇1min，100%乙醇1min；（5）透明：二甲苯I3min，二甲苯II5min；（6）封片：滴一滴中性树胶于载破片中央，将细胞爬片正面盖在中性树胶上，避免产生气泡；（7）光学显微镜下观察，拍照保存；（8）结果判定：阴性对照本地清晰，背景无特异着色；样品细胞胞质见黄色至棕黄色着染判定为阳性。遗传标记鉴定将第三代拯救病毒P3rHNyc15以及第三代亲本野毒HNyc15提取核酸，反转录，具体步骤参照第三章中3.2.2.2，用NADC6F/NADC6R（表3.1）做PCR，PCR体系50μL，包括5×PrimeSTARTBuffer10μL；2.5mMdNTPmixture4μL；PrimeSTARTHSDNAPolymerase0.5μL；NADC6F/NADC6R各1μL(10μM)；模板1μL；补充水至50μL。反应程序：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸7min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下切下目的片段产物，将目的片段回收后进行XbaI酶切鉴定，体系如下：10×GreenBuffer1μLXbaI1μL回收产物8μL样品混匀后，于37℃水浴中反应30min，然后将两个样分别进行琼脂糖凝胶电泳。4.2.2.9拯救病毒生物学分析以低剂量（0.1MOI）病毒(P3代亲本毒株HNyc15和P3代拯救病毒rHNyc15)感染PAM细胞，分别在感染后不同的时间段(12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h)收取200μL细胞上清液进行病毒滴度测定，根据不同时间点病毒的滴度绘制病毒多步生长曲线。病毒滴度测定方法如下：用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定。将待检样品用维持液作10倍系列稀释-2-6后，将10-10连续稀释的病毒接种96孔培养板上的PAM单层细胞。每稀释梯度接种841 孔，设2列细胞对照，0.2mL/孔，置37℃5%CO2的二氧化碳培养箱中培养，每隔24h观察感染细胞，记录出现CPE的孔数，停止出现CPE时终止观察。根据结果按Reed-Muench法计算TCID50。4.3结果与分析4.3.1pBluescriptⅡSK(+)载体改造为了便于将HNyc15基因组入pBluescriptⅡSK(+)载体，通过融合PCR将pBluescriptⅡSK(+)载体多克隆位点（MCS）中的单酶切位点去掉，插入NotⅠ、XbaⅠ、PacⅠ3个用于全长质粒构建的酶切位点，同时在多克隆位点的上游引入CMV真核启动子，下游引入HDV、BGH序列。经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切鉴定结果显示切出与目的条带大小一致的两条带；经KpnⅠ、XbaⅠ分别单酶切结果显示只切出一条带，如图4-3所示，显示酶切鉴定正确；测序也表明载体改造成功，命名为pBlue-CMV-HB。图4-3pBluescriptⅡSK(+)载体改造酶切鉴定图。Fig4-3IdentificationofpBluescriptⅡSK(+)vector注：M:DL5000Maker，1、经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切的载体；2、经KpnⅠ单酶切的载体；3、经XbaⅠ单酶切的载体。4.3.2HNyc15株各片段RT-PCR扩增结果利用设计的6对特异性引物，提取PRRSVHNyc15病毒RNA，利用SupersciptⅢreversetranscriptase反转录酶合成cDNA第一链，通过PCR扩增获得了PRRSVHNyc15全基因组的6个片段(图4-4所示)，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果片段与预期大小相符，分别为3528bp，3959bp，1667bp，2833bp，2058bp，2044bp。电泳的结果初步说明HNyc15基因组各个片段扩增成功。42 图4-4PRRSVHNyc15株全基因组各片段RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。Fig4-4RT-PCRamplificationofsixfragmentsofPRRSVHNyc15genome注：M:DL5000Maker，A-F分别代表全基因组的6个片段。4.3.3HNyc15株全长cDNA质粒的拼接与测序根据PRRSVHNyc15毒株第1代病毒全基因组及pBlue-CMV-HB载体序列的限制性内切酶位点，选取SacⅠ、XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ、Bsp1407Ⅰ五个酶切位点将HNyc15全基因组分A、B、C、D、E、F六个片段，并通过添加在基因组上下游的酶切位点NotⅠ、PacⅠ连接到改造后的低拷贝质粒pBlue-CMV-HB载体，构建出含有HNyc15全长基因的质粒。为了鉴别通过感染性克隆获得的拯救病毒与亲本病毒，通过定点突变PCR技术在基因组中引入一个遗传标记XbaI(7187nt)，该点突变为沉默突变，未引起氨基酸水平的改变，该酶切位点还用于片段的连接。插入HNyc15全长cDNA的质粒命名为pBlue-CMV-HNyc15，全长约为19kb，用限制性内切酶NotⅠ、XbaⅠ进行双酶切鉴定，鉴定结果(图4-5)初步表明PRRSVHNyc15全长cDNA连入pBlue-CMV-HB载体，测序结果与上传至GenBank上的HNyc15全基因组序列完全一致，表明PRRSVHNyc15全长cDNA质粒构建成功。图4-5含HNyc15基因组全长的质粒酶切鉴定图Fig4-5IdentificationoffulllengthcloneofHNyc15注：M:DL1,5000Maker，1为pBlue-CMV-HNyc15质粒;2为未经酶切的质粒对照。43 4.3.4病毒拯救将构建好的HNyc15全长质粒进行抽提纯化，然后将抽提好的质粒转染处于生长旺盛期的BHK-21细胞。转染后48h将细胞冻融一次，取上清接种PAM细胞，接种后48h便可观察到变圆、皱缩、折光性增强、聚堆、逐渐脱落等典型的细胞病变(CPE)，而对照细胞正常。96h收获细胞培养物（见图4-6），命名为rHNyc15，标记为P0代。图4-6拯救病毒在PAM细胞上的病变（CPE）（×200）.Figure4-6Cytopathiceffect(CPE)oftherescuedvirusinPAMcells（×200）.注：A为HNyc15在BHK细胞的转染产物接种PAM细胞后48h，B为正常PAM细胞对照4.3.5PRRSVHNyc15株感染性克隆的鉴定4.3.5.1拯救病毒的IPMA鉴定将P3代HNyc15、P3代rHNyc15分别接种24孔板中的PAM细胞，待细胞病变50%-70%左右用冷丙酮固定，按照操作程序进行IPMA鉴定，显微镜下观察，拯救病毒、亲本病毒HNyc15感染细胞孔染色呈棕红色，正常对照细胞对照孔无着色反应（图4-7）。表明HNyc15及其拯救病毒rHNyc15均能够在PAM细胞中增殖，HNyc15株拯救成功。图4-7HNyc15的IPMA鉴定试验（200×）Figure4-7Immunoperoxidasemonolayerassayoftheclonedvirus（200×）注：A为HNyc15，B为rHNyc15，C为对照PAM细胞44 4.3.5.2拯救病毒的遗传标记鉴定分别对P3HNyc15、P3rHNyc15提取核酸，反转录，用HNyc15全基因扩增引物中的NADC6F/NADC6R做PCR，扩增出同样大小的基因片段（1500bp），分别如图4-8中1、2；将2个片段纯化后，分别用XbaⅠ做单酶切鉴定，结果显示，亲本病毒P3HNyc15没有被切开，只有一条带；拯救病毒切出了1313bp和187bp两个条带，分别如图4-8中3、4；表明遗传标记鉴定正确。