类NADC30株致猪繁殖与呼吸综合征诊断与防治的研究

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全日制硕士专业学位（毕业）论文类NADC30株致猪繁殖与呼吸综合征诊断与防治的研究学位申请人：孟利佳指导教师：董世山教授学位名称：兽医硕士学科领域：不区分研究领域授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月三日 分类号：S852.3单位代码：10086密级：公开学号：20169200789类NADC30株致猪繁殖与呼吸综合征诊断与防治的研究StudyOnDiagnosisandPreventionofNADC30-LikePorcineReproductiveandRespiratorySyndrome学位申请人：孟利佳指导教师：董世山教授学位名称：兽医硕士学科领域：不区分研究领域授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月三日 摘要猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的，主要特征是母猪发生繁殖功能障碍和各年龄段猪出现严重的呼吸道症状，且易发生继发感染，俗称“猪蓝耳病”。该病自首次发生至今有30余年，在全球范围内均未得到有效控制，众多国家和地区仍然受到很大影响。猪繁殖与呼吸综合征病毒分为两种基因型，即欧洲型和美洲型，1996年在我国首次分离到了美洲型PRRSV。2006年，我国首次爆发高致病性猪蓝耳病（HP-PRRSV），给养猪业造成了严重的损害，引起人们的重视。由于该病毒极易发生变异，给防控增加了困难。近年来，很多猪场PRRS的免疫水平很好，但是仍然出现了明显的繁殖障碍与呼吸道症状，先后从不同地区发现新的毒株。河北省猪蓝耳病频频发生，其中有关PRRSV类NADC30株的报道很少。2017年，河北省4个养猪场疑似患猪繁殖与呼吸综合征病，藁城市、晋州市和邢台市养殖场的送检病猪为保育猪，患病猪临床表现精神沉郁，呼吸困难，皮肤发绀，消瘦后发生死亡；沧州市养猪场送检的母猪体温升高达40℃以上，临床出现流产现象。为进一步诊断，本研究分别从病理学、病原学和中药防治等角度进行了系统的分析和研究。对送检病猪进行大体剖检，发现病变大多表现为肺脏局部气肿、严重肉变，气管和支气管有纤维素样分泌物，多处淋巴结肿大出血。采集病猪的肺脏、肾脏、肝脏、淋巴结等多个组织，制成石蜡切片进行H.E.染色，显微镜下观察可见，肺泡间隔显著增宽，有大量淋巴细胞浸润，呈典型间质性肺炎变化；淋巴结周边严重出血，淋巴滤泡内出现多核巨细胞；肾小管上皮细胞变性、坏死。免疫组织化学染色，发现肺脏上皮细胞、巨噬细胞内存在大量PRRSV。利用商品化PRRSV通用型检测试剂盒对剖检病猪的组织器官进行RT-PCR病原检测，扩增结果与目的条带的片段大小一致，PRRSV检测均为阳性，说明4起病例均为PRRSV感染所致。之后，对4个PRRSV毒株的N基因序列进行扩增、克隆和测序，经遗传进化分析表明，4个毒株中SJZ201701株、JZ株和CZ株与NADC30参考毒株高度同源，NG株与4株HP-PRRSV的同源性高达100%。综合判定，3起病例为类NADC30株PRRSV感染，1起为HP-PRRSV感染。将确诊猪繁殖与呼吸综合征80头患病母猪和100头患病仔猪作为试验猪，分别随机均分为对照组和给药组，板蓝根、甘草等11味中药组成复方中药制剂，母猪给药组每头给药80g，仔猪每头40g，每日分3次给药，连续给药6d，空白组不给药，观察15d后进行效果判定。结果显示，母猪对照组有5头流产，采食量减少，给药组有1头流产，采食量明显好转；仔猪对照组呼吸道症状逐渐加重，共死亡10头，给药组有2头死亡，呼吸道症状明显减轻，体温等恢复正常。说明该组方可以有效改善 PRRS患病猪的临床症状，具有较好的治疗效果。关键词：猪；繁殖与呼吸综合征；类NADC30株；诊断；中药防治 StudyOnDiagnosisandPreventionofNADC30-LikePorcineReproductiveandRespiratorySyndromeAuthor:MengLijiaAdvisor:ProfessorDongShishanMajor:VeterinaryMedicineAbstractPorcineReproductiveandRespiratorySyndrome(PRRS)iscausedbyPorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus(PRRSV),whichischaracterizedbyreproductivedisordersinsows,respiratorysymptomsinpigsofallagesandsecondaryinfections.Itcommonlyknownasthe“blueearpigdisease”.Thediseasehasnotbeeneffectivelycontrolledgloballyforabout30years,andmanycountriesandregionsremainheavilyaffected.PRRSVisdividedintotwogenotypes,EuropeangenotypeandAmericangenotype.In1996,theAmericanPRRSVwasfirstisolatedinChina.In2006,thefirstoutbreakofHighlyPathogenicPRRSV(HP-PRRSV)inChinacausedseriousdamagetothepigindustryandarousedpeople’sattention.Becauseofthehighlysusceptibletomutation,preventionandcontrolofPRRShaveincreaseddifficulties.Inrecentyears,theimmunizationlevelofPRRSinmanyfarmswasverywell,buttherewerestilltypicalbreedingandrespiratorysymptoms.SeveralnewPRRSVstrainshavebeenfoundedindifferentregions.PRRSfrequentlyoccurredinHebeiProvince,butNADC30-LikePRRSVstrainsrarelyreported.In2017,fourpigfarmsinHebeiProvinceweresuspectedofhavingthediseaseofPRRS.Thenurserypigs,inGaochengCity,JinzhouCityandXingtaiCityfarms,whichclinicalsignsofthediseasedpigswerefever,gloomy,dyspneaandcyanosisofskin,weightlossanddeath.Thetemperatureofthe3-month-oldsowsofCangzhouCityfarmwasupto40degreescentigrade,andtheoccasionalabortionoccurred.Inthestudy,weperformedtheresearchfromthepathology,molecularetiology,preventionandcontrolofTraditionalChineseMedicine(TCM)respectivelyinordertomakeadefinitivediagnosis.Ageneralnecropsyoftheinfectedpigswasperformed,localemphysemaandconsolidationoflung,fibrinoidsecretionsoftracheaandbronchus,swellingandhemorrhageoflymphnodeswereobserved.Collectinglung,kidney,liver,lymphnodesandmultipletissue,madethemintoparaffinsectionsandtoH.E.staining,observedunderthemicroscope.Thepathologicalchangesincludedlymphocyteinfiltration,typicalinterstitialpneumonia,hemorrhageandmultinucleatedgiantcellinfiltrationoflymphnode,renaltubularepithelialcelldegeneration,necrosis.ImmunohistochemicalstainingrevealedthatalargenumberofPRRSVwerefoundinthelungepithelialcellsandmacrophages. WedetectedPRRSVintissuesofdiseasedpigsbyRT-PCRwiththecommercialPRRSVtestingkit.Cloningresultsarealignedwithtargetfragment,indicatingthatthosecaseswereallresultedfromPRRSV.Therefore,weclonedandsequencedN-terminalofthefourstrainsrespectively.ThePhylogeneticanalysisshowedthatthestrainnamedSJZ201701,JZandCZhadhighlyhomologywithNADC30-LikePRRSV,andthehomologybetweenNGandthefourHP-PRRSVstrainsreachedupto100%.Inconclusion,threecaseswerecausedbyNADC30-LikePRRSVandtheotheronewascausedbyHP-PRRSV.80sowsand100pigletswithPRRSwererandomlydividedintotwogroups,controlgroupandtreatmentgroup.ThepigsoftreatmentgroupweredrenchedwithChineseherbalprescription,whichwascomposedof11kindsoftraditionalChinesemedicine,suchasIsatidisRadix,Mahuang,Xingren,etal,threetimesadayand80gforsows,40gforpiglets,continuousadministrationof6d.Theblankcontrolgroupswerenotadministered,determinetheefficacyafter15d.Theresultsshowedthattherewere5miscarriagesinthecontrolgroupofsowsandthefeedintakewasreduced;oneabortionoccurredintheadministrationgroup,andthefeedintakewassignificantlyimproved.Therewere10deathsincontrolgroupofpigletsandtherespiratorysymptomsweregraduallyaggravated;2deathsintreatmentgroupandtemperaturereturnedtonormal.ItisindicatedthatthisprescriptioncaneffectivelyimprovetheclinicalsymptomsofpigswithPRRS,andhasagoodtherapeuticeffect.Keywords:swine;porcinereproductiveandrespiratorysyndrome;NADC30-Likestrain;diagnosis;preventionandcontrolofTCM 目录1引言.......................................................................................................................................................11.1研究背景....................................................................................................................................11.2病原学........................................................................................................................................11.2.1分类与形态......................................................................................................................11.2.2理化特性..........................................................................................................................21.2.3病毒的感染特性..............................................................................................................21.2.4生物学特性......................................................................................................................31.3流行病学....................................................................................................................