《中和性抗人巨细胞病毒抗体的制备及表位鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：R36单位代码：10312密级：学号：20102021博士学位论文题目：中和性抗人巨细胞病毒抗体的制备及表位鉴定研究生：唐奇指导教师：冯振卿教授学科专业：病理学与病理生理学学院名称：基础医学院完成时间：二〇一八年五月 南京医科大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人。或集体已经发表或撰写的成果作品对本文的研宄做出重要贡献的个人和集体，Ｉ均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：曰期Ａ：月Ａ曰导师签名：曰期尸牟乙月，曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅。本人授权南京医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。“”本学位论文属于（请在以下相应方框内打Ｖ）：１、保密□，在年解密后适用本授权书。２、不保密口。１日期：样６月／日＜导师签名：＼日期：＞＾＞年月日／ 目录中文摘要.......................................................................................................................1ResearchanddevelopmentofpotentneutralizingantibodyagainsthumanCytomegalovirusanditsepitopeidentification.........................................................5前言.....................................................................................................................10第一部分中和性抗HCMV兔源单克隆抗体的制备及其特性鉴定....................16一、材料与方法.................................................................................................16二、结果.............................................................................................................27三、讨论.............................................................................................................48第二部分抗HCMV全分子人兔嵌合抗体及人源化抗体的制备及特性鉴定..52一、材料与方法.................................................................................................52二、结果.............................................................................................................65三、讨论.............................................................................................................81第三部分全人源抗HCMV单克隆抗体的筛选、制备及特性鉴定....................83一、材料与方法.................................................................................................83二、结果.............................................................................................................93三、讨论...........................................................................................................102全文小结...................................................................................................................106参考文献...................................................................................................................108人巨细胞病毒疫苗的研发.......................................................................................117缩略语.......................................................................................................................137抗HCMV兔源单克隆抗体可变区核酸序列........................................................138抗HCMV人源单克隆抗体可变区氨基酸序列....................................................153攻读博士学位期间发表论文与科研工作情况.......................................................157致谢.....................................................................................................................161 南京医科大学博士学位论文中和性人巨细胞病毒抗体的制备及表位鉴定中文摘要人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）归属于疱疹病毒乙亚科的巨细胞病毒属，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒，为dsDNA病毒，直径约200nm，基因组大小为230~240kbp。人类是HCMV的唯一宿主。这种病毒进入细胞内以后会导致细胞体积增大。根据感染的时间，人类巨细胞病毒感染可分为先天感染和后天感染。一般情况下，HCMV原发感染为隐性感染，无明显的临床症状，一经感染终生携带，病毒周期性地从黏膜部位释放。免疫力低下者如器官、骨髓移植病人和艾滋病患者感染HCMV，可导致视网膜炎、肺炎、脑炎等严重致命性疾病。对于孕妇来说，HCMV原发或复发感染均可引起胎儿宫内感染或围产期感染，而导致新生儿畸形、智力低下和发育迟缓等。由于HCMV感染患者大多处于潜伏感染状态；即使HCMV在体内复制活动，也多为无症状性感染。目前又无有效、安全的抗HCMV药物，故对HCMV感染的治疗，仍限于症状性感染时的对症处理。有效抑制病毒复制的药物如更昔洛伟、丙氧鸟苷等已广泛用于HCMV的预防和治疗，但是常会伴有骨髓抑制、肾毒性、特异性CTL反应及耐药性等副作用。因此，研究与制备中和性抗HCMV抗体，开发抗HCMV疫苗，对于HCMV的治疗和预防有着重要的医学价值和社会意义。人巨细胞病毒基因组编码超过200种蛋白，重要的包括结构蛋白pp65、pp150、非毒力蛋白IE1和包膜糖蛋白gB、gH、gcII等。目前，已制备了多个以gB、pp65、1E-1、pp150为抗体的结合表位的抗体，尽管具有较高的结合活性和效价，但是中和活性不高，无法完全阻止HCMV在体内的感染。近期研究发现，人巨1 南京医科大学博士学位论文细胞病毒使用了两种不同的方式感染成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞。HCMV通过糖蛋白复合物gB、gH/gL/gO、gM/gN感染成纤维细胞，而感染上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞需要附加gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物（gH五聚体）。回顾HCMV疫苗开发的历史也可以发现，早期开发的减毒活疫苗如AD169和Towne，虽然可以诱导获得短暂的中和抗体应答，但不能彻底清除体内病毒，阻止病毒对上皮细胞的感染。而基因检测发现，两者正是缺失了gH五聚体基因。因此，gH五聚体有可能是HCMV中和性抗体的关键靶抗原。本研究拟采用分子克隆和抗体工程技术等技术制备中和性抗HCMV抗体，分别在动物和个体水平检测中和性抗体的特异性，明确gH五聚体可以作为中和性抗体的靶抗原。研究分为以下三个部分：一、兔源中和性抗HCMV单克隆抗体的制备及其特性鉴定本部分研究拟在动物水平检测抗HCMV抗体产生的类型以及中和活性和结合活性的特点。研究首先使用经基因修饰，包含有gH五聚体（gH，gL，pUL128，pUL130，pUL131）的AD169减毒病毒疫苗免疫家兔。再通过细胞融合和特异性筛选鉴定，获得兔源单克隆抗体。使用病毒中和实验和ELISA分别检测抗体中和活性和结合活性。采用基因工程技术获得抗体可变区序列。综合抗体特异性检测结果，对抗体可变区基因组进化聚类进化分析。结果显示，成功制备45株抗HCMV兔源单克隆抗体，其中具有中和抗体作用抗体25株。将中和活力是HCMV-HIG的十倍以上的中和抗体作为优选抗体（11/25）。检测发现，8株优选抗体（8/11）识别的抗原是gH五聚体。绝大部分的结合性抗体并不同时具有中和活力，而且其靶抗原多为gB蛋白。基因组分析结果显示，45株单克隆抗体来自于26个B细胞组，组内抗体的抗原结合特性和中和活性较为统一。中和性抗体的HCDR3和LCDR3平均长度为15.9AA和12.3AA，明显长于20个结合性抗体的CDR3均值，13.0AA（P=0.009）和10.9AA（P=0.009）。上述结果提示，以gH五聚体作为抗原表位的抗体，具有较好的中和活性。2 南京医科大学博士学位论文二、抗HCMV全分子人兔嵌合抗体及人源化抗体的制备及特性鉴定本部分研究旨在利用抗体工程技术，开发与制备中和性抗HCMV抗体。研究采用分子克隆和基因重组的方法，制备人兔嵌合抗体表达质粒。使用人源CDR替换技术，设计并优化兔单抗可变区序列，并制备人源化抗体表达质粒。使用293F真核细胞表达系统，表达全分子抗体。使用亲和层析系统纯化抗体，使用病毒中和实验和ELISA分别检测抗体中和活性和结合活性。结果显示，成功制备5株人兔嵌合抗体和3株人源化抗体。重组抗体的种属特异性更接近于人，且保持一定的中和活力或结合活力。抗体CDR3基因序列与抗体的特异性、VDJ区基因空间构象以及抗体的表达有直接作用。上述结果表明，可以通过抗体工程技术制备，制备、优化抗HCMV中和性抗体，为相应治疗性抗体的研发奠定理论基础。三、全人源抗HCMV单克隆抗体的筛选、制备及特性鉴定本部分研究的目的是验证感染HCMV的个体中，gH五聚体是其产生的中和性抗体的主要靶抗原。本研究选取高滴度HCMV感染者外周血，使用免疫磁珠筛选获得记忆型B细胞并进行单B细胞培养。设计人源抗体引物，并采用单B细胞PCR技术获得抗体可变区序列。采用抗体工程技术制备与表达全人源抗HCMV抗体，并使用病毒中和实验和ELISA分别检测抗体中和活性和结合活性。结果显示，成功获得192株全人源抗HCMV抗体，其中中和性抗体21株。15个中和性抗体的靶抗原为gH五聚体，占中和作用抗体总数的71.4%。12个中和性抗体（12/21）的轻链为lambda链，占中和作用抗体总数的57.2%。结果表明，感染HCMV的个体中，大部分中和性抗体的表位为gH五聚体。从高滴度HCMV感染者体内获取全人源高中和性抗HCMV单克隆抗体是可行的。综上所述，不管是使用改良的灭活病毒疫苗免疫家兔，还是对高滴度HCMV感染患者的记忆型B细胞检测，均证实gH五聚体是中和性HCMV抗体重要的靶抗原。开发与制备人源化或全人源中和性抗HCMV抗体的过程中，应注意抗3 南京医科大学博士学位论文体CDR3基因对抗体功能的影响。关键词：人巨细胞病毒，中和性抗体，嵌合抗体，人源化抗体，全人源抗体4 南京医科大学博士学位论文ResearchanddevelopmentofpotentneutralizingantibodyagainsthumanCytomegalovirusanditsepitopeidentificationHumancytomegalovirus(HCMV)belongstocytomegalovirusfamilywhichisincludedinBetaherpesvirinae.AsadsDNAvirus,HCMVisthelargestvirusinhumanherpesvirusgroupwith200nmdiameterand230-240kbpgenomesize.HumanistheonlyhostofHCMVwhichoftenleadstotheincreaseofcellvolume.Basedonthetimeofinfection,HCMVinfectioncanbedividedintocongenitalinfectionandacquiredinfection.PrimaryHCMVinfectionisnormallyidentifiedascovertinfectionbecauseoflackofclinicalsymptoms.Thosehypoimmunitypatients,suchastransplantpatientsandHIVpatientscouldcarrythevirusforwholelifeandHCMVcouldbereleasedfrommucousmembranesperiodically.HCMVinfectionmaycauseseveralvitaldiseases,suchasretinitis,pneumonitisandencephalitis.Forpregnantwomen,HCMVinfectioncoulddevelopintrauterineinfectionandperinatalinfectionforfetus,whichwillgiverisetobirthdefects,mentaldeficiencyanddevelopmentalretardation.MostofHCMVinfectedpatientsareinlatentinfectionstate.EvenifHCMVisreplicatedinvivo,itismostlyasymptomatic.Atpresent,therearenoeffectiveandsafedrugsforHCMVtreatment.Therefore,thetreatmentofHCMVinfectionisstilllimitedtosymptomatictreatment.Fornow,drugsthatinhibitviralreplication(suchasganciclovirandpropanoside)havebeenwidelyadministeredforHCMVpreventionandtreatment,butarealwayslimitedbysideeffectssuchasmyelosuppression,nephrotoxicity,specificCTLreactionsanddrugresistance.HencethereisgreatimportanceanddemandtodeveloppotentneutralizingantibodyandHCMVvaccine.Humancytomegalovirusisencodedmorethan200proteins,includingpp65,pp150,IE1,glycoproteinB,gH,gcIIandsoon.Atpresent,anumberofantibodieswhichtarget5 南京医科大学博士学位论文gB,pp65,1E-1andpp150havebeendeveloped.However,mostofthemshowpoorneutralizationactivityandunsuitabilityforprotectionfromHCMVinfection.RecentstudieshaverevealedthatHCMVcaninfectfibroblasts,epithelialcells,endothelialcellsandmacrophagesintwoways.GlycoproteinH(gH)complexgB,gH/gL/gO,gM/gNarenecessaryforfibrocytesinfectionwhilegH,gL,UL128,UL130,andUL131proteinsaredetrimentalforepicytes,endotheliocytesandmacrophagesinfection.BecausethepentamericgHcomplexismissingincommonlaboratorystrains,itsimportanceinviraltropism,viralpathogenesis,andvaccinedesignwasnotfullyappreciated.ItisnotsurprisingthatTownevirusandAD169virusinducedpoorneutralizingtitersagainstviralinfectionofepithelialcellsbecauseofmissingpentamericgHcomplex.Thus,thepentamericgHcomplexislikelyakeyantigenofHCMVneutralizingantibody.Inthisstudy,neutralizingantibodiesagainstHCMVweredevelopedbymolecularcloningandantibodyengineeringtechniques.Theantibodiesweretestedatanimallevelandindividualpatientlevels.ThepentamericgHcomplexcouldbeusedasatargetantigenforneutralizingantibodyagainstHCMV.Therearethreepartsofthispresentstudy:1.DevelopmentandcharacterizationofrabbitneutralizingmonoclonalantibodyagainstHCMV.TheanalysesofthetypesofantibodiesagainstHCMVandthecharacterizationofneutralizationactivityandbindingactivitywereperformedinvivo.RabbitswereimmunizedwithAD169attenuatedvirusvaccinecontainingpentamericgH(gH,gL,pUL128,pUL130,andpUL131).TherabbitHybridomacellwasobtainedthroughcellfusionandspecificityverification.NeutralizingactivityandbindingactivityofantibodieswereexaminedbyvirusneutralizationtestandELISA.Thevariableregionsequenceofantibodywasobtainedbygeneticengineeringtechniques.Basedonthe6 南京医科大学博士学位论文resultsofantibodyspecificitytest,antibodyvariableregiongenomewasanalyzedbyclusteronline.45rabbitmAbagainstHCMVweresuccessfullyprepared,including25neutralizingantibodies.ThemAbswith≥10-foldneutralizingcapacitythanHCMVHIGwereidentifiedaseliteneutralizers(11/25).Amongthem8eliteneutralizingantibodiescouldrecognizepentamericgHcomplex.ThemajorityofbindingantibodesbarelyshowedneutralizationroleandonlyrecognizegBproteininsteadofpentamericgHcomplex.Genomicanalysesforvariableregionsuggestedthat45antibodieswereoriginatedfrom26Bcellgroups,inwhichtheantigenbindingactivityandneutralizationactivitywereconsistent.ThelengthofaminoacidofHCDR3(15.9AA,P=0.009)andLCDR3(12.3AA,P=0.009)ofneutralizingantibodieswassignificantlylongerthanthatofbindingantibodies.AllinformationaboveimpliedthattheantibodeswhichtargettopentamericgHcomplexhavegoodneutralizationactivity.2.Developmentandcharacterizationofhuman-rabbitchimericanti-HCMVantibodyandhumanizedanti-HCMVantibodyThepurposeofthisstudyistodevelopneutralizingantibodiesagainstHCMVbyantibodyengineeringtechnology.Geneticengineeringandantibodyengineeringwereusedtoreconstructhuman-rabbitchimericantibodyexpressionvector.Chimericantibodyandhumanizedantibodywereexpressedby293freestyleexpressionsystemandpurifiedbyproteinA.NeutralizingactivityandbindingactivityofantibodiesweretestedbyvirusneutralizationtestandELISA.Therewere5human-rabbitchimericantibodiesand3humanizedantibodiesweresuccessfullydeveloped.Therecombinantantibodyisclosertohuman,andmaintainsneutralizationandbindingactivity.ItalsoprovedthesignificanceofCDR3sequenceinantibodyconstruction.ThesequenceofVDJregiongenehasadirectimpactonthespaceepitopeaswellastheantibodyexpression.Theseresultsshowthatusingantibodyengineering7 