图4-8利用Genomicmarker区分HNyc15株亲本病毒与克隆病毒Figure4-8DifferentiationbetweenclonedvirusandparentalHNyc15strain.注：M:DL2000Maker；1、2分别为P3HNyc15、P3rHNyc15用NADC6F/NADC6R扩增的基因片段；3、4分别为P3HNyc15、P3rHNyc15NADC6F/NADC6R扩增的基因片段用XbaI酶切的结果。4.3.6PRRSVHNyc15株拯救病毒的生物学特性按照方法中4.2.2.9所述进行HNyc15亲本病毒和拯救病毒的多步生长曲线测定。结果如图4-9所示，HNyc15的病毒滴度略高于rHNyc15，且均在36h滴度达到最高，在36h后滴度缓慢下降，表明拯救病毒rHNyc15在PAM细胞上的增殖特性与亲本病毒HNyc15的增殖特性无明显差异。图4-9拯救病毒和亲本病毒的生长曲线Fig.4-9.Growthkineticsofrescuedandparentalvirus45 4.4讨论[67]自从1998年Meulenberg等人首次通过反向遗传学技术成功拯救出PRRSVLV株后，该技术已成为PRRSV研究中重要的一部分，后来针对各种类型的PRRSV毒株的构建和改造替换逐渐增多，通过在病毒基因组序列上的操作来间接改变病毒基因组结构，进而对致病机理及免疫反应等多方面进行研究。运用反向遗传操作技术拯救病毒过程中，获得准确的全基因序列是后期构建和改造的基[100]本条件。为了获得准确的cDNA序列，本试验中使用耐热SupersciptⅢreversetranscriptase反转录酶，能大大增加反转录产物的长度，提高了反转录效率，获得真实的cDNA序列。随着PCR扩增序列的延长，RT-PCR的保真性也成比例下降，因此在测序及分段扩增时必须使用具有3’-5’校验功能的高保真聚合酶。本研究将HNyc15全基因组分为6段进行RT-PCR扩增，把6段测序结果与之前得到准确序列对比后，只有一个点发生了点突变，使用点突变试剂盒进行了回复突变，确保6段序列准确无误后进行后续操作。为了区分拯救病毒和亲本病毒，在B、C片段之间通过同义突变引入XbaⅠ酶切位点作为遗传标记又可连接片段。找到合适的酶切位点是全长cDNA质粒构建的一个难点。中间克隆载体选用商品化的平末端克隆载体pEASY-BluntSimple载体，该载体上的多克隆位点酶切位点相对较少，便于将各片段PCR产物连接到克隆载体；在选择用于片段拼接酶切位点时，要选用在基因组中相对唯一的酶切位点，至少是在各片段上唯一存在的，并且在中间载体中不能有该酶切位点的存在。在6个片段的扩增引物中添加NotI这个全基因组中没有的酶切位点作为公共酶切位点，更便于片段之间的拼接。还可以对前后两段同时进行连接，这样可以大大提高实验效率。本研究采用CMV真核启动子，直接构建能够在动物细胞体内转录的cDNA全长克隆，[101]省去了RNA转染繁琐的体外转录步骤，使感染性克隆的转染方便，提高了转染效率。本研究通过构建PRRSV类NADC30毒株HNyc15基因组全长cDNA克隆并在基因组的上游添加了CMV真核启动子，并在感染性克隆全长质粒中引入遗传标记，通过转染对病毒全长cDNA克隆进行拯救，成功拯救出一株遗传稳定的病毒（rHNyc15），遗传标记存在。并对拯救病毒进行IPMA鉴定和多步生长曲线的测定，可知拯救病毒在PAM细胞上的增殖特性与亲本毒株相比并没有明显的差异。2012年率先在河南省发现类NADC30毒株，其后在东北的吉林、黑龙江等省份也发现[102]该类毒株，在国内呈扩散态势，并表明该类毒株是由NADC30与国内的毒株重组产生的。因此，类NADC30毒株感染性克隆的建立，为深入研究我国PRRSV的分子变异机制、复制、重组规律等奠定基础。46 第五章结论5.1利用PAM细胞，从河南伊川猪场的血清样品中分离到1株PRRSV类NADC30毒株，命名为HNyc15株。5.2通过测序获得HNyc15的全基因组序列，其具备类NADC30毒株在nsp2区域不连续性缺失131个氨基酸的特征。5.3成功构建了PRRSV类NADC30毒株HNyc15的感染性克隆，拯救病毒与亲本毒株在PAM细胞上的增殖特性差异不显著。47 参考文献[1]NeumannEJ,KliebensteinJB,JohnsonCD,etal.AssessmentoftheeconomicimpactofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeonswineproductionintheUnitedStates[J].JAmVetMedAssoc.2005,227(3):385-392.[2]ZhouL,YangH.PorcinereproductiveandrespiratorysyndromeinChina[J].VirusRes.2010,154(1-2):31-37.[3]BaronT,AlbinaE,LeforbanY,etal.Reportonthefirstoutbreaksoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)inFrance[J].AnnRechVet.1992,23(2):161-166.[4]KuwaharaH,NunoyaT，TajimaM,etal.AnoutbreakofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeinJapan[J].JVetMedSci.1994,56(5):901-909.[5]郭宝清，陈章水，刘文兴，崔益洙.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究.中国畜禽传染病,1996,2:3-7.[6]TianKG,YuXL,ZhaoTZ,etal.EmergenceoffatalPRRSVvariants:unparalleledoutbreaksofatypicalPRRSVinChinaandmoleculardissectionoftheuniquehallmark[J].PLoSONE,2007,6:1-10.[7]Zhou,L.,Z.Wang,Y.Ding,X.Ge,X.GuoandH.Yang:NADC30-likeStrainofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,China[J].Emerginginfectiousdiseases,2015a,21,2256-2257.[8]Brockmeier,S.L.,C.L.Loving,A.C.Vorwald,M.E.Kehrli,Jr.,R.B.Baker,T.L.Nicholson,K.M.Lager,L.C.MillerandK.S.Faaberg.GenomicsequenceandvirulencecomparisonoffourType2porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrains[J].Virusresearch,2012,169,212-221.[9]CavanaghD.Nidovirales:anewordercomprisingCoronaviridaeandArteriviridae[J].ArchivesofVirology.1997.142:629–633.[10]田克恭.猪繁殖与呼吸综合征.中国农业出版社,北京,2015,13-14.[11]BeyerJ.,FichtnerD.,SchirrmeierH.,etal.,Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV):kineticsofinfectioninlymphaticorgansandlung[J].JVetMedBInfectDisVetPublicHealth2000,47:9-25.