................31.3.1传染源和传播途径..........................................................................................................41.3.2易感动物..........................................................................................................................41.3.3流行特点..........................................................................................................................41.4临床症状....................................................................................................................................41.4.1繁殖母猪和公猪..............................................................................................................41.4.2仔猪和育肥猪..................................................................................................................51.4.3高致病性PRSSV............................................................................................................51.5病理变化....................................................................................................................................51.5.1病理剖检变化..................................................................................................................51.5.2组织病理学变化..............................................................................................................61.5.3致病机理..........................................................................................................................61.6诊断............................................................................................................................................71.6.1诊断要点..........................................................................................................................71.6.2实验室诊断......................................................................................................................81.6.3鉴别诊断........................................................................................................................101.7防治..........................................................................................................................................121.8本文研究思路及目标...............................................................................................................132材料与方法.........................................................................................................................................142.1材料..........................................................................................................................................142.1.1病料来源........................................................................................................................142.1.2主要试剂........................................................................................................................142.1.3实验仪器........................................................................................................................142.2方法..........................................................................................................................................152.2.1疑似病例发病情况........................................................................................................152.2.2病理学诊断....................................................................................................................152.2.3病原学检测....................................................................................................................172.2.4猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的遗传进化分析....................................................18 2.2.5复方中药治疗PRRS试验.............................................................................................223结果......................................................................................................................................................233.1临床症状观察结果....................................................................................................................233.2病理学观察结果........................................................................................................................233.3组织病理学观察结果...............................................................................................................243.3.1肺脏的组织病理学观察结果........................................................................................243.3.2淋巴结的组织病理学观察结果....................................................................................243.3.3肾脏的组织病理学观察结果........................................................................................253.3.4脾脏的组织病理学观察结果........................................................................................253.3.5免疫组化染色结果........................................................................................................263.4病原学检测检测结果...............................................................................................................263.4.1RT-PCR检测结果.........................................................................................................263.4.2PRRSV基因组序列及结果...........................................................................................273.5复方中药治疗PRRS试验结果...............................................................................................313.5.1母猪治疗结果................................................................................................................313.5.2仔猪治疗结果.................................................................................................................314讨论......................................................................................................................................................324.1PRRS的发生、流行及危害.....................................................................................................324.2PRRSV的病原学诊断..............................................................................................................324.3PRRSV的遗传进化分析..........................................................................................................324.4中药的作用...............................................................................................................................334.5复方中药的临床应用...............................................................................................................334.6PRRS的复方中药治疗.............................................................................................................335结论....................................................................................................................................................35参考文献..................................................................................................................................................36作者简介..................................................................................................................................................43致谢........................................................................................................................................................44 1引言1.1研究背景猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）为动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus）的成员之一，是有囊膜包被的单股正链RNA病毒，呈球形结构[1-2]。