南京医科大学博士学位论文technologytodevelopandoptimizinganti-HCMVneutralizingantibodiescouldbeachievable,whichlaysatheoreticalfoundationfortheresearchanddevelopmentoftherapeuticantibodies.3.Screening,developmentandcharacterizationoffullhumanmonoclonalantibodiesagainsthumanHCMVThepurposeofthissectionistotestthatpentamericgHcomplexisthekeytargetantigenofneutralizinganti-HCMVantibodiesproducedbyHCMVinfectedindividuals.WecollectedperipheralbloodfromHCMVinfectedpeoplewithhightiterneutralizedantibody,andobtainedmemoryBcellsbyimmunomagneticbeadsmultistepscreening.ByutilizingtheimprovedPCRamplificationtechnologyandprimerdesign,thevariableregiongenesequenceoftheantibodywassuccessfullyobtainedfrommostofsingleBcells.Geneticengineeringandantibodyengineeringtechnologywereusedforreconstructionandexpressionoffullhumananti-HCMVantibody.NeutralizingactivityandbindingactivityofantibodiesweretestedbyvirusneutralizationtestandELISA.Inthispart,192fullhumananti-HCMVantibodiesweresuccessfullyobtained.21antibodyclonespossessingneutralizationperformanceweredetected,andthetargetantigensof15antibodieswerepentamericgHcomplex,accountingfor71.4%ofthetotalneutralizationantibody,whichwasconsistentwithourexpectations.Inparticular,thelightchainsof12antibodies(12/21)werelambdachain,whichaccountsfor57.2%ofthetotalneutralizedantibody.TheresultsshowedthatmostoftheneutralizingantibodiesinHCMVinfectedindividualstargetedpentamericgHcomplex.ItisfeasibletoobtainfullhumanelicitneutralizingantibodiesfromHCMVinfectedindividualswithhightiter.Tosumup,whethertouseanimprovedattenuatedvirusvaccinetoimmunizerabbitsortotestmemoryBcellsinpatientswithhightiterHCMVinfection,Wehaveprove8 南京医科大学博士学位论文thatpentamericgHcomplexisansubstantialtargetantigenforneutralizedantibody.PentamericgHcomplexcanprovidenewdirectionsandtechnicalguidelinesforHCMVvaccineresearchanddevelopment.Keywords:humancytomegalovirus,neutralizingantibody,chimericantibody,humanizedantibody,fullhumanantibody9 南京医科大学博士学位论文前言人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）属疱疹病毒科，不同于DNA或RNA病毒，HCMV含有两种核酸（DNA与RNA），又称为涎病毒，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒[1]。因为该病毒进入细胞内以后会导致细胞增大，所以叫做巨细胞病毒[2]。人类是HCMV的唯一宿主。HCMV感染遍布全球，感染率很高，在不同种族、不同地区人群中感染率有所差别，在工业化国家的感染率在60~70%，而在发展中国家则几乎达到100%[3][4]。HCMV感染分为先天性感染和后天获得性感染[2]。HCMV感染后的临床表现和转归与个体的免疫功能状态密切相关[5]。免疫功能正常者因密切接触感染者的分泌物感染HCMV，多表现为隐性感染，部分为单核细胞增多症样表现[6]。病毒潜伏部位常在唾液腺、乳腺、肾脏、子宫颈、睾丸、白细胞以及其它腺体中，病毒可长期或间歇地自唾液、乳汁、尿液、精子及子宫颈分泌物中排出[7~9]。但在大多数免疫正常个体呈无症状感染，而在免疫抑制个体、胎儿和婴幼儿如果感染则可出现明显病症[10]。围产期新生儿易经产道或母乳感染HCMV，调查发现，新生儿先天感染率为0.2%～2.3%，其中10%在出生时有先天性感染表现，包括：黄疸、肝脾肿大、淤斑或紫癜、血小板减少和肺炎;中枢神经系统异常如小头畸形、颅内钙化、脉络膜视网膜炎及感觉神经性耳聋、智力低下甚至死，30%最终会死亡，主要是由于多器官损伤、严重肝功能不良、出血、并发细菌感染而引起死亡，大多发生在新生儿时期[11]。幸存者90%以上有明显的后遗症，如感觉神经性耳聋占50%，智力低下和其他神经系统异常占30%，脉络膜视网膜炎及眼球萎缩占20%[12]。无症状感染的新生儿预后比较好，其中也有10%～17%将在1～2年或数年后出现神经性耳聋、智力低下等神经系统后遗症,其中以单侧或双侧进行性神经性耳聋最常见[2][11]。免疫功能缺陷者因输血（血液制品）或器官移植等感染HCMV或HCMV再活化后，可表现为单个或多个脏器受累，最常见为间10 南京医科大学博士学位论文质性肺炎、肝炎、胃肠炎、视网膜炎等[13]。HCMV感染已经在来自腹主动脉瘤患者的主动脉平滑肌细胞中得到证实[14]。HCMV还与格林巴利综合征、1型糖尿病和2型糖尿病有关[15~17]。HCMV感染正逐渐成为一个社会问题，根据相关研究发现HCMV在健康成人中血清阳性率逐年降低[18]，生育期妇女血清阴性的人数却在增加，这意味着以后成人原发感染的机会将增加，另外HCMV与器官移植[19]中的排斥反应有着极为密切的关系，虽然具体机制尚不清楚。鉴于HCMV感染对人类健康的危害，寻找安全、有效的治疗和预防措施迫在眉睫。目前在临床上治疗HCMV的常用药物[20]，如Ganciclovir、Valganciclovir、Cidofovir、Foscarnet等均为核苷酸的衍生物或类似物，虽然对病毒的复制和增殖具有较好的阻止作用，但受其作用机理的约束，对机体细胞的副作用也显而易见，如骨髓抑制、肾毒性、特异性CTL反应及耐药性等。尽管已有从健康人单采血浆中筛选获得高效价人巨细胞病毒人免疫球蛋白，如CSLBehring的Cytogam和BiotestAG的Cytotect，可用于实体器官移植和治疗胎儿感染等。其机制为抗体与HCMV囊膜糖蛋白等结合，阻止囊膜糖蛋白介导的病毒与细胞膜的融合，以防止病毒侵入宿主细胞并干扰子代病毒的复制[21]。但是因为其来源有限，组成复杂，无法做到工业化生产，同时该类抗体不具备明显的保护作用，无法用于预防感染和相关的疫苗研究。11 南京医科大学博士学位论文图1HCMV病毒HCMV直径约为120~300nm，核酸为235kb的双股线性DNA，有213个开放读码框，其中有165个编码基因（图1），重要的包括结构蛋白pp65、pp150、非毒力蛋白IE1和包膜糖蛋白gB、gH、gcII等[1]。Varnum[22]等证明HCMV病毒颗粒由59种结构基因编码的产物与众多宿主蛋白构成，是疱疹病毒中最大的，具有严格的种属特异性。人巨细胞病毒糖蛋白B（GlycoproteinB，gB）有两个内部的疏水性融合的循环，这可能与靶细胞膜相互作用有关，如果gB分子不具有融合活性，它就不能进入HCMV[23]。gB通过介导受体酪氨酸激酶α，激活了磷脂酰肌醇3-激酶/分子蛋白激酶B信号通路，调节病毒进入宿主细胞[24]。gB结合配体细胞，对于促进病毒进入宿主细胞或细胞信号传导必不可少，反之，在缺乏gB的情况下，HCMV病毒无法进入正常细胞[25]。HCMV要进入人体引发重大疾病需要两个膜糖蛋白，它们分别是gB和gH／gL复合体，通过它们从而进入宿主细胞[26]。gB和gH／gL复合体介导HCMV进入细胞的途径包括两个步骤：第一，细胞受体的结合，第二，融合病毒颗粒包膜与细胞膜。在HCMV感染的机制中，gB提高12 南京医科大学博士学位论文了病毒的侵袭力。它并不是一种结合蛋白，而是为HCMV充当了病毒的融合蛋白，gB是病毒与细胞结合的配体[27]。IE1-72是另一种由HCMV病毒所产生，参与DNA结合的蛋白[28]。通过与多种转录因子或辅助因子相互作用参与转录调节，并通过染色质结构调节葡萄糖调节蛋白的表达[29]。IE1-72通过与启动子结合，调节原生染色质结构，激活GRP78基因的表达，是一种细胞分子伴侣诱导病毒生长活跃的病毒机制[30]。HCMV感染后能编码UL111A基因产物[31]，其结构和功能与人类IL-10相似，被称为cmvIL-10。CmvIL-10能结合IL-10的受体进而抑制炎症反应，如抑制T细胞合成IL-2和IFN-γ等炎症因子、抑制MHC-II类分子和B-7分子的表达等，还能调节核转录因子-κB的活性抑制炎症反应[32]。此外，磷蛋白pp65、pp150、pp50/52、pp71及pp28也是研究较多的HCMV相关蛋白，主要介导巨细胞病毒感染CD8+细胞毒性T细胞反应[33~35]利用上述蛋白为靶抗原，筛选抗HCMV抗体或制备相关的疫苗的研究已进行多年，尽管取得一定的临床效果[36]，但是所制备或产生的抗体的中和活性，依旧不高；或者制备的疫苗的保护力不强，尚不能完全满足临床治疗和预防的需要。近年来对HCMV致病机制的研究进一步发现，巨细胞病毒使用了两种不同的方式感染成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞[37]。成纤维细胞的感染需要糖蛋白复合物gB、gH/gL/gO、gM/gN，而感染上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞需要附加gH/gL/UL128/UL130/UL131复合物。最近的研究显示，高效的中和反应与UL128~131基因产物的出现有关。Foults[38]等的研究发现，使用巨细胞病毒高效免疫球蛋白(Cytomegalovirus-specifichy-perimmunoglobulin，CMV-HIG)在阻止病毒进入上皮细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞中比在成纤维细胞的效果更好，运用gH/gL/UL128/UL130/UL131特异性抗体阻止病毒感染成纤维细胞比以gB特异性抗体的效力更好。而在回顾早期研发的AD169和Towne灭活病毒疫苗，因其获取自人成纤维细胞，病毒基因UL128~131发生突变、丢失，故而失13 南京医科大学博士学位论文去对上皮细胞和内皮细胞的感染能力。这可以解释为何上述疫苗缺乏产生足够有效滴度的中和性抗体的原因（图2）。图2HCMV编码基因基于目前HCMV致病机制相关研究的结果和对既往HCMV灭活病毒疫苗缺陷的分析，gH五聚体有可能是重要的、可产生中和性抗HCMV抗体的靶抗原。为此，在前期研究中，运用分子生物技术修复AD169病毒株中缺失的gH，gL，pUL128，pUL130，pUL131基因（图3）。使用修复后的AD169res病毒免疫小鼠、14 南京医科大学博士学位论文家兔和短尾猴，均产生较高滴度的中和性抗HCMV抗体。图3重组AD169病毒为进一步明确上述中和性抗体与gH五聚体的关系，以及制备与开发中和性抗HCMV抗体，本研究拟从动物及个体水平检测中和性抗体与gH五聚体之间的联系，同时运用抗体工程技术制备人兔嵌合抗体、人源化抗体及全人源抗体。研究经不同工艺开发的抗体，中和活性的变化，为治疗用抗体的研发以及相关疫苗的研究奠定理论基础。15 南京医科大学博士学位论文第一部分中和性抗HCMV兔源单克隆抗体的制备及其特性鉴定1995年，Dr.KatherineKnight在LoyolaUniversityofChicago成功地在在转基因兔中获得骨髓瘤样肿瘤(plasmacytoma)。其后几年里，Dr.RobertPytela和Mr.WeiminZhu在UCSF将此技术进行了改进，使之能高产量的生产兔单克隆抗体。兔单克隆抗体的出现带来了许多优势：①更广泛的抗体谱；②免疫球蛋白结构简单；③更高特异性和亲和力；④易于人源化；⑤优质单抗药的候选应用。从抗体开发的经验来看，兔的免疫系统可以产生识别更多独特表位的抗体。众所周知，兔有不同于人类和小鼠的免疫应答机制，当用外界抗原进行免疫时，兔子能产生强于人和小鼠的免疫应答反应。体细胞超突变引起基因重排而产生的VJ和VDJ进一步丰富抗体谱，增加了抗体亲和力的多样性。兔子的主要抗体谱系产生机制与人和小鼠类似，但是在该过程中，兔子不但有体细胞超突变过程，还有额外的基因转换机制进一步丰富兔子的抗体谱。因此，兔源抗体甚至可以识别部分鼠源抗体不能识别的抗原，使用兔子的免疫系统，检测蛋白的免疫原性有着特殊的作用效果。本部分研究主要采用以AD169res制备的实验用HCMV疫苗免疫家兔，制备兔源杂交瘤，筛选兔源单克隆抗体。通过检测与鉴定不同兔源单克隆抗体的结合活性和中和活性，分析不同抗原与抗体功能的关系，同时，通过对抗体可变区基因序列的聚类分析，结合功能检测结果，综合分析筛选制备获得的抗HCMV抗体的特异性表位及其结合活性和中和活性的关系。一、材料与方法1.材料1.1细胞株16 南京医科大学博士学位论文MRC-5、ARPE-19、240E购自美国ATCC。培养条件为DMEM-H培养基，10%FBS，5%CO2,37℃。1.2病毒AD169病毒购自美国ATCC，AD169res及实验用HCMV疫苗由美国MERCK公司提供。1.3实验动物3~4月龄雌性新西兰大白兔，购自美国Covance。1.4细菌及质粒感受态细菌Stellar™CompetentCells（E.coliHST08strain）购自大连TAKARA公司。pMD18-T购自TAKARA公司。1.5重组蛋白重组gB蛋白由北京义翘神州合成，重组pH五聚体由美国Redbiotec公司合成。1.6主要试剂及耗材HAT美国SIGMAPEG美国SIGMA1640培养基美国Gibco胎牛血清美国Gibco青霉素/链霉素美国InvitrogenExTaq日本TAKALAdNTP日本TAKALADNAMarker美国NEBPCR产物回收试剂盒美国QIAGEN质粒回收试剂盒美国QIAGENT25，T75细胞培养瓶美国Corning17 南京医科大学博士学位论文96孔，24孔，6孔细胞培养板美国CorningPVDFMembrane美国MilliporeECLKIT美国MilliporeODYSSEY封闭液美国Li-CorMouseanti-humanIEmAb美国QEDBioscience生物素标记抗鼠IgG美国VectorLaboratoriesIRDye800CWStreptavidin美国Li-CorSapphire700美国Li-CorDRAQ5美国Li-CorSuperScriptII美国Invitrogen胰蛋白胨英国OXOID酵母提取物英国OXOID30KAmiconUltra-4美国MILLIPORE1.7主要仪器CO2细胞培养箱美国ThermoAKTApurifi100蛋白纯化系统美国GELabSyst全波长酶标仪美国Thermo倒置显微镜日本Olympus生物安全柜美国ThermoScientificC1000S核酸扩增仪美国BIORAD凝胶成像系统GelEZ美国BIORADOnedrop蛋白浓度测定仪中国伍义760R恒温摇床美国APLUSMODER超低温冰箱中国海尔Q10去内毒素超纯水系统美国Millipore细胞计数仪TC10美国BIORAD18 南京医科大学博士学位论文水平低速低温离心机德国HERAEUS制冰机美国SGOTSMANLi-CorAeriusIRDyeplatescanner美国Li-Cor1.8主要溶剂及配方（1）LB培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加900ml去离子水溶解后调pH至7.0，定容至1L。分装于250ml锥形瓶中，15psi高压下蒸汽灭菌20min后4℃保存。（2）LB琼脂:称取5g的琼脂粉末加入500mlLB培养基，高压下蒸汽灭菌20min后4℃保存。（3）LBS培养基：称取30g蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化钠，6g磷酸氢二钠，1g磷酸二氢钾，溶解后调pH至7.0，用去离子水定容至1L。分装于250ml锥形瓶中，高压蒸汽灭菌20min后4℃保存。（4）PBS缓冲液：取8gNaCl、1.44gNa2HPO4、0.2gKCl和0.24gKH2PO4，溶解于900ml去离子水中，调节溶液的pH值至7.4，最后加水定容至1L。（5）PBST：取500μl的吐温20加入1LPBS缓冲液中。（6）1MTris-HCl：取121.1gTris加入900mL的蒸馏水，溶解后加入浓HCL调节pH至6.8，定容至1L。（7）1.5MTris-HCl：取181.7gTris溶解于900ml蒸馏水中，调节pH至8.8，然后用去离子水定容至1L。（8）10%（W/V）过硫酸铵：称取过硫酸铵1g溶解于10ml去离子水中，过滤分装，放-20℃保存。（9）考马斯亮兰R250染色液：称取0.25g考马斯亮蓝，加入450ml甲醇，450ml水，100ml冰乙酸，滤纸过滤。（10）考马斯亮兰R250脱色液：甲醇450ml，水450ml，冰乙酸100ml。（11）10xTris-Glycine电泳缓冲液：称取30gTris，188gGlycine，10gSDS溶19 南京医科大学博士学位论文解于1L水中。（12）电转化洗液：1mMHepes，10%甘油，用1MNaOH调pH值为7.0。（13）电转化复苏液：BHI液体培养基中含10%甘油，0.4%葡萄糖，10mMMgCl2·6H2O。（14）ELISA包被液：0.2M碳酸盐缓冲液，pH调节至9.6。2.方法2.1抗HCMV杂交瘤细胞制备2.1.1动物免疫选取四只3~4月龄雌性新西兰大白兔，免疫前先从耳缘静脉抽取静脉血，析出的血清作为阴性对照。将HCMV疫苗分为10，30，100ug三个剂量组，分别用0.5ml生理盐水溶解，于第0，3，8周采用背部皮下多点注射的方式免疫动物。初次免疫后第11周，耳缘静脉取血获得抗血清，用间接ELISA法进行抗血清效价测试。第14周，选择其中一只效价较高的大白兔注射500μg剂量的HCMV疫苗，并在注射后4天处死兔子，获取脾脏。2.1.2细胞融合1）使用不含血清，含2×青链霉素的不完全培养液漂洗脾脏。2）将脾脏组织剪碎后过200目不锈钢筛网。冲洗筛网，收集细胞悬液。3）800rpm离心去上清。加入红细胞裂解液处理以去除红细胞，加不完全培养液中止。4）收获处于对数生长期的240E细胞，并计数，使用不完全培养基重悬。5）将脾细胞与240E细胞以10：1的比例混合，吹匀后离心去上清，用不完全培养液冲洗1次，离心去上清。6）45秒内加入1mlPEG，作用30秒后，加不完全培养液终止PEG的作用。20 南京医科大学博士学位论文7）离心去除上清，重悬细胞后按照100μl／孔铺96孔细胞培养板，37℃、5％CO2。8）融合24小时后，补加HAT条件培养液。2.1.3杂交瘤细胞筛选融合完成2周后使用夹心法ELISA检测杂交瘤培养上清中是否有兔源IgG分泌，将阴性克隆剔除，并收集阳性克隆细胞培养上清。采用ELISA及病毒中和实验检测待测克隆的抗原结合能力和病毒中和能力，将阳性克隆行2轮亚克隆培养后，定株保存。2.2抗HCMV兔源单克隆抗体表达与纯化使用完全培养基培养抗HCMV兔源杂交瘤细胞，培养细胞至指数增殖期后，采用梯度置换法将培养基置换为无血清培养基。连续培养后，收集杂交瘤细胞培养上清，并用0.22μm微孔过滤器滤去上清中杂质和细菌。使用AKTA蛋白纯化系统亲和层析，首先使用10个柱体积平衡液平衡ProteinGHP亲和层析柱，再按照0.5ml/min的流速将杂交瘤上清上样，再用10~15个柱体积平衡液冲洗，待蛋白吸收峰下降至基线后，用0.1M甘氨酸缓冲液（pH2.7），以1ml/min流速冲洗层析柱，并收集洗脱液。用1MTris（pH9.0）调节洗脱液的pH至7.4，并加入PBS后，使用10kDa超滤管超滤，3000rpm离心10min，进行Buffer置换后，收集上层截留液，定容、分装后低温保存。2.3抗HCMV兔源单克隆抗体结合活力检测1）为检测抗体与不同抗原的结合能力，分别将抗原、重组抗原、纯化的疫苗病毒分别用PBS稀释至2μg/ml，200μl/well包被96孔酶标板，4°C过夜。2）加入3%脱脂奶粉封闭4h。3）使用PBST漂洗5遍后，弃液。4）将待测抗体使用PBST稀释，稀释比为0.2~30μg/ml，分别加入到96孔21 南京医科大学博士学位论文酶标板中，实验设3个复孔。5）同样的，为比较抗体与不同浓度病毒的结合能力，将病毒抗原倍比稀释，稀释比为0.1~100μg/ml，200μl/well包被96孔酶标板，4°C过夜。6）加入3%脱脂奶粉封闭4h。7）使用PBST漂洗5遍后，弃液。8）将待测抗体使用PBST稀释，稀释至2μg/ml，分别加入到96孔酶标板中，实验设3个复孔。8）上述两组实验分组，均使用PBST漂洗5遍后，弃液。9）加入羊抗兔IgG-HRP，孵育1h。10）使用PBST漂洗3遍后，弃液。11）按照100μl/well加入ADHP显色，并放置于酶标仪检测。2.4抗HCMV兔源单克隆抗体中和活力检测1）将处于指数增殖期的ARPE19细胞重悬为单细胞悬液。2）于病毒感染前一天，将ARPE19按照1.5ⅹ104cells/well(3x105cells/ml)接种于96孔细胞培养板。并于病毒感染当天，于显微镜下检测细胞，确保90%的区域被细胞覆盖。3）将待测抗体样品与ARPE19培养基等比例混合，并在96孔培养板中行倍比稀释，起始稀释比为1:25。4）根据HCMV病毒滴度，稀释病毒后与ARPE19培养基混合。5）将倍比稀释的待测抗体与病毒悬液等体积混合，总体积为70-80μl/well.6）室温放置1小时，并轻微摇晃。7）按照50μl/well，将混合液添加到ARPE19细胞培养板中。8）放置培养板至37°C、5%CO2培养箱中培养24h。9）使用移液器，轻柔吸去细胞培养上清，并加入100l/well3.7%甲醛固定液，室温静置20min。22 南京医科大学博士学位论文10）吸去固定液，分别使用200l/wellPBST漂洗5遍，每次间隔4min。室温操作。11）漂洗后，倒置细胞培养板于吸水纸上，吸去残液。12）按照100l/well加入Odyssey封闭液，室温静置1h，并轻微晃动。13）吸去封闭液，并在吸水纸上轻拍，弃除残液。14）使用Odyssey封闭液与0.2%Tween20混合液稀释L14抗体(IgG1,mouseanti-humanCMVIEmAb)2g/ml，并按照50l/well加入到待测细胞培养板中。15）室温静置2h小时，并轻微晃动。16）吸去抗体溶液，使用自动洗板机按照200l/well，PBST清洗5遍，间隔4min。17）使用Odyssey封闭液与0.2%Tween20混合液稀释生物素标记的抗鼠IgG至7.5g/ml，并按照50l/well加入到待测细胞培养板中。18）室温静置1h小时，并轻微晃动。19）吸去抗体溶液，按照200l/well，PBST清洗5遍，间隔4min。20）将IRDye800CWStreptavidin(1:1000终浓度),Sapphire700(1:1000终浓度)，5mMDRAQ5solution(1:10,000终浓度)混合，按照50l/well加入到待测细胞培养板中，室温避光静置1h。21）重复操作16.22）漂洗后，在吸水纸上轻拍，去除残液。使用70%酒精擦拭细胞培养板底部，使用锡纸包裹，置干燥箱内20min。23）使用LiCorAerius扫描，将数据导入置EXCEL表中，并计算800/700的比率。24）使用GraphPadPrism5.0软件计算EC50/NT50。2.5抗HCMV兔源单克隆抗体可变区基因序列扩增23 南京医科大学博士学位论文2.5.1抗HCMV兔源单克隆抗体cDNA模板的获取1）将上述已定株的抗HCMV兔源单克隆抗体的杂交瘤细胞株复苏后使用无血清培养基培养，并收集细胞。2）参照Trizol说明书，提取杂交瘤细胞株的总RNA，测定OD260与OD280并计算两者比值。3）参照SuperScriptII逆转录酶说明书，以总RNA中的mRNA为模板，逆转录合成此细胞株的cDNA第一链。2.5.2抗体可变区基因PCR1）参照IMGT及PubmedIgG数据库，设计兔IgG轻链、重链可变区扩增引物。