[12]HalburP.G.,MillerL.D.,PaulP.S.,etal.,Immunohistochemicalidentificationofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)antigenintheheartandlymphoidsystemofthree-week-oldcolostnim-deprivedpigs[J].VetPathol1995,32:200-204.[13]HalburP.G.,PaulP.S.,FreyM.L.,etal.,ComparisonoftheantigendistributionoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus[J].VetPathol1996,33:159-170.[14]WensvoortG.,TerpstraC.,PolJ.M.,etal.,MysteryswinediseaseinTheNetherlands:theisolationofLelystadvirus[J].VetQ1991,13:121-130.[15]VoicuLL.,SilimA.,MorinM.,etal.,Interactionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruswithswinemonocytes[J].VetRec1994,134:422-423.[16]BautistaEM，GoyaiSMandCollinsJE．SerologicsurveyforLelystadandVR-2332strainsofporcinerespiratoryandreproductivesyndrome(PRRS)virusinUSswineherds[J]．JVet48 DiagnInvest，1993,4(5)：612-614.[17]KimH.S.,KwangJ.,YoonI.J.,etal.,Enhancedreplicationofporcinereproductiveandrsyndrome(PRRS)virusinahomogeneoussubpopuationofMA-104cellline[J].ArchVirol1993,133:477-483.[18]VoicuI.L.,SilimA.,MorinM.,etal.,Interactionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruswithswinemonocytes[J].VetRec1994,134:422-423.[19]CafrunyW.A.,DumanR.G.,WongG.H.,etal.,Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)infectionspreadsbycell-to-celltransferinculturedMARC-145cellsisdependentonanintactcytoskeleton,andissuppressedbydrug-targetingofcellpermissivenesstovirusinfection[J].VirolJ2006,3:90.[20]WangF，QiuHZhangQ，PengZ，LiuB．Associationoftwoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)receptorgenes，CDl63andSNwithimmunetraits[J]．Molecularbiologyreports2012，39：3971-3976．[21]DelputtePL,VanderheijdenN,NauwynckHJ,etal.,Involvementofthematrixproteininattachmentofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirustoaheparinlikereceptoronporcinealveolarmacrophages[J].JVirol2002,76:4312-20.[22]DelputtePL,CostersS,NauwynckHJ.,Analysisofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusattachmentandinternalization:distinctiverolesforheparansulphateandsialoadhesin[J].JGenVirol2005,86:1441-5.[23]DuanX,NauwynckHJ,FavoreelHW,etal.,Identificationofaputativereceptorforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusonporcinealveolarmacrophages[J].JVirol1998,72:4520-3.[24]VanderheijdenN,DelputtePL,FavoreelHW,etal.,Involvementofsialoadhesininentryofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusintoporcinealveolarmacrophages[J].JVirol2003,77:8207-15.[25]CalvertJG,SladeDE,etal.,CD163expressionconferssusceptibilitytoporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses[J].JVirol.2007Jul;81(14):7371-9.[26]VanGorpH,VanBreedamW,DelputtePL,NauwynckHJ.SialoadhesinandCD163joinforcesduringentryoftheporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JGenVirol.2008Dec;89(Pt12):2943-53.[27]RaiberEA,etal.Targeteddeliveryofantigenprocessinginhibitorstoantigenpresentingcellsviamannosereceptors[J].ACSChemBiol.2010May21;5(5):461-76.[28]ThanawongnuwechR,HalburPG,ThackerEL.Theroleofpulmonaryintravascularmacrophagesinporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfection[J].AnimHealthResRev.2000Dec;1(2):95-102.[29]DelputtePL,VanBreedamW,BarbeF,VanReethK,NauwynckHJ.IFN-alphatreatmentenhancesporcineArterivirusinfectionofmonocytesviaupregulationoftheporcineArterivirusreceptorsialoadhesin[J].JInterferonCytokineRes.2007Sep;27(9):757-66.