临床上，PRRSV主要感染猪，引起猪繁殖与呼吸综合征的发生。PRRS是一种高度接触性传染病，俗称“猪蓝耳病”，表现为妊娠母猪发生繁殖障碍，各生长阶段的猪出现不同程度的呼吸道症状，并且容易继发感染[3]。到目前为止，许多国家地区仍受到PRRSV的严重危害，在全球范围内尚未得到有效的控制[4]。该病在北美（1987年）和欧洲（1991年）首次爆发，除澳大利亚、瑞士、新西兰等少数国家外，大多数国家均有关于PRRS的报道，近年来呈现逐渐增多的趋势。我国最早是在1996年分离到了美洲型PRRSV，在随后几年中疫情总体较平稳。直至2006年，我国首次爆发了高致病性猪蓝耳病，其临床上感染猪呈现出高发病率与高死亡率，至少有200万头猪只受到影响，给养猪业造成了严重的损害，引起人们极大的重视[5]。PRRSV具有高度变异的特性，自2012年以来，PRRSV类NADC30毒株（NADC30-like毒株）开始在我国多个地区流行，并呈不断上升趋势，先后从不同地区发现新的毒株[6-8]。近年来，河北省一些猪场的PRRSV免疫水平较好，但疾病仍然频频发生，而有关PRRSV类NADC30株的报道很少。本研究对河北省养猪场的送检猪进行了系统的诊断，还进行了复方中药对PRRSV患病猪治疗效果的研究，为针对PRRSV的临床诊断和防控提供重要依据，对PRRSV病毒遗传变异进展的研究有重要的参考价值。1.2病原学1.2.1分类与形态猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是一种高度接触性传染病，该疾病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起猪出现急性、慢性和亚临床性症状。根据不同抗原型，可将PRRSV分为两个基因型，基因1型（Type1）主要分布在欧洲地区，故又称欧洲型，基因2型（Type2）分布于美洲和亚太地区，故又称为美洲型。根据ORF5基因，基因1型PRRSV又可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因亚型，基因2型PRRSV可以分为9个基因亚型[9]。1991年，荷兰首次分离得到LV（Lelystadvirus）欧洲型PRRSV代表毒株[10]。1992年，在北美爆发的PRRS中，分离到美洲型PRRSVVR-2332代表毒株[11]。1996年我国首次报道了PRRS的发生，在流产死胎中成功分离得到美洲型PRRSV，命名为CH-1a株[12]。PRRSV具有对称的二十面体球形结构，直径约50～60nm[13-14]。第十次国际病毒学大会上，PRRSV被正式归类于套式病毒目（Nidovirales）（又称尼多病毒目）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、1 动脉炎病毒属（Arterivirus）。猴出血热病毒(Simianhemorrhagicfevervirus，SHFV)、小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒（Lactatedehydrogenaseelevatingvirus，LDV）和马动脉炎病毒（Equinearteritisvirus，EAV），这三种动脉炎病毒家族成员的形态结构、蛋白质组成和复制方式均相似，但无血清学交叉反应[15-16]。PRRSV有6种结构蛋白，包括GP2、GP3、GP4、GP5（囊膜蛋白）、M蛋白（膜基质蛋白）和N蛋白（核衣壳蛋白），其中有被糖基化的3种蛋白，分别为GP3、GP4、GP5；另一种为非糖基化蛋白，包括E蛋白和M蛋白。这些糖蛋白有不同的功能，GP2a与GP3、GP4、E蛋白形成的蛋白复合体在病毒的吸附过程中有重要作用；N蛋白为主要结构蛋白，被双层核衣壳包围形成RNA基因的骨架，它也是病毒感染后细胞内表达水平最高的蛋白，因具有保守性强、特异性高的特点被广泛用于PRRSV抗体的血清学诊断[17]。Nsp1是病毒入侵机体后最早产生的非结构蛋白；PRRSV基因组中变异最大的区域为Nsp2区，现已成为该分子流行病学研究中重要的靶基因[18]；Nsp9和Nsp10与病毒的复制、致死毒力的增加密切相关[19]。图1PRRSV的结构图Fig.1DiagramofPRRSVstructure1.2.2理化特性PRRSV有囊膜包被，是单股、正链、不分节段的RNA病毒，在电镜下观察发现该病毒粒子为球形，二面体对称，核衣壳上长有突起，外围是脂质双层膜层，呈蜂窝样的表面结构[20]。在pH6.5～7.5之间病毒可稳定存在，在pH小于5或pH大于7时，PRRSV的感染能力下降。该病毒耐热性差，5645℃min病毒失活；37℃仅存活24h；4℃放置病毒逐渐失去感染性。低温时稳[14，21]定性较好，-70℃～-20℃存活半年以上。此外，PRRSV对氯仿、三氯甲院、乙醚等油脂溶剂极为敏感，因此临床上PRRSV的消毒剂可使用脂溶剂。在蔗糖和氯化铯密度梯度中的浮密度分别为1.18～1.23g/cm3和1.13~1.19g/cm3，利用此特性可提纯分离出感染性高的病毒[21-22]。1.2.3病毒的感染特性PRRSV主要感染猪肺部的肺泡巨噬细胞（PAM）和单核巨噬细胞，尤其是彻底分化的猪肺泡巨噬细胞。其他组织的巨噬细胞，如淋巴结、脾脏、胎盘、脐带等也可感染[14]。有报道证明，树突状细胞亦可感染PRRSV。病毒能在MA-104、CL-2621等传代细胞系上一般情况下无明显的2 细胞病变（Cytopathiceffect，CPE）现象[23]。传代非洲绿猴肾细胞（MARC-145）是PRRSV体外感染试验的主要研究对象[24]。研究发现，MARC-145细胞是唯一高度允许PRRSV繁殖的连续细胞系，该细胞感染后发生聚集、脱落、固缩和崩解等明显的CPE现象[25-26]。有文章利用PAM或MARC-145研究了miRNA调控PRRSV基因表达情况[27]。美洲型PRRSV在上述细胞均能够良好增殖，除PAM细胞外，欧洲型PRRSV在其它种类细胞上培养的毒价均较低[25]。1.2.4生物学特性PRRSV感染可引起PAM细胞的凋亡，使机体产生免疫抑制，具有持续感染性，较高的遗传多样性和ADE作用[13]。欧洲型PRRSV与美洲型PRRSV的基因序列差异较大，同源性为50%～60%；相同基因型毒株之间存在多个亚型，欧洲型PRRSV可以分为3个基因亚型，美洲型PRRSV分为9个基因亚型[28]，这也是该病毒具有较高的遗传多样性的重要原因。因PRRSV主要侵害免疫细胞，循环抗体存在于机体内，可造成猪的持续性感染，即病毒在体内长期排毒呈现亚临床感染症状。ADE作用是PRRSV重要的生物学特性之一，在病毒感染机体早期产生能使其失去感染细胞能力的特异性抗体（不具有中和作用），这些抗体与病毒结合形成病毒-抗体复合物，该复合物与[13，21]细胞表面表达的FcR结合从而介导病毒进入靶细胞，促进病毒的增殖。加入一定滴度的PRRSV抗体的PAM培养物，病毒的毒价明显升高[22]。中和抗体可通过降低病毒吸附和内化的方式发挥抗病毒作用，抵抗PRRSV在体外感染巨噬细胞[29]，而非中和活性的抗体在与病毒结合、增强病毒与PAM相互作用中起重要的桥梁作用。由于肝素与病毒血凝素相互作用，致使红细胞凝集受到抑制，一般情况下PRRSV对猪、羊、牛、鸡、鸭、鹅、兔、豚鼠和人O型等红细胞均不凝集。经非离子除垢剂、脂溶剂处理的PRRSV能凝集BALB/C和ddy小鼠的红细胞[30]。1.3流行病学1985年以前，PRRSV在美国和加拿大的猪群中就已经被发现，在20世纪80年代中期欧洲地区也出现病毒感染情况[31-32]。1991年，荷兰首次成功分离到欧洲型PRRSV，并将其命名为“LV”株。1992年，在北美分离到美洲型PRRSV，命名为“VR-2332”株。随后，比利时、法国、德国、英国、西班牙、加拿大、美国、韩国、泰国等多个国家暴发了PRRS疫情[33-35]。1995年底，[12，36-37]我国首次报道了PRRS的发生，且出现了不同毒力的毒株。2006年，我国南方地区猪群出现皮肤潮红、呼吸急促、高热等临床症状，被称为“猪高热病”，因其发病率和死亡率较高，随后几个月内，这种“猪高热病”迅速在河北、河南、山东、陕西等全国大部分地区爆发流行。研究者证明，此次疫情主要是由HP-PRRSV引起的，各种年龄的猪均有发病，发病率达50%以上，死亡率达20%～100%，给我国的养猪业造成巨大的经济损失[38-41]。2005年～2007年，湖北、江西、江苏、上海等长江中下游地区规模化养猪场，不同年龄阶段的血清学检测样本阳性率分别为91.1%、94.8%和96.1%；广西、广东、海南等十几个地区养猪场的感染率为81.3%，血清中PRRSV抗体阳性率普遍较高，且有逐年上升的趋势成逐年递增的趋势[42-43]。2015～2016年来自江苏、浙江、四川、安徽、山东、河北、河南、上海、广东、广西、福建、江西等12省市地区3 发病猪PRRSV的阳性检出率为52.8%，流行毒株仍存在基因多样性，HP-PRRSV依然是优势流行毒株，且存在经典毒株变异的新毒株[44]。有研究显示，2014～2016年我国相继出现关于NADC30-Like毒株的报道，并且感染呈现逐年増高趋势[45]。此类毒株与北美NADC30株属于同一亚群，其NSP2基因缺失了131个氨基酸，与国内HP-PRRSV病毒株存在重组现象[46]。1.3.1传染源和传播途径感染PRRSV的发病猪和隐形感染猪为最主要的传染源，带毒猪也可以是传染源。研究发现，PRRSV主要感染机体的呼吸系统。在动物妊娠的中后期进行垂直传播，通过直接或间接接触动物的唾液、乳汁[47]、鼻腔分泌物、种公猪的精液[48-49]等这些含有大量的感染性病毒粒子的分泌物均能引起PRRS的发生。此外，猪场的生物安全措施、隐性感染猪的引进及售出均可导致PRRSV的感染[50]，其主要包括通过污染的器具、针线、气溶胶以及在运输过程中进行传播，昆虫也可以携带病毒进行传播。PRRSV感染的猪向外排毒具有周期性、间歇性特点，在猪群内反复循环，很难清除，且传播迅速。1.3.2易感动物PRRSV主要感染猪，不同性别、品种和年龄阶段的猪均易感，妊娠母猪和仔猪感染后临床表现尤为明显。研究发现，禽类也能传播感染PRRSV[51]。1.3.3流行特点目前我国PRRSV分离株主要有欧洲型PRRSV、经典北美PRRSVsubgroup1、经典北美PRRSVsubgroup2、originalHP-PRRSVsubgroup（HP1subgroup）、HP2subgroup（2010年）、JXA1-P80-likesubgroup（HP3subgroup）以及NADC30-likesubgroup７个分支，其中，HP1subgroup、HP3subgroup和NADC30-likesubgroup是目前国内主要流行的毒株。然而，一些毒株呈区域流行趋势的小的分支不包括在这7个分支之中。自2011年起，PRRSV基因重组、缺失和插入的发生较之前更为频繁，且影响了PRRSV的分化[52]。PRRS的潜伏期一般为14天，无明显的季节流行性，夏秋两季相对高发。1.4临床症状PRRS可致各种年龄的猪发病，根据临床症状为母猪发生繁殖障碍性疾病，不同年龄的猪以呼吸系统疾病为主要特征，PRRSV致使猪群产生免疫抑制，发病猪群容易继发感染由其他病毒或细菌引起的疾病，如传染性胸膜肺炎、附红细胞体病、链球菌病等[53-54]。1.4.1繁殖母猪和公猪母猪感染后临床表现为耳部、外阴、腹部、尾部等部位皮肤发绀，体温升高可至41℃，精4 神沉郁，呼吸困难，受胎率、分娩率均降低，发情期延长，出现早产、流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等症状，个别母猪会发生腹泻，分娩后阴道分泌物较多、胎衣不下，后期出现四肢瘫痪，症状持续较久，最终导致死亡。耐过母猪生长迟缓。患病公猪会出现性欲减退、精液质量降低、射精量减少和呼吸道等症状。1.4.2仔猪和育肥猪仔猪在2～28日龄容易发病，死亡率能高达85%。大多数仔猪发病后出现厌食、嗜睡、咳嗽、呼吸困难等症状，严重者体温将超过40℃，食欲不振、食欲废绝、肌肉震颤、共济失调等。少数病猪的皮下出现斑块，发生关节炎、败血症。患病仔猪耐过后生长缓慢，容易继发感染其他病原。育肥猪发病时出现腹泻、结膜炎、肺炎等症状。1.4.3高致病性PRSSV高致病性PRRS临床症状常以急性发病为主要特征，发病猪持续41℃以上高热，食欲不振，咳嗽，眼部结膜炎，耳部、口鼻部、四肢、腹部等皮肤发绀，四肢无力，运动障碍，便秘，有的发生腹泻，严重者出现抽搐等神经症状。母猪感染HP-PRRSV后,流产率达到30%以上，仔猪发病率高达100%。1.5病理变化1.5.1病理剖检变化1.5.1.1繁殖母猪和公猪繁殖母猪感染PRRSV后，主要引起子宫、输卵管的病理变化，妊娠前期、中期的病变较轻，子宫和输卵管发生轻微水肿，妊娠后期病变较为严重。肺部轻微水肿，局部呈暗红色并出现灰色病灶，组织出现充血、淤血、气肿、肉变、纤维素性渗出等间质性肺炎症状。偶尔发生轻度脑炎和心肌炎。公猪的病变不明显。1.5.1.2断奶仔猪剖检可见病猪耳部、腹部等多处皮肤发绀。肺脏组织在发病初期有弥漫性淤血，间质增宽，后期组织表面有出血点，局部发生气肿、肉变。淋巴结尤其是腹股沟淋巴结肿大、出血，心包、胸腔和腹腔内积液增多。肾脏表面颜色变浅，出现似针尖大小的出血点。