Vκ5‘senseprimers5‘-GAGCTCGTGMTGACCCAGACTCCA-3’5‘-GAGCTCGATMTGACCCAGACTCCA-3‘5‘-GAGCTCGTGATGACCCAGACTGAA-3’Vκ3‘antisenseprimers5’-TCGTAGGATCTCCAGCTCGGTCCC-3’5’-TCGTTTGATTTCCACATTGGTGCC-3’5’-TCGTTTGACSACCACCTCGGTCCC-3’Vλ5‘senseprimer5’-GAGCTCGTGCTGACTCAGTCGCCCTC-3’Vλ3‘antisenseprimer5’-TCGGCCTGTGACGGTCAGCTGGGTCCC-3’VH5‘senseprimers5’-CAGTCGGTGGAGGAGTCCRGG-3’5’-CAGTCGGTGAAGGAGTCCGAG-3’24 南京医科大学博士学位论文5’-CAGTCGYTGGAGGAGTCCGGG-3’5’-CAGSAGCAGCTGRTGGAGTCCGG-3’VH3‘antisenseprimer5’-GCTGARGAGAYGGTGACCAGGGTGCC-3’2）轻链PCR体系：10×Buffer5μl25mMMgCl23μl2.5mMdNTPs4μlVL引物(20μM)2+2μlcDNA2μlExTaq(5U/μl)1μlddH2O31μlTotal50μl条件：95℃5min95℃30s60℃30s72℃60s×3072℃10min4℃∞3）重链PCR体系：5×HighGCBuffer10μl25mMMgCl24μl2.5mMdNTPs2μlVL引物(20μM)2+2μlcDNA2μlExTaq(5U/μl)1μlddH2O27μlTotal50μl25 南京医科大学博士学位论文条件：95℃5min95℃30s60℃30s72℃60s×3072℃10min4℃∞2.5.3抗体VH与VL测序1）VH、VLPCR产物，分别与PMD18-T载体连接，进行T-A克隆后挑取单克隆进行测序。反应体系：PCR产物4μlpMD18-T1μlsolutionI1μlddH2O4μlTotal10μl2）产物连接过夜，与50μl感受态大肠杆菌Stellar™CompetentCells混匀均匀。3）冰上静置30min；4）60℃水浴热激90sec；5）冰上静置3min；6）加入200μlLB培养基37℃，120rpm震荡培养45min；7）4000rpm离心弃上清，重悬。8）取100μl涂于含有氨苄青霉素（终浓度100μg/ml）的LB平板；培养板正置培养30min后倒置培养过夜。9）第二天挑取阳性单克隆，接种于1ml含有氨苄青霉素LB培养基中，37℃、220rmp过夜培养。26 南京医科大学博士学位论文10）第三天送菌液至金斯瑞公司测序，使用通用引物M13F、M13R测序。11）将序列正确的克隆提质粒后保存于-20℃冰箱。2.6抗HCMV兔源单克隆抗体基因序列分析1）将抗体序列与PubmedIgG(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)比对，检索分析抗体可变区序列，确认抗体可变区序列从FR1至V或J区。2）将抗体序列与IMGT数据库(http://www.imgt.org/)比对，确认抗体CDR1、2、3区域序列及空间表位构型。3）将抗体序列与VBASE2数据库（http://www.vbase2.org/）进行比对，确认抗体亚型，V、D、J区域基因。4）将抗体组序列使用MultipleSequenceAlignment（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行聚类分析，比较同组抗体基因在CDR区域的不同和突变差异，导出系统进化树。5）综合分析抗体基因序列、抗体结合力、抗体中和活力和抗原特异性，优化系统进化树表型。2.7数据统计1）所有数据结果经Excel整理，应用SPSS18.0及Stata12.0统计软件进行处理。计数资料以均数±标准差表示，均数比较采用t检验，多个率(或构成比)之间或两组间比较采用χ2检验。2）使用GraphPadPrism5软件完成数据图表。二、结果1.动物免疫本研究使用经基因修饰，包含有gH五聚体（gH，gL，pUL128，pUL130，pUL131）的AD169减毒病毒疫苗免疫兔子。以免疫前兔血清为阴性对照，以感染HCMV的捐献者（30人份）的血清为阳性对照，收集第十一周免疫兔子的血27 南京医科大学博士学位论文清，比较使用10，30，100ug/dose三个剂量组免疫后，家兔所产生的抗体中具有50%中和能力的抗体滴度。结果显示，经疫苗免疫后，均能产生有效中和抗体，平均滴度分别为670，960，1930，处于HCMV暴露阳性人群采信区间以内（图1-1）。图1-1HCMV疫苗免疫血清中和滴度检测2.抗HCMV兔源杂交瘤细胞的制备及筛选使用兔脾脏细胞与240E细胞融合，克隆化培养后检测细胞培养上清中抗体的表达。经检测约有500个克隆可分泌兔IgG。将阳性克隆连续培养后，分别检测细胞培养上清与HCMV病毒疫苗的结合活性及中和活性，共筛选出具有结合活性和或中和活性的克隆75个。之后，继续进行2轮的亚克隆培养，筛选出45株可稳定表达抗体的特异性单克隆杂交瘤细胞株。3.抗HCMV兔源单克隆抗体的表达与纯化对已定株的杂交瘤细胞均进行无血清化培养，并收集细胞培养上清。无菌过滤后，按照ProteinGHP亲和层析手册，使用AKTAPurifier100蛋白纯化系统28 南京医科大学博士学位论文纯化。纯化后的抗体经Buffer置换后，定容、分装、冻存。纯化后抗体经变性SDS-PAGE检测显示，抗体重轻链大小与预期一致，重链51kDa左右，轻链26kDa左右。图1-2中显示用ProteinG纯化的抗体纯度在95%以上。图1-2兔源抗HCMV单克隆抗体SDS-PAGE检测4.兔源抗HCMV单克隆抗体对病毒抗原的结合作用和中和作用检测为准确比较与分析45株抗HCMV兔单抗的特性，课题组分别检测了每个单克隆抗体的特征常数。为进一步比较，使用商业化人巨细胞病毒免疫球蛋白HCMV-HIG（CytoGam）为对照标准品，分别检测CytoGam对HCMV病毒抗原的结合活性及中和活性，并建立标准曲线（图1-3A，1-3B）。以达到结合50%最大结合病毒量的抗体浓度（EC50binding）为抗体的结合活力评价指标；以阻断50%病毒进入细胞的抗体浓度（EC50neutralizing）为抗体的中和活力评价指标。所有45个兔单抗的结合及中和数值见表1-1。29 南京医科大学博士学位论文将45个兔单抗的结合活力值（EC50binding）设为X轴，中和活力值（EC50neutralizing）设为Y轴，绘制图1-3C。以EC50neutralizing值为1μg/mL的HCMV-HIG设立基线（图1-3A），用以区分兔单抗的中和活力。其中25个EC50neutralizing小于等于1μg/mL的抗体，被认为是中和性抗体（横线以上，标记为三角形），20个EC50neutralizing大于1μg/mL的抗体，被认为不具备中和活性（横线以下，标记为圆圈）。以EC50binding值为2μg/mL的HCMV-HIG(图1-3B)为参照，大部分（14/20）非中和性抗体与病毒有较高的结合活力（横线以下右下象限，图1-3C）。30 南京医科大学博士学位论文图1-3兔源抗HCMV单克隆抗体特异性检测为进一步研究抗体特性，课题组将EC50neutralization数值小于等于0.1μg/mL（图1-3C，实心三角形）或EC50binding数值小于等于0.2μg/mL（图1-3C，实心圆形）的抗体克隆定义为优选中和抗体和优选结合抗体。特别的是，仅有单克隆抗体57.4可被同时标记为优选中和抗体和优选结合抗体。31 南京医科大学博士学位论文表1-145个抗HCMV兔单抗的结合活力及中和活力5.抗HCMV抗体对不同类型细胞作用结果检测HCMV病毒采用不同的方式感染上皮细胞和成纤维细胞，为了区分中和抗体的作用机制，课题组分别检测不同兔单抗对成纤维细胞系细胞MRC-5和上皮细胞系细胞ARPE-19的抗病毒保护作用。将MRC-5细胞组的EC50neutralizing数值设为Y轴，将ARPE-19细胞组的EC50neutralizing数值设为X轴，构建45株兔源单克隆的中和能力散点图（图1-4）。结果显示，兔源单抗可分为3个组别，A组抗体仅对ARPE-19细胞有保护力，B组细胞对MRC-5和ARPE-19细32 南京医科大学博士学位论文胞均产生保护作用，而C组抗体对两种细胞均无保护作用。在之前筛选出的11个代表性中和抗体中，有5个可以阻止病毒感染成纤维细胞和上皮细胞，而剩下的6个仅对上皮细胞具有保护作用，这其中包括克隆57.4和276.10。这些出现在对MRC-5和ARPE-19细胞不同的中和效果，与在临床样本中检测的结果一致，结果提示gH五聚体可能是HCMV病毒感染上皮细胞的关键。图1-4抗HCMV抗体对不同类型细胞的保护作用6.病毒抗原差异比较采用质谱法检测与比较AD169病毒与实验用抗HCMVAD169res的蛋白组成。使用无标记定量分析，对50种病毒蛋白检测的错误率小于0.5%。结果提示，AD169病毒与实验用抗HCMVAD169res具有类似的蛋白组成，都包含有gB，gO(UL74)抗原，而抗HCMV疫苗还包含有gH五聚体（gH，gL，pUL128，pUL130，pUL131）（图1-5）。因此，兔源单抗与AD169病毒或实验用抗HCMVAD169res的结合差异，可以归咎与是否与gH五聚体发生结合。课题组采用病毒滴定法检33 南京医科大学博士学位论文测兔单抗与不同抗原的结合能力。结果显示三种结合模式（图1-6），如仅与抗HCMV疫苗结合（例如克隆57.4，图1-6A）；与两种病毒均发生结合，但与抗HCMV疫苗的结合力更高（例如克隆58.5，图1-6B）；仅与两种抗原均可发生结合（例如295.5，图1-6C）。在对11个优选结合抗体的检测显示，9个具有同克隆295.5同样的结合作用（图1-6D）。而对11个优选中和抗体的检测显示，克隆57.4和克隆276.10仅与抗HCMV疫苗结合，而剩余的9个类似于克隆58.5，图1-5质谱检测分析蛋白差异34 南京医科大学博士学位论文图1-6ELISA检测抗体结合力与抗HCMVAD169res的结合力高于与AD169病毒的结合力。因此，中和性抗体可能的结合蛋白为gH五聚体，与本研究的假设一致，即gH五聚体为产生中和性抗体的关键抗原，是中和性抗体的表位。7.抗HCMV兔单抗与重组蛋白的作用检测为了检测抗HCMV兔单抗是否与gH五聚体特异性结合，分别以11个优选中和抗体和11个优选结合抗体包板，以重组gH五聚体蛋白和重组gB蛋白作为待测抗原，ELISA检测抗体结合特性（图1-8）。之后，以浓度为1μg/mL的重组gH五聚体蛋白和重组gB蛋白做包板抗原，检测22个优选抗体与gH五聚体或gB蛋白结合的差异（图1-7）。35 南京医科大学博士学位论文图1-7代表性抗体与抗原结合检测所有的优选中和抗体均与gB不反应。三个优选结合抗体（272.7、350.1和210.4）与gB有较强的结合反应，而三者对上皮细胞和成纤维细胞均无中和作用。这些结果提示，gB并不适合作为制备具有阻止内皮细胞感染作用的中和性抗体的抗原。在11个优选中和抗体中，8个可明确与gH五聚体发生结合反应；而在优选结合抗体中，仅有克隆292.1和269.6可与gH五聚体发生结合反应，而且结合力较低。因此，绝大部分具有中和作用的抗体是以gH五聚体为结合抗原。36 南京医科大学博士学位论文图1-8AELISA检测抗HCMV抗体结合特37 南京医科大学博士学位论文图1-8BELISA检测抗HCMV抗体结合特性38 南京医科大学博士学位论文8.抗HCMV兔源单克隆抗体可变区基因序列扩增分别培养抗HCMV兔源杂交瘤细胞，收集单克隆细胞后，提取杂交瘤细胞株的总RNA，测定OD260与OD280并计算两者比值（图1-9A）。使用SuperScriptII逆转录试剂盒，逆转录合成此细胞株的cDNA第一链。采用PCR法，使用特异性引物分别扩增抗体可变区基因，成功扩增抗体轻链可变区序列（300~340bp）。重链可变区序列（330~380bp）（图1-9B）。切胶回收可变区基因扩增产物，连接PMD-18T载体，挑克隆送公司测序后，与IMGT数据库和VBASE2数据库比对分析为抗体可变区序列。图1-9抗HCMV兔源单克隆抗体可变区基因序列扩增9.抗HCMV兔源单克隆抗体可变区基因序列分析将抗体序列与PubmedIgG与IMGT数据库比对，确认可变区序列，修复部分因PCR非特异性突变造成的碱基错位、缺失。确认后的45株抗体可变区基因核酸序列见列表。将抗体序列做进一步分析，明确FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4结构域基因序列，并做统计分析（表1-2,1-3）。分别检索和比对各个抗体的亚型及V、D、J区基因类型，并做统计分析（图1-10）。结果显39 南京医科大学博士学位论文示，重链及轻链VDJ基因的类型分布于兔IgG基因组VDJ基因类型分布较为一致，无明显区别，提示实验动物的免疫过程没有受非实验设计因素影响。对轻链J区基因的分析提示，λ链的比例（5%）低于均值（25~30%）。将45株抗体的EC50neutralizing中和数值与抗体重链V基因型做比较分析，结果提示，具有较好中和作用的抗体重链V基因型为IgHV1S40和IgHV1S69。将EC50neutralizing中和数值与抗体重链D基因型做比较分析，结果提示具有较好中和作用的抗体重链D基因型为IgHD2、IgHD6、IgHD8和IgHD7（图1-11）。图1-10抗HCMV抗体的亚型及V、D、J区基因类型分析40 南京医科大学博士学位论文图1-11抗HCMV抗体中和特性与抗体亚型的分析41 南京医科大学博士学位论文表1-2抗HCMV抗体轻链可变区基因氨基酸序列分析42 南京医科大学博士学位论文表1-3抗HCMV抗体重链可变区基因氨基酸序列分析43 南京医科大学博士学位论文为了在基因水平深入了解抗体功能的变化，课题组将45株抗体的轻链、重链可变区基因序列利用MultipleSequenceAlignment（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行聚类分析，并结合已获得的抗体EC50neutralizing中和数值和EC50Binding结合数值，以及结合抗原的特异性，构建兔源抗HCMV单抗的系统进化树（图1-12,1-13）。图1-12兔源抗HCMV单抗重链可变区基因系统进化树44 南京医科大学博士学位论文抗体重链CDR3（HCDR3）是抗体基因中最具个体特异性及影响抗体结构的关键基因，根据HCDR3的差异性，将45个克隆分为26个组，每组包含2个以上的单克隆抗体，同组的抗体来自于同族系B细胞。结果显示，中和性抗体和结合性抗体被分到不同的组中。11个优选中和抗体中的8个较为集中的聚集在抗体组13,16和20中。抗体组18中只有中和性抗体347.3，但该组抗体与中和性抗体组16在系统进化树中的位置较为接近。抗体组1中有5个克隆，抗体组6中有3个克隆，抗体组17和21各有2个克隆，上述分组均为包含较弱中和活性抗体克隆。总体来讲，25个具有中和作用的抗体中的20个克隆被分到7个组中。与中和性抗体相反，绝大部分不具有中和作用的抗体的分布比较分散。而在抗体组9和22中，均聚集了具有较高结合活性的抗体克隆。上述结果说明抗体结合表位与抗体的功能直接相关。45 南京医科大学博士学位论文图1-13兔源抗HCMV单抗轻链可变区基因系统进化树对于一个既定的抗体，其重链、轻链可变区CDR3的长度往往与抗体的中和活力、结合活力或亲和力等功能直接相关。本研究中，11个优选中和抗体的平均HCDR3长度（15.6AA）大于优选结合抗体的平均HCDR3长度（12.2AA）（P=0.024），而LCDR3的长度无统计学差异（11.6AA和10.8AA，P=0.266）（图1-14）。将所有45个抗体序列进行比较，25个中和性抗体的HCDR3和46 南京医科大学博士学位论文LCDR3平均长度为15.9AA和12.3AA，明显长于20个结合性抗体的CDR3均值，13.0AA（P=0.009）和10.9AA（P=0.009）。上述结果证实，中和性抗体需要更长的HCDR3和或LCDR3来结合特异性抗原。中和性抗体和非中和抗体的轻重链发生体细胞突变的个数并没有显著差异（表1-4）。在开发中和性抗体的过程中，通过体细胞突变来提高抗体亲和力具有重要的应用价值。表1-4优选抗体基因突变检测47 南京医科大学博士学位论文图1-14抗HCMV单抗CDR3长度与抗体功能比较三、讨论已有的研究证实，接受HCMV免疫球蛋白过继性免疫的怀孕妇女可以防止CMV病毒感染胎儿及先天性疾病[39]，因此，制备HCMV疫苗是可行的。而完成这一目标的首要问题，是确保疫苗注射后，人体能产生足够多和有效的抗HCMV中和性抗体。然而，人类的免疫球蛋白是多克隆的混合物，并不适合去筛选针对特异抗原的中和性抗体，特别是当目的抗原为CMV这样非常巨大、复杂的抗原。本研究通过使用含有gH五聚体的实验用HCMVAD169res疫苗免疫家兔，制备和筛选出45株具有不同抗原表位的兔抗HCMV单克隆抗体。并对这45个兔源单抗的结合能力、中和能力，以及抗体可变区基因序列的比较和综合分析。研究发现，那些具有较强中和能力的抗体，与具有较高结合病毒能力的抗体的基因存在很大差异；与非中和性抗体相比，中和性抗体具有更长的HCRR3或LCDR3；绝大多数代表性的中和抗体中，其结合的表位均为gH五聚体。48 南京医科大学博士学位论文本研究中描述的抗体与直接来源于人体的抗体不同[40]，因为后者产生的抗体的基因也可能因为捐献者反复感染，而被不断重塑。因为HCMV病毒本身不会在家兔体内复制，因此，使用疫苗诱导家兔产生抗体的多样性和特异性，是由抗原本身所携带的病毒抗原的多样性和特异性决定的[41]。在抗体克隆的筛选过程中，抗原表达量的强弱并不会对筛选中和性抗体有明显影响。事实上，中和性抗体和结合性抗体在分布上是彼此分离的，例如本研究中，筛选出的优选结合抗体仅具有较弱的中和活性，而优选中和抗体的结合活性仅相当于所有相关抗体的平均结合活性。中和性抗体和非中和性抗体可以通过对抗体HCDR3的同源性差异分析而加以区分。从基因水平上讲，中和性抗体轻链及重链的CDR3都显著长于非中和性抗体相应片段，而两组抗体发生体细胞突变的数目没有显著区别。在B细胞基因组学的研究中，尚无明确这些具有超长HCDR3或LCDR3的抗体具有特定功能。但是在HIV及自身免疫型疾病相关研究中，同样发现类似的具有中和作用的抗体，存在具有超长CDR3结构的现象。本研究结果表明，具有超长HCDR3和或LCDR3的中和性抗HCMV抗体，是由VDJ或VJ基因重组，以及是或否有连接N/P结构域决定的[42]。HIV病毒持续感染，可造成感染者抗体[43]基因发生体细胞突变的数目增加。而本研究中，选择含有gH五聚体的实验用HCMVAD169res疫苗作为免疫抗原，在家兔体内制备抗体，所发生的抗体体细胞突变的数目并未增加。抗体克隆57.4是本研究中唯一一个同时兼具优势中和活力和结合活力的抗体克隆，其重链CDR3的突变率达到31%，其超长的CDR3提高了抗体的亲和力成熟。在对45株抗HCMV兔源单克隆基因的系统发育分析表明，抗体的中和活性与抗体基因系统发育存在相关性。从数量上讲，中和性抗体仅仅是B细胞库中的次要群体，但大部分中和抗体均靶向免疫减毒表位或者罕见抗原表位，而不是像gB蛋白那样，表达较多，具有很强免疫原型的抗原。通常而言，抗体的抗病毒功能是通过与其同源抗原结合而发生的，那么抗体49 南京医科大学博士学位论文具有更高的结合活力，其中和作用能力越强。但在本研究中，除了克隆57.4，优选中和抗体和优选结合抗体并不一致。这里有三种可能的解释。首先，是否这些中和抗体与其固有抗原的结合力较低？本研究的结果显示，7个优选中和抗体，与gH五聚体有较强的结合力，即使在抗体浓度为100ng/ml时，仍然可与抗原特异性结合。第二个可能的解释为，用来免疫的实验用HCMV疫苗中，gB等蛋白表达量非常高，而产生中和性抗体的蛋白抗原表达较低。在用来做ELISA检测的HCMVAD169res中，gH五聚体的表达量远低于gB蛋白的表达量，因此影响到ELISA检测信号反应的灵敏性。蛋白质组学分析显示，HCMVAD169res与传统的AD169病毒[44]绝大部分的组成一致，为gM，gB和gH/gL/gO复合物。而HCMVAD169res特有的gH五聚体仅占其总分子量的1%。最后一种可能的解释，这些与中和性抗体结合的抗原或多肽更容易降解和变性，在将待测抗原包板的过程中受损的程度更大，因此，显著影响了ELISA检测的度数。在用ELISA检测优选中和抗体的结合特异性，克隆57.4和276.10仅与HCMVAD169res结合。而剩余的9个抗体与HCMVAD169res的结合力大于与AD169病毒的结合力。这些抗体可能靶向于gH/gL表位，因为HCMVAD169res和AD169病毒均包含gH/gL/gO复合物和gH/gL复合物[45][46]。使用重组gH五聚体蛋白包板ELISA检测抗体结合特异性，前述剩余的9个抗体中的6个表现出明显的结合反应，而克隆347.3,15.1和223.4较弱。综合上述结果分析，这三株抗体也许识别的是gH五聚体蛋白的空间表位。大部分优选结合抗体与HCMVAD169res和AD169病毒的结合没有明显的差异性。综上所述，本研究中筛选获得的优选中和抗体，可以明确均与gH五聚体结合。上述结果同样可以解释，缺乏gH五聚体的AD169疫苗无法诱导产生特异性抗体，阻断HCMV病毒感染人上皮细胞的原因[41]。gH五聚体在抗HCMV中和性抗体的研发以及抗病毒疫苗设计中至关重要。因为gH五聚体对HCMV感染人内皮细胞、上皮细胞以及白细胞的发病机制直50 南京医科大学博士学位论文接相关[47]。相对于其他抗原靶点的抗体，以gH五聚体为靶点的中和抗体可以在粘膜接触表面一类的位置，阻止HCMV病毒的感染[48][49]。HCMV也可以以白细胞为宿主细胞播散并传播，侵犯血管内皮细胞[50][51]。而以gH五聚体为靶点的中和抗体可有效阻断病毒这一行为的发生。HCMV的致病性与其感染内皮细胞的能力有关，血管内皮细胞被认为是HCMV持续感染部位[52~54]。更为重要的是，组织病理学研究发现，临床组织标本已经鉴定HCMV在器官特异性上皮细胞中表达，如视网膜色素上皮细胞和肺泡上皮细胞，并且上皮细胞中的病毒性损伤已被用来病理诊断HCMV视网膜炎和肺炎[55][56]。上述研究证明，靶向gH五聚体的抗体，不仅对于预防HCMV病毒的传播，同时可以在抑制HCMV病毒的持续感染和对终末器官的病毒感染中发挥作用。51 南京医科大学博士学位论文第二部分抗HCMV全分子人兔嵌合抗体及人源化抗体的制备及特性鉴定在20世纪80年代初期，抗体基因的结构和功能的研究成果与重组DNA技术互相结合，产生了基因工程抗体技术。基因工程抗体，即根据不同的需要，将抗体的基因进行加工、改造和重组，转染至适当的受体细胞内进行表达的抗体分子，这也是第三代抗体。与传统经杂交瘤制备的鼠源或兔源单克隆抗体相比，通过基因工程技术改造，可降低抗体的异源性，减小抗体的分子量，有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位，同时利用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。本部分研究旨在利用抗体工程技术，开发与制备中和性抗HCMV抗体。研究采用分子克隆和基因重组的方法，制备人兔嵌合抗体表达质粒；使用人源CDR替换技术，设计并优化兔单抗可变区序列，并制备人源化抗体表达质粒。采用FreeStyle293真核表达系统表达全分子抗体，研究不同抗体可变区基因共表达后的功能变化情况。本部分的研究，可进一步探索制备抗HCMV中和性抗体，为相应治疗性抗体的研发奠定理论基础。一、材料与方法1．材料1.1细胞株MRC-5、ARPE-19购自美国ATCC。培养条件为DMEM-H培养基，10%FBS，5%CO2,37℃。FreeStyle™293-F细胞购自美国LifeTechnologiesGibco，使用GIBCO®FreeStyle™293表达培养基，8%CO2，37℃，置120rpm摇床上连52 南京医科大学博士学位论文续培养。1.2病毒AD169病毒购自美国ATCC，AD169res及实验用HCMV疫苗由美国MERCK公司提供。1.3细菌及质粒感受态Stellar™CompetentCells（E.coliHST08strain）购自Clonetech公司；pMD18-T购自TAKALA公司；嵌合抗体表达载体pHIgG1H、pHLCK、pHLCL由UniversityofTexasHealthScienceCenteratHouston安志强实验室提供。1.4重组蛋白重组gB蛋白由北京义翘神州合成，重组pH五聚体由美国Redbiotec公司合成。