[30]DeaS,GagnonCA,MardassiH,PirzadehBandRogan(2000a).Currentknowledgeonthestructuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virus:comparisonoftheNorthAmericanandEuropeanisolates[J].ArchivesofVirology145:659–688.[31]WurmT,ChenH,HodgsonT,BrittonP,BrooksGandHiscoxJA.Localizationtothenucleolusisacommonfeatureofcoronavirusnucleoproteins,andtheproteinmaydisrupt49 hostcelldivision[J].JournalofVirology.2001,75:9345–9356.[32]MolenkampR,GreveS,SpaanWJ,SnijderEJ.EfficienthomologousRNArecombinationandrequirementforanopenreadingframeduringreplicationofequinearteritisvirusdefectiveinterferingRNAs[J].JVirol.2000,74（19）:9062-9070[33]HanJ,LiuG,WangY,etal.Identificationofnonessentialregionsofthensp2replicationproteinofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrainVR-2332forreplicationincellculture[J].JVirol.2007,81:9878-9890.[34]ZhouL,ZhangJ,ZengJ,etal.The30-amino-aciddeletionintheNsp2ofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusemerginginChinaisnotrelatedtoitsvirulence[J].JVirol,2009,83(10):5156-5167.[35]BeuraLK,SarkarSN,KwonB,etal.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnonstructuralprotein1betamodulateshostinnateimmuneresponsebyantagonizingIRF3activation[J].JVirol.2010,84:1574-1584[36]TianX,LuG,GaoF,etal.Structureandcleavagespecificityofthechymotrypsin-likeserineprotease(3CLSP/nsp4)ofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus(PRRSV)[J].JMolBiol.2009,392:977-993.[37]DenBoonJA,SnijderEJ,LockerJK,HorzinekMC,RottierPJ.Anothertriple-spanningenvelopeproteinamongintracellularlybuddingRNAviruses:thetorovirusEprotein[J].Virology.1991Jun;182(2):655-63.[38]BautistaAP.Acuteethanolbingefollowedbywithdrawalregulatesproductionofreactiveoxygenspeciesandcytokine-inducedneutrophilchemoattractantandliverinjuryduringreperfusionafterhepaticischemia[J].AntioxidRedoxSignal.2002Oct;4(5):721-31.[39]LiY,ZhouL,ZhangJ,GeX,ZhouR,ZhengH,GengG,GuoX,YangH.Nsp9andNsp10contributetothefatalvirulenceofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusemerginginChina[J].PLoSPathog.2014Jul3;10(7):e1004216.[40]BautistaEM,FaabergKS,MickelsonD,McGruderED.Functionalpropertiesofthepredictedhelicaseofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].Virology,2002,298(2):258-270.[41]HedgesJF,BalasuriyaUBandMacLachlanNJ.Theopenreadingframe3ofequinearteritisvirusencodesanimmunogenicglycosylated,integralmembraneprotein[J].Virology.1999,264:92–98.[42]SnijderEJ,DobbeJC,andSpaanWJ.Heterodimerizationofthetwomajorenvelopproteinisessentialforarterivirusinfectivity[J].J.Virol.2003,77:97-104.[43]Ansari,I.H.,Kwon,B.,Osorio,F.A.,Pattnaik,A.K.InfluenceofN-LinkedGlycosylationofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusGP5onVirusInfectivity,Antigenicity,andAbilityToInduceNeutralizingAntibodies[J].JVirol,2006,80:3994-4004.[44]彭长凌,高崧,刘秀梵.间接免疫荧光试验检测方法的应用[J].上海畜牧兽医通讯,2005,11(1):18-22.[45]王莉娟,祁小乐,崔保安.分泌抗猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与鉴定[J].中国畜牧兽医,2005,32（4）：43-44.[46]MardassiH.,MassieB.,DeaS.Intracellularsynthesis,processing,andtransportofproteinsencodedbyORFs5to7ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JVirol.1996,221:98–112.[47]赵耘，林志雄，罗长宝，陈茹.猪生殖与呼吸综合征中国分离株ORF7基因的克隆及50 鉴定[J].中国兽医杂志.1998,24(10)：3-5.[48]TaoLinetal..Useofreversegeneticstodevelopanovelmarkerporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].VirusGenes.2012,45:548–555，[49]RossowKD,BautistaEM,GoyalSM,etal.Experimentalporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfectioninone-,four-,and10-week-oldpigs[J].JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation,1994,6(1):3-12.