1.5.1.3保育猪大体病变与上述类似，主要表现为间质性肺炎症状，多处淋巴结肿大，常与其他病原混合感染。1.5.1.4高致病性猪繁殖与呼吸综合征5 各器官组织出血广泛性出血，肺脏颜色变暗、出血、发生实质性变化。心肌有出血、坏死现象。肝脏周围有瘀血、肿大、变性坏死。淋巴结发生出血、坏死。脾脏边缘不整齐，表面有出血和坏死灶。1.5.2组织病理学变化1.5.2.1PRRSV感染的组织病理学变化单纯的PRRSV感染引起以间质性肺炎为特征的病理学变化，可见猪肺间隔增宽，有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，有的毛细血管内皮细胞发生肿大，肺泡巨噬细胞、纤维细胞增生，肺泡腔内存在细胞碎片，有时发生瘪缩、空虚[55]。气管上皮细胞发生肿胀、增生、脱落，细支气管周围有炎性细胞浸润灶。淋巴滤泡体积变大，淋巴细胞增生。PRRSV感染后期，发病猪心脏病变特征为组织间质和血管外周见淋巴细胞、巨噬细胞以及浆细胞浸润。脑组织内也发生血管套管现象，神经胶质细胞增生。1.5.2.2HP-PRRSV感染的组织病理学变化HP-PRRSV感染后，肺脏的肺泡壁巨噬细胞、纤维细胞增生，支气管和细支气管周围有淋巴小结样增生，血管中形成透明血栓，呈典型的间质性肺炎症状。扁桃体中出现大量脱落的嗜中性粒细胞，淋巴细胞数量减少。脾小体的淋巴细胞坏死，红髓发生充血、出血。淋巴结出现水肿和出血，淋巴细胞坏死，巨噬细胞显著增多。脑组织出现小胶质细胞坏死和“血管套”现象等。肝脏、肾脏、心脏和消化系统发生颗粒变性、出血和淋巴细胞浸润。血管内皮细胞肿胀，周围浸润的淋巴细胞形成“袖套”，静脉内形成血栓。母猪的特征性病理变化主要发生在子宫、输卵管、肺脏及淋巴结[56]。在妊娠前期和中期，子宫黏膜水肿，嗜酸性粒细胞轻微浸润；妊娠后期，子宫黏膜上皮坏死脱落、充血、炎性细胞浸润，动脉发生炎症，血管周围出现程度不同的“袖套现象”，输卵管发生不同程度的水肿。1.5.3致病机理生物进化过程中，固有免疫是动物机体抵御外界的第一道防线。然而，PRRSV能够通过多种机制抵御机体的抗病毒免疫应答，具体表现为TLRs和细胞因子的表达调控、抑制NK细胞的活性、干扰ISGs的功能。目前，PRRSV适应性免疫应答的研究主要集中于中和抗体和细胞介导的免疫反应两方面。PRRSV感染后，机体产生的中和抗体水平下降，细胞介导的免疫应答主要特征为CD4+细胞增殖、发生迟发型变态反应，引起T淋巴细胞亚群发生变化[13]。目前，PRRSV的致病机制尚不明确。一般认为，PRRSV主要侵害猪体内的猪肺泡巨噬细胞（PAM），PAM上PRRSV的受体包括CD163[57]、唾液酸黏附素（Sialoadhesin，Sn）[58]、波形蛋白（Vimentin）、硫酸乙酰肝素（Heparinsulfate，HS）[59]、非肌肉肌动蛋白ⅡＡ（NonmusclemyosinAⅡ，NMHCII-A）[60]和Toll样受体（Toll-likereceptors，TLRs）[61]等，病毒与受体结合进入细胞内进行大量繁殖，PAMs细胞崩解后释放的病毒通过血液循环和淋巴循环系统被运送至富含巨噬细胞的免疫器官内，损伤巨噬细胞，改变T细胞亚群及体内细胞因子量，B细胞功能降6 低或升高，对机体造成免疫抑制，从而容易引发病毒血症和病原菌的继发感染。PRRSV能穿过胎盘进而感染仔猪，致使脐带发生病变，组织学观察可见坏死性的脐带动脉炎[20]。前文提到，实验室主要通过MARC-145细胞对PRRSV致病机理进行研究。经蛋白质组学分析发现，病毒感染的宿主细胞蛋白表达量发生变化，引起各种免疫防卫反应[62]。研究证明，MARC-145细胞在不同周期针对PRRSV细胞受体存在差异表达。在G0/Gl期内，CD163受体表达水平最高；在G2/M期（G2至有丝分裂转变期）内，NMHCII-A的表达量最高，同步化于此时期的细胞最容易感染PRRSV[63]。随着PRRSV感染时间的延长，MARC-145细胞凋亡数不断增加，有研究表明，细胞周期有效地停滞在G2/M期是由于PRRSVGP5Δ97-119的稳定表达，MARC-145细胞生长受到抑制[64]；还可能与病毒诱导的DNA损伤监测ATM和ATR激活、检测DNA损伤、触发下游信号级联有关[65]。1.6诊断猪繁殖与呼吸综合征不能仅凭借临床症状确诊，还需借助于血清学、分子生物学等多种技术。在PRRS诊断过程中，一方面可以利用血清学试验，如血清中和试验（SN）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接荧光抗体试验（IFA）、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、乳胶凝集试验（LAT）以及胶体金抗体检测技术等，另一方面可以进行病毒分离，此外借助于RT-PCR、FQ-PCR、NASBA、ISH、LAMP、基因芯片检测技术等多种方法，达到确诊的目的[66-67]。1.6.1诊断要点对于PRRS进行准确诊断，一般需要根据流行病学、临床症状和病变并结合血清学检测、分子生物学检测等实验室检测方法进行确诊。临床上针对PRRSV感染病例的初步诊断主要从以下方面入手：第一，临床上PRRSV一般只感染猪，且各年龄猪均易感，通过水平和垂直方式进行传播和扩散，分为急性、慢性和隐性感染。第二，感染PRRSV的猪主要表现：妊娠母猪厌食，体温可升高至40～41℃，妊娠后期出现早产、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍性疾病；各种年龄段猪发生呼吸系统疾病，仔猪症状较明显，表现出严重的呼吸困难、流涕、呕吐、腹泻和多发性关节炎，断奶前仔猪的死亡率高达50～60%；易出现继发感染。第三，病理学检测见患病猪肺组织淤血肉变、淋巴结肿大出血；肺间隔增宽、肺泡II型细胞增生，大量炎性细胞浸润，内充满坏死性渗出物；淋巴结滤泡体积增大，淋巴细胞增生；胎盘与子宫剥离，上皮细胞坏死脱落；血管内有炎症反应；多处组织发生水肿充血。第四，引发猪发生相似临床症状的病原体有很多，大多数为混合感染，不同养殖场感染PRRSV的临床症状存在很大差别，所以必须依赖于更为精确的实验室检测方法进一步确诊。7 1.6.2实验室诊断1.6.2.1病毒的分离鉴定采集疑似病毒感染猪的肺、淋巴结等组织进行病毒的分离[68]，按照基本操作方法研磨病料组织，反复冻融，进行无菌处理后接种于单层易感细胞中进行孵育，在接种后3d观察CPE变化。盲传三代后收集细胞病毒液，进行RT-PCR检测；另外，电镜下观察病毒粒子形态特征[69]，从而进一步鉴定所分离的病毒。PRRSV属于动脉炎病毒属的成员，直径大小为50nm左右，形状为球形或椭圆形[20]，囊膜外有脂质双层膜，表面有明显的纤突。1.6.2.2逆转录聚合酶链式扩增技术（RT-PCR）RT-PCR技术是应用于RNA病毒的检测和鉴定的新型分子生物学技术，该方法操作简便、快捷、特异性高，无论是急性感染或持续感染均能直接从样品中检测到病毒RNA，病毒核酸在感染24小时后可以被检测到，且适用于难以进行病毒分离的组织。我国针对美洲型PRRSV的ORF6、ORF7基因，设计出跨保守序列的套式引物，研制出了套式RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒较常规RT-PCR方法的敏感性高100倍，但是所需时间长且易被污染出现假阳性[73]。目前商品化的PRRSV检测试剂盒可以在一次RT-PCR中同时完成病毒的检测和分型。荧光RT-PCR检测法的灵敏度更高，应用较广泛[70]。一步法TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法的建立可以成功检测到含量较低的模板RNA，灵敏度比常规RT-PCR方法高10倍，重复性较好[71]。利用长度较短的TaqMan-MGB荧光探针，目的基因更易被找到，由于此探针本身不会产生荧光，从而降低了PCR反应中前15个循环荧光信号的强度，在识别错配碱基与信噪比等方面占优势，该探针所建立的荧光定量RT-PCR方法可检测到下限1ECID50的病毒[72]。为进一步改善PRRSV荧光RT-PCR检测方法，研究者根据国内主要流行毒株全基因序列，将探针经筛选、优化后进行引物设计，成功建立了一种新的PRRSV通用型荧光定量RT-PCR检测方法[73]。1.6.2.3环介导恒温扩增技术（LAMP）环介导恒温扩增技术（Loop-Mediatedisothermalamplification，LAMP）是利用特异性的引物和酶，在恒温反应条件下对模板进行扩增的快速诊断技术。该技术不需要昂贵的设备，普通水浴锅即可完成，具有灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单等特点，被广泛应用于疾病的诊断、动物或食品中的病原微生物的检测[74-75]等。RNA病毒的快速检测，则需要在原反应液中加入适量逆转录酶和BstDNA聚合酶，即逆转录环介导恒温核酸扩增技术（RT-LAMP）。研究者已经针对美洲型PRRSV[76]和PRRSV的ORF5基因保守区[77]分别建立了RT-LAMP方法，可以现场对疾病进行诊断。但是，LAMP对环境要求较高，极易被污染，从而影响结果的判定。1.6.2.4血清学检测技术血清学技术在疾病的诊断中应用非常广泛。目前PRRSV血清学检测方法有中和试验（SN)、免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光技术（IFA)等。⑴中和试验（SN）中和试验的特异性虽好，但在PRRSV感染早期无法检测到患病猪体内的中和抗体，故不适用于疾病的急性诊断。研究发现，在中和试验的基础上添加补体成分、改变反应条件，能提高实8 验的敏感性，结果显示在感染后9~11d就可检测到滴度较高的SN抗体[78]。SN需要培养大量细胞，操作较繁琐，对操作人员的技术要求较高，故目前大多局限于实验室研究。⑵免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidasemono-layerassay，IPMA）是最早检测PRRSV抗体的血清学诊断方法，具有敏感性较好，特异性较强的特点。该方法主要利用PAM、CL-2621、CRL-2843-CD163等细胞来培养病毒，将检测血清直接添加至细胞中，用辣根过氧化物酶（HRP）来标记二抗，底物AEC显色，生成红色沉淀产物，最后肉眼直接观察结果[79]。血清中PRRSV抗体在感染后6d可被检测，4~6周抗体含量最多，且能持续6~12个月，具有较高的特异性。研究者针对PRRSV抗体成功建立了一种IPMA检测试剂盒，其具有较高的特异性和敏感性[80]，但因耗时、昂贵等缺点，未被广泛使用。⑶酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附法（ELISA）是利用抗原与抗体可发生特异性结合的特点，将抗原或抗体吸附于固相载体上进行免疫酶反应，最终通过肉眼或酶标仪判定结果。该方法特异性较好，敏感性较IPMA法强，被广泛用于病毒抗体的检测。常用的方法有间接ELISA法、阻断ELISA法、Dot-ELISA法和双抗夹心ELISA法等。美国IDEXX公司和和韩国安捷公司研制的PRRSV抗体间接ELISA检测试剂盒，是将PRRSV重组后的N蛋白作为包被抗原，可以检测病毒感染初期机体的抗体水平。由于N蛋白不能诱导产生中和抗体，无法反应机体的免疫状态，不适用于检测疫苗免疫的效果，具有一定的局限性，成本高，未能得到广泛应用。而法国海博莱-LSI研制的试剂盒主要利用PRRSV重组囊膜蛋白（M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5）包被抗原，既能检测夜野毒感染的情况，又能弥补N蛋白作为抗原试剂盒的缺陷，能够很好地评价感染猪群的抗体水平，且抗原用量少，成本相对较低，可用于规模性检测。研究人员还成功建立了一种针对PRRSV抗体的NSP7-ELISA检测方法，可以区分PRRSV感染抗体及灭活疫苗免疫抗体，特异性和敏感性较好[81]。阻断ELISA是在间接ELISA的基础上，将抗原置于固相载体上，按顺序依次加入待检血清、单抗、酶标抗体和底物，从而检测抗体，又称为竞争ELISA。血清中的抗体与抗原特异性结合后，引起单抗与抗原结合量减少，OD值降低。通过计算阻断率（PI）来判定结果。研究者建立了一种间接竞争ELISA方法，包被抗原是原核表达的PRRSV-N蛋白，3h内即可完成检测，具有特异性强、稳定性和重复性好的特点[82]。有研究将HP-PRRSVNsp2蛋白缺失的30个氨基酸合成多肽，制备出缺失Nsp2的单抗1E9，并利用该单克隆抗体研制出液相阻断ELISA试剂盒，用于快速检测和区分PRRSV感染和HP-PRRSV感染，同时还成功研制出一种免疫胶体金诊断试纸条[83]。间接ELISA的酶标抗体为二抗，可与待测抗体结合；阻断ELISA一抗为酶标抗体，可与抗原相结合，而且放大了测定结果，易于判断，在PRRS的诊断中同时进行定性和定量分析。⑷免疫荧光试验（IFA）免疫荧光技术是将免疫学方法与荧光标记技术相结合的一种方法。在保证活性不受影响的前提下，用荧光色素标记于抗体或抗原上，经特异反应后，在荧光显微镜下即可检出荧光，从而可对抗原或抗体进行细胞定位。PRRSV感染7d后可检出相应的抗体，由于需培养细胞、倒置荧光显微镜，结果也需要肉眼观察，故不适于临床大规模应用，推广上有一定难度[84]。1.6.2.5免疫胶体金层析技术9 此技术是将层析分析技术、胶体金标记技术、免疫学反应相结合，以纤维层析材料为固相，样品通过毛细作用，与材料上相应的抗原或抗体发生免疫反应，反应物与结合后的复合物在液-固界面被分离开来，目测胶体金标记物以判定试验结果。影响该技术的因素包括微孔滤膜的选择和处理、受体包被量的选择和固定、抗体的纯化、标记物的制备等。具有检测速度快、特异性强、灵敏度高、无有害物质、成本低、操作简单等优点，在猪病的诊断中得到广泛应用[85-86]。1.6.2.6核酸探针原位杂交技术在一定的条件下，有一定同源性的两条核酸单链通过碱基互补配对成为双链的过程被称为核酸原位杂交技术。根据检测物的不同，可分为细胞内和组织切片内原位杂交，包括固定、预杂交、杂交、冲洗和显示五个过程，具有高度特异性。研究者针对PRRSVN蛋白基因的cDNA制备成特异性探针，通过原位杂交（ISH）法检测出石蜡切片中的病毒，该技术快速、灵敏，在病毒感染的早期和晚期均能检测，可用于临床诊断和抗原定位[87]。1.6.2.7基因芯片技术与核酸印迹杂交技术相同，基因芯片技术将已知的基因序列与相应的互补序列进行杂交，结果程序不同强度、不同分布特点的杂交信号，通过这些杂交信号完成对待检样品的定性和定量分析，从而获得遗传信息。该技术能够同时完成大批量样品的序列的检测，有高度特异性，使用的探针是已知固定的，故又被认为是反向杂交。1.6.2.8单克隆抗体技术单克隆抗体（MonoclonalAntibody，mAb）被应用于基因重组疫苗的研制、病原的诊断、疾病的防治、机体抗感染机制和发病机制的研究。