1.5主要试剂及耗材FreeStyle™293表达培养基美国GIBCO293fectin™美国GIBCOOpti-MEM培养基美国GIBCO青霉素/链霉素美国Invitrogen0.25%胰酶EDTA美国InvitrogenExTaq日本TAKALAdNTP日本TAKALADNAMarker美国NEBPCR产物回收试剂盒美国QIAGEN质粒回收试剂盒美国QIAGENIn-FusionPCRKit日本Clonetech53 南京医科大学博士学位论文30Kd超滤管美国Millipore限制性内切酶FspI美国NEB限制性内切酶BmtI美国NEB酵母提取物英国OXID胰蛋白胨英国OXID超滤管（30kD）美国MilliporeHRP标记羊抗人抗体美国JacksonT25，T75细胞培养瓶美国Corning96孔，24孔，6孔细胞培养板美国Corning96-wellELISPOTplates美国Millipore胎牛血清美国GIBCORPMI1640培养基美国GIBCOPVDFMembrane美国MilliporeECLKIT美国Millipore1.6主要仪器C1000S核酸扩增仪美国BIORAD凝胶成像系统GelEZ美国BIORADCO2细胞培养箱美国Thermo倒置显微镜日本Olympus生物安全柜美国ThermoScientific超高速落地离心机美国BeckmanOnedrop蛋白浓度测定仪中国伍义760R恒温摇床美国APLUSMODER超低温冰箱中国海尔54 南京医科大学博士学位论文5417R台式高速低温离心机德国EPPENDORF水平低速低温离心机德国HERAEUS制冰机美国SGOTSMANAKTApurifi100蛋白纯化系统美国GELabSyst全波长酶标仪美国ThermoScientific恒温水浴箱美国Polyscience负压真空泵中国天津易世达CO2细胞震荡培养箱德国HairforceQ10去内毒素超纯水系统美国Millipore细胞计数仪TC10美国BIORADLi-CorAeriusIRDyeplatescanner美国Li-CorCV6000液氮罐美国Thermo旋转混合仪美国Thermo1.7主要溶剂及配方(1)LB培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，加900ml去离子水溶解后调pH至7.0，定容至1L。分装于250ml锥形瓶中，15psi高压下蒸汽灭菌20min后4℃保存。(2)LB琼脂:称取5g的琼脂粉末加入500mlLB培养基，高压下蒸汽灭菌20min后4℃保存。(3)LBS培养基：称取30g蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，6gNa2HPO4，1gKH2PO4，溶解后调pH至7.0，用去离子水定容至1L。分装于250ml锥形瓶中，高压蒸汽灭菌20min后4℃保存。(4)1MTris-HCl：取121.1gTris加入900mL的蒸馏水，溶解后加入浓HCL调节pH至6.8，定容至1L。(5)1.5MTris-HCl：取181.7gTris溶解于900ml蒸馏水中，调节pH至8.8，然后用去离子水定容至1L。55 南京医科大学博士学位论文(6)10%（W/V）过硫酸铵：称取过硫酸铵1g溶解于10ml去离子水中，过滤分装，放-20℃保存。(7)考马斯亮兰R250染色液：称取0.25g考马斯亮蓝，加入450ml甲醇，450ml水，100ml冰乙酸，滤纸过滤。(8)考马斯亮兰R250脱色液：甲醇450ml，水450ml，冰乙酸100ml。(9)10xTris-Glycine电泳缓冲液：称取30gTris，188gGlycine，10gSDS溶解于1L水中。(10)电转化洗液：1mMHepes，10%甘油，用1MNaOH调pH值为7.0。(11)电转化复苏液：BHI液体培养基中含10%甘油，0.4%葡萄糖，10mMMgCl2·6H2O。(12)ELISA包被液：0.2M碳酸盐缓冲液，pH调节至9.6。(13)氨苄青霉素贮存液：氨苄青霉素溶于水中，终浓度为100mg/ml，-20℃避光保存。(14)卡那霉素贮存液：卡那霉素溶于水，终浓度为50mg/ml，-20℃避光保存。(15)50xTAE电泳缓冲液：称取242gTris碱，量取57.1ml冰醋酸及100ml0.5mol/LEDTA（PH8.0）溶于1L水中。(16)ProteinAElutionbuffer：9.6g柠檬酸溶于400ml蒸馏水中，用NaOH调节pH值至2.3，最后加蒸馏水定容至500ml。(17)柠檬酸－氢氧化钠溶液(pH2.3，0.1mol/L):4.25g柠檬酸，用氢氧化钠调整PH至2.3，加水定容至200ml。(18)5％脱脂牛奶：称脱脂牛奶粉5g,溶于100mlPBS溶液中,4℃保存。(19)5×Loadingbuffer：250mmol/LTris-HCl（pH6.8），500mmol/L二硫糖醇(DTT)，10%SDS(电泳级)，0.5%溴酚蓝，25%甘油临用前加2－巯乙醇35μl于每1ml裂解液中。(20)10%SDS-PAGE凝胶配制如下：56 南京医科大学博士学位论文10%分离胶(5ml)配方：DW2.0ml30%丙烯酰胺1.6ml1.5MTris(pH8.8)1.3ml10%SDS50μl10%APS50μlTEMED2μl5%积层胶(3ml)配方：DW2.1ml30%丙烯酰胺0.5ml1.0MTris(pH6.8)0.38ml10%SDS30μl10%APS30μlTEMED2μl2.方法2.1抗HCMV人兔嵌合抗体表达质粒的构建2.1.1扩增抗HCMV兔单抗可变区序列根据第一部分实验结果，选取具有高中和活力的抗HCMV兔单克隆抗体57.4，276.1，58.5，124.4，60.1以及具有高结合活力的抗HCMV兔单克隆抗体272.7，350.1作为制备人兔嵌合抗体的候选克隆。根据ClonetechIn-fusionHDCloningKit的要求，设计特异性In-fusionPCR引物，由金斯瑞生物技术公司合成，分别扩增抗体的VH、VL/K基因片段。引物设计如下：57.4VKIF5’-ACAGACGCTCGCTGCGAGCTCGATCTGACC-3’57 南京医科大学博士学位论文57.4VKIR5’-TGCAGCCACCGTACGTAGGATCTCCAGCTC-3’57.4VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTACAGTCGGTGAAGGAG-3’57.4VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAAGAGATGGTGAC-3’272.7VKIF5’-ACAGACGCTCGCTGCGAGCTCGATCTGACC-3’272.7VKIR5’-TGCAGCCACCGTACGTTTGACCACCACCTC-3’272.7VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTACAGTCGCTGGAGGAG-3’272.7VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAAGAGACGGTGAC-3’276.1VKIF5’-ACAGACGCTCGCTGCGAGCTCGATCTGACC-3’276.1VKIR5’-TGCAGCCACCGTACGTTTGACGACCACCTC-3’276.1VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTACAGTCGTTGGAGGAG-3’276.1VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAGGAGATGGTGAC-3’58.5VKIF5’-ACAGACGCTCGCTGCGAGCTCGATCTGACC-3’58.5VKIR5’-TGCAGCCACCGTACGTTTGACCACCACCTC-3’58.5VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTACAGTCGTTGGAGGAG-3’58.5VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAAGAGATGGTGAC-3’60.6VKIF5’-ACAGACGCTCGCTGCGAGCTCGATATGACC-3’60.6VKIR5’-TGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACATT-3’60.6VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTACAGTCGGTGAAGGAG-3’60.6VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAAGAGACGGTGAC-3’350.1VKIF5’-ACAGACGCTCGCTGCGAGCTCGATATGACC-3’350.1VKIR5’-TGCAGCCACCGTACGTTTGACCACCACCTC-3’58 南京医科大学博士学位论文350.1VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTACAGTCGTTGGAGGAG-3’350.1VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAGGAGATGGTGAC-3’124.4VKIF5’-ACAGACGCTCGCTGCGAGCTCGATATGACC-3’124.4VKIR5’-TGCAGCCACCGTACGTTTGACGACCACCTC-3’124.4VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTACAGTCGCTGGAGGAG-3’124.4VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAAGAGACGGTGAC-3’以装载有抗体可变区序列的pMD18T质粒(见第一部分研究)为模板，分别扩增不同抗体克隆可变区序列，用于重组表达质粒的构建。PCR扩增体系如下，扩增结束后加rTaqenzyme2μl/tube10min，去除PCR产物粘末端。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化扩增目的条带，溶于去离子水内，分光光度计法测定DNA浓度，-20℃冻存备用。体系：10×Buffer5μl25mMMgCl23μl2.5mMdNTPs4μlInfusionprimer1+1μlpMD18T-VHorVKorVL2μlExTaq(5U/μl)0.5μlddH2O33.5μlTotal50μl条件：95℃5min95℃30s60℃30s72℃45s×3059 南京医科大学博士学位论文72℃10min4℃∞2.1.2重组抗HCMV人兔嵌合抗体表达质粒1）双酶切全分子抗体表达质粒分别双酶切处理质粒pHIgG1H、pHLCK、pHLCL，37℃酶切过夜。10×NEBbuffer25μlBmtI1.5μlFspI1.5μlVector4μl加ddH2O至50μl2）回收酶切产物在酶切产物加入核酸上样缓冲液，终止反应，1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外下切取目的条带，采用DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）回收目的片段，Onedrop分光光度计测定回收片段的浓度。3）In-fusionPCR，反应如下：5XIn-FusionHDEnzymePremix2μlLinearizedVector2μlVHorVLorVK4μl加ddH2O至10μl50℃孵育15min完成重组。4）连接产物转化取1.5μl连接产物加入到Stellar感受态中，冰浴30min后，42℃水浴热激90s，冰浴2min，加入1mlLB培养基，37℃，摇床孵育50min（180rpm/min），离心浓缩后，涂布到含有卡纳抗性的LB琼脂糖培养板上，放置37℃细菌培60 南京医科大学博士学位论文养箱中过夜培养。从琼脂糖培养板上，挑取克隆，用2mlLB扩增培养后，取菌液进行PCR鉴定。2.1.3重组质粒鉴定1）将菌液PCR鉴定阳性的克隆送金斯瑞生物技术有限公司测序，测序结果与合成序列进行比对分析，正确的克隆命名为pHIgG1H57.4/pHLCK57.4，pHIgG1H276.1/pHLCK276.1，pHIgG1H58.5/pHLCK58.5，pHIgG1H124.4/pHLCK124.4，pHIgG1H272.7H/pHLCK272.7，pHIgG1H350.1/pHLCK350.1，pHIgG1H60.1/pHLCK60.1。2）大量扩增测序正确的质粒克隆，使用美国QIAGEN质粒大提试剂盒，纯化去内毒素后的质粒，按照500ug/ml的浓度，250ug/管分装。2.2抗HCMV人兔嵌合抗体表达与纯化2.2.1FreeStyle293F真核表达系统表达人兔嵌合抗HCMVIgG1)复苏及培养293FFreestyle细胞，培养基为FreeStyle293FExpressionMedium，培养条件为：CO2浓度为8%，细胞培养摇床转速为120rmp，培养温度为37℃。待转染实验前一天观察细胞，细胞密度不低于1.2×106个细胞/ml，活力不低于95%。2)转染前测定细胞密度，调整细胞密度需为1×106/ml，转染体系为100ml。3)分别取每个IgG克隆的配对重链及轻链表达质粒各250µL至2.5mlOpti-MEM培养基中；取200µL的293FectinTransfectionReagent于2.8mL的Opti-MEM培养基中，静置5min。4)将两种混合液混合，轻轻摇晃至均匀，静置20min。5)将293F细胞离心后用293FExpressionMedium重悬，吸取90×106个细胞于培养瓶中，用293FExpressionMedium定容至94ml，静置20min。6)加入6mL的DNA、293Fectin混合物。将细胞放在摇床培养箱中培养，培养条件为：CO2浓度为8%，细胞摇床转速为120rmp，培养温度为37℃。61 南京医科大学博士学位论文120小时后收集细胞培养上清。优化后的主要技术参数：抗体轻链重链DNA质量比1:1转染试剂（µl）与总DNA（µg）比1:1转染细胞浓度(1*106/ml)与总DNA（µg）比1:2收获细胞培养上清时间120hCO2细胞培养摇床转速120rpm2.2.2纯化抗HCMV人兔嵌合抗体62 南京医科大学博士学位论文1)使用AKTAPurif100蛋白纯化系统，按照ProteinA亲和层析操作手册进行抗体亲和层析。1500rpm离心处理细胞培养上清，弃杂质及沉淀，并用0.22μm针式过滤器过滤。2)加入3倍体积的预平衡液，静置。3)按标准操作手册预处理蛋白纯化系统，使用BindingBuffer预灌流系统，流速为1ml/min，设报警压为0.3Pa。4)以0.5ml/min流速上样，收集流穿液备用。5)切换BindingBuffer至以2ml/min流速，以10倍上样体积的液体平衡ProteinAHP亲和层析柱。6)待蛋白UV检测基线下降并保持平稳后，切换至ElutionBuffer，pH2.3，流速为1.5ml/min，并收集洗脱液。7)用1MTris-base，pH8.8调节收集管中蛋白样品pH至7.0。8)加入适量PBS后，使用30kDa超滤管进行Buffer置换，3000rpm，20min/次，置换3次。9)使用Onedrop测定蛋白浓度，定容后分装低温保存。2.3人兔嵌合抗HCMV抗体功能验证2.3.1SDS-PAGE电泳分析1)配置10%聚丙烯酰胺凝胶。2)超滤后的全分子抗体、纯化后收集的流穿液、纯化前的细胞上清、未转染的293F细胞上清分别加5×上样缓冲液，混匀，沸水浴10min。3)加样后进行电泳，浓缩胶电压为80V，分离胶以后用110V，电泳至溴酚蓝跑出即可终止电泳。4)考马斯蓝染胶30min，PBST脱色至背景干净，目的条带清晰可见。2.3.2ELISA检测抗体结合能力方法同前，参见第一部分研究方法介绍。63 南京医科大学博士学位论文2.3.3病毒中和实验方法同前，参见第一部分研究方法介绍。2.4人源化抗HCMV抗体可变区基因优化设计人源及兔源IgG基因组数据库引自PubmedIgG(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)和IMGT数据库(http://www.imgt.org/)。抗体可变区CDR区域的分析，参照IMGT数据库及Kabat/Chothia，Haaidar，Yu等文献报道。人源化抗体可变区FR1、FR2、FR3、FR4序列引自IMGT数据库。重组人源化抗体CH1~CH3，CL1引用自人源抗体IgG1恒定区序列。2.5人源化抗HCMV抗体表达质粒构建委托金斯瑞公司完成合成经优化设计的57.4、276.1、272.7和58.5轻、重链可变区基因序列。采用Infusion-PCR将合成后的基因分别重组到抗体表达质粒pHIgG1H、pHLCK中。重组方法及克隆筛选鉴定方法见本部分研究2.1。2.6人源化抗HCMV抗体表达、纯化采用FreeStyle293F真核表达系统表达人源化抗HCMV抗体，具体方法同本部分研究方法2.2~2.3。2.7人源化抗HCMV抗体特异性功能鉴定经真核表达的全人源抗体，分别使用病毒中和实验和抗原结合实验检测抗体的特异性。具体方法及步骤参见本研究第一部分方法介绍。2.8数据统计1)所有数据结果经Excel整理，应用SPSS18.0及Stata12.0统计软件进行处理。计数资料以均数±标准差表示，均数比较采用t检验，多个率(或构成比)之间或两组间比较采用χ2检验。2)使用GraphPadPrism5软件完成数据图表。64 南京医科大学博士学位论文二、结果1、重组抗HCMV人兔嵌合抗体表达质粒的构建以装载有抗体可变区序列的pMD18T质粒(见第一部分研究)为模板，以特异性引物分别扩增待重组嵌合抗体可变区序列。采用InfusionPCR将插入片段分别与经BmtI和FspI双酶切的抗体表达质粒pHIgG1H、pHLCK或pHLCL连接。抗体表达质粒中已预先插入抗体重链及轻链恒定区基因序列。重组后的质粒经转化，挑取单克隆后扩增，酶切鉴定后，挑选阳性克隆送公司测序验证。以重组人图2-1PCR扩增抗体可变区序列兔嵌合抗体HR57.4为例，图2-1为获得重组抗体可变区序列，图2-2为酶切验证重组后的pHIgG1H57.4/pHLCK57.4。依次完成pHIgG1H57.4/pHLCK57.4，pHIgG1H276.1/pHLCK276.1，pHIgG1H58.5/pHLCK58.5，pHIgG1H124.4/pHLCK124.4，pHIgG1H272.7H/pHLCK272.7，pHIgG1H350.1/pHLCK350.1，pHIgG1H60.165 南京医科大学博士学位论文/pHLCK60.1，共7个嵌合抗体的质粒重组，抗体表达质粒按照200ug/ml浓度分装后，冻存。图2-2重组人兔嵌合抗体表达质粒2、重组抗HCMV人兔嵌合抗体的表达与纯化使用293freestyle真核表达系统共转染配对的抗体轻重链表达质粒，120h后收获细胞培养上清。将细胞上清过滤后使用ProteinA亲和层析柱纯化（图2-3）。将纯化前的细胞上清、纯化后收集的流穿液、超滤浓缩后的抗体、未转染的293F细胞上清及对照人源抗体进行SDS-PAGE电泳（图2-4），结果显示抗体表达量较高，抗体轻、重链大小与预期一致。超滤浓缩处理纯化后抗体，SDS-PAGE检测，无明显杂质（图2-5）。抗体平均产量为5.8mg/100mL，除克隆58.5、350.1未能正常表达外，其5个嵌合抗体均正常表达。66 南京医科大学博士学位论文图2-3ProteinA亲和层析纯化人兔嵌合抗体图2-4SDS-PAGE检测抗体表达67 南京医科大学博士学位论文图2-5SDS-PAGE检测嵌合抗体图2-6病毒中和实验68 南京医科大学博士学位论文3、人兔嵌合抗体特异性及中和活性检测3.1人兔嵌合抗体中和作用功能变化为比较重组前后，抗体克隆中和活性的变化，课题组采用病毒中和实验检测配对的重组抗体。实验以具有相同人抗体IgG恒定区序列的重组全人源抗HCMV抗体为对照（见研究内容三），克隆25-2为中和性抗体，克隆8-3为高结合力非中和性抗HCMV抗体。结果显示（图2-6），重组后的人兔嵌合抗体中，克隆60.6，124.4的中和活性变化不大，克隆57.4的中和活性略有下降，克隆276.1的中和活性收到明显影响。使用病毒中和实验检测兔源单抗与人兔嵌合抗体对ARPE19细胞中和活性的变化。本实验加入鼠-兔嵌合抗体57.4（由sinobiologicalinc定制）做对照。结果显示兔源抗体57.4的EC50neutralizing（NT50）为0.0035μg/ml，人兔嵌合抗体57.4的NT50为0.6937μg/ml，鼠兔嵌合抗体57.4的NT50为8.118μg/ml。57.4-HRChimeric557.4Rabbit272.7-HRChimerico4i272.7RabbittaR276.1-HRChimeric.3276.1Rabbitget57.4-MRChimericnI0027/008100.0000010.000010.00010.0010.010.1110100Antibody(ug/ml)图2-7不同来源抗体的中和活性比较69 南京医科大学博士学位论文兔源抗体276.1的NT50为0.0488μg/ml，人兔嵌合抗体276.1的NT50为0.9142μg/ml。兔源抗体272.7的NT50为5.507μg/ml，人兔嵌合抗,272.7的NT50为4.754μg/ml（图2-7）。人兔嵌合抗体，并未提高原有优选兔源中和性抗体的中和能力，同时，也未改善原有优选兔源结合性抗体的中和能力。而鼠兔嵌合抗体的中和能力受到明显影响。3.2人兔嵌合抗体结合活性功能变化以实验用抗HCMV疫苗为待测抗原，检测57.4，272.7，276.1，60.6和124.4五株抗体及相应人兔嵌合抗体，对病毒结合特性EC50binding的变化（图2-8）。结果显示，将兔源IgGFc段替换为人源Fc段后，并未显著提高抗体的结合特性。图2-8人兔嵌合抗体结合能力检测优选结合抗体中，兔源抗体57.4的EC50binding（EC50）为0.01μg/ml，人兔嵌合抗体57.4的EC50为0.034μg/ml；兔源抗体272.7的EC50为0.015μg/ml，人兔嵌合抗,272.7的EC50为0.028μg/ml。优选中和抗体的结合能力并未显著改变，人兔嵌合抗体276.1的EC50为3.74μg/ml，人兔嵌合抗体60.6的EC50为70 南京医科大学博士学位论文14.79μg/ml，人兔嵌合抗体124.4的EC50为5.13μg/ml。3.3结构优化表达人兔嵌合抗体对中和活性的影响中和性抗体124.4和324.4为系统进化树中同属抗体组20，属于抗体基因序列中，同源性较高的克隆。两者的轻链可变区序列基本一致，尤其是CDR1~3区域完全一致，而两者重链可变区序列存在差异，尤其是CDR区域存在较多突变（图2-9）。为研究抗体重链可变区对抗体中和作用的影响，课题组将上述抗体轻重链表达质粒重新组合，使用293Freestyle真核表达系统制备pHIgG1H124.4/pHLCK324.4和pHIgG1H324.4/pHLCK124.4抗体，并通过病毒中和实验检测抗体中和活性的变化（图2-10）。结果显示，人兔嵌合抗体124.4的NT50为0.0166μg/ml，人兔嵌合抗体324.4的NT50为0.0348μg/ml。而重新组合表达制备的人兔嵌合抗体124.4H324.4K的NT50为0.0192μg/ml，人兔嵌合抗体324.4H124.4K的NT50为0.0488μg/ml。上述结果表明，抗体重链可变区序列对抗体中和作用影响较大，选择系统进化相近的抗体可变区序列，进行抗体结构优化，有一定的研究价值。5HR324.4H124.4KHR124.4H324.4K4HR324.4HR124.4oitaR3.getnI0072/00810-6-5-4-3-2-1012101010101010101010Antibody(ug/ml)图2-10人兔嵌合抗体中和活性71 南京医科大学博士学位论文图2-9抗体可变区基因比较72 南京医科大学博士学位论文3.4人源化抗HCMV抗体设计及功能鉴定嵌合抗体尽管降低了由抗体Fc段引起的种属排斥反应，但可变区中含有的非人源基因任然具有潜在的引发排斥反应的可能。因此，进一步的降低非人源性抗体基因的表达，即人源化抗体技术发展的目标。目前较为可行的人源化抗体设计的策略是执行CDR移植，即使用人源抗体骨架区序列（Frameworkregion，FR）替换非人源抗体骨架区序列，使修饰后的抗体人源性达到90%以上（图2-10）。图2-10人源化抗体结构示意图本部分研究使用PubmedIgG和IMGT数据库分析待人源化抗HCMV抗体基因序列，确认抗体骨架区基因亚型以及可变区CDR1~CDR3基因序列。首先，使用同源性最高的人源FR基因序列替换原有的兔源FR基因序列。同时，保留兔源抗体可变区基因序列中CDR上下游关键位置氨基酸。以图2-11所示抗体57.4、295.5等为例，通过对抗体可变区基因线性结构分析和空间结构预测，提示在CDR区域上、下游存在Cys，Lys，Arg，Phe，Pro，Trp等极性或含有苯环的氨基酸可能会明显影响抗体空间结构。因此，需要在替换的人源FR框架基因序列中，保留相对位置的氨基酸，减少对CDR空间构像的影响。此外，通过对73 南京医科大学博士学位论文比同一系统进化树下，靶向同一抗原的抗体组序列，保留其中高保守氨基酸（图2-13~2-16）。按照上述原则，完成人源化抗体57.4、276.1、272.7和58.5的设计。人工合成人源化抗体可变区基因后，重组至抗体表达质粒中。采用前述真核表达系统表达并纯化抗体。采用病毒中和实验和病毒抗原结合实验检测重组表达的人源化抗HCMV抗体。