[50]RossowKD,CollinsJE,GoyalSM,NelsonEA,Christopher-HenningsJ,BenfieldDA.Pathogenesisofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfectioningnotobioticpigs[J].VetPathol.1995,32（4）:361-373[51]LePotierMF,BlanquefortP,MorvanE,AlbinaE.ResultsofacontrolprogrammefortheporcinereproductiveandrespiratorysyndromeintheFrench'PaysdelaLoire'region[J].VetMicrobiol.1997,355(1-4):355-60.[52]WensvoortG,TerpstraC,PolJM,TerLE,BloemraadM,DeKluyverEP,KragtenC,VanBuitenL,DenBestenA,WagenaarF,EtA.MysteryswinediseaseinTheNetherlands:theisolationofLelystadvirus[J].VetQ.1991,13（3）:121-130[53]BotnerA,StrandbygaardB,SorensenKJ,HaveP,MadsenKG,MadsenES,AlexandersenS.AppearanceofacutePRRS-likesymptomsinsowherdsaftervaccinationwithamodifiedlivePRRSvaccine[J].VetRec.1997,141（19）:497-499[54]MardassiH,MounirS,DeaS.StructuralgeneanalysisofaQuebecreferencestrainorporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)[J].AdvExpMedBiol.1995a,380:277-281.[55]YoshiiM,KakuY,MurakamiY,ShimizuM,KatoKandkedaH.GeneticvariationandgeographicdistributionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinJapan[J].ArchivesofVirology.2005,150:2313–2324.[56]KissI,SamiL,KecskemetiSandHanadaK.Geneticvariationoftheprevailingporcinerespiratoryandreproductivesyndromevirusesoccurringonapigfarmuponvaccination[J].ArchivesofVirology.2006,151:2269–2276.[57]LiB,FangLR,XuZF,etal.Recombinationinvaccineandcirculatingstrainsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses[J].EmerginglntectiousDseases2009,12(15):2032-2035.[58]ZhaoKuan，YeChao，ChangXiao-bo，eta1．ImportationandrecombinationareresponsibleforthelatestemergenceofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinChina[J]．JVirol，2015，89(20)：10712-10716．[59]Pallaresetal.,Porcinecircovirustype2(PCV-2)coinfectionsinUSfieldcasesofpostweaningmultisystemicwastingsyndrome(PMWS)[J].JVetDiagnInvest.2002Nov;14(6):515-9.[60]李俊，王金宝，张祯涛，周顺.猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分子生物学研究进展[J].莱阳农学院学报，2004,21(004),316-320.[61]LiX,WuJ,TanF,LiY,JiG,ZhuangJ,ZhaiX,TianK.GenomecharacterizationoftwoNADC30-likeporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusesinChina[J].Springerplus.2016Sep29;5(1):1677.[62]GagnonC.A.,LachapelleG.,LangelierY.,etal.Adenoviral-expressedGPSofporcinerespiratoryandreproductivesyndromevirusdiffersinitscellularmaturationfromtheauthenticviralproteinbutmaintainsknownbiologicalfunctions[J].ArchVirol2003,51 48(5):951-72.[63]QiuH.J.,TianZ.J.,TongG.Z.,etal.ProtectiveimmunityinducedbyarecombinantpseudorabiesvirusexpressingtheGPSofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinpiglets[J].Vet.Immunol.Immunopathol.2005,106(3-4):309-319.[64]汤景元，姜平，蒋文明.表达PRRSVM蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究[J].中国病毒学，2005,20(6):618-622.[65]Plana-DuranJ.,BritonsM.,UrnizaA.,etal.Efficacyofaninactivatedvaccineforpreventionofreproductivefailureinducedbyporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].VetMicrobiol.1997,55(1-4):361-370.[66]DavisJL,ClementsJE.CharacterizationofacDNAcloneencodingthevisnavirustransactivatingprotein[J].PNAS.1989,86(2):414-418[67]MeulenbergJJ,Bos-deRuijterJN,vandeGraafR,etal.Infectioustranscriptsfromclonedgenome-lengthcDNAofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JVirol.1998,72(1):380-387.