研究者们针对不同的PRRSV毒株和不同的蛋白（包括GP3、GP4、GP5、M蛋白、N蛋白）研制成功多种PRRSV单克隆技术，这种技术既可以区分PRRSV的基因型，又可用于病毒的分型[88]。1.6.3鉴别诊断1.6.3.1猪支原体肺炎猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体引起的一种慢性、接触性及消耗性呼吸道传染病，又称为地方流行性肺炎或猪气喘病。肺炎支原体呈革兰氏阴性，无细胞壁，主要感染猪的呼吸道、肺脏和淋巴结中，患病猪和带菌猪是主要传染源，可通过呼吸道、接触和空气进行传播。临床发病猪主要表现为精神不振，气喘、消瘦、腹式呼吸明显，剖检可见肺脏肉变，严重者出现肺水肿和肺气肿。该病对机体具有一定的免疫抑制作用，可导致患病猪饲料利用率降低，生长速度缓慢。1.6.3.2猪传染性胸膜肺炎猪传染性胸膜肺炎(Porciecontagiouspleuropneum，PCP)是一种高度传染性疾病，病原是胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoiae，APP），以呼吸道症状为主要特征，各年龄段的猪均易感染，可通过空气、污染的排泄物等进行传播，有较高的发病率和病死率，在世界各地的养猪场造成了损失。急性PCP临床表现为突然发病，个别发生突然死亡，体温可达41.5℃，厌食、腹泻、呕吐、皮肤发绀、呼吸困难、呈犬坐式等症状，亚急性和慢性PCP病程较长，病猪轻微发热，出现不同程度的咳嗽，食欲减退，嗜睡不喜运动。慢性期的猪群症状不明显，一般能10 自行恢复。病理剖检可见患病猪肺脏呈典型的出血性纤维素性胸膜肺炎症状，间质增宽，严重肉变；气管和支气管内有血性粘性渗出物，肺门淋巴结肿大；病程较长时出血肺脏和胸膜粘连、心包炎等症状。猪传染性胸膜肺炎常与感染猪的其他常见疾病混合发生，如猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、猪瘟、猪圆环病等，控制该病的关键在于重视免疫预防工作。1.6.3.3猪流感猪流感（Swineinfluenza）的病原是猪流感病毒（Swineinfluenzavirus，SIV），是一种急性呼吸道传染病，不同日龄、性别和品种的猪均易感染，阻碍猪群的生长发育，降低肉料比。猪是流感病毒的中间宿主，能同时感染来源于人类、禽类和猪流感病毒，得以实现病毒的重排[89]。目前，最常见的血清型为H1N1和H3N2亚型，当发生病原混合感染时病程缩短，死亡率和复发率升高。由于猪流感病原复杂，致病因子与猪群的生活环境相关，对养猪业造成极大危害。1.6.3.4猪伪狂犬病猪伪狂犬病（PorcinePseudorabies，PPR）主要以出现神经症状为主，同时可导致猪群发生呼吸道和繁殖系统疾病，临床表现出现不同症状，是由伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的急性传染病。猪是PRV的天然宿主和主要传染源，易感动物还有多数家畜和野生动物。PRV能引起怀孕母猪出现流产、产死胎、木乃伊胎等症状，又能感染仔猪，主要表现为突然发病，体温升高至41℃，精神萎靡、运动功能障碍、呕吐、腹泻等，有极高的发病率，死亡率可高达100%[90]。育肥猪感染PRV后生长迟缓，并伴有呼吸系统疾病，多呈隐性感染，临床表现为发热、咳嗽、呕吐等症状，但多数可以康复。种公猪临床表现为睾丸肿胀或萎缩，精子活性降低甚至丧失。病理剖检可见患病猪的扁桃体、肺脏、脾脏、肝脏等多处出现坏死，脑膜严重充血。组织病理学观察主要表现为典型的非化脓性脑炎，在神经细胞和淋巴细胞内有包涵体，并且出现“血管套”现象。目前，猪伪狂犬病已经遍布世界多个国家，该病没有明显的季节性，抗生素治疗无效，造成了严重的危害。1.6.3.5猪细小病毒病猪细小病毒病（porcineparvovirusinfection，PPI）又称猪繁殖障碍病，临床上主要以母猪发生繁殖系统疾病为特征。病毒感染后常导致母猪流产、产死胎、木乃伊胎和弱仔等。猪细小病毒能通过胎盘垂直传播，所产仔猪的排毒时间较长，感染的种公猪亦可通过精液传染给易感母猪，致使疾病进一步扩散。临床剖检可见胎儿充血、出血、水肿、脱水以及坏死等病理变化。猪细小病毒对外界抵抗力强，预防本病的最有效途径是加强引种管理、疫苗免疫，暂无无特效治疗方法。1.6.3.6猪流行性乙型脑炎猪乙型脑炎（Japaneseencephalitis，JE）具有明显的季节性，故又被称为流行性乙型脑炎，是一种典型的人畜共患病。该病的病原是乙型脑炎病毒（Japanaseencephalitisvirus，JEV），主要损害机体的中枢神经系统，发病率和死亡率均较高，夏季蚊虫叮咬导致疾病高发。患猪主要表现为高热、精神不振、食欲减退等症状，部分病猪后肢关节肿大、跛行、麻痹，母猪患病后出现繁殖障碍，流产的胎儿脑组织发生水肿，皮下有血样浸润，公猪大多出现严重的睾丸炎。病理变化集中于脑、脊髓、睾丸和子宫等组织。抗生素对该病的治疗无明显效果，目前该病已经扩散至多个国家和地区。1.6.3.7猪布鲁菌病11 猪布鲁菌病（BrucellaSuisdisease）是重要的人畜共患传染病之一，又被称为传染性流产。该病典型的临床特征为母猪发生不孕或流产，公猪有睾丸炎和副睾炎。患病母猪的子宫、阴道分泌物、胎衣和胎儿中均可检测到大量病原体，其他组织器官病毒含量相对较少。各年龄阶段的猪均可感染PRRSV，性成熟的猪只尤为易感，其他家畜中牛、羊也容易感染。人类通过接触患病畜、带毒动物，或者患病畜的肉、乳等动物制品可感染病毒。因此，该病的防治对于公共卫生学意义重大。1.6.3.8猪弓形虫病刚地弓形虫能够引起猪群发生猪弓形虫病（Toxoplasmosis），又称弓形体病、弓浆虫病，由于宿主种类繁多，人和动物的感染率都很高，也是一种重要的人畜共患性原虫病，猫科动物为终末宿主。猪群暴发弓形虫病多在夏季高温高湿的季节，主要以不同程度的神经症状和繁殖障碍为临床特征，死亡率达60%以上。严重的患病猪临床表现体温升高、咳嗽、呼吸困难、食欲废绝、喜饮水、便秘、腹泻、呈犬坐式，怀孕母猪还出现流产、产死胎或弱胎。临床剖检可见病死猪肺脏和脾脏肿大、出血、局部坏死，多处淋巴结肿大、呈灰白色，肝脏肿大硬化，肾脏出现灰白色坏死灶和零星的出血点。猪弓形虫病在我国的分布范围较广。1.7防治目前，我国PRRSV的流行和变异非常复杂，疾病尚未得到有效预防和控制。消除传染源、阻断病毒的传播途径是最根本、最有效的生物防控措施。从健康猪场引种，加强检疫工作，严格做到全进全出；对猪舍、设施用具进行定期全面消毒；合理选择建厂地址；将猪的排泄物以及饲养垃圾及时进行无害化处理；猪舍注意通风、卫生、减少应激因素；及时处理患病猪只，被感染猪舍应全面严格消毒；为避免公猪受到感染可进行人工授精；疫情发生后及早确诊、扑杀、无害化处理病死猪及带毒的排泄物、死胎、胎衣等。此外，慎重选用疫苗接种，依然是防制PRRS的重中之重。PRRS的疫苗有弱毒疫苗、减毒灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗等。传统弱毒苗的免疫剂量小，在临床上获得广泛应用，但存在毒力返强的风险。灭活疫苗的安全性高，能够改善各项生产指标，但也存在缺陷。研究证明，动物注射PRRSV弱毒疫苗后能产生较高水平的抗体，相比灭活疫苗抗体能维持较长时间，免疫效果良好[91]。有研究通过确定在微载体上的培养条件，实现了Marc-145细胞从BC-7L型到BC-14L型不同反应器之间的二级放大，从而PRRSV可以在生物反应器内进行增殖，改进后的新型工艺在PRRSV疫苗大规模生产中占绝对优势[92]。近年来，PRRSV的基因疫苗、亚单位疫苗以及活载体疫苗等已成为主要研究方向。亚单位疫苗可针对病毒的结构蛋白（如GP3蛋白、GP5蛋白、M蛋白等）刺激机体产生特异性中和抗体；DNA疫苗通过表达PRRSV结构蛋白的重组质粒，诱导机体特异性免疫反应的发生；活载体疫苗能同时诱导细胞免疫与体液免疫。研究者已经成功构建了一种利用CMV启动子的HP-PRRSV反向遗传操作系统。首先制备CMV启动子和HP-PRRSV毒株的重组质粒，然后将其转染至MARC-145细胞，最终获得一种拯救病毒，该病毒与亲本病毒在MARC-145细胞中的复制特性相似，并且含有特殊的分子标记，为HP-PRRS的防控奠定了基础[93]。研究表明，新合成的水溶性12 TLR7激动剂SZU101能够抑制PRRSV感染PAM细胞，发挥具有良好的抗肿瘤作用[61]。利用基因反向遗传操作技术开发新型佐剂、免疫调节剂、构建重组病毒，是研究PRRS疫苗的研方向之一。近年来，随着临床上西药耐药性越来越严重，中药制剂的抗病毒作用越来越被人们所重视。中药的抗病毒途径分为两种：一种是通过直接抑制病毒活性而干扰病毒的繁殖过程；第二种途径是通过增强机体免疫调节而产生间接抗病毒作用。中医的用药方式主要是复方为主，这也是中药与西药可区分开来的的主要特点。中医传统观点认为，复方用药有君、臣、佐、使之分，而药物与药物之间又会产生相须、相使、相乘、相恶等相互作用，这几种作用相互催化相互制约，发挥着扶正法邪，治病防病之功效。也正因为如此，中药复方是通过多种活性成分、多靶点、多环节（途径）调控机体的整体动态平衡，形成协同效应，并不是简单的单味药活性成分所起作用的叠加。1.8本文研究思路及目标综上所述，PRRSV的高度变异性使猪繁殖与呼吸综合征成为了国内外养猪业有待解决的重要疫病之一，猪群一旦感染PRRSV后，将引起猪群生产性能降低甚至死亡，其隐性感染的危害也不容小觑。目前，控制PRRS流行应以预防为主，实时监测猪群PRRSV的感染情况。本研究拟采用病理学技术，对河北省养殖场送检病猪进行系统诊断，针对部分N基因序列遗传进化分析比较，进而了解PRRSV的变异规律。同时本研究还将对河北省某猪场的PRRS患病母猪和仔猪进行复方中药治疗试验，通过给药效果分析，为猪场PRRS疾病治疗提供依据。13 2材料与方法2.1材料2.1.1病料来源病猪来自于河北省藁城市、沧州市、晋州市、邢台市养殖场。2.1.2主要试剂实验室配制试剂如下：PBS缓冲液（pH7.4）：1000ml蒸馏水加NaCl8.5g、Na2HPO42.8g、NaH2PO40.4g，4℃保存备用。无菌双抗生理盐水：链霉素和青霉素按照1：1比例混合均匀，过滤除菌并分装，于-20℃保存备用。10%甲醛溶液：100mL甲醛与900mL蒸馏水混合，室温下保存备用。无水乙醇、二甲苯均为国产分析纯试剂。苏木素、伊红等染色液购自江西江蓝纯生物试剂有限公司；DL2000Marker、6×LoadingBuffer试剂均购自大连宝生物公司；抗PRRS病毒N蛋白单克隆抗体为山东绿都生物科技有限公司产品。SABC-AP（小鼠IgG）试剂盒、粘片剂APES、复合消化液均为武汉博士德生物工程有限公司产品。PRRSV通用型RT-PCR检测试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司产品。1×TAE电泳缓冲液由本实验室自行配置。胶回收试剂盒为大连Takara公司产品，pMD-18T为大连TaKaRa公司产品。质粒DNA提取试剂盒为Biomiga公司产品。2.1.3实验仪器医用手术器械购自上海医疗器械（集团）有限公司Veriri96WellThermalCycler购自赛默飞世尔（中国）有限公司DYY-6C电泳仪购自北京市六一仪器厂蓝光透射台购自北京赛智创业科技有限公司电子分析天平SQP购自赛多利斯仪器（北京）有限公司生物显微镜BX53DP73购自日本OLYMPUS公司组织切片机ERM4000购自澳大利亚Heotion公司KD-T组织摊烤片机购自浙江省金华市科迪仪器设备有限公司YD-6L全自动生物组织冷冻包埋机购自浙江省金华市科迪仪器设备有限公司D1008掌上离心机购自大龙兴创实验仪器（北京）有限公司立式超低温保存箱DW-86L388A购自中国海尔集团高通量组织研磨器SCINENTZ-48购自宁波新芝生物科技有限公司14 2.2方法2.2.1疑似病例发病情况本研究包括河北省4起疑似病例。2017年1月，藁城市某养殖场送检患病猪为70～80日龄，该场母猪存栏量为50多头，保育猪共500多头，先后有9头死亡；2017年4月沧州市某猪场送检母猪3月龄，该场共200多头仔猪；2017年9月晋州市某猪场送检保育猪，该场存栏量为300头左右；2017年10月邢台市某猪场送检40～45日龄仔猪。分别向畜主了解患病猪所在猪场的发病时间、发病数量、患畜年龄、发病临床症状、有无病史、疫苗接种情况和养殖场饲养情况，以及该地区的疫病情况。对送检病猪进行临床观察，精神状态、体态、被毛、呼吸状况，并观察其体表是否有出血点、体温是否正常、可视黏膜是否正常等。检查送检猪体表温度和直肠温度，触诊检查其浅表淋巴结和其它组织器官的性状，有无肿大等变化。同时，应了解猪场的疫苗免疫情况，对患畜做出初步的诊断。2.2.2病理学诊断2.2.2.1剖检病变观察⑴皮下检查将病猪置于剖检台，切断四肢肌肉，使其平躺，由下颌部沿腹部正中线将皮肤切至会阴部，注意绕开乳房及生殖器官。剥皮的过程，要检查皮下组织是否有出血点，体表淋巴结是否有出血、肿大等变化，脂肪组织、结缔组织、肌肉组织、等是否存在病变。⑵腹腔检查分别沿肋弓、髂骨体将腹壁切开至剑状软骨处和耻骨前缘，打开腹腔，检查腹腔是否有脓肿、粘连；腹腔液的性状和量；脾脏的大小、颜色、厚度、边缘是否整齐；肝脏、肾脏、膀胱等是否有肿大、出血、淤血、坏死等；各淋巴结是否有肿大、出血等；胃肠黏膜、肠管及胃肠内容物的变化。⑶胸腔检查将两侧肋软骨沿胸骨剪断，再将肋骨与椎骨、胸骨联结处锯断，去除胸骨后，打开胸腔，检查胸腔积液的性状；胸膜的颜色、是否有粘连；心脏积液的性状，心包膜、心肌、心内膜是否有增厚、出血点等；肺组织的大小、颜色，表面是否有出血、淤血、坏死灶、气肿等的病变。⑷头部检查用骨锯和骨钳将猪的头骨打开，检查脑积液的性状，脑膜、脑组织是否有出血点。⑸四肢检查观察病死猪四肢皮肤是否出现发绀现象，关节是否有肿大，将皮肤环切，注意关节腔内是否存在积液。15 2.2.2.2组织病变观察⑴病料的取材和保存无菌采集淋巴结、肺脏病变组织与健康组织交界处，每样组织各取两份，其中一份组织用于石蜡组织切片的制作；另一份标记组织样品名称、日期、来源等信息后，-20℃保存备用。⑵石蜡切片的制作石蜡切片技术是组织病理学最基本的技术[94]。其操作步骤主要包括：组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封固。①固定将所采组织切成小块置于10%甲醛溶液中固定，一般组织块固定时间应不少于24h。流水冲洗，以去除组织内的甲醛，冲洗时间一般过夜或24h以上。②脱水由于水和石蜡无法混合，在组织浸蜡前需要将水分脱去，实验室常用的脱水剂为乙醇。用不同浓度的乙醇溶液，可逐步脱去组织内的水分。脱水时间如表1所示。③透明目前应用最广的透明剂是二甲苯，其目的是为了增加组织硬度。二甲苯容易使组织脆化，故应根据组织的种类、大小严格掌握透明时间，待组织完全透明立即终止。透明时间如表1所示。④浸蜡石蜡是切片技术中应用最广的包埋剂。