结果显示（图2-12），经人源化改造后的抗体，hHR57.4的中和能力及结合能力与HR57.4有一定的提高；hHR272.2的结合能力有显著提高，中和活性未见改变；hHR276.1的中和活性未见明显变化。上述结果表明，人源化改造，有可能改善嵌合抗体的结合力和亲和力。图2-12人源化抗体结合及中和能力检测74 南京医科大学博士学位论文75 南京医科大学博士学位论文图2-11抗体CDR区域氨基酸序列分析76 南京医科大学博士学位论文图2-13人源化抗体设计克隆276.177 南京医科大学博士学位论文图2-14人源化抗体设计克隆58.578 南京医科大学博士学位论文图2-15人源化抗体设计克隆57.479 南京医科大学博士学位论文图2-16人源化抗体设计克隆272.780 南京医科大学博士学位论文三、讨论基因工程抗体是自多克隆抗体，鼠源单克隆抗体之后，第三代抗体，是利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。相比于前两代抗体，基因工程抗体具有很多优点：①通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；②基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；③根据治疗的需要，制备新型抗体；④可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本。因此，基因工程抗体在抗体药物研发、临床治疗中有广泛的应用前景。基因工程抗体技术，主要包括制备嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等[57][58]。目前较为成熟，且应用于抗体药物工业的技术主要为前两者，嵌合抗体技术和人源化抗体技术[59~61]。本部分研究正是利用这两种技术尝试构建重组人兔嵌合抗HCMV抗体及人源化抗HCMV抗体，检测兔源抗HCMV中和性抗体经人源化改造后，抗体中和活性的改变，为开发相关治疗性中和抗体药物奠定理论基础。本部分研究中，首先尝试构建及表达人兔嵌合抗体，即使用人源轻、重链恒定区序列替换兔源轻、重链恒定区序列。利用双质粒共转染系统，在真核细胞293F中表达全分子人兔嵌合抗体。共有5个嵌合抗体被成功表达完成，使用ProteinA纯化过程中，人源Fc段可被有效识别，SDS-PAGE检测也证实，获得的轻、重链可变区序列与预期一致。克隆58.5、350.1未能正常表达，这也许与替换的轻、重链恒定区序列与其天然兔源恒定区序列突变太多，影响了轻链与重链以及重链与重链之间二硫键的缔结，从而对全分子抗体构型的影响。重组后的嵌合抗体的中和能力和结合能力都有明显影响。如代表性中和抗体57.4和276.1的中和活性出现明显下降。影响抗体特异性功能因素，既可能是CDR区域的特81 南京医科大学博士学位论文异性，也可能是可变区基因的空间构像发生变化。重组后的嵌合抗体，编码重链基因包括C、V、D、J，编码轻链基因包括C、V、J。这其中C来自于人源抗体恒定区，而D区J区基因均来自母本，兔源基因。VDJ区基因的变化，会明显影响抗体铰链区的空间构像和稳定性[62]。这也许是本研究中，嵌合抗体的特异性功能尤其是中和活力受到影响的原因之一。抗体的中和活性与重链CDR3直接相关（见第一部分研究），而重链CDR3和FR4最靠近抗体重链J区，受到重组后的影响最为明显。为了验证抗体重链CDR3对抗体中和活性的影响，以及将该策略应用于抗HCMV中和抗体结构优化的可能性。本研究将选择同源性较高的克隆124.4和324.4做交叉表达。两者的轻链具有非常高的相似度，仅在FR区域存在3处突变，CDR1处存在1处突变。而两者的重链尽管同源性较高，但CDR区域存在较多突变。结果显示，使用124.4H替换324.4H后与324.4K共表达，获得的重组124.4H324.4K抗体的中和活力得到较大提高，接近124.4。而使用相反组合的重组抗体，中和能力显著低于324.4。因此，同源重组抗体过程中，应优选的使用与重链可变区CDR区同源性最高的片段做选择性替换[63~65]。本部分研究中，课题组也尝试进行了人源化改造抗HCMV抗体。使用同源性最高的人源FR区基因替换兔FR基因。在设计过程中，保留了FR序列中可能对抗体CDR区空间构想产生影响、位置较为接近及表达相对保守的氨基酸，如丝氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等[66~68]。参考系统进化分析和抗体结合分析，选取基因突变较少，且针对同一抗原靶点的抗体组做同源性分析，选取保守性最高的CDR序列。为减少D、J区基因对空间构想和铰链区结构的影响，使用人源FR4序列与人源CH1序列连接[69][70]。结果表明，制备的人源化抗体与嵌合抗体相比，结合活力有一定的改善，而抗体全分子中人源基因的比例得到进一步提高。本部分的研究对于开发人源化中和性抗HCMV抗体有着重要的参考价值。82 南京医科大学博士学位论文第三部分全人源抗HCMV单克隆抗体的筛选、制备及特性鉴定全人源抗体是抗体发展的最新阶段，因其在安全性、有效性和与人类疾病的相关性方面表现出巨大优势，是用于人类疾病治疗的理想抗体，是当前抗体技术开发的重点方向。目前相对成熟的技术包括：噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠制备技术。然而，随着B细胞永生化培养和单细胞逆转录PCR技术的出现，人源单细胞克隆表达抗体技术正成为抗体制备前沿技术。使用高通量筛选具有抗原特异性的B细胞，并通过单B细胞逆转录PCR，获得同源免疫球蛋白的重链和轻链可变区基因，从而完成全人源抗体的制备的设想得以实现。验证感染HCMV的个体中，gH五聚体是其产生的中和性抗体的主要靶抗原，同时制备及开发全人源中和性抗HCMV抗体是本部分的主要研究目的。本部分研究拟通过对高滴度HCMV感染患者外周血的高通量筛选，获取可分泌IgG的记忆型B细胞。经连续培养后，检测B细胞分泌的抗体是否具有与HCMV结合作用和或中和作用。设计人源抗体引物，并采用单B细胞PCR技术获得抗体可变区序列。采用抗体工程技术制备与表达全人源抗HCMV抗体，并使用病毒中和实验和ELISA分别检测抗体中和活性和结合活性。上述研究，有助于进一步明确gH五聚体是中和性抗HCMV抗体的主要靶抗原，同时建立获取全人源抗HCMV中和性抗体的制备方法，为后期相关治疗性中和抗体的开发储备技术。一、材料与方法1材料1.1细胞株MRC-5、ARPE-19购自美国ATCC。培养条件为DMEM-H培养基，10%FBS，5%CO2，37℃。293-hCD40L由美国MERCK公司提供，R20培养基，10%FBS，83 南京医科大学博士学位论文5%CO2，37℃。1.2病毒AD169病毒购自美国ATCC，AD169res及实验用HCMV疫苗由美国MERCK公司提供。1.3细菌及质粒感受态细菌Stellar™CompetentCells（E.coliHST08strain）购自大连TAKARA公司。pMD18-T购自TAKARA公司。1.4重组蛋白重组gB蛋白、重组IL-21蛋白由北京义翘神州合成，重组pH五聚体由美国Redbiotec公司合成。1.5主要试剂及耗材EasySepKit美国StemcellHumanMemoryBcellIsolationKit美国StemcellR20培养基美国Gibco胎牛血清美国Gibco青霉素/链霉素美国InvitrogenExTaq日本TAKALAdNTP日本TAKALADNAMarker美国NEBPCR产物回收试剂盒美国QIAGEN质粒回收试剂盒美国QIAGENPVDFMembrane美国MilliporeECLKIT美国MilliporeODYSSEY封闭液美国Li-CorMouseanti-humanIEmAb美国QEDBioscience84 南京医科大学博士学位论文生物素标记抗鼠IgG美国VectorLaboratoriesIRDye800CWStreptavidin美国Li-CorSapphire700美国Li-CorDRAQ5美国Li-CorSuperScriptII美国Invitrogen胰蛋白胨英国OXOID酵母提取物英国OXOID30KAmiconUltra-4美国MILLIPORE1.6主要仪器CO2细胞培养箱美国ThermoAKTApurifi100蛋白纯化系统美国GELabSyst全波长酶标仪美国Thermo倒置显微镜日本Olympus生物安全柜美国ThermoScientificC1000S核酸扩增仪美国BIORAD凝胶成像系统GelEZ美国BIORADOnedrop蛋白浓度测定仪中国伍义760R恒温摇床美国APLUSMODER细胞计数仪TC10美国BIORAD水平低速低温离心机德国HERAEUSLi-CorAeriusIRDyeplatescanner美国Li-Cor1.7主要溶剂及配方1)MTris-HCl：取121.1gTris加入900mL的蒸馏水，溶解后加入浓HCL调节pH至6.8，定容至1L。2)1.5MTris-HCl：取181.7gTris溶解于900ml蒸馏水中，调节pH至8.8，然后用去离子水定容至1L。85 南京医科大学博士学位论文3)10%（W/V）过硫酸铵：称取过硫酸铵1g溶解于10ml去离子水中，过滤分装，放-20℃保存。4)考马斯亮兰R250染色液：称取0.25g考马斯亮蓝，加入450ml甲醇，450ml水，100ml冰乙酸，滤纸过滤。5)10xTris-Glycine电泳缓冲液：称取30gTris，188gGlycine，10gSDS溶解于1L水中。6)电转化洗液：1mMHepes，10%甘油，用1MNaOH调pH值为7.0。7)电转化复苏液：BHI液体培养基中含10%甘油，0.4%葡萄糖，10mMMgCl2·6H2O。其余主要试剂同本研究第二部分2.方法2.1记忆型B细胞富集及培养2.1.1PBMC制备1)对收集的6例经检测HCMV感染阳性患者捐献的血清，检测抗HCMV抗体表达及中和活性（方法同第一部分研究）。选取富含中和性抗体滴度最高的捐献者外周血进入下一步实验。2)将40ml捐献者血液，分装至15mL离心管，按照所使用的静脉血总体积1/4～1/5的比例先加入淋巴细胞分离液（Ficoll），再用滴管沿管壁缓慢加入枸橼酸钠抗凝静脉血，使之叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。3)2000rpm，4℃水平离心30min。4)去除血浆部分，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，小心吸出单核细胞带并转移到新管中。5)加入5倍以上体积的RPMI1640培养基，1500rpm，4℃水平离心10min，洗涤细胞两次。6)洗涤后，1×PBS重悬细胞，1500rpm，离心3min，洗涤细胞三次。86 南京医科大学博士学位论文7)分离得到的细胞悬液中加入适量红细胞裂解液后混匀，静置4-5min，1000rpm离心5min后，弃上清。8)1×PBS重悬细胞，1500rpm，离心3min，洗涤细胞三次。9)将细胞重悬于15mlR10（20％FBS）中并取出10μl样品并与40μl台盼蓝混合。计数活细胞，备用。2.1.2记忆型B细胞富集使用STEMCELLEasySep试剂盒富集记忆B细胞1)使用RoboSep缓冲液重悬PBMC，并调整细胞浓度至5×107个/ml。2)将细胞放入5mlFACS圆底管中，3)按照100μl/ml的比例，加入EasySepHumanMemoryBCellEnrichmentCocktail，充分混合并在室温（15-25℃）下孵育10min。4)涡旋振荡30秒，确保EasySepD磁珠混合均匀，并处悬浮状态。5)按照100μl/ml的比例，加入重悬的EasySepD磁珠，充分混合并在室温（15-25℃）下孵育5min。6)加入RoboSep缓冲液，使细胞悬液达到5ml的总体积（约108个细胞）。轻轻吹打2~3次，混合管中的细胞。7)放置入磁力架中，静置10min。8)拿起磁力架，并连续翻转管和，将上清液倒入新的5mlFACS管中。将磁铁和管倒置2-3秒，然后返回直立位置。9)从磁铁上取下原来的管子，并将装有所需细胞的新管子放入磁铁中，放置5min。10)再次重复步骤7，在磁体中共进行3次分离。11)在200×g室温下将新管中的富集细胞离心10min。小心地吸出或倾倒上清液。在250mlR10培养基中重悬细胞并计数活细胞。2.1.3饲养细胞培养87 南京医科大学博士学位论文1)将293-hCD40L细胞在含有10ug/mlBlasticidin的MEM培养基（10％FBS，P/S）中培养至80~90%融合。2)在B细胞培养前1周将细胞按照0.8~1×106个细胞/瓶，转接至P175细胞培养瓶。3)细胞传代和收获时，将细胞用胰蛋白酶消化10min。4)在添加至B细胞培养前，更换为R20培养基，并以5000rad辐射细胞。2.1.4记忆型B细胞培养1)将辐照处理的293-hCD40L细胞按照200个/孔接种至96孔细胞培养板。2)将富集获得的记忆型B细胞稀释后，按照1.44个/孔接种至预先接种饲养细胞的96孔细胞培养板。3)加入重组人IL-21，终浓度为50ng/ml。4)置细胞培养板于CO2培养箱中培养2周，培养条件为5%CO2，37℃。5)收获细胞培养上清，用于病毒中和实验和病毒结合实验。6)去上清后的细胞，按照50μl/well，加入RNALadder，并放置-80℃保存。2.2单B细胞抗体可变区基因扩增2.2.1人源IgG可变区引物设计经典的人源IgG可变区引物均使用复杂的简并引物，用以覆盖抗体基因组序列。由于单细胞PCR实验的设计和反应体系限制，需要尽可能减少加入引物的质量，并降低反应体系的大小，同时不得影响抗体可变区基因的特异性。为此，课题组重新设计人源IgG可变区PCR扩增引物。该引物的设计原则如下：上游引物与抗体Leadersequence互补，涵盖L1和L2两个外显子的结合部，排除扩增含有内含子片段的抗体可变区DNA序列的可能。下游引物与抗体恒定区CH1/CL互补（图3-1）。设计后的引物为简并引物（表3-1）。88 南京医科大学博士学位论文图3-1人源IgG可变区引物设计示意图表3-1优化设计的人源抗体可变区基因扩增引物•PrimerforVHLeaderNoSequenceCoden%SubTypeGroupVH01RCTGAGCTGGRTTTTCCTR=(A,G)14/4035.0%VH3VH02CTTCCTCCTSCTGGTGGCS=(G,C)7/4017.5%VH4VH03CTGGACCTGGAGVATCCTV=(A,C,G)6/4015.0%VH1,VH7VH04TGGGTTTTCCTTGTTGCT3/407.5%VH3HF1VH05ATGGGGTCAACCGCCATC2/405.0%VH5VH06GGACACACTTTGCTMCACM=(A,C)2/405.0%VH2VH07TGGAGGATCCTCTTCTTG2/405.0%VH1VH08ATGTCTGTCTCCTTCCTCVH6VH09ATGGACTGGACCTGGAGGHF2VH10GGGCTGAGCTGGCTTTTTVH11CTGTGGTTCTTCCTTCTC4/4010.0%•PrimerforVKLeaderNoSequenceCoden%SubTypeGroupVK01YGCTCAGCTCCTGGGGCTY=(C,T)25/4062.5%VKI,VKIIHK1VK02TTCCTCCTGCTACTCTGG7/4017.5%VKIIIVK03AGGGTCCCTGCTCAGCTCVK04AGGGTGCCCGCTCAGCGCHK2VK05AGGCTCCTTGCTCAGCTT89 南京医科大学博士学位论文VK06GTGTTGCAGACCCAGGTCVKIVVK07GGGTCCCAGGTTCACCTCVKVVK08TTCTGCTSCTCTGGGTTCS=(G,C)8/4020.0%VKVI•PrimerforVLLeaderNoSequenceCoden%SubTypeGroupVL01CCTGGGCTCTGCTSCTCCS=(G,C)6/3119.3%VL2,VL10VL02ATGGCCTGGACYCCTCTCY=(C,T)4/3112.9%VL3,VL7VL03CCCTCTCYTCCTCACCCTY=(C,T)5/3116.1%VL1HL1VL04CCCCCTCCTCAYTCTCTGY=(C,T)3/319.6%VL3VL05TCCTCTCTCACTGCACAG3/319.6%VL5VL06GGCCTGGGCTCCACTRCTR=(A,G)2/316.4%VL6,VL9VL07ATGGCCTGGATGATGCTTVL08GCCTGGACCCAACTCCTCVL09ATGGCCTGGGTCTCCTTCHL2VL10ATGGCCTGGACCGTTCTCVL11ATGGCCTGGACCGCTCTCVL12ATGGCATGGATCCCTCTCVL13ATGGCATGGGCCACACTC8/3125.8%•PrimerforConstantregionNoSequenceCodeVHRGACMGATGGGCCCTTGGTGGAM=(A,C)VKRGACAGATGGTGCAGCCACVLRGGGGGYAGCCTTGGGCTGACY=(C,T)2.2.2全人源抗HCMVIgGcDNA模板的获取在含有分选获得的人B细胞克隆的96孔细胞培养板中加入RNALadder，经三遍反复冻融后，使用QIAGEN的singlecellKIT获得单B细胞mRNA全转录本，并使用SuperScriptII逆转录KIT扩增IgGcDNA第一链。2.2.3PCR扩增IgG可变区基因分别使用HF1/VHR和HK1/VKR引物进行第一轮PCR。PCR产物经核酸电90 南京医科大学博士学位论文泳检测大小，若与预期抗体片段大小一致，胶回收纯化扩增目的条带，连接pMD18T质粒后，送公司测序验证(具体方法同第一部分研究)。若大小不一致，或未见明显条带，则使用HF2/VHR、HK2/VKR和HL1/VLR引物进行第二轮PCR。若任未获得轻链可变区序列，则使用HL2/VLR引物进行第三轮PCR。体系：5×Buffer10μl2.5mMdNTPs2μlPrimer1+1μlcDNA1μlPrimerSTAR(5U/μl)0.5μlddH2O34.5μlTotal50μl条件：95℃5min95℃45s60℃45s72℃60s×4572℃10min4℃∞2.3抗HCMV全人源单克隆抗体可变区基因序列分析1)将抗体序列与PubmedIgG(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)比对，检索分析抗体可变区序列，确认抗体可变区序列。2)将抗体序列与IMGT数据库(http://www.imgt.org/)比对，确认抗体CDR1、2、3区域序列及空间表位构型。3)将抗体序列与VBASE2数据库（http://www.vbase2.org/）进行比对，确认91 南京医科大学博士学位论文抗体亚型，V、D、J区域序列及亚型。4)将抗体组序列使用MultipleSequenceAlignment（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行聚类分析，比较同组抗体基因在CDR区域的不同和突变差异。2.4重组抗HCMV全人源单克隆抗体的表达与制备选取具有优选克隆25-2，7-2，8-3制备重组全分子抗HCMV抗体。根据ClonetechIn-fusionHDCloningKit的要求，设计特异性In-fusionPCR引物，由金斯瑞生物技术公司合成，分别扩增抗体的VH、VL/K基因片段。引物设计如下：25-2VKIF5’-ACAGATGCCAGATGCTCCTATGAGCTGACT-3’25-2VKIR5’-GTTGGCCTTGGGCTGTAGGACGGTCAGCTT-3’25-2VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTACAAGTGCAGCTGTTG-3’25-2VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAAGAGACGGTGAC-3’7-2VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTACAGGTGCAGCTGTTG-3’7-2VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAGGAGACGGTGAC-3’7-2VKIF5’-ACAGATGCCAGATGCCAGTCTGTCCTGACT-3’7-2VKIR5’-GTTGGCCTTGGGCTGTAGGACGGTGACCTT-3’8-3VKIF5’-ACAGATGCCAGATGCCAGTCTGTCCTGACT-3’8-3VKIR5’-GTTGGCCTTGGGCTGTAGGACGGTCAGCTT-3’8-3VHIF5’-GGTGTCCACTCGCTAGAGGTGCAGCTGTTG-3’8-3VHIR5’-GCCCTTGGTGGATGCTGAGGAGACGGTGAC-3’以装载有抗体可变区序列的pMD18T质粒为模板，分别扩增不同抗体克隆92 南京医科大学博士学位论文可变区序列，用于重组表达质粒的构建。除使用抗体可变区基因模板不同以外，其余PCR反应体系及程序、抗体表达及抗体纯化方案同第二部分研究相关内容。2.5抗HCMV全人源单克隆抗体的功能验证本部分研究，除待测抗体克隆不同，以及使用抗人IgGHRP二抗以外，所采用方法均与本课题研究第二部分，制备及检测抗HCMV抗体所用方法一致。二、结果1、记忆型B细胞富集、培养及鉴定对收集的6例经检测HCMV感染阳性患者捐献的血清，检测检测抗HCMV抗体的滴度。结果显示，#1号捐献者的相对抗HCMV抗体滴度及对病毒的NT50最高。选取该捐献者40ml外周血，进行PBMC分离后，使用记忆型B细胞分离试剂盒，利用免疫磁珠，分选获得CD3-CD27hiCD19+CD20-的记忆型B细胞。按照1.44个/well接种于含有饲养细胞的96孔板中，共200块细胞培养板。两周后收集细胞培养上清，分别进行3次ELISA检测。第一轮检测细胞上清中是否含有人IgG。第二轮使用上述阳性克隆的细胞培养上清，检测其对HCMV病毒的StandardcurveFractionofwellspositiveforIgG2.5502.040n=750mslln1.5e300w5f4oD1.020O%0.5100.000.010.11101001000100001000000.00.51.01.52.02.5[IgG,ng/mL]OD450nm93 南京医科大学博士学位论文图3-2人源抗HCMV抗体特异性检测结合力和中和能力。结果显示，总计19200个B细胞克隆中，经连续培养，具有可分泌人IgG功能的克隆有4800个，具有与HCMV特异性反应的有197个，其中，具有与HCMV特异性结合的有182个，具有中和活力的有24个，9个克隆同时具有良好的中和活力和结合活力（图3-2）。将筛选获得的197个克隆分别检测与gH五聚体和gB蛋白的结合作用，结果显示197个克隆中，33个克隆可与gB蛋白结合，且有3个克隆同时具有较好的中和活力；16个克隆可以gH五聚体结合，其中15个具有较好的中和活性。94 南京医科大学博士学位论文图3-3人源抗HCMV抗体结合特异性检测2.单B细胞抗体可变区基因扩增为验证基于抗体Leadersequence至Constantregion设计的引物的有效性和特异性。选取HCMV阳性捐献者分离获得的PBMC，提取RNA后，制备cDNA95 南京医科大学博士学位论文文库。PCR检测针对各抗体可变区亚型引物扩增特异性。结果显示（图3-4），各引物组均能较好的扩增出抗体可变区条带，尤其是重链引物组，PCR产物较为明显，且大小均一。轻链引物组中VK06、VK08、VL04、VL05、VL06和VL12条带较弱或不明显，可能与该类型抗体基因表达较低或采样cDNA文库基因表达丰度有关。图3-4人源IgG可变区引物检测为检测抗体引物对抗体cDNA的敏感性，将cDNA稀释至4pg（相当于单96 南京医科大学博士学位论文B细胞抗体cDNA质量）后，PCR检测扩增抗体可变区基因片段的特异性。结果如图3-5所示，cDNA质量从50ng降至4pg，重链可变区基因产物仍能有效扩增和识别。图3-5极限检测人源IgG可变区引物扩增敏感性使用上述特异性抗体可变区引物，对筛选获得的197例HCMV阳性B细胞克隆进行PCR扩增。分别使用HF1/VHR和HK1/VKR引物进行第一轮PCR。对未获得预期条带的克隆，使用HF2/VHR、HK2/VKR引物进行第二轮PCR。若有轻链扩增未成功，则使用HL2/VLR引物进行第三轮PCR。部分重链克隆需使用HighGCBuffer扩增，部分轻链克隆，需进行2stepPCR或高Tm程序优化处理。合计共192例HCMV阳性B细胞成功获得配对的抗体可变区序列。5例克隆未获得正确的可变区序列，原因可能为制备细胞cDNA过程中，部分RNA降解。3.抗HCMV全人源单克隆抗体基因序列分析将抗体序列与PubmedIgG与IMGT数据库比对，确认可变区序列，修复部分因PCR非特异性突变造成的碱基错位、缺失。进一步分析、明确FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4结构域基因序列，各个抗体的亚型及V、D、J区基因类型，并做统计分析（图3-6）。