[68]CalvertJG,SheppardMG,WelchSW.InfectiouscDNAcloneofNorthAmericanporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virusanduseshereof[J].USPatentApplication2003,0157689.[69]FangY,RowlandRRR,RoofM,etal.Afull-lengthcDNAinfectiouscloneofNorthAmericantype1porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:expressionofgreenfluorescentproteinintheNsp2region[J].JVirol,2006,80(23):11447-11455.[70]LvJ,ZhangJ,SunZ,etal.AninfectiouscDNAcloneofahighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusvariantassociatedwithporcinehighfeversyndrome[J].JGenVirol,2008,89(9):2075-2079.[71]GuoB,LagerKM,HenningsonJN,etal.ExperimentalinfectionofUnitedStatesswinewithaChinesehighlypathogenicstrainofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].Virology,2013,435(2):372-384.[72]NielsenHS,LiuG,NielsenJ,etal.GenerationofaninfectiouscloneofVR-2332,ahighlyvirulentNorthAmerican-typeisolateofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus[J].JVirol,2003,77(6):3702-3711.[73]VerheijeMH,RCOlsthoorn,MVKroese,etal.Kissinginteractionbetween3'noncodingandcodingsequencesisessentialforporcinearterivirusRNAreplication[J].JVirol,2002,76(3):1521-1526.[74]WissinkEH,HAvanWijk,JMPol,etal.Identificationofporcinealveolarmacrophageglycoproteinsinvolvedininfectionofporcinerespiratoryandreproductivesyndromevirus[J].ArchVirol,2003,148(1):177-187.[75]KimDY,JGCalvert,KOChang,etal.Expressionandstabilityofforeigntagsinsertedintonsp2ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)[J].VirusRes,2007,128(I-2):106-114.[76]KwonB,AnsariIH,PattnaikAK,etal.Identificationofvirulencedeterminantsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusthroughconstructionofchimericclones[J].Virology,2008,380(2):371-378.[77]ZhouL,NiYY,PineyroP,etal.DNAshufflingoftheGP3genesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)producesachimericviruswithanimprovedcross-neutralizingabilityagainstaheterologousPRRSVstrain[J].Virology,2012,434(1):52 96-109.[78]FangY,Christopher-HenningsJ,BrownE,etal.Developmentofgeneticmarkersinthenon-structuralprotein2regionofaUStype1porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus:implicationsforfuturerecombinantmarkervaccinedevelopment[J].JGenVirol,2008,89(12):3086-3096.[79]Duan,X.,Nauwynck,J.J..Effectsoforiginandstateofdifferentiationandactivationofmonocytes/macrophagesontheirsusceptibilitytoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)[J].Arch.virol.1997a,142,2483-2497.[80]Duan,X.,Nauwynck,J.J.,Pensaert,M.B..Virusquantificationandidentificationofcellulartargetsinthelungsandlymphoidtissuesofpigsatdifferenttimeintervalsafterinoculationwithporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)[J].Vet.Microbiol.1997b,56,9-19.[81]DuY.,YooD.,ParadisM.A.,ScherbaG.Antiviralactivityoftilmicosinfortype1andtype2porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinculturedporcinealveolarmacrophages[J].Antivir.Antiretrovir,2011,3(3):028-033.[82]MengelingW.L.,LagerK.M.,VorwaldA.C..Diagnosisofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome[J].J.Vet.Diagn.Invest,1995,7:3-16.[83]RowlandRR，LunneyJ，DekkersJ．Controlofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)throughgeneticimprovmentsindiseaseresistaceandtolerance[J].FrontGenet,2012,3:260.[84]朱佳毅，任晓峰．猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法的研究进展[J].中国预防兽医学报，2014，36(1):77-80．[85]AnT,ZhouY,LiuG,etal.Geneticdiversityandphylogeneticanalysisofglycoprotein5ofPRRSVisolatesinmainlandChinafrom1996to2006:coexistenceoftwoNA-subgenotypeswithgreatdiversity[J].Veterinarymicrobiology,2007,123(1):43-52.