根据环境选择不同熔点的石蜡：室温时，选用熔点52℃～54℃左右的石蜡。冬季石蜡熔点以47℃左右为宜。夏季可以用57℃或更高熔点的石蜡。特别注意，新蜡应反复熔炼后使用。表1组织脱水、透明、浸蜡的时间Table1Timeofdehydration,transparencyandwaxingoftissues步骤溶剂温度时间170%乙醇室温或4℃2～4h或过夜280%乙醇室温或4℃2～4h390%乙醇室温或4℃2～3h495%乙醇（A）室温或4℃1～2h595%乙醇（B）室温或4℃1～2h6无水乙醇（A）室温或4℃1h7无水乙醇（B）室温或4℃1h8无水乙醇—二甲苯（1:1）室温或4℃1h9二甲苯（A）室温或4℃20～40min10二甲苯（B）室温或4℃视组织块大小而定11二甲苯石蜡（1:1）60℃15min～30min12二甲苯石蜡（1:2）60℃15min～30min13石蜡I60℃15min～30min14石蜡II60℃15min～30min⑤包埋将上述已浸透石蜡的组织制作成蜡块，具体步骤如下：提前将包埋框、眼科镊等所需器械放入熔蜡箱内，加热待用。首先，将熔化的石蜡缓慢注入包埋器，用镊子将已渗透石蜡的组织块取出，切面向下，平置放入包埋器中。作好标记后，室温下待石蜡凝固。最后，取出凝固的蜡块，按照组织大小切除多余的蜡修整包埋块。16 ⑥切片将修整好的组织包埋块固定于切片机上，调整刀片角度、切片厚度进行连续切片，厚度为5µm，用毛笔将蜡片摊于摊片机水面上，待其自然展开后捞片，烘干。⑦染色实验室常用的染色方法为苏木素-伊红染色法（hematoxylin-eosinstaining，HE）。具体步骤如下：脱蜡复水：将切片依次放入二甲苯I、二甲苯II各10min，1:1二甲苯无水乙醇混合液、无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各2min。按照如下程序进行染色：蒸馏水（2min）、苏木素染液（5～15min）、自来水洗（2min）、0.5%～1%盐酸酒精液中分化（5s）、蒸馏水洗（2min）、1%氨水返蓝（30s）、蒸馏水（2min）、伊红染液中（5min）、自来水冲洗（2min）。⑧封固切片经上述操作后，用中性树胶将切片永久封固，进行镜下观察。2.2.2.3免疫组织化学检测PRRSV抗原免疫组化（Immunocytochemistry，IHC）通常以组织切片为载体，通过抗原抗体反应使标记抗体的显色剂显色，从而定位病毒所处的组织细胞位点，了解病毒在目标体内的分布规律[95]。SABC（StreptAvidin—BiotinComplex）是一种由过氧化物酶和链霉亲和素构成的复合物，具有高敏感性、操作简便等特点。本研究采用SABC-AP（小鼠IgG）试剂盒检测PRRSV在机体内的感染情况、病变情况和分布规律。取上述中包埋好的组织蜡块，载玻片提前经APES处理，然后进行切片、捞片、烘片、常规脱蜡。将30%H2O2和蒸馏水按1：10比例混合，室温下作用5～10min，再用蒸馏水洗3次。然后，加复合消化液，反应5～10min后蒸馏水洗3次；加5%BSA封闭液，室温作用20min，甩掉剩余液体。接着，加入稀释度为11∶00的一抗（小鼠IgG），4℃过夜；取出后用PBS洗3次，每次2min。随后，加入二抗山羊抗小鼠IgG，37℃孵育20min，PBS冲洗3次，每次2min；加入SABC-AP，37℃作用20min，PBS洗涤4次，每次5min。最后，将BCIP/NBT显色剂用TBS按照一定比例（1：20）稀释，混匀，37℃显色30min，蒸馏水洗涤。苏木素复染3min后进行水洗，待干燥后用中性树胶封固，在电子显微镜下观察结果。2.2.3病原学检测2.2.3.1组织样品处理取2.2.2.1冻存的肺脏、淋巴结等组织，反复冻融3次，随后称取3g样品于4mL高压灭菌过的离心管内，加入1mL无菌的双抗生理盐水，放入两颗高压后的大小适当的钢珠，置于组织研磨仪中，6000HZ研磨1min，然后将组织匀浆转移至新的4mL离心管内，5000r/min离心10min，取100μL上清液于1.5mL洁净无菌的离心管中。2.2.3.2病毒RNA的提取按照PRRSV通用型RT-PCR试剂盒说明书提前病毒RNA。取2.2.3.1样品、阴性对照样品、阳性对照样品，分别加入600μL裂解液，颠倒混匀，室温静置4min左右。将混合液移入吸附柱中，13000rpm/min30s，离心后弃去收集管内液体，分别加入600μL洗液，进行离心13000rpm/min30s，重复操作一次。然后，弃掉收集管内的液体，13000rpm/min2min，空离后可除去残留的17 液体。最后将吸附柱移至新的1.5mL离心管内，并向柱中央小心加入30μL洗脱液，室温静置1min，13000rpm/min30s，离心后管内液体即为模板RNA。2.2.3.3RT-PCR扩增按照RT-PCR试剂盒说明书，建立总体积为20μL的反应体系，在PCR反应管分别加入RT-PCR反应液16.8μL、模板RNA2μL、酶混合液1.2μL。PCR仪内反应程序为：42℃45min，953℃min；9430℃s，55℃30s，7230℃s，循环35次后，再经727℃min延伸，置4℃保存。2.2.3.4琼脂糖凝胶电泳PCR反应结束后，进行电泳鉴定：用电子天平称取0.45g琼脂糖于一洁净的锥形瓶中，加入1×TAE电泳缓冲液30mL，配制成1.5%的琼脂糖凝胶，在微波炉内加热2min至琼脂糖全部溶解，待冷却至约60℃，加入1µL核酸染色液，迅速摇匀，缓慢倒入胶槽内，待完全凝固后垂直拔出梳子，将平板凝胶置于提前加入适量1×TAE缓冲液的电泳槽中。取5µLPCR产物与1µL6×LoadingBuffer均匀混合，将PCR产物混合液、DL2000Marker、阳性对照、阴性对照分别缓慢加入凝胶孔中，盖上电泳槽，电压120V，电泳20min。电泳结束后，在凝胶成像仪下观察结果扫描图像，判定结果（目的片段大小为436bp）。2.2.4猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的遗传进化分析2.2.4.1RT-PCR产物的凝胶回收处理取2.2.3.3中的RT-PCR产物，按照胶回收试剂盒的说明书，将目的片段（大小为436bp）回收处理。具体操作如下：⑴在紫外灯下，快速地切下上章中电泳后的凝胶目的片段，吸干表面液体，分别置于高压灭菌的1.5mL离心管中，利用电子天平进行称重，所得重量近似于凝胶的体积。⑵向上述离心管中分别加入等体积的BindingBuffer（XP2），颠倒混匀，置于65℃水浴锅中加热8min左右至凝胶完全融化。此混合液为浅黄色时视为正常，注意调节pH值。⑶取一个装有HiBindDNAMini柱子的2mL收集管，将上述步骤中的混合液全部移至柱子中，10000g/min室温离心1min，弃掉收集管中滤液。⑷将柱子置于一新的2ml收集管内，加入300µLBindingBuffer（XP2）至柱子中央，10000g/min室温离心1min，弃去收集管内液体。⑸将柱子放入新的2ml收集管内，加入700µLSPWWashbuffer（经无水乙醇稀释）室温10000g/min离心1min，重复此步骤一次。⑹弃去滤液，将柱子置于一新的2mL收集管内，13000g/min室温空离2min。⑺将柱子放入1.5ml离心管中，向柱中央加入20µLElutionBuffer，室温放置1min，13000g/min离心1min，即得到所需DNA。2.2.4.2基因的克隆⑴连接将本章2.2.4.1中的回收产物分别连接至pMD-18T载体，在PCR管中建立一个20µL的体系，18 分别加入pMD-18T载体1µL、胶回收产物9µL、SolutionⅠ10µL，充分混合后，16℃过夜。⑵转化取大肠杆菌DH5α50µL与连接产物5µL至灭菌的离心管内，充分混合，在冰上静置30min后，快速放入42℃水浴锅中90s，迅速重新放置冰上2min，然后在超净工作台中加入800µL含有Amp+的LB液体培养基，置于37℃200r/min摇床上复苏60min。复苏完毕，转至离心管中，5000r/min离心10min，使细菌扩大培养，然后用移液器吸取200µL于琼脂糖平板上均匀涂布，做好标记，37℃温箱正向放置1h，使菌液被充分吸附，然后倒置培养过夜。⑶挑菌用灭菌枪头在琼脂糖平板上分别挑取2～3个单菌落，置于Amp+LB液体培养基，作好标记，置于37℃180r/min摇床上培养16h。⑷重组质粒的提取根据质粒小剂量DNA提取试剂盒说明书进行提取，具体步骤如下:①取上述菌液，10000r/min1min离心后收集菌体，弃掉上清。②向离心管内加入BufferA1250µL，充分吹打，使其悬浮均匀。③向离心管中加入250µLBufferB1，缓慢颠倒10次，使其混合均匀后室温下静置5min至溶液粘稠且澄清。④向离心管中加入BufferN1350µL，迅速颠倒数次，混合均匀可见白色絮状沉淀，13000r/min离心10min。⑤取带有收集管的DNA柱，加入上述上清液，13000r/min1min，离心后弃掉收集管内液体。⑥取新的DNA柱置于收集管中，加入BufferKBDNA500µL，13000r/min1min，离心后弃掉液体。⑦取新的DNA柱置于收集管中，加入DNAWashBuffer500µL，13000r/min1min，离心后弃去滤液。⑧重复操作上述步骤，13000r/min开盖离心6min后即可去除残留乙醇。⑨将柱子放入新的1.5mL灭菌离心管中，加入40µL蒸馏水，室温静置2min，13000r/min离心1min，洗脱质粒DNA。重复此操作，收集两次离心的洗脱液，最后进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，成像仪下观察结果。⑸质粒的PCR鉴定提取的质粒10倍稀释后取1µL作为PCR的模板，整个反应体系25µL，质粒的PCR反应体系及扩增条件同2.2.3.3所述。2.2.4.3病毒N基因的序列分析提取的质粒经过PCR鉴定后，阳性结果送往上海生物工程股份有限公司进行序列测定。根据测序结果，利用DNAstar和MEGA5.2等软件将四株PRRSV毒株与41株参考毒株的部分基因进行遗传进化分析，观察其变异情况。表2PRRSV参考毒株基本信息Table2DetailsofPRRSVstrainsusedinthisstudy19 毒株国家致病型基因登录号编号Strains/IsolatesCountryPathotypeAccessionnumberofgene116224BUSA,1997美洲型AF0468692RespPRRSMLVUSA,2005美洲型AF0661833PA8Canada,2002美洲型AF1763484SPChina,2000美洲型AF1842125BJ-4China,2000美洲型AF3318316P129America,2002美洲型AF4940427CH-1aChina,2002美洲型AY0326268HB-1(sh)2002China,2002美洲型AY1503129VR-2332America,2003美洲型AY15056410JA142America,2004美洲型AY42427111PL97-1SouthKorea,2004美洲型AY5852411201NP1.2Thailand,2005美洲型DQ05637313LMYSouthKorea,2006美洲型DQ47347414IngelvacATPUSA,2006美洲型DQ98808015HUB1China,2006美洲型EF07594516JXA1China,2007美洲型EF11244517HEB1China,2007美洲型EF11244718HUN4China,2007美洲型EF63500619SY0608China,2009美洲型EU14407920CH-1RChina,2008美洲型EU80784021TJChina,2012美洲型EU86024822CGChina,2008美洲型EU86423123JXA1P15China,2009美洲型FJ54885524CBB-1-F3China,2009美洲型FJ88912925BJBLZChina,2009美洲型FJ95074526YDChina,2012美洲型JF74871727ZCYZChina,2011美洲型JF80091128NADC30USA,2012美洲型JN65445929A2MC2USA,2012美洲型JQ08787330WUH4China,2012美洲型JQ3262713110-10BJ-4China,2012美洲型JQ6635443210-10HEB-1China,2012美洲型JQ66355133VR2385USA,2012美洲型JX0441403410BY-GDChina,2013美洲型JX19263635YN-2011China,2013美洲型JX85769836SDA2China,2012美洲型JX87837937HK1HongKong,2013美洲型KF28713220 38HLJB1China,2015欧洲型KT22438539HLJA1China,2015美洲型KT35173940HLJB1China,2015美洲型KT35174041LVUSA,2000欧洲型M9626221 2.2.5复方中药治疗PRRS试验2.2.5.1试验地点河北省石家庄市某猪场2.2.5.2试验动物该猪场饲养的母猪共80头，仔猪300头左右，临床上母猪发生流产，所产仔猪精神沉郁、嗜睡、高热，耳廓、腹部、四肢等皮肤发绀，并出现咳嗽、气喘、腹式呼吸等临床症状。剖检病死仔猪，可见肺部出现充血、气肿、肉变、局部多灶性坏死，肺门淋巴结肿大等病变。据了解，猪群已进行猪蓝耳病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒疫苗的免疫，曾使用过替米考星、氟苯尼考、头孢菌素等药物均无明显效果。经实验室RT-PCR病原学诊断确定该猪场已感染PRRSV。2.2.5.3复方中药的制备根据清热解毒、活血止血、补气保胎、宣肺理气的组方原则，组成生石膏、麻黄、天花粉、板蓝根、元参、桔梗、杏仁、双花、紫花地丁、小蓟、甘草等。计算用药量。首先将所有中药放入冷水中加水量为药材的10～12倍，充分浸泡1h。然后将其进行加热，煮沸后持续15～20min，过滤后的上清液给猪饮水，药渣拌料后饲喂。病情严重的猪，可将上述熬制中药液浓缩1倍后灌服。2.2.5.4试验设计⑴分组治疗将80头母猪随机分成两组隔离饲养，每组40头，复方中药组每头给药80g，空白组不给药。另外，将100头仔猪同样随机分为两组，每组50头，复方中药组每头给药40g，发病严重仔猪可加量到每头60g～80g，空白对照组不给药。两个给药组均连续给药6d，分3次给药，15d内观察后进行效果判定。⑵效果判定观察患病猪的精神状态、采食量变化、呼吸状况、皮肤颜色变化和死亡数量等，判定效果。治愈：猪用药后体温、食欲等恢复正常，无临床症状；显效：猪用药后饮食及其他症状得到有效缓解；无效：猪用药后临床症状加重，甚至出现死亡。