在对抗体轻链的分析中显示，轻链为Kappa链的克隆有149个，占总数的77.6%，lambda链的克隆有43例，占总数97 南京医科大学博士学位论文的22.4%。在具有结合功能的171个克隆中，Kappa链的克隆有141个，占总数的82.5%，lambda链的克隆有30例，占总数的17.5%。上述两组数据中，抗体轻链为Kappa链的比例与基因组抗体轻链中Kappa链的比例类似。比较特殊的是，在21个具有中和作用的克隆中，Kappa链的克隆有9个，占总数的42.8%，lambda链的克隆有12例，占总数的52.7%。此类型抗体的比例远高于基因组抗体轻链中lambda链的比例（图3-7）。图3-5抗HCMV全人源抗体可变区基因分类在对192例阳性抗体克隆可变区CDR区域的分析发现，重链CDR3的分布较为集中，主要为10~14AA或15~19AA，与基因组抗体可变区重链CDR基因大小分布类似；轻链CDR3的大小主要为1~9AA，相较于基因组抗体可变区轻链CDR基因略小（均值为8~12AA）（图3-7）。将21例具有中和作用的抗体序列做进一步分析（表3-2），可与gB抗原结合的抗体克隆的轻链CDR3长度均值98 南京医科大学博士学位论文为7.6AA（P=0.038），重链CDR3长度均值为12.7AA（P=0.021）。而可与gH五聚体抗原结合的抗体克隆的轻链CDR3长度均值为14.3AA（P=0.008），重链CDR3长度均值为18.9AA（P=0.014）（图3-8）。图3-6抗HCMV全人源抗体轻重链克隆比例分析图3-7抗HCMV全人源抗体可变区CDR3长度与分布表3-221例中和性抗HCMV全人源抗体结合能力检测ClonegBPentamerVirion800/700RatioLighttype114H0.0460.0420.0380.429Lambda223H0.0490.5270.0530.461Lambda322H0.0500.1610.0440.505Lambda424H0.0460.3720.0370.827Lambda541H0.0481.3560.2090.709Kappa662H0.0470.2130.0660.803Lambda99 南京医科大学博士学位论文783H0.0460.1520.0660.481Kappa888H0.0480.5480.1400.458Lambda9126H0.0490.5100.0840.768Kappa10122H0.0511.9340.1690.440Kappa11144H0.0420.6330.0850.506Lambda12145H0.0420.1610.0470.668Lambda13147H0.0480.0400.0460.718Lambda1425H0.0501.7250.1940.410Kappa15151H0.0420.1680.0820.568Kappa16154H2.0590.0400.2530.518Lambda17155H0.0420.4420.1060.743Kappa18162H0.0410.1170.0640.691Lambda19194H0.0420.0400.0390.671Lambda207H2.0600.0401.4950.906Kappa218H2.0950.0431.6650.749KappaNote:background800/700ratiofrom0.4to1.0;andpositivecontrolfrom2.0to3.5图3-8中和性抗HCMV全人源抗体可变区CDR3长度与分布4.重组抗HCMV全人源抗体制备及功能鉴定在对21个中和性抗体的序列分析，以及对192个HCMV阳性抗体克隆的系100 南京医科大学博士学位论文统进化分析，筛选出具有代表性克隆7-2、8-3和25-2。其中克隆25-2具有较高的中和活性，且与gH五聚体结合，克隆7-2、8-3具有较高的结合活性，且与gB蛋白结合。首先对抗体克隆的VDJ区基因分析（图3-9），并与抗体基因组VDJ区基因比对，修正部分因PCR造成的突变。图3-8人源抗HCMV抗体VDJ区基因分析第二步，将可变区FR1~FR4序列与抗体基因组基因序列比对，以同源性最高的序列为参照，修正FR1部分突变基因（图3-9）。101 南京医科大学博士学位论文图3-9人源抗HCMV抗体FR区基因分析根据抗体表达质粒pHIgG1H、pHLCK或pHLCL，设计InfusionPCR特异性引物。通过InfusionPCR将优化后的人源可变区基因序列重组至抗体表达质粒。使用293Freestyle表达系统表达重组抗体，并进行纯化和超滤。结果显示克隆2-7未能正常表达，提示重链J区存在较多突变，影响抗体轻重链空间结构的形成。克隆8-3和25-2均能正常表达，且经序列优化后的克隆，中和性及结合特性都有一定的提高（图3-10）。图3-10重组人源抗HCMV全分子抗体功能检测三、讨论随着分子生物学技术、生物信息技术以及基因工程技术的发展，单克隆抗体的开发进入到新的阶段。单个B细胞抗体制备技术的兴起，使得从人类个体直102 南京医科大学博士学位论文接获得具有生物学功能的抗体成为可能[71~73]。利用该技术制备的单克隆抗体，具有全人源性、自身高度特异性和均一性，在疾病治疗、病原微生物诊断与治疗等方面显示出独特的优势和良好的应用前景[74~76]。已有的全人源抗体制备技术，如噬菌体展示技术[77][78]和转基因小鼠技术等[79][80]，存在一定的技术限制。在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性[81]。不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。而转基因小鼠技术存在转基因片段较小，且相邻基因片段高度同源，重组过程复杂，在面对抗原多样性时无法完全产生相应的抗体[82][83]。而单B细胞抗体制备技术，可以直接从感染或免疫后的人类个体中，直接快速的分离到记忆型B细胞，通过高通量筛选和基因测序，快速获得抗体可变区基因，从而完成人源抗体的重组制备[84]。目前，利用该技术已成功制备多个用于制备抵抗病原微生物感染的高度特异性人源抗体，如HIV抗体、破伤风抗体、乙肝抗体、流感抗体等[85~87]。Morris[88]等从HIV-1疫苗接种者外周血中分离单个B细胞，克隆得到能识别HIV-1gp41保守位点且中和多株HIV-1的抗体，并研究得出结论在HIV-1gp41包被蛋白的C端存在多个免疫原性靶点。利用单B细胞抗体制备技术，从H1N1感染患者外周血中制备了针对H1N1病毒基因保守区的中和性抗体[89]，动物保护实验发现，筛选制备出的3株抗体在小鼠感染H1N1后70h后仍然发挥保护作用，且中和绝大部分H1N1、H5N1病毒株。也有研究报道[90][91]，使用从人单B细胞扩增获取的流感抗体基因，连接至真核表达载体并检测活性，仅用6天即制备筛选出5株高亲和力人流感单克隆抗体。因此，单B细胞抗体制备技术使得高效、高通量制备高亲和力人单克隆抗体成为可能[92][93]。本部分研究中，通过分选具有较高抗体滴度的HCMV感染者外周血，获得记忆型B细胞（CD3-CD27hiCD19+CD20-）。将单个B细胞加入可分泌表达人重103 南京医科大学博士学位论文组CD40L的饲养细胞中培养，B细胞可持续生长10~14天，这期间分泌产生的抗体足够满足抗体特异性检测实验的需要。2周后，收集细胞培养上清，检测是否有人IgG分泌，结果显示约4800个细胞克隆分泌抗体，约占总克隆数的25%。区别于经典的抗体筛选方案，在克隆抗体可变区序列之前，进一步检测细胞培养上清中分泌抗体的中和活性和结合活性，从而减少待功能验证的抗体数目。结果显示与HCMV有特异性作用的细胞克隆共有197个，其中，中和活性24个，结合活性182个。与本研究第一部分动物免疫实验结果类似，所产生的中和性抗体中，中和活性最高的抗体的靶抗原为gH五聚体，而大部分以gB蛋白为靶抗原的抗体均为结合性抗体。在对单B细胞进行抗体可变区基因扩增的过程中，本研究对扩增引物做了重新设计，即基于抗体Leadersequence至Constantregion进行设计。上述两个区域的抗体序列相对保守，一方面最大程度保证了抗体的特异性。传统的以FR1为上游引物的设计，会造成部分非特异片段产物，同时，FR1区域易产生突变，虽然不影响抗体的特异性，但是对抗体的分泌表达，即抗体产量产生影响。另一方面，可以减少兼并引物的使用量，提高PCR反应体系的敏感性。不同于已有的单细胞PCR[94][95]采用的两步法巢式PCR[96]设计，因为抗体基因存在不确定性和未知性，本研究使用简并引物完成一步PCR。改良之处在于将PCR反应循环数升至45个循环，同时严控模板cDNA和dNTP的质量和纯度(用于制备cDNA的MrnaOD值介于1.90~1.95)。经单B细胞扩增，最终获得192个抗体克隆序列，其中包括21个中和性抗体和171个结合性抗体。对抗体亚型、轻重链类型分析，抗体Kappa链和lambda链，以及V，J区基因类型的分布与抗体基因组类型的分布类似，并无明显差异。提示，HCMV病毒感染，并不会影响免疫系统抗体基因的表型。而对21个明确具有中和作用的抗体基因分析发现，轻链为lambda链的克隆为12个，占中和作用抗体数目的57.2%。类似的现象同样出现在对HIV-1抗体的研究中。lambda链104 南京医科大学博士学位论文的CDR3的长度比Kappa链的CDR3长，这也许与其中和作用有关。将识别表位为gH五聚体的中和性抗体与识别表位为gB蛋白的中和性抗体可变区基因序列比较发现，为gH五聚体的中和性抗体，重链和轻链的CDR3长度均有显著增加。而21个中和性抗体中，与gH五聚体结合的抗体有15个，与gB蛋白结合的抗体仅有3个（另有3个与其他蛋白结合）。该结果再次证实，gH五聚体可作为中和性抗HCMV抗体研发中重要的靶抗原。针对该蛋白产生的抗体，具有一定的中和作用，防止HCMV病毒对上皮细胞的感染。综上所述，本部分研究证实感染HCMV病毒的患者体内存在大量抗HCMV抗体，其中大部分具有中和作用的抗体的表位为gH五聚体。因此，gH五聚体可作为开发与研制中和性抗HCMV抗体的靶抗原。本部分研究还筛选制备出多株具有较高中和活力的全人源抗体，为进一步研发治疗用全人源抗HCMV抗体提供理论和技术支持。105 南京医科大学博士学位论文全文小结1.本研究使用经基因修饰，包含有gH五聚体（gH，gL，pUL128，pUL130，pUL131）的AD169减毒病毒疫苗免疫家兔。经细胞融合和特异性筛选鉴定，获得45株兔源单克隆抗体，其中具有中和抗体作用抗体25株。将中和活力是HCMV-HIG的十倍以上的中和抗体作为优选抗体（11/25）。检测发现，8株优选抗体（8/11）识别的抗原是gH五聚体。绝大部分的结合性抗体并不具有或兼具中和活力，且靶向gB蛋白。基因组分析结果显示，45株单克隆抗体来自于26个B细胞组，组内抗体的抗原结合特性和中和活性较为统一。中和性抗体的HCDR3和LCDR3平均长度为15.9AA和12.3AA，明显比非中和性抗体的LCDR313.0AA（P=0.009）和HCDR310.9AA（P=0.009）均值高。2.本研究采用基因工程技术和抗体工程技术，成功制备、表达和纯化出5株人兔嵌合抗HCMV抗体和3株人源化抗HCMV抗体。抗体特异性检测表明，重组后的人兔嵌合抗体和人源化抗体内非人源基因的比例明显降低，且保持一定的中和活力或结合活力。抗HCMV中和抗体可变区CDR3基因序列与抗体的特异性、VDJ区基因空间构象以及抗体的表达有直接作用。3.本研究选取高滴度HCMV感染者外周血，使用免疫磁珠筛选获得记忆型B细胞并进行单B细胞培养。设计人源抗体引物，并采用单B细胞PCR技术获得192株全人源抗HCMV抗体可变区序列。经病毒中和实验和抗原结合实验，确认其中21株为中和性抗HCMV抗体，15个中和性抗体的靶抗原为gH五聚体，占中和作用抗体总数的71.4%，12个中和性抗体（12/21）的轻链为lambda链，占中和作用抗体总数的57.2%。4.基于上述结果，证实gH五聚体是中和性HCMV抗体重要的靶抗原。靶向gH五聚体的抗HCMV人源化或全人源抗体，可应用于HCMV临床治疗及106 南京医科大学博士学位论文相关疫苗的研究。在开发与制备人源化或全人源中和性抗HCMV抗体的过程中，应注意抗体CDR3基因对抗体功能的影响。107 南京医科大学博士学位论文参考文献[1]RyanKJ,RayCG,eds.SherrisMedicalMicrobiology(4thed.).McGrawHill.pp.(2004).556;566–9[2]KoichiYamanishi;Arvin,AnnM.;GabriellaCampadelli-Fiume;EdwardMocarski;Moore,Patrick;Roizman,Bernard;Whitley,Richard.Humanherpesviruses:biology,therapy,andimmunoprophylaxis.Cambridge,UK:CambridgeUniversityPress.(2007)0-521-82714-0[3]S.Varani&M.P.Landini.Cytomegalovirus-inducedimmunopathologyanditsclinicalconsequences.Herpesviridae.(2011)2(6):6.[4]StarasSA,DollardSC,RadfordKW,FlandersWD,PassRF,CannonMJ.SeroprevalenceofcytomegalovirusinfectionintheUnitedStates,1988–1994.Clin.Infect.Dis.(2006)43(9):1143–51.[5]Britt,WilliamJ.CongenitalHumanCytomegalovirusInfectionandtheEnigmaofMaternalImmunity.JournalofVirology.(2017)91(15)[6]GederL,SanfordEJ,RohnerTJ,RappF.Cytomegalovirusandcanceroftheprostate:invitrotransformationofhumancells.CancerTreatRep.(1977)61(2):139–46.[7]T.Fülöp;A.Larbi&G.Pawelec.HumanTcellagingandtheimpactofpersistentviralinfections.FrontiersinImmunology.(2013)4:1–9[8]ElizabethG.Damato;CaitlinW.Winnen.Cytomegalovirusinfection:perinatalimplications.JObstetGynecolNeonatalNurs.(2006)31(1):86–92.[9]CarusoC,etal.Mechanismsofimmunosenescence.ImmunAgeing.(2009)6:10.[10]Gredmark-RussS,DzabicM,RahbarA,WanhainenA,BjörckM,LarssonE,MichelJB,Söderberg-NauclérC.Activecytomegalovirusinfectioninaorticsmoothmusclecellsfrompatientswithabdominalaorticaneurysm.JMolMed.(2009)87(4):347–56.[11]Lunn,M.;Hughes,R.TheRelationshipbetweenCytomegalovirusInfectionandGuillain-BarreSyndrome.ClinicalInfectiousDiseases.(2011)52(7):845–847.[12]MattesFM,McLaughlinJE,EmeryVC,ClarkDA,GriffithsPD.Histopathologicaldetectionofowl'seyeinclusionsisstillspecificforcytomegalovirusintheeraofhumanherpesviruses6and7.J.Clin.Pathol.(2000)53(8):612–4.[13]PassRF,ZhangC,EvansA,etal.Vaccinepreventionofmaternalcytomegalovirusinfection.N.Engl.J.Med.(2009)360(12):1191–9[14]AhnSY,LeeSY,KimBS,RheeKH,KimJH,SungIK,ParkHS,JinCJ.Cytomegalovirusinfection-relatedspontaneousintestinalperforationandaorto-entericfistulaafterabdominal108 南京医科大学博士学位论文aorticaneurysmalrepair.KoreanJGastroenterol（2010）55(1):62-7[15]WangL,ShaoC,YangC,KangX,ZhangG.Associationofanti-gangliosidesantibodiesandanti-CMVantibodiesinGuillain-Barrésyndrome.BrainBehav.（2017）7;7(5)[16]ZanoneMM,FavaroE,QuadriR,MiceliI,GiarettaF,RomagnoliR,DavidE,PerinPC,SalizzoniM,CamussiG.Associationofcytomegalovirusinfectionswithrecurrenceofhumoralandcellularautoimmunitytoisletautoantigensandoftype1diabetesinapancreastransplantedpatient.TransplInt.(2010)1;23(3):333-7[17]CasarinRC,DuartePM,SantosVR,LimaJA,GagnonG,CasatiMZ,GonçalvesRB.InfluenceofglycemiccontrolonEpstein-BarandCytomegalovirusinfectioninperiodontalpocketoftype2diabeticsubjects.ArchOralBiol.(2010);55(11):902-6[18]FarahMusaAR,FülöpT,KokkoK,KanyicskaB,LewinJR,CsongrádiÉ.Cytomegaloviruscolitisinacriticallyill,dialysis-dependent,acutekidneyinjurypatientwithoutimmunosuppressivetherapy.ClinNephrol.(2015);84(1):44-9[19]Serrano-AlonsoM,Guillen-GrimaF,Martin-MorenoP,RabagoG,ManriqueJ,Garcia-Del-BarrioM,ReinaG,Torre-CisnerosJ,Fernandez-AlonsoM,HerreroJI.Reductioninmortalityassociatedwithsecondarycytomegalovirusprophylaxisaftersolidorgantransplantation.TransplInfectDis.(2018)Mar[20]ChmielC,SpeichR,HoferM,MichelD,MertensT,BoehlerA.Ganciclovir/valganciclovirprophylaxisdecreasescytomegalovirus-relatedeventsandbronchiolitisobliteranssyndromeafterlungtransplantation.ClinInfectDis.(2008);46(6):831-9[21]JacobsenMC,ManuntaMDI,PincottES,FentonM,SimpsonGL,KleinNJ,BurchM.SpecificImmunitytoCytomegalovirusinPediatricCardiacTransplantation.Transplantation.(2018)[22]VarnumSM,StreblowDN,MonroeME,SmithP,AuberryKJ,Pasa-TolicL,WangD,CampDG2nd,RodlandK,WileyS,BrittW,ShenkT,SmithRD,NelsonJA.Identificationofproteinsinhumancytomegalovirus(HCMV)particles:theHCMVproteome.JVirol.(2004)78(20):10960-6.[23]PatroneM,CoroadinhaAS,TeixeiraAP,AlvesPM.PalmitoylationStrengthensCholesterol-dependentMultimerizationandFusionActivityofHumanCytomegalovirusGlycoproteinB(gB).JBiolChem.(2016)26;291(9):4711-22.[24]PiresF,SilvaH,Domínguez-RenedoO,Alonso-LomilloMA,Arcos-MartínezMJ,Dias-CabralAC.DisposableimmunosensorforhumancytomegalovirusglycoproteinBdetection.Talanta.(2015);136:42-6[25]RycelM,WujcickaW,ZawilińskaB,ParadowskaE,SuskiP,GajZ,WilczyńskiJ,Leśnikowski109 南京医科大学博士学位论文Z,NowakowskaD.MixedinfectionswithdistinctcytomegalovirusglycoproteinBgenotypesinPolishpregnantwomen,fetuses,andnewborns.EurJClinMicrobiolInfectDis.(2015)34(3):585-91[26]WuY,PragerA,BoosS,ReschM,BrizicI,MachM,WildnerS,ScrivanoL,AdlerB.HumancytomegalovirusglycoproteincomplexgH/gL/gOusesPDGFR-αasakeyforentry.PLoSPathog.(2017)12;13(4)[27]ZhouM,LanchyJM,RyckmanBJ.HumanCytomegalovirusgH/gL/gOPromotestheFusionStepofEntryintoAllCellTypes,whereasgH/gL/UL128-131BroadensVirusTropismthroughaDistinctMechanism.JVirol.(2015);89(17):8999-9009[28]WakefieldA,PignataA,GhaziA,AshooriA,HegdeM,LandiD,GrayT,ScheurerME,ChintagumpalaM,AdesinaA,GottschalkS,HicksJ,PowellSZ,AhmedN.IsCMVatargetinpediatricglioblastoma?ExpressionofCMVproteins,pp65andIE1-72andCMVnucleicacidsinacohortofpediatricglioblastomapatients.JNeurooncol.(2015);125(2):307-15[29]HwangES,ZhangZ,CaiH,HuangDY,HuongSM,ChaCY,HuangES.HumancytomegalovirusIE1-72proteininteractswithp53andinhibitsp53-dependenttransactivationbyamechanismdifferentfromthatofIE2-86protein.JVirol.(2009);83(23):12388-98[30]Shi-ChenOuD1,LeeSB,ChuCS,ChangLH,ChungBC,JuanLJ.TranscriptionalactivationofendoplasmicreticulumchaperoneGRP78byHCMVIE1-72protein.CellRes.(2011);21(4):642-53.[31]AvdicS,McSharryBP,SlobedmanB.ModulationofdendriticcellfunctionsbyviralIL-10encodedbyhumancytomegalovirus.FrontMicrobiol.(2014)4;5:337[32]BacaJonesCC1,KreklywichCN,MessaoudiI,VomaskeJ,McCartneyE,OrloffSL,NelsonJA,StreblowDN.RatcytomegalovirusinfectiondepletesMHCIIinbonemarrowderiveddendriticcells.Virology.