[86]GmylAP,AgolVI.DiversemechanismsofRNArecombination[J].MolecularBiology,2005,39(4):529[87]常晓博，等.PRRSV新亚型毒JT580的基因组变异特征研究[J].2015，49(5)：12-16.[88]周艳,郑海红,袁世山.RNA病毒的重组机制及其研究进展[J].中国动物传染病学报,2011,19(6):71-76.[89]BrockmeierSL,LovingCL,VorwaldAC,KehrliME,Jr.,BakerRB,NicholsonTL,LagerKM,MillerLC,FaabergKS.GenomicsequenceandvirulencecomparisonoffourType2porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusstrains[J].Virusresearch,2012,169:212-221.[90]张洪亮，张晶等.2016年我国部分地区类NADC30新亚群猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析[J].中国预防兽医学报，38（9）：675-680.[91]ZhouL,ZhangJ,ZengJ,etal.The30-amino-aciddeletionintheNsp2ofhighlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusemerginginChinaisnotrelatedtoitsvirulence[J].JVirol,2009,83(10):5156-5167.[92]AlejskaM,FiglerowiczM,MalinowskaN,etal.AuniversalBMV-basedRNArecombinationsystem—howtosearchforgeneralrulesinRNArecombination[J].Nucleicacidsresearch,2005,33(12):e105-e105.[93]GaoZQ,GuoX,YangHC.GenomiccharacterizationoftwoChineseisolatesofporcinerespiratoryandreproductivesyndromevirus[J].Archivesofvirology,2004,149:1341-1351.53 [94]LiB,FangL,XuZ,LiuS,GaoJ,JiangY,ChenH,XiaoS.Recombinationinvaccineandcirculatingstrainsofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeviruses[J].EmergInfectDis,2009,15:2032-2035[95]Taniguchi,T.,Palmieri,M.,Weissmann,C.QBDNA-containinghybridplasmidsgivingrisetoQBphageformationinthebacterialhost[J].Nature.1978,274,223-228.[96]SosnovtsevS,GreenKY.RNAtranscriptsderivedfromaclonedfull-lengthcopyofthefelinecalicivirusgenomedonotrequireVpGforinfectivity[J].Virology,1995,210(2):383-390.[97]YountB,CurtisKM,FritzEA,HensleyLE,JahrlingPB,PrenticeE,DenisonMR,GeisbertTW,BaricRS.Reversegeneticswithafull-lengthinfectiouscDNAofsevereacuterespiratorysyndromecoronavirus[J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(22):12995-13000.[98]vanDintenLC,denBoonJA,WassenaarAL,SpaanWJ,SnijderEJ.AninfectiousarteriviruscDNAclone:identificationofareplicasepointmutationthatabolishesdiscontinuousmRNAtranscription[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(3):[99]吕健，孙志，张建武，刘维全，袁世山.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建[J].微生物与感染，2007,2:219-227.[100]BoyerJC,HaenniAL.InfectioustranscriptsandcDNAclonesofRNAviruses[J].Virology,1994,198(2):415-26.[101]ChangheeLeea,JayG.Calvertb,Siao-KunW.Welchb,DongwanYooa.ADNA-launchedreversegeneticssystemforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusrevealsthathomodimerizationofthenucleocapsidproteinisessentialforvirusinfectivity[J].Virology2005,331,47–62.[102]ZhaoK，YeC，ChangXB，etal.ImportationandrecombinationareresponsibleforthelatestemergenceofhighlypathogenicPRRSVinChina[J].JVirol，2015.54 ConstructionandIdentificationofInfectiousCloneofNADC30-likePorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusstrainHNyc15Supervisor:Prof.ZhangXu-keandProf.ZhangLong-xianMasterCandidate:XuXiao-dongAbstract：Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)isaviralinfectiousdiseaseleadingtoseriousharmtotheglobalpigindustrycausedbyPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV).Since2012,severalfieldisolatesofPRRSVwereisolatedatpigfarmsinChinawhichshowedthehighestnucleotidesimilaritytoagrouprepresentedbyNADC30,atype2PRRSVthathasbeenisolatedinUniteStatesofAmericain2008.Accordingly,thesePRRSVisolatesweredesignatedasNADC30-likePRRSV.Thestrainshadmoderatepathogenicity,andcurrentcommercialPRRSVvaccinefailedtoprotectNADC30-likePRRSVinfection.Sofar,thediseasehasbeenreportedtobewidelyspreadinseveralprovincesandledtohugeamountofeconomiclossesinChina.ItisofgreatscientificsignificancetoinvestigatethegeneticevolutionoftheNADC30-likePRRSVandassociatedmolecularmechanismswithitspathogenicity.Inthepresentstudy,aNADC30-likePRRSVstrainHNyc15wasanalyzedandthefull-lengthgenomesweresequencedinordertoexploretheevolutionofNADC30-likePRRSV.Byusingreveregeneticmanipulation,theinfectiouscDNAcloneoftheNADC30-likePRRSVstrainHNyc15wasconstructedwhichcouldprovidescientificevidencesforelucidatingthemolecularpathogenesisoftheNADC30-likePRRSV.Inthisstudy,PRRSVwasdetectedinserumsamplesfromYichuanpigfarminHenanProvince.TheresultsshowedthatPRRSVwaspositive.ThepreliminarydifferentiatingPCRresultsshowthatitwasaNADC30-likePRRSV.Theporcinealveolarmacrophages(PAM)wereusedfortheseparationofvirus.TypicalcytopathiceffectwasobservedinPAMcells48hpostinfection.After96hours,thecultureswereharvested.TheNsp2genewasamplifiedbyRT-PCRandsequenced,AlignmentsofNsp2genesequencingshowedthattherehadthe131aminoaciddeletioninthenonstructuralprotein2(nsp2)regionasotherreportedNADC30-likePRRSVstrains.Therefore,thisisolatedviruswasidentifiedasaNADC30-likePRRSVanddesignatedHNyc15strain.Inthisstudy,twelvepairsofprimersweresynthesizedaccrordingtothereportedNADC30-likegenomesequencesatNCBIandRT-PCRmethodwasusedfor55 amplificationofthecompletegenomeofHNyc15strain.Theresultsofeachgenesequenceweresplicedandaligned.Geneticevolutionanalysisandrecombinationanalysiswasperformedwiththewholegenomesequenceofthereportedstrains.TheresultsshowedthatthegenomelengthofHNyc15strainwas15049bp.GeneticanalysesdemonstratedthatHNyc15exhibits60.4%,85.2%,and93.8%nucleotideidentitywithPRRSVstrainsLelystadvirus(LV),VR2332,andNADC30,respectively.TheevolutionaryanalysisshowedthatHNyc15,HENAN-XINX,HNjz15,HENAN-HEBandNADC30belongedtothesamesubgroup,andthesubgroupwascomposedofNADC30isolates,TheresultsofrecombinationanalysisshowedthatHNyc15strainhadrecombinationwithVR-2332andCH-1abetweenORF2andORF4.ItisinferredthattheNADC30-likePRRSVmaybemutatedbytheNADC30strainandtype2PRRSV.Inthisstudy,thegenomeofNADC30-likePRRSVstrainHNyc15wasdividedintoA,B,C,D,EandFsixfragmentsaccordingtotheappropriaterestrictionsites.TheamplifiedproductswereinsertedintothepEASY-Bluntsimplevector.TheCMVeukaryoticpromoterwasinsertedinthemultiplecloningsites(MCS)ofthepBluescriptIISK(+)vector,HDVandBGHsequenceswereinsertedinthebackwardposition.ThemodifiedvectorwasnamedpBlue-CMV-HB.SixfragmentswereligatedintothemodifiedvectorpBlue-CMV-HBtoconstructfull-lengthcDNAclonespBlue-CMV-HNyc15.TheCatposition7186wasmutatedtoTbyPCRtocreatearestrictionenzymesiteXbaIasthegeneticmarker.Thefull-lengthcDNAplasmidwastransfectedintoBHK-21cells.After48hours,thecultureswereharvestedandinoculatedinPAMcell.Thecytopathiceffectswereobservedat48hpostinfection.Immunoperoxidasemonolayerassay(IPMA)andidentificationofgeneticmarkershowedthatviruswasrescuedsuccessfully.TherescuedvirusexhibitedasimilargrowthpatterntoitsparentalvirusinPAMcellswithpeaktitersat36hpost-infection.Inconclusion,werescuedvirusfromaninfectiouscDNAcloneofHNyc15strain.ThedevelopmentofreversegeneticssystemsforNADC30-likePRRSVwillbehelpfultousforbetterunderstandingthemoleculermechanismofthevirus.Keyword:PRRSV;NADC30-like;HNyc15;Sequenceanalysis;Infectiousclone56