治愈率（%）=治愈数/治疗总数×100；显效率（%）=显效数/治疗总数×100；有效率（%）＝（治愈数+有效数）/治疗总数×100。22 3结果3.1临床症状观察结果据了解，藁城市养猪场饲养的母猪无明显的临床症状，送检病猪是从外地引种，引进后十天左右出现气喘症状，所产仔猪10~20日龄开始发病，病程1个月左右。使用替米考星、氟苯尼考等药物疗效不佳，先后共有9头猪消瘦后死亡。据饲养员介绍，该猪场未使用过PRRSV疫苗。沧州市猪场2017年3月新引进一批仔猪并注射了猪蓝耳病疫苗，不久猪群开始发病，畜主介绍使用过替米考星、头孢菌素、阿奇霉素等药物进行治疗，但效果不佳。晋州市猪场偶有个别猪出现气喘、消瘦现象，经氟苯尼考、多西环素用药治疗，效果不明显。2017年10月邢台市猪场仔猪在15日龄时注射了猪蓝耳病疫苗，送检猪的体温高达41.8℃。经观察，4个养殖场送检病死猪大都出现如下症状：患病猪在发病初期，皮肤出现针尖大小的出血点，发病中期皮肤呈片状出血，且开始出现气喘、咳嗽等症状，后期患病猪精神萎靡，食欲减退，呼吸困难，全身性皮肤发绀，消瘦后导致死亡，根据症状初步诊断送检猪可能存在PRRSV感染。由于大多数病例为多种病原混合感染，本次研究主要针对PRRSV进行。3.2病理学观察结果经剖检后，4个养殖场的送检猪主要发生以下病理变化：皮下组织有出血点。肺脏局部颜色变浅，出现代偿性气肿，局部有淤血、严重肉变，间质增宽，组织表面有胶冻样分泌物（如图2A所示），支气管内有大量白色渗出物，肺门淋巴结严重出血（如图2B所示）。颌下淋巴结（如图2C所示）、肩前淋巴结、腹股沟淋巴结、髂淋巴结、肠系膜淋巴结等多处淋巴结肿大、出血。肾脏表面见针尖大小的出血点（如图2D所示），肾乳头肿大，表面可见针尖至小米粒大出血斑点。另外，邢台市患病猪病变较严重，有明显的纤维素性肺炎症状，脾脏边缘有轻微梗死，边缘不整齐，肝脏发生变性、坏死，膀胱有散在的出血点。ABCDA肺脏肉变、有胶冻样渗出物；B肺门淋巴结出血肿胀、支气管内有黏液渗出；C颌下淋巴结肿大出血；D肾脏肿大、出血点图2病理学剖检结果Fig.2Theresultofpathologicalexamination23 3.3组织病理学观察结果3.3.1肺脏的组织病理学观察结果肺脏呈典型的间质性肺炎，肺泡间隔显著增宽，有大量淋巴细胞浸润（如图3A所示），肺泡壁不完整，腔体变小，肺泡隔血管扩张、充血、出血（如图3B所示），肺泡内出现坏死的上皮细胞和数量不等的红细胞。支气管和细支气管粘膜上皮细胞部分发生坏死，有的已脱落至管腔内。2413ABH.E.H.E.A肺泡间隔显著增宽（箭头1），大量淋巴细胞浸润（箭头2）；B血管扩张（箭头3），肺泡腔内有脱落的上皮细胞（箭头4）图3肺脏组织病理学观察结果Fig.3Theresultofhistopathologicalobservationoflungs3.3.2淋巴结的组织病理学观察结果淋巴结周边毛细血管扩张、严重出血，淋巴细胞数量减少，淋巴滤泡内出现多核巨细胞（如图4A所示），周围大量嗜酸性粒细胞（如图4B所示）；淋巴小结变小，细胞结构松散，数量减少，出现个体较大的淋巴细胞。1223BH.E.AH.E.A淋巴结周边严重出血（箭头1），淋巴滤泡内出现多核巨细胞（箭头2）；B淋巴滤泡内见大量嗜酸性粒细胞（箭头3）图4淋巴结组织病理学观察结果Fig.4Theresultofhistopathologicalobservationoflymphglands24 3.3.3肾脏的组织病理学观察结果呈急性间质性肾炎，髓质区毛细血管扩张，红细胞渗出，有充血、出血现象，间质细胞肿大，淋巴细胞和单核细胞增多。肾小管、集合管受到压迫管腔狭窄，上皮细胞变性坏死，偶尔出现细胞管型或蛋白管型，间质内有大量淋巴细胞浸润（如图5A所示）。肾小囊扩张，肾小球内出现少数红细胞及血管内皮细胞（如图5B所示）。231A1BH.E.H.E.A肾小管变性坏死（箭头1），间质淋巴细胞浸润（箭头2）；B肾小球少量出血（箭头3）图5肾脏结组织病理学观察结果Fig.5Theresultofhistopathologicalobservationofkidney3.3.4脾脏的组织病理学观察结果如图6所示，脾脏白髓体积变小，脾小体的淋巴细胞体积变小、广泛坏死，数量减少，中央动脉周围组织的淋巴细胞数量减少，髓质血管内充血、出血，血管壁坏死，脾索中出现许多细胞碎片，且有大量淋巴细胞浸润，红细胞增多。21H.E.红细胞增多（箭头1），髓质淋巴细胞浸润（箭头2）图6肾脏结组织病理学观察结果Fig.6Theresultofhistopathologicalobservationofkidneys25 3.3.5免疫组化染色结果免疫组化结果如图7所示，肺脏、脾脏、淋巴结、肾脏、肝脏免疫组化试验中，仅肺脏中能检测到PRRSV抗原阳性细胞，主要定位于肺泡上皮细胞和巨噬细胞。图7PRRSV免疫组化染色结果Fig.7TheresultofPRRSVstainingbyIHC3.4病原学检测检测结果3.4.1RT-PCR检测结果bpM123bpM1232000200010001000500500250250100100ABbpM123bpM1232000200010001000500500250250100100CD图8病猪PRRSVRT-PCR扩增鉴定结果26 M：DLMaker20001：阳性对照2：阴性对照3：RT-PCR扩增产物Fig.8TheRT-PCRamplificationresultsofPRRSVofpigsM:DLMaker2000;1:Positivecontrol;2:Negativecontrol;3:RT-PCRamplifiedproducts3.4.2PRRSV基因组序列及结果3.4.2.1质粒鉴定结果利用质粒DNA提取试剂盒提取4株PRRSV的质粒，经PCR鉴定后，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，置于凝胶成像仪中观察结果，可见扩增出四条明亮的条带，与436bp处目的条带的大小一致，结果如图8所示。bpM12345620001000500250100图9PRRSV质粒的PCR鉴定结果M：DLMaker20001：阳性对照2：阴性对照3：SJZ201701株4：CZ株5：JZ株6：NG株Fig.9IdentificationofplasmidofPRRSVbyPCRM:DLMaker2000;1:Positivecontrol;2:Negativecontrol;3:SJZ201701strain;4:CZstrain;5:JZstrain;6:NGstrain3.4.2.2基因组测序结果测序结束后，分别选取SJZ201701株、CZ株、JZ株和NG株部分N基因（327bp），如表3-1所示，与41株PRRSV参考毒株对应部分序列进行比较。3.4.2.3N基因的序列同源性分析利用MegAlign软件将以上4个序列与41株PRRSV参考毒株的对应部分进行比较，如图10和图11所示，结果显示：SJZ201701株部分N基因与参考毒株相应部分的核苷酸序列同源性在96.3%～57.8%之间，其中与NADC30株同源性最高，为96.3%，与CZ株和16224B株的同源性较高，分别为95.4%和91.4%，与HLJB1株同源性最低，为57.8%，与LV株的同源性较低，为59.0%。SJZ201701株相应的氨基酸序列同源性在84.4%～33.0%之间，与NADC30株同源性最高，为84.4%，与CZ株和JZ株的同源性较高，分别为83.5%和75.2%；与LV和HLJB1株同源性最低，均为33.0%。表3PRRSV株部分N基因序列27 Table3PartialNgenesequenceofPRRSVstain毒株部分N基因序列Strains/IsolatesPartialNgenesequenceGAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAGATGCTGGGTAAGATTATCGCCCAACAGAACCAGTCTAGAGGCAAGGGACCGGGAAAGAAGAATAAGAATAGAAACCCGGAGAAGCCCCATTTTCCTTTAGCAACTGAAGATGACGTCAGACATCACTTTACCCCCAGTGAGCAACAATTGTGTCTGTCGTCAATCCGGSJZ201701株ACTGCTTTTAACCAAGGCGCTGGAACTTGCACCCTGTCTGACTCAGGGAGAATAAGTTACACTGTGGAGTTTAGCTTGCCTACTCATCATACTGTGCGCCTGATTCGCGTCACAGCGTCACCCTCAGCGAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAGATGCTGGGTAAGATTATCGCCCAACAGAGCCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGAAAGAAGAATAAGAGTAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGCGACTGAAGATGACGTCAGACATCACTTTACCCCCGGTGAGCGACAATTGTGTCTGTCGTCAATCCGCZ株GACTGCTTTTAACCAAGGCGCTGGAACTTGCACCCTGTCAGACTCAGGGAGATTAAGTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCTACTCGTCATACCGTGCGCCTGATTCGCGTCACAACGTCACCCTCAGCGAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAGATGCTGGGCAATATTATCGCCCAGCAGAGACAGTCCAAAGGTAGGGGACCGGGAAAGAAGAATAAGAATAAAAACCTGGAGAAGCCCCATTTTCCTCTGGCGACTGAAGATGACGTCAGACATCATTTTACCCCTAGTGAGCGACAATTGTGTCTGTCGTCAATCCGGJZ株ACCGCCTTTAATCAAGGCGCTGGAACTTGTACCCTGTCAGACTCAGGGAGAATAAGTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCTACTCATCATACCGTGCGCTTGATTCGCGTCACGACGTCACCCTCAGCGAATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAAATGCTGGGTAAGATCATCGCCCAACAAAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCGGGGAAGAAAAATAGGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTCCCTCTAGCGACTGAAGATGACGTCAGGCATCACTTTACCCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTCTGTCGTCGATCCAGNG株ACTGCCTTCAATCAGGGCGCTGGAACTTGTGCCCTGTCAGATTCAGGGAGGATAAGTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCGACGCAACATACTGTGCGTCTGATCCGCGCCACAGCATCACCCTCAGCCZ株部分N基因与参考毒株的基因核苷酸序列同源性在96.0%～59.0%之间，与NADC30株同源性最高，为96.0%，与JZ株同源性较高，为93.0%，与16224B株和VR-2385株的同源性均为90.5%；与HLJB1株同源性最低，为59.0%，与LV株同源性较低，为60.6%。CZ株相应的氨基酸序列同源性在85.3%~32.1%之间，与NADC30株同源性最高，为85.3%，与SJZ201701株和JZ株同源性较高，分别为83.5%和78.9%；与LV和HLJB1株同源性最低，均为32.1%。28 JZ株部分N基因与PRRSV参考毒株的基因核苷酸序列的同源性在94.2%～58.7%之间，与NADC30株同源性最高，为94.2%，与SJZ201701株和CZ株同源性较高，分别为90.8%和93.0%，与16224B株的同源性稍高，为89.3%；与HLJB1株同源性最低，为58.7%，与LV株同源性较低，为59.0%。JZ株相应的氨基酸序列同源性在79.8%~32.1%之间，与NADC30株同源性最高，为79.8%；与LV同源性最低，为32.1%，与HLJB1株同源性较低，为33.9%。NG株较为特殊，其与PRRSV参考毒株中HUN4株、YD株、JXA1株以及TJ株的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别为100.0%和93.6%，与HLJB1株的核苷酸同源性最低，为58.1%，LV株同源性较低，为59.9%；与LV株的氨基酸序列同源性最低，为31.2%，与HLJB1株的核苷酸序列同源性较低，为32.1%。图10PRRSV-N基因氨基酸序列同源性比较Fig.10ThecomparisonoftheaminoacidsequenceofPRRSV-Ngene图11PRRSV-N基因核苷酸序列同源性比较Fig.11ThecomparisonofthenucleotidesequenceofPRRSV-Ngene3.4.2.4N基因的系统进化关系分析29 根据推导的N蛋白氨基酸序列，如图12和图13所示，可将45株PRRSV分成2个群（“Ⅰ”和“Ⅱ”），其中SJZ201701株CZ株、JZ株属于美洲型PRRSV，且与NADC30亲缘关系最近；而与欧洲型毒株LV株和HLJB1株的亲缘关系最远；NG株属于高致病性美洲型PRRSV。ⅠⅡ图12根据N基因推导的氨基酸绘制的系统进化树Fig.12PhylogenetictreebasedonaminoaciddeducedfromNgeneⅠⅡ30图13根据N基因推导的核苷酸绘制的系统进化树Fig.13PhylogenetictreebasedonnucleotidededucedfromNgene 3.5复方中药治疗PRRS试验结果3.5.1母猪治疗结果试验母猪经复方中药治疗后，如图14所示，对照组母猪到试验结束共有2头恢复食欲，40头中5头出现流产情况，流产总比例为12.5%；给药组母猪仅1头发生流产，流产率为2.5%，试验第3天有5头采食量恢复正常，试验第15天有31头采食量恢复正常，5头食欲出现好转，治愈率和有效率分别为77.5%和90%。说明本试验使用的复方中药对母猪发生PRRS的治疗效果较好。