(2009)25;388(1):78-90.[33]TomtishenJP3rd.Humancytomegalovirustegumentproteins(pp65,pp71,pp150,pp28).VirolJ.（2012）17;9:22[34]GyulaiZ,EndreszV,BurianK,PincusS,ToldyJ,CoxWI,MericC,PlotkinS,GönczölE,BerencsiK.CytotoxicTlymphocyte(CTL)responsestohumancytomegaloviruspp65,IE1-Exon4,gB,pp150,andpp28inhealthyindividuals:reevaluationofprevalenceofIE1-specificCTLs.JInfectDis.(2000);181(5):1537-46[35]GilA,ShenS,ColeyS,GibsonL,DiamondDJ,WangS,LuS.Humancytomegalovirustegumentproteins(pp65,pp71,pp150,pp28).HumVaccinImmunother.(2013);9(10):2120-32[36]PlotkinSA,BoppanaSB.Vaccinationagainstthehumancytomegalovirus.Vaccine.2018Apr110 南京医科大学博士学位论文2[37]WuSE,MillerWE.TheHCMVUS28vGPCRinducespotentGαq/PLC-βsignalinginmonocytesleadingtoincreasedadhesiontoendothelialcells.Virology.(2016)497:233-243.[38]FoutsAE,ChanP,StephanJP,VandlenR,FeierbachB.AntibodiesagainstthegH/gL/UL128/UL130/UL131complexcomprisethemajorityoftheanti-cytomegalovirus(anti-CMV)neutralizingantibodyresponseinCMVhyperimmuneglobulin.JVirol.(2012);86(13):7444-7[39]NigroG,AdlerSP,LaTorreR,BestAM;CongenitalCytomegalovirusCollaboratingGroupPassiveimmunizationduringpregnancyforcongenitalcytomegalovirusinfection.NEnglJMed(2005)353(13):1350–1362.[40]MacagnoA,etal.IsolationofhumanmonoclonalantibodiesthatpotentlyneutralizehumancytomegalovirusinfectionbytargetingdifferentepitopesonthegH/gL/UL128-131Acomplex.JVirol(2010)84(2):1005–1013.[41]FuTM,etal.Restorationofviralepithelialtropismimprovesimmunogenicityinrabbitsandrhesusmacaquesforawholevirionvaccineofhumancytomegalovirus.Vaccine(2012)30(52):7469–7474.[42]NadelB,FeeneyAJNucleotidedeletionandPadditioninV(D)Jrecombination:Adeterminantroleofthecoding-endsequence.MolCellBiol(1997)17(7):3768–3778.[43]WuX,etal.FocusedevolutionofHIV-1neutralizingantibodiesrevealedbystructuresanddeepsequencing.Science(2011)333(6049):1593–1602.[44]VarnumSM,etal.Identificationofproteinsinhumancytomegalovirus(HCMV)particles:TheHCMVproteome.JVirol(2004)78(20):10960–10966.[45]ComptonTReceptorsandimmunesensors:Thecomplexentrypathofhumancytomegalovirus.TrendsCellBiol(2004)14(1):5–8.[46].WillePT,KnocheAJ,NelsonJA,JarvisMA,JohnsonDCAhumancytomegalovirusgO-nullmutantfailstoincorporategH/gLintothevirionenvelopeandisunabletoenterfibroblastsandepithelialandendothelialcells.JVirol(2010)84(5):2585–2596.[47].RevelloMG,GernaGHumancytomegalovirustropismforendothelial/epithelialcells:Scientificbackgroundandclinicalimplications.RevMedVirol(2010)20(3):136–155.[48]BrittWVirusentryintohost,establishmentofinfection,spreadinhost,mechanismsoftissuedamage.HumanHerpesviruses:Biology,Therapy,andImmunoprophylaxis,(2007)(CambridgeUnivPress,Cambridge).[49]CannonMJ,etal.Awarenessofandbehaviorsrelatedtochild-to-mothertransmissionof111 南京医科大学博士学位论文cytomegalovirus.PrevMed(2012)54(5):351–357.[50]LilleriD,etal.FetalhumancytomegalovirustransmissioncorrelateswithdelayedmaternalantibodiestogH/gL/pUL128-130-131complexduringprimaryinfection.PLoSOne(2013)8(3):e59863.[51]GernaG,etal.Humancytomegalovirusserumneutralizingantibodiesblockvirusinfectionofendothelial/epithelialcells,butnotfibroblasts,earlyduringprimaryinfection.JGenVirol(2008)89(Pt4):853–865.[52]GernaG,etal.Humancytomegalovirusreplicatesabortivelyinpolymorphonuclearleukocytesaftertransferfrominfectedendothelialcellsviatransientmicrofusionevents.JVirol(2000)74(12):5629–5638.[53]GernaG,PercivalleE,SarasiniA,RevelloMGHumancytomegalovirusandhumanumbilicalveinendothelialcells:Restrictionofprimaryisolationtobloodsamplesandsusceptibilitiesofclinicalisolatesfromothersourcestoadaptation.JClinMicrobiol(2002)40(1):233–238.[54]WaldmanWJ,KnightDA,HuangEH,SedmakDDBidirectionaltransmissionofinfectiouscytomegalovirusbetweenmonocytesandvascularendothelialcells:Aninvitromodel.JInfectDis(1995)171(2):263–272.[55]AraiY,etal.Effectsofintrapulmonaryviraltropismandcytokineexpressiononthehistologicalpatternsofcytomegaloviruspneumonia.PatholInt(2012)62(9):628–639.[56]RummeltV,etal.Tripleretinalinfectionwithhumanimmunodeficiencyvirustype1,cytomegalovirus,andherpessimplexvirustype1.Lightandelectronmicroscopy,immunohistochemistry,andinsituhybridization.Ophthalmology(1994)101(2):270–279.[57]SaeedAF,WangR,LingS,WangS.AntibodyEngineeringforPursuingaHealthierFuture.FrontMicrobiol.(2017)28;8:495[58]SiddiquiMZ.Monoclonalantibodiesasdiagnostics;anappraisal.IndianJPharmSci.(2010);72(1):12-7.[59]NieriP,DonadioE,RossiS,AdinolfiB,PodestàA.Antibodiesfortherapeuticusesandtheevolutionofbiotechniques.CurrMedChem.(2009);16(6):753-79.Review.[60]DebbageP.Targeteddrugsandnanomedicine:presentandfuture.CurrPharmDes.(2009);15(2):153-72.Review.[61]YamashitaM,KatakuraY,ShirahataS.Recentadvancesinthegenerationofhumanmonoclonalantibody.Cytotechnology.(2007);55(2-3):55-60[62]JacksonKJ,WangY,CollinsAM.HumanimmunoglobulinclassesandsubclassesshowvariabilityinVDJgenemutationlevels.ImmunolCellBiol.(2014);92(8):729-33.112 南京医科大学博士学位论文[63]Kazemi-LomedashtF,MuyldermansS,Habibi-AnbouhiM,BehdaniM.Designofahumanizedantivascularendothelialgrowthfactornanobodyandevaluationofitsinvitrofunction.IranJBasicMedSci.(2018);21(3):260-266.[64]ZettlitzKA,TavaréR,KnowlesSM,StewardKK,TimmermanJM,WuAM.ImmunoPETofMalignantandNormalBCellswith89Zrand124I-LabeledObinutuzumabAntibodyFragmentsRevealsDifferentialCD20InternalizationInVivo.ClinCancerRes.(2017)1;23(23):7242-7252.[65]SunF,WangT,JiangJ,WangY,MaZ,LiZ,HanY,PanM,CaiJ,WangM,ZhangJ.Engineeringahigh-affinityhumanizedanti-CD24antibodytotargethepatocellularcarcinomabyanovelCDRgraftingdesign.Oncotarget.(2017)19;8(31):51238-51252.[66]LebozecK,Jandrot-PerrusM,AvenardG,Favre-BulleO,BillialdP.Design,developmentandcharacterizationofACT017,ahumanizedFabthatblocksplatelet'sglycoproteinVIfunctionwithoutcausingbleedingrisks.MAbs.(2017);9(6):945-958[67]WagnerEK,WangX,BuiA,MaynardJA.SynergisticNeutralizationofPertussisToxinbyaBispecificAntibodyInVitroandInVivo.ClinVaccineImmunol.(2016);23(11):851-862[68]ChoiY,NdongC,GriswoldKE,Bailey-KelloggC.Computationallydrivenantibodyengineeringenablessimultaneoushumanizationandthermostabilization.ProteinEngDesSel.(2016);29(10):419-426[69]BurkovitzA,OfranY.Understandingdifferencesbetweensyntheticandnaturalantibodiescanhelpimproveantibodyengineering.MAbs.(2016);8(2):278-87.[70]BujotzekA,LipsmeierF,HarrisSF,BenzJ,KuglstatterA,GeorgesG.VH-VLorientationpredictionforantibodyhumanizationcandidateselection:Acasestudy.MAbs.(2016);8(2):288-305.[71]ChenYQ,WohlboldTJ,ZhengNY,HuangM,HuangY,NeuKE,LeeJ,WanH,RojasKT,KirkpatrickE,HenryC,PalmAE,StamperCT,LanLY,TophamDJ,TreanorJ,WrammertJ,AhmedR,EichelbergerMC,GeorgiouG,KrammerF,WilsonPC.InfluenzaInfectioninHumansInducesBroadlyCross-ReactiveandProtectiveNeuraminidase-ReactiveAntibodies.Cell.(2018);173(2):417-429.[72]Marrón-LiñaresGM,NúñezL,Crespo-LeiroMG,Álvarez-LópezE,Barge-CaballeroE,Barge-CaballeroG,Couto-MallónD,Pradas-IrunC,MuñizJ,TanC,RodríguezER,Vázquez-RodríguezJM,Hermida-PrietoM.DonorPolymorphismsinGenesRelatedtoB-CellBiologyAssociatedWithAntibody-MediatedRejectionAfterHeartTransplantation.CircJ.(2018)113 南京医科大学博士学位论文[73]HoriA,FujimuraT,KawamotoS.Anti-inflammatoryintravenousimmunoglobulin(IVIg)suppresseshomeostaticproliferationofBcells.Cytotechnology.(2018)Apr2[74]PechtI.Immuno-receptors:fromrecognitiontosignalingandfunction.EurBiophysJ.(2018)Mar29.[75]ChaudharyN,WesemannDR.AnalyzingImmunoglobulinRepertoires.FrontImmunol.(2018);9:462[76]AkgünK,MetzI,KitzlerHH,BrückW,ZiemssenT.RescuetherapywithalemtuzumabinBcell/antibody-mediatedmultiplesclerosis.TherAdvNeurolDisord.(2018Ma);11:[77]JafariB,Hamzeh-MivehroudM,Moosavi-MovahediAA,DastmalchiS.IdentificationofNovelSingle-DomainAntibodiesagainstFGF7UsingPhageDisplayTechnology.SLASDiscov.(2018);23(2):193-201.[78]WangH,LiuR,ZhangW,SunL,NingZ,JiF,CuiJ,ZhangG.Identificationofepitopesonnonstructuralprotein7ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusrecognizedbymonoclonalantibodiesusingphage-displaytechnology.VirusGenes.(2017);53(4):623-635[79]KangXZ,GuoXR,ChenBB,ZhangTY,YuanQ,ChenPJ,ZhangJ,XiaNS.TheuniqueantibodysuppressesHBVviremiaandreduceshepatocarcinogenesisinHBV-transgenicmice.HumVaccinImmunother.(2018)13:1-7.[80]AyméG,AdamF,LegendreP,BazaaA,ProulleV,DenisCV,ChristopheOD,LentingPJ.ANovelSingle-DomainAntibodyAgainstvonWillebrandFactorA1DomainResolvesLeukocyteRecruitmentandVascularLeakageDuringInflammation-BriefReport.ArteriosclerThrombVascBiol.(2017Sep);37(9):1736-1740[81]SaeedAF,WangR,LingS,WangS.AntibodyEngineeringforPursuingaHealthierFuture.FrontMicrobiol.(2017)28;8:495[82]YangW,YoonA,LeeS,KimS,HanJ,ChungJ.Next-generationsequencingenablesthediscoveryofmorediversepositiveclonesfromaphage-displayedantibodylibrary.ExpMolMed.(2017)24;49(3):e308[83]ShimH.AntibodyPhageDisplay.AdvExpMedBiol.(2017);1053:21-34[84]BlancoE,Perez-AndresM,Sanoja-FloresL,WentinkM,PelakO,Martín-AyusoM,GrigoreG,Torres-CanizalesJ,López-GranadosE,KalinaT,vanderBurgM,Arriba-MéndezS,SantaCruzS,PuigN,vanDongenJJM,OrfaoA.SelectionandvalidationofantibodyclonesagainstIgGandIgAsubclassesinswitchedmemoryB-cellsandplasmacells.JImmunolMethods.(2017)28.114 南京医科大学博士学位论文[85]PatilHP,HerreraRodriguezJ,deVries-IdemaJ,MeijerhofT,FrijlinkHW,HinrichsWLJ,HuckriedeA.AdjuvantationofPulmonary-AdministeredInfluenzaVaccinewithGPI-0100PrimarilyStimulatesAntibodyProductionandMemoryBCellProliferation.Vaccines(Basel).(2017)27;5(3).[86]FuF,LiL,ShanL,YangB,ShiH,ZhangJ,WangH,FengL,LiuP.Aspike-specificwhole-porcineantibodyisolatedfromaporcineBcellthatneutralizesbothgenogroup1and2PEDVstrains.VetMicrobiol.(2017);205:99-105.[87]MaoX,ZhangJ,HanY,LuanC,HuY,HaoZ,ChenM.DeficientforendoplasmicreticulumcalciumsensorsStim1andStim2affectsaberrantantibodyaffinitymaturationinBcells.Oncotarget.(2016)20;7(38):60885-60895[88]MorrisL,MkhizeNN.ProspectsforpassiveimmunitytopreventHIVinfection.PLoSMed.(2017)14;14(11):[89]PainterSD,HaralambievaIH,OvsyannikovaIG,GrillDE,PolandGA.DetectionofinfluenzaA/H1N1-specifichumanIgG-secretingBcellsinolderadultsbyELISPOTassay.ViralImmunol.(2014);27(2):32-8[90]KoutsakosM,WheatleyAK,LohL,ClemensEB,SantS,NüssingS,FoxA,ChungAW,LaurieKL,HurtAC,RockmanS,LappasM,LoudovarisT,ManneringSI,WestallGP,ElliotM,TangyeSG,WakimLM,KentSJ,NguyenTHO,KedzierskaK.CirculatingTFHcells,serologicalmemory,andtissuecompartmentalizationshapehumaninfluenza-specificBcellimmunity.SciTranslMed.(2018)14;10(428).[91]AndrewsSF,GrahamBS,MascolaJR,McDermottAB.IsItPossibletoDevelopa"Universal"InfluenzaVirusVaccine?ImmunogeneticConsiderationsUnderlyingB-CellBiologyintheDevelopmentofaPan-SubtypeInfluenzaaVaccineTargetingtheHemagglutininStem.ColdSpringHarbPerspectBiol.(2017)29[92]KaplonH,Dieu-NosjeanMC.WhichfutureforBlymphocytesinfiltratingsolidtumors:prognosticbiomarkerand/ortherapeutictarget?MedSci(Paris).(2018);34(1):72-78.[93]MarshallMJE,StopforthRJ,CraggMS.TherapeuticAntibodies:WhatHaveWeLearntfromTargetingCD20andWhereAreWeGoing?FrontImmunol.(2017)4;8:1245[94]JoachimsML,LeehanKM,LawrenceC,PelikanRC,MooreJS,PanZ,RasmussenA,RadfarL,LewisDM,GrundahlKM,KellyJA,WileyGB,ShugayM,ChudakovDM,LessardCJ,StoneDU,ScofieldRH,MontgomeryCG,SivilsKL,ThompsonLF,FarrisAD.Single-cellanalysisofglandularTcellreceptorsinSjögren'ssyndrome.JCIInsight.(2016)2;1(8).[95]SongY,ZhangM,TaoX,XuZ,ZhangL,ZhengY,ZhuM,GaoL.ASingle-Cell-TypeReal-115 南京医科大学博士学位论文TimePCRMethodBasedonaModifiedPatch-PipetteCellHarvestingSystem.MolBiotechnol.(2016);58(8-9):558-65[96]SprouseML,BlahnikG,LeeT,TullyN,BenarjeeP,JamesEA,RedondoMJ,BettiniML,BettiniM.StreamlinedSingleCellTCRIsolationandGenerationofRetroviralVectorsforInVitroandInVivoExpressionofHumanTCRs.JVisExp.(2017)10;(127)116 南京医科大学博士学位论文综述：人巨细胞病毒疫苗的研发【摘要】人类巨细胞病毒（HCMV）广泛存在于不同种族人群中，是发达国家先天性病毒感染最为常见的原因。开发HCMV疫苗可以提高生活质量，大幅降低后期治疗的经济成本，也有益于预防或改善免疫受损个体的HCMV疾病。因此，HCMV疫苗的发展已被医学研究所确定为一项重大的公共卫生优先事项。目前，HCMV疫苗在临床预防中没有得到许可，但在过去二十年中该疫苗的开发已经得到了巨大的进步。已进行的HCMV疫苗临床试验包括：糖蛋白B亚单位疫苗；甲病毒复制子颗粒疫苗；DNA疫苗；减毒活疫苗。在临床前研究和感染动物模型研究中也正在探索各种疫苗设计策略，包括：重组水疱性口炎病毒疫苗；重组改良型痘苗病毒安卡拉；复制缺陷型腺病毒载体疫苗和减毒活疫苗；重组鼠CMV基因组克隆在大肠杆菌细菌人工染色体诱变产生的保护作用等。本文，概述了HCMV疫苗在临床试验和临床前研究的发展现状，总结了近期有关HCMV生物学研究领域的一些进展，这将对未来HCMV疫苗的研发产生重要意义。【关键词】人巨细胞病毒疫苗感染预防巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV），亦称细胞包涵体病毒，是一种疱疹病毒组DNA病毒[1]。其特点是增殖缓慢，复制周期长，且具有高度种属特异性[2]。人或动物感染后，造成被感染细胞肿大变圆，核变大，核内出现典型的大型嗜酸性包涵体[3]。巨细胞病毒分布广泛，可以引起以生殖泌尿系统、中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，严重感染可造成死亡[4]。CMV感染可分为以下类型：⑴原发感染：先天性感染和围生期感染；⑵继发性感染：生后感染或获得性感染。除此之外，也可根据有无症状分为症状性感117 南京医科大学博士学位论文染或全身性感染，以及无症状性感染（asymptomaticinfection）或亚临床型感染（subclinicalinfection）这两类[5]。机体的细胞免疫功能对CMV感染的发生和发展起重要作用，细胞免疫缺陷者可导致严重的和长期的CMV感染[6]。对于免疫功能正常的感染者，原发感染CMV后能产生特异性抗体和杀伤性T淋巴细胞，激活NM细胞，但只能发挥机体有限抗病毒能力而无法预防再次感染[7]。CMV在人群中感染非常广泛，中国成人感染率达95%以上，通常呈隐性感染，多数感染者无临床症状[8]。病毒可以侵袭多个器官和系统产生严重疾病，如妊娠母体感染后可以导致早产、流产以及死产；儿童及成人感染后可引起单核细胞增多症、肝炎、间质性肺炎、视网膜炎、脑炎等疾病[10]。CMV病毒具有潜在致癌的可能性，在宫颈癌、结肠癌、前列腺癌、Kaposis肉瘤等肿瘤中，通过CMVDNA以及CMV抗体滴度检测均发现相关检验指标明显高于正常人[9]。目前该领域的研究重点之一是如何预防孕妇的先天性感染[11]。CMV感染对发育中的胎儿通常会造成毁灭性的后果，有研究表明，在孕妇怀孕期间先天感染率是0.5-2%。HCMV在胎儿期的传播可能发生在孕期的任何时候，但初次感染一般发生在妊娠的前半段时间，胎儿出现不良反应的风险似乎是最高的[12]。在先天感染的婴儿中，大约有10%的婴儿在出生时会有症状，其余90%的婴儿在出生时无症状，有10-15%的婴儿会产生永久性后遗症，包括感觉神经性耳聋和智力迟钝[13]。与唐氏综合症或胎儿酒精综合症相比，更多的儿童因为感染先天性巨细胞病毒而患有长期的神经发育障碍[14]。孕前母体对HCMV的免疫可以一定程度上保护胎儿免受病毒的垂直传播，所以HCMV的孕前疫苗研发尤为重要[15]。文献报道关于母体感染HCMV并传播给胎儿的概率差异性较大（24-75%），但风险都很高[16]。最新Meta分析的传播风险为30%。在怀孕期间产妇反复感染并向胎儿传播巨细胞病毒的风险只有0.15-2%。然而母体反复感染HCMV出生的先天感染婴儿的总数比母体原发性感染后出生的婴儿的总数高出4-5倍[16,17]。这些结果表明，血清阳性免疫而防止118 南京医科大学博士学位论文再感染的疫苗比血清阴性更为重要。Fowler等人研究孕前免疫结果显示，血清HCMV阳性妇女比血清阴性妇女今后妊娠中先天感染HCMV的风险降低了69%，与妇女怀孕期间获得原发性感染病毒并传播给出生的婴儿相比，获得孕前免疫的妇女不仅显著降低了传播病毒给胎儿的几率，而且还可以降低婴儿先天性感染疾病的程度[18]。据报道在怀孕期间母亲患有原发性HCMV感染的先天性感染婴儿中，有25%至少有一个后遗症；而在有复发性感染的妇女中，婴儿出生后发生的先天感染率只有8%[19]。这些关于孕前母体免疫保护作用的数据肯定了孕产妇疫苗研发的重要性，目的是减少先天性HCMV的发生率，以及发生垂直传播后，有效降低疾病的严重程度[20]。从理论上说，HCMV疫苗也可能有益于其他可能感染HCMV的高危人群，包括移植受体、造血干细胞移植患者和恶性肿瘤患者[21]。但从经济和社会效益看，育龄孕前妇女的HCMV疫苗是研发的重要人群，可以降低先天性感染导致婴儿神经发育损伤的严重程度[22]。HCMV疫苗是“21世纪的疫苗”，在这篇文章中，我们总结了二十年以来巨细胞病毒疫苗的发展，并提出了未来的疫苗新策略。一、HCMV疫苗临床研究1.HCMV-gB特异性表位疫苗所有感染HCMV的患者都表现为gB阳性，人巨细胞病毒包膜糖蛋白（gB）是病毒感染性中一种必需的病毒糖蛋白[23-25]。人血清中HCMV对GB表位具有特异性识别能力，最新一项研究表明HCMV-gB疫苗可与MF59联合使用[26]。本研究在血清阴性的育龄妇女中随机进行，并设立的阴性对照。在疫苗接种后随访半年，分别为0、1、6个月，用病毒培养或免疫印迹证实原发性HCMV的感染，结果显示HCMV-gB疫苗组感染率8%（18/225），阴性对照组14%（31/216），总有效率为50%(95%CI:7–73%)。是否可以将gB疫苗广泛地应用到临床实践中，要根据巨细胞病毒在人群中感染率而定[27]。HCMV基本再生数（R0）约为1.7-119 南京医科大学博士学位论文2.5，意味着只有1.7-2.5个人会因为接触到一个被感染的人而感染[26]。另一项研究表明，如果50%（R0=1.7）或60%（R0=2.5）的人口被控制不受感染，HCMV就可以在这个群体里根除。因此虽然病毒R0与天花相似（R0=2.3-2.4），但是对高度暴露HCMV的人群进行第二阶段研究中发现，50%的gB疫苗的效能足以防止HCMV在一个群里内传播。在HCMV-gB疫苗组和阴性对照组中，婴儿先天性感染HCMV的发生率分别是1.2%（1/81）和3.1%(3/97)。阴性对照组中有一名婴儿先天性HCMV感染并有严重的临床症状。该研究的样本量较小，不足以证明新生儿的感染率与疫苗疗效的关系，也没有解决疫苗诱导HCMV免疫对胎儿的感染率或后遗症的调节是否等同于自然免疫的问题[28]。HCMV-gB疫苗组发生的局部和全身反应多于阴性对照组，但多数反应轻微且短暂。总体的不良事件发生率和严重程度相比，HCMV-gB疫苗组和阴性对照组之间没有显著差异，说明HCMV-gB疫苗的安全性有待提高[29]。2．HCMV-gB/pp65双元件颗粒疫苗gB和磷蛋白65（pp65，又名ppUL83）是通过CD4+T细胞提呈的最常见HCMV抗原，同时pp65也是CD8+T细胞最常见的提呈抗原，因此，该疫苗的免疫机制是pp65蛋白刺激T细胞活化[30]。在HCMV感染过程中CD8+T细胞最重要的一个靶点是HCMV直接-早期蛋白（IE1，72kDa），在HCMV血清阳性的受试者中IE1特异性反应蛋白的阳性率高达40%，因此，IE1基因产物也被作为候选疫苗的特异性靶点[31]。甲病毒复制子载体系统多被用于传染病预防性和治疗性疫苗的开发平台。研究者利用甲病毒疫苗来预防HCMV感染，该项研在血清反应阴性的成年自愿者中进行，入选受试者符合随机双盲原则。AVX601是双元件甲病毒复制子颗粒疫苗，可以表达HCMV-gB和pp65融合蛋白[32]。将20个巨细胞病毒血清反应阴性的受试者分为2个实验组，其中第1组受试者接受低剂量的疫苗（1×107感染单位），第2组受试者接受高剂量的疫苗（1×108感染单120 南京医科大学博士学位论文位）。于0、8、24周接受肌肉或皮下注射后检测，第1组中93%和第2组中100%的受试者中均检出中和抗体。通过culturedELISpot法和exvivoELISpot法检测T细胞对HCMV抗原的反应性，两组反应强度相近（P＞0.05）。T细胞对pp65、gB、IE1三者的反应量级依次增大[33]。多色流式细胞仪检测证实HCMV抗原特异性CD4+和CD8+效应T细胞在HCMV刺激下可产生多种细胞因子，并且所有注射了AVX601疫苗的受试者中诱导免疫反应均可出现[34]。该疫苗的耐受性良好，有个别出现轻度到中度的全身和局部副作用，表现为红斑和硬结，但都在出现症状一周后消失，临床数据在注射前后无明显变化。这些结果支持AVX601疫苗在安全范围内，接下来需要进一步提高AVX601疫苗预防育龄妇女巨细胞病毒感染的能力来预防先天性巨细胞病毒病[35]。3.双价HCMV核糖核酸疫苗众所周知，HCMV疫苗的潜在价值并不局限于预防先天性感染[36]。对于一些免疫功能低下的人群也是HCMV疫苗接种的目标人群，在免疫功能低下的人群中注射HCMV-DNA疫苗可以消除减毒活病毒疫苗或重组活病毒载体疫苗里带来的安全隐患[37]。在原则上DNA疫苗非常适合疫苗设计的特异性和精确度，而且DNA疫苗能产生大量的CD4+和CD8+T细胞和抗体反应[24,38]。虽然DNA疫苗在移植患者和肿瘤病人上使用是安全有效的，有利于预防感染，但是用于孕妇和婴儿预防巨细胞病毒感染，还有待将来去验证。在甲病毒属类，HCMV-DNA疫苗主要的免疫原是gB和pp65免疫原[39]。VCL-CB01是双质粒编码HCMV-pp65和gB的双价HCMV-DNA疫苗，正在进行临床一期评估[27]。在甲病毒属类，HCMV-DNA疫苗主要的免疫原是gB和pp65免疫原。VCL-CB01是双质粒编码HCMV-pp65和gB的双价HCMV-DNA疫苗，正在进行临床一期评估[40]。通过16周的临床试验观察，有45.5%HCMV血清阴性的受试者和25%HCMV血清阳性受试者都产生了HCMV免疫抗体，其中68.2%（15/22人）的血清阴性受121 南京医科大学博士学位论文试者分别通过culturedELISpot法和exvivoELISpot法都检测到pp65（+）和/或gB（+），而且还验证了在检测T细胞活性方面，culturedELISpot法比exvivoELISpot法的灵敏度更高。这些结果表明VCL-CB01疫苗具有激活抗原特异性T细胞的能力和增殖、分泌IFN-γ的抗原再刺激能力[41]。虽然疫苗增强了现有的pp65抗原T细胞反应，但VCL-CB01疫苗的局限性是在HCMV血清阳性受试者中gB抗体的滴度不高。这种疫苗还需要进一步优化免疫原性，特别是对gB（+）和人巨细胞病毒血清阳性的群体[41-43]。VCL-CB01疫苗的一般耐受性良好，最常见的不良事件（AES）是注射部位轻微和中度的疼痛，未见严重的不良反应[41]。虽然在81.8%的受试者中有短暂或轻度不适发生，但随着剂量和次数的增加，AES的严重程度并显著增加，所有受试者均未见后遗症。这些HCMV疫苗临床安全数据与在其他的一期临床试验数据相一致，并且支持VCL-CB01的可持续研究[44]。对VCL-CB01安全性和免疫原性进行II期临床评估，利用接受同种异体造血干细胞移植（HCT）的供体者和受体者进行[45]。VCL-CB01疫苗接种患者中HCMV感染的发生、HCMV感染的复发、血清中DNA的持续时间、累积病毒载量曲线下的区域以及血清中DNA的峰值水平范围是24%-70%[46]。此外，首次病毒重新激活的时间也缩短了，而且一个并行的分析表明，接受疫苗的人需要更短的抗病毒治疗时间，而且与安慰剂组相比，他们更不可能进行抗病毒治疗[47]。第二阶段试验的最终结果将会对HCMV血清阳性的移植受者的HCMV疾病的发展战略有价值，并可能引领VCL-CB01或相关疫苗的其他试验，以预防先天性HCMV感染[12]。4HCMVTowne减毒活疫苗在已研发的几种HCMV疫苗并进行的人体试验中，减毒活Towne疫苗是研究最多、最广泛、时间最长的疫苗[48]。虽然Towne疫苗不能阻止肾移植患者的122 南京医科大学博士学位论文感染，但能防止血清反应阴性的肾移植患者出现HCMV疾病。最近研究表明，Towne疫苗的不足之处在于接种疫苗后CD4+和CD8+T细胞无法产生足够的抗原特异性IFN-γ反应[49]。目前有研究正在探索提高疫苗免疫原性的方法。方法一是通过基因重组技术，用不衰减的HCMVToledostrain基因取代Towne基因的相应部分。方法二是使用HCMVDNA疫苗促进Towne疫苗的记忆性免疫应答。方法三是将Towne疫苗和重组人（RH）IL-12共同使用。以下进行逐一介绍。rhIL-12辅助Towne疫苗的免疫原性和安全性处于I期临床评估阶段，利用HCMV阴性的健康受试者测定使用剂量[50]。rhIL-12的佐剂效应与抗HCMV-gB抗体滴度峰值和剂量增加有关，并增强病毒裂解特异性CD4+T细胞增殖反应。接种Towne疫苗并给予0.5μg或更高剂量hIL-12后，所有受试者都会对pp65抗原出现阳性CD8+T细胞IFN-γ反应。通过全血HCMV-DNA的PCR和尿HCMV培养证实，辅以剂量高达2μGrhIL-12的Towne疫苗是可耐受的，并不会引起Towne耐药。因此，Towne佐剂疫苗能保证在HCMV阴性受试者上进行更多研究是足够安全的[51]。最近报道了提高Towne的免疫原性的另一种方法，其中HCMV-DNA疫苗用于启动记忆反应[52]。VCL-CT02是一种含有HCMV基因pp65、IE1和gB的DNA疫苗。VCL-CT02的启动记忆反应的效应也在一系列的I期临床试验中被评估[53]。60%的肌内注射受试者中被发现HCMV特异性记忆T细胞能通过酶联免疫斑点测定法。Twone疫苗接种后第一次pp65T细胞反应和gB抗体反应的中位时间对经过DNA准备的受试者是14天，对只接种Twone疫苗的受试者是28天，这提示一种更快速的抗原特异性反应(allp<0.05bylog-ranktest)。虽然单独的DNA疫苗具有低免疫原性，免疫接种vcl-ct02能对Twone疫苗安全地作出回忆应答[54]。在肌肉或皮内试验，vcl-ct02耐受性良好，无严重不良事件。最常见的AES是轻微和短暂的局部反应，如疼痛，红斑和肿胀注射部位。所有接种Twone疫苗后的尿HCMV培养都是阴性的。我们需要研究如何提高免疫原性和123 南京医科大学博士学位论文检测其抑制HCMV感染过程的能力。增强Towne疫苗免疫原性的最后一种方法是制造Towne和Toledo的嵌合体疫苗，这些疫苗保留一些基因突变，显然有助于Towne疫苗衰减。在一项双盲、安慰剂对照研究中，研制了四种独立嵌合疫苗并进行了测试。健康成人志愿者虽然接种了Towne/Toledo嵌合体疫苗，但未能提高HCMV的体液免疫和细胞免疫应答，这四种候选疫苗耐受性良好，并没有引起全身感染[55]。为了确保这四种候选疫苗在HCMV阴性受试者中的安全性和免疫原性故还需进一步研究。二、HCMV疫苗临床前研究已经有一些研发的新疫苗在动物实验阶段获得了很好的结果，并被批准用于临床一期试验，下面综述一些正在动物实验阶段疫苗的设计和预防策略。1.重组水泡性口炎病毒表达小鼠巨细胞病毒抗原gB粘膜表面在HCMV感染中起关键作用。HCMV可通过唾液、性接触、胎盘移植、输血、固体器官移植或HCT传播[56]。水平传播HCMV的侵入门户为鼻腔、口腔和生殖器粘膜。作为重组疫苗载体，水泡性口炎病毒（VSV）可诱导强烈的体液和细胞免疫，尤其是在粘膜表面。这个属性使得重组VSV（RVSV）成为开发HCMV疫苗的一个重要选择[57]。为验证该种疫苗，在小鼠模型中，利用活rVSV表达载体表达的小鼠巨细胞病毒（MCMV）gB蛋白同源物已经在研发中。为了检测黏膜rVSV-gB疫苗保护机体免受CMV感染的效果，在小鼠鼻内接种rVSV-gB，4周后所有免疫小鼠均产生了血清抗体。rVSV-gB的免疫反应诱导了中和抗体反应，导致MCMV感染后肺组织匀浆中病毒滴度减少。rVSV-gB免疫小鼠的脾细胞对gB产生CD8+IFN-γ响应，这表明rVSV-gB刺激细胞免疫应答[58]。该实验中免疫小鼠表现出最小的AES，该动物试验的安全性和免疫原性数据支持这一策略在人类临床试验中的进一步研究。124 南京医科大学博士学位论文2．重组修饰痘苗病毒Ankara改良型痘苗病毒安卡拉（MVA）的减毒病毒，被视为授权牛痘病毒衍生品的一个更安全的替代，可作为潜在的天花疫苗，并已建立了一个安全、有效的抗原传递系统[59]。MVA能将异种抗原作为的疫苗，MVA的一个重要特点是可以适应大量外来基因，这与MVA基因组的6个缺失有关，而这一特点又支持插入多个HCMV基因而不影响后续抗原的复制或包装。基于AD169序列，可分泌的HCMV-gB抗原，构建重组MVA疫苗。在临床前研究中，接种MVA-gB疫苗的小鼠能出现滴度很高的gB特异性中和抗体，这个剂量相当于佐剂亚单位gB蛋白免疫或天然HCMV感染人类引起的水平[60]。MVA-gB免疫产生了与gb特异性抗体反应非常相似的水平，并且无论先前存在的MVA或牛痘病毒免疫，都具有类似的增效作用。一种表达gB、pp65和IE1的三价MVA已经被开发和用于临床研究，这种三价MVA疫苗在小鼠免疫接种后，可有效地诱导体液和细胞免疫。人体研究方面，实验使用了两名健康的志愿者，他们的外周血单核细胞（PBMCs）是用三价MVA疫苗免疫[61]。在本实验中，出现了特异性细胞毒性T细胞反应的蛋白pp65和IE1。这些特性源于MVA疫苗设计原理。在恒河猴巨细胞病毒感染模型中对重组MVA疫苗进行了评价。该项研究中，为恒河猴注射这一抗原的NDA质粒疫苗后，一种表达恒河CMV-gB病毒pp65-2和IE1同源物的MVA生成。在这项研究中，第一次重组MVA增强后，只注射单次DNA质粒的恒河猴比未注射的恒河猴更早出现更强的抗体和细胞免疫反应。在第二次MVA增强后，两组免疫组中均能检测到gb和pp65-2抗体反应水平，以及pp65特异性的CD4+和CD8+T细胞。除了MVA组无法检测到抗IE1抗体外，与未经处理的对照组相比，两组疫苗组的血浆峰值病毒载量均有所降低[61,62]。这些来自具有高度相关性的非人类灵长类动物模型的数据强调了MVA型疫苗预防HCMV感染和疾病的潜力，并证明这些疫苗在临床试验是可行的。125 南京医科大学博士学位论文3．复制缺陷型腺病毒载体的多表位疫苗临床前研究中另一个被关注的载体疫苗是利用一个复制缺陷的腺病毒载体来表达CMV亚基候选疫苗，类似于rVSV疫苗，在鼠模型中使用复制缺陷型腺病毒接种于鼻粘膜，通过全身和粘膜免疫可诱导表达MCMV-gB或糖蛋白H[63-65]。最近，研发的经过修饰的腺病毒载体Ad5F35，可表达基于AD169序列的HCMV-gB免疫原性蛋白。在体外感染Ad5F35后，来自健康献血者的PBMCs表达为高水平AD-1抗原且没有细胞病理效应[66]。因为AD-1抗原表位在不同的HCMV菌株之间是守恒的，所以AD5F35上的AD-1抗原表位被认为会引起对不同临床分离株的中和抗体反应。在候选亚基HCMV疫苗开发和测试的临床试验中，大多数研究集中在gB、pp65和IE1上。然而，还有许多其他的HCMV编码蛋白在宿主免疫应答中也起着关键作用的[34,67-69]。一种新的复制缺乏腺病毒载体疫苗Ad-gBCMVpoly被设计用来诱导广泛的HCMV特异性免疫反应[70]。Ad-gBCMVpoly编码46个HCMV-T细胞的表位的多种抗原，如IE1、IE2、pp50、pp65、pp150、gB、gH和DNase[71]。这个HLA类I型受限T细胞多抗原决定基与HCMV-gB抗原的胞外域相连接，这使得HCMV多肽和gB蛋白的表达成为单一的融合蛋白[10,72]。用这种嵌合疫苗接种小鼠后可以使抗体反应和病毒特异性CD4+和CD8+T细胞反应在模型中得到中和。注射了这种嵌合疫苗的小鼠强烈地抵抗了表达HCMV抗原和IE1的重组牛痘病毒的感染[73]。随着疫苗体外刺激，在HCMV血清阳性个体中，有多种抗原特异性的CD4+和CD8+T细胞快速扩张[74,75]。Ad-gBCMVpoly疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫,它在不同临床情况中可能是有用的,从先天性感染(免疫球蛋白在保护胎儿中发挥着关键作用),到免疫缺陷患者的原发性或二次感染HCMV(T细胞可能是保护的关键因素)[76]。这种多抗原决定疫苗可以用任何一种载体来传递，包括DNA疫苗或重组蛋白疫苗，进一步强调其在各种方法中潜在的价值，这些方法旨在保护高危宿主对抗HCMV感染和/或疾病[77]。126 南京医科大学博士学位论文4．细菌人工染色体突变重组活巨细胞病毒疫苗为了便于生产，可将减毒HCMV疫苗在细胞培养液培养到满意的滴度水平，因为即使在免疫缺陷的宿主体内，减毒HCMV疫苗也会被严重削弱，并且应该引起强烈的免疫反应，足以抵抗HCMV相关疾病[78,79]。产生这种疫苗的一种新颖的方法是对CMV基因靶向删除调节宿主的免疫反应。这种方法可通过克隆CMV基因组的突变得到促进[80]。为了验证这个疫苗的可行性，通过MCMV-BAC诱变产生重组MCMV病毒（左右两端共缺失32个基因的野生型基因组，Δm01-17+m144-158-mcmv），这个MCMV突变失去了基因M01-17和m144-158，可被大多数已知的免疫调节剂调节MHC-1表达（M04、M06和M152）和自然杀伤（NK）细胞反应（M144，M145，M152，155和M157）[81]。重组基因突变在体外复制到野生型水平，但在免疫能力强的B/c小鼠体内，甚至在缺少NKB细胞和T细胞且对MCMV最敏感的鼠株scid/bg小鼠体内，都被严重削弱了。但在缺乏I型干扰素受体的小鼠中得到了很好的耐受性[82]。重组缺失突变基因可诱导MCMV特异性抗体和一种特定的细胞免疫反应，该反应能通过对外围细胞毒性CD8+T淋巴细胞的染色检测到，保护小鼠免受野生型MCMV感染。使用UV灭活重组缺失突变体进行免疫接种后发现，对野生型MCMV没有保护性免疫作用，这表明成功的保护病毒在体内的复制是必要的[83]。通过BAC突变基因对CMV基因进行靶向删除，为活的减毒活CMV疫苗的基本原理设计提供了一个新颖且有价值的工具[65]。动物模型的临床前评估可通过在病毒基因移除之后实验性确定候选疫苗的衰减和免疫原性来帮助生成重组疫苗，这些病毒基因的去除会在发病机理和/或免疫逃逸中发挥作用[84]。展望有效的HCMV疫苗要求既能刺激机体产生体液免疫，也能刺激机体产生细胞免疫。最近研究表明，给原发感染的孕妇注射特异的抗HCMV的免疫球蛋白，增加了特异IgG的浓度和活性，明显阻断母婴传播和降低出生儿的致残几率。一127 南京医科大学博士学位论文个用MF59佐剂包被gB的重组HCMV疫苗在对年轻母亲的II期临床试验中被发现对HCMV感染有预防作用[85]。因此对于怀孕的妇女来说，体液免疫发挥决定性作用，疫苗诱导产生的中和抗体足够限制或延缓HCMV的感染。但是对于器官移植者，细胞毒性T细胞的免疫更为重要。对于抗HCMV血清阴性患者接受抗HCMV血清阳性的供体器官，体液免疫在原发感染中同样起着重要的作用。这就要求我们根据不同的接种对象，选择不同成份配伍的亚单位疫苗，以更经济、有效地预防HCMV病毒感染。如果将几种保护性抗原同时免疫机体，也许能诱导类似于自然感染所获得的免疫，以保证最大限度地发挥疫苗的保护作用。如何研发预防和治疗HCMV感染的最佳疫苗还有待我们继续探讨，在理想情况下，HCMV疫苗会引起体液免疫和细胞免疫，而不存在潜伏HCMV感染或活病毒载体的潜在风险[86,87]。最佳的疫苗可用于免疫器官的育龄妇女或接受器官移植的免疫低下患者[88]，因此如何研制有效的CMV疫苗仍是广大科研工作者亟需攻克的一座堡垒。最近在人类巨细胞病毒生物学研究方面的一些进展已经确定了新的潜在疫苗靶点，为未来疫苗的设计和研发奠定了基础。参考文献[1]BarrettAJ.CMV:whenbadvirusesturngood.Blood2011;118:1193-1194.[2]BerenC,DreesensLL,LiuKN,KnoblerCMandGelbartWM.