ABA试验母猪流产比率对比图；B试验母猪采食量恢复情况图14复方中药治疗母猪PRRS试验结果Fig.14TheresultsofcompoundChinesemedicineintreatmentofPRRSinsows3.5.2仔猪治疗结果试验仔猪经中药治疗后，如图15所示，空白对照组到试验结束共有10头死亡，死亡率达20%，其余34头仔猪仍表现呼吸道症状；给药组仔猪有2头发生死亡，死亡率为4%，试验第3天有39头表现呼吸道症状，试验第15天仅7头有临床症状，治愈率和有效率分别为82.0%和96%。说明复方中药对仔猪发生PRRS的治疗效果良好。AB31A试验仔猪死亡率对比图；B试验仔猪发病情况 4讨论4.1PRRS的发生、流行及危害在我国，猪繁殖与呼吸综合征的发生早在1996年就有相关报道，大部分地区在2006年爆发了严重的高致病性猪蓝耳病，致使养殖场200多万头猪发病死亡，死亡率达50%，猪蓝耳病的发生和流行给养猪业造成了严重的经济损失。血清学调查显示，PRRSV感染猪非常普遍，在欧洲、美洲、亚洲等地区均有发生。2006～2009年研究者从河北省11个不同地区，采集了1565份组织样品，检测到PRRSV的总阳性率达45.18%，HP-PRRSV的总阳性检出率达12.08%，HP-PRRSV和PRRSV经典毒株混合其他病原共同感染的比率分别为57.67%和43.24%，PRRSV在河北省猪群中普遍存在，且呈长期的隐形感染，给养猪业带来了严重的潜在危害[96]。本研究中，四个养猪场的发病率都很高，藁城市养殖场共计500头保育猪，死亡9头即送检，而其他养殖场病猪死亡数不等，有的可达70%以上。4.2PRRSV的病原学诊断目前，针对PRRSV的诊断可以用病毒分离鉴定、中和试验等方法。病毒的分离培养不仅要求操作严格无菌，且需要时间较久，步骤繁琐；中和试验除上述因素，还容易受到母源抗体的影响，在血清学检测时无法真正反映猪群的感染情况。RT-PCR方法是目前PRRSV诊断较为快速、简便且灵敏度较高的一种诊断技术，市场上商品化的检测试剂盒得到了广泛的应用。本研究在对PRRSV进行诊断的过程中，不仅对送检病例的临床症状、剖检病变、组织学病理变化等进行了诊断，而且利用特异性强、灵敏度高的RT-PCR方法进行病原学检测，系统地完成了对该病的诊断。4.3PRRSV的遗传进化分析对河北省4个猪场送检病猪进行序列分析，取4个毒株的部分N基因且片段大小为327bp，将其分别与PRRSV其他成员进行同源性分析，并绘制出系统遗传进化树，结果发现本研究分离的病毒位于PRRSV病毒株的分支上，与41株PRRSV参考毒株一起被分成2个群，其中NG株与经典的HP-PRRSVJAX1株（2007年）高度同源，核苷酸和氨基酸序列同源性比较结果分别为100.0%和93.6%。SJZ201701株、CZ株、JZ株属于美洲型PRRSV，且与NADC30株（2008年）的同源性最高，核苷酸序列同源性对比结果依次为96.3%、96.0%、94.2%，氨基酸序列同源性对比结果依次为84.4%、85.3%、79.8%；3株与欧洲型PRRSV的亲缘关系均较远。PRRSV是不分节段的单链RNA病毒，其基因组全长为15kb左右，包括9个开放阅读框32 （ORFs）分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3-7[97]。其中，ORF1a和ORF1b可产生至少14个非结构蛋白（Nsp1α、Nsp1β、Nsp2~Nsp12）。ORF2-7编码的病毒结构蛋白为GP2、GP3、GP4、GP5、M、N。其中Nsp2、GP3和GP5三个蛋白的基因变异最为显著，最保守的是M蛋白，其次是N蛋白。N蛋白是非常保守的碱性亲水蛋白，也是该病毒衣壳蛋白的主要成份。PRRSV感染后的细胞中，N蛋白的表达水平较高，占整个病毒的20%~40%，在C端有近一半的氨基酸残基，在形成核衣壳、维持蛋白构象中具有关键作用[98-99]。然而，本研究中4株毒株的其它非结构与结构基因与其N基因的变异是否一致，其致病性和致病机制，还需进一步研究证实。4.4中药的作用到目前为止，抗生素、激素类等化学药物滥用导致畜产品中药物残留和病原微生物产生耐药性等问题已成为国内外需迫切解决的关键。PRRSV具有高度变异性，可导致猪发生免疫抑制，目前尚未研制出针对该病毒的特效药物和疫苗。中药具有天然、毒性小、残留少甚至无残留等特点，对机体治疗和保健的作用机制不同于西医，在机体抑菌、抗病毒、免疫调节作用等方面占有绝对优势。黄连、黄芩、黄柏、紫花地丁、蒲公英、板蓝根、连翘、石膏、知母、鱼腥草、天花粉、苦参、元参、马齿觅、金银花、大青叶、穿心莲、白花蛇舌草、野菊花、败酱草等是清热类药材。麻黄、柴胡、菊花、桑叶、葛根、桂枝等属于解表类药材。甘草、人参、当归、淫羊藿等属于补益类药材。在临床上，以上三类中药均具有一定的抗病毒作用，可抑制和杀灭多种病毒，增强机体免疫、抗应激作用，诱导分泌干扰素，解表类药物对呼吸道病毒有突出效果。4.5复方中药的临床应用复方中药已经广泛应用到临床疾病防治上，具有抗病毒作用的代表方剂包括黄连解毒散、龙胆泻肝汤、清肺散、银翘散、四君子汤、桑菊饮等。研究证明黄连、黄芩、僵蚕、栀子、柴胡、陈皮、芒硝、柴胡等20多种中药组成的消毒饮加减方对猪链球菌病有很好的治疗效果[100]。有研究表明，由党参、白术等7种药材和藿香、泽泻等9种药材组成的两种复方中药配方可用于临床上猪流行性腹泻的治疗[101]。有研究者将麻黄、杏仁、薏苡仁、甘草、厚朴、白蔻仁、滑石等11味中药制成改良后的三仁汤中药提取物，通过CPE试验和MTT测定方法，证明了在一定浓度范围内该复方制剂在Marc-145细胞中抗PRRSV作用显著，可以有效防治疾病[102]。将虎杖、女贞子、黄芪、景天三七、杠板归、山药、地耳草、半枝莲、蒲公英等10味中药的提取物接种于单层Marc-145细胞可有效抑制PRRSV繁殖[103]。4.6PRRS的复方中药治疗清热散（包括伴郎、大青叶、石膏、大黄、玄明粉等成分）是复方中药的代表剂，有抗病毒、抗菌的功效，可有效抑制流感病毒等多种病毒，增强白细胞对细菌的吞噬作用，能抑制金黄色葡33 萄球菌、肺炎双球菌、溶血链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。本试验利用板蓝根、生石膏、天花粉、紫花地丁、双花等中药，具有清热解毒、增强机体免疫力的作用；桔梗、杏仁、小蓟、甘草、元参具有宣肺利咽，祛痰定喘，生津止渴等作用。在中兽医的基础理论上，采用辩证法对试验猪用药，调节阴阳、扶正祛邪，使患病猪的机体达到一个平衡状态。结果显示，该方可以有效改善PRRS患病猪的临床症状，复方中药治疗后，给药组母猪较对照组采食量明显好转，咳嗽、气喘等症状得到有效缓解，体温和精神状态恢复正常；仔猪给药组除病情严重的2头死亡外，其他仔猪呼吸道症状明显减轻，体温恢复到正常水平，对照组呼吸道仔猪逐渐加重，先后死亡10头，说明对PRRS具有较好的治疗效果。试验观察期结束后，应猪场要求已对患病猪进行了给药治疗，病情得到一定改善。34 5结论5.14个养殖场送检猪肺脏组织出现淤血、气肿、肉变的等间质性肺炎变化，结合临床发生情况和症状，初步诊断为PRRSV感染。5.2本研究确诊4例病猪为PRRSV感染所致，4株PRRSV分别命名为“SJZ201701”、“CZ”、“JZ”和“NG”株。5.3本研究确诊河北省3例猪PRRS是由NADC30-Like株感染所致，SJZ201701株、CZ株和JZ株与NADC30株的核苷酸同源性分别为96.3%、96.0%、94.2%。5.4本研究中药复方防治猪PRRS具有良好效果。由板蓝根、麻黄、甘草等11味组成的复方中药应用于患病猪治疗，试验组母猪采食量明显好转，仔猪体温恢复正常，呼吸道症状明显减轻。35 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影响[J].养猪,2009(04):73-74.42 作者简介姓名：孟利佳性别：女出生日期：1992年2月12日籍贯：河北省邯郸市邯山区学习经历:2011年9月～2014年6月，就读于河北北方学院动物防疫与检疫专业，专科。2014年9月～2016年6月，就读于河北工程大学动物医学专业，本科，获学士学位。2016年9月～2018年6月，就读于河北农业大学研究生院兽医硕士专业，硕士。43 致谢花开花落，似水流年，两年硕士研究生的时光转瞬即逝，回顾这两年的生活，对师友同窗满满的感激和不舍涌上心头。人生旅途中会遇到很多人，彼此相处的经历造就了不一样的我们。最想感谢的是我的导师董世山教授，两年的硕士生活使我受益良多，在老师的悉心指导下，我不仅顺利的完成了自己的学习任务及相关课题的研究，完成了本论文的设计和撰写，还学会了如何提高自己的科研能力，如何培养严谨缜密的思维，如何将理论与实践相结合……董老师渊博的知识、丰富的阅历、睿智的性格、宽广的胸怀和严谨的科研态度，不仅授予我知识，还教会我如何为人处事，老师的尊重和爱护，让我在磨练中成长，我会谨记于心，万分感激！能够遇到董老师，我很幸运！在此，谨以此文向我的恩师致以最真挚的谢意!衷心感谢陈立功老师对我试验和生活上的无私指导和帮助，在我科研上遇到困难和挫折时指点迷津，指正缺点，陈老师严于律己的科研态度时常激励着我奋发向前。衷心感谢刘聚祥老师、胡满老师、仲飞老师、王建平老师、任玉红老师、武现军老师、郑世学老师、王庚南老师、刘静老师、李玉荣老师对我实验研究多方面的帮助和指点。衷心感谢同窗侯海婷、李阳、王子昌、闫硕、仝慧娴、夏晚秋、李强、王丙雷，师姐徐环叶、李双江、史芳舒、宋祎萍，已经毕业的师兄高福勇、黄康东，师妹崔欢、白晓、王鸽，师弟张成、张虎、刘铭，还有硕士期间在实验、学习和生活中给予我支持和帮助的所有同学和朋友。最后，我要感谢我的家人对我无限的付出、支持和鼓励，有这样一个坚强的后盾，我很幸福，感恩永远！在未来的旅途中，我将背起行囊，勇敢前行。孟利佳2018年5月44 45 46 47 48 49 50 51 类NADC30株致猪繁殖与呼吸综合征诊断与防治的研究学位名称:兽医硕士研究领域:不区分研究领域研究生:孟利佳指导教师:董世山教授猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的，主要特征是母猪发生繁殖功能障碍和各年龄段猪出现严重的呼吸道症状，且易发生继发感染，俗称“猪蓝耳病”。该病自首次发生至今有30余年，在全球范围内均未得到有效控制，众多国家和地区仍然受到很大影响。猪繁殖与呼吸综合征病毒分为两种基因型，即欧洲型和美洲型，1996年在我国首次分离到了美洲型PRRSV。2006年，我国首次爆发高致病性猪蓝耳病（HP-PRRSV），给养猪业造成了严重的损害，引起人们的重视。由于该病毒极易发生变异，给防控增加了困难。近年来，很多猪场PRRS的免疫水平很好，但是仍然出现了明显的繁殖障碍与呼吸道症状，先后从不同地区发现新的毒株。河北省猪蓝耳病频频发生，其中有关PRRSV类NADC30株的报道很少。2017年，河北省4个养猪场疑似患猪繁殖与呼吸综合征病，藁城市、晋州市和邢台市养殖场的送检病猪为保育猪，患病猪临床表现为，在发病初期，皮肤出现针尖大小的出血点；发病中期皮肤呈片状出血，且开始出现气喘、咳嗽等症状；后期患病猪精神萎靡，食欲减退，呼吸困难，全身性皮肤发绀，消瘦后导致死亡，；沧州市养猪场送检的母猪体温升高达40℃以上，临床出现流产现象。为进一步诊断，本研究分别从病理学、病原学和中药防治等角度进行了系统的分析和研究。1病理学诊断对送检病猪进行大体剖检，发现病变大多表现为皮下组织有出血点。肺脏局部颜色变浅，出现代偿性气肿，局部有淤血、严重肉变，间质增宽，组织表面有胶冻样分泌物，支气管内有大量白色渗出物，肺门淋巴结严重出血。颌下淋巴结、肩前淋巴结、腹股沟淋巴结、髂淋巴结、肠系膜淋巴结等多处淋巴结肿大、出血。肾脏表面见针尖大小的出血点，肾乳头肿大，表面可见针尖至小米粒大出血斑点。另外，邢台市患病猪病变较严重，有明显的纤维素性肺炎症状，脾脏边缘有轻微梗死，边缘不整齐，肝脏发生变性、坏死，膀胱有散在的出血点。采集病猪的肺脏、肾脏、肝脏、淋巴结等多个组织，制成石蜡切片进行H.E.染色，显微镜下观察可见，肺脏呈典型的间质性肺炎，肺泡间隔显著增宽，有大量淋巴细胞浸润，肺泡壁不完整，腔体变小，肺泡隔血管扩张、充血、出血，肺泡内出现坏死的上皮细胞和数量不等的红细胞。支气管和细支气管粘膜上皮细胞部分发生坏死，有的已脱落至管腔内。淋巴结周边毛细血管扩张、严重出血，淋巴细胞数量减少，淋巴滤泡内出现多核巨细胞，周围大量嗜酸性粒细胞；淋巴小结变小，细胞结构松散，数量减少，出现个体较大的淋巴细胞。呈急性间质性肾炎，髓质区毛细血管扩张，红细胞渗出，有充血、出血现象，间质细胞肿大，淋巴细胞和单核细胞增多。肾小管、集合管受到压迫管腔狭窄，上皮细胞变性坏死，偶尔出现细胞管型或蛋白管型，间质内有大量淋巴细胞浸润。肾小囊扩张，肾小球内出现少数红细胞及血管内皮细胞。脾脏白髓体积变小，脾小体的淋巴细胞体积变小、广泛坏死，数量减少，中央动脉周围组织的淋巴细胞数量减少，髓质血管内充血、出血，血管壁坏死，脾索中出现许多细胞碎片，且有大量淋巴细胞浸润，红细胞增多。免疫组化结果显示，肺脏、脾脏、淋巴结、肾脏、肝脏免疫组化试验中，仅肺脏中能检测到PRRSV抗原阳性细胞，主要定位于肺泡上皮细胞和巨噬细胞。2分子病原学诊断 利用商品化PRRSV通用型检测试剂盒对剖检病猪的组织器官进行RT-PCR病原检测，四个猪场病料的PRRSVRT-PCR产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像显示，PRRSV通用型RT-PCR检测结果均为阳性，扩增出的条带与目的片段大小一致（436bp），证明在四个猪场中存在PRRSV的感染。将藁城市、晋州市、沧州市和邢台市猪场四个毒株分别命名为“SJZ201701”株、“JZ”株、“CZ”株、“NG”株。之后，对4个PRRSV毒株的N基因序列进行扩增、克隆和测序，经遗传进化分析表明，NG株与经典的HP-PRRSVJAX1株（2007年）高度同源，核苷酸和氨基酸序列同源性比较结果分别为100.0%和93.6%。SJZ201701株、CZ株、JZ株属于美洲型PRRSV，且与NADC30株（2008年）的同源性最高，核苷酸序列同源性对比结果依次为96.3%、96.0%、94.2%，氨基酸序列同源性对比结果依次为84.4%、85.3%、79.8%；3株与欧洲型PRRSV的亲缘关系均较远。综合判定，藁城市、沧州市、晋州市3起病例为类NADC30株PRRSV感染，邢台市养殖场为HP-PRRSV感染。3复方中药防治将确诊猪繁殖与呼吸综合征80头患病母猪和100头患病仔猪作为试验猪，分别随机均分为对照组和给药组，板蓝根、甘草等11味中药组成复方中药制剂，母猪给药组每头给药80g，仔猪每头40g，每日分3次给药，连续给药6d，空白组不给药，观察15d后进行效果判定。结果显示，母猪对照组有5头流产，采食量减少，给药组有1头流产，采食量明显好转；仔猪对照组呼吸道症状逐渐加重，共死亡10头，给药组有2头死亡，呼吸道症状明显减轻，体温等恢复正常。说明该组方可以有效改善PRRS患病猪的临床症状，具有较好的治疗效果。关键词：猪；繁殖与呼吸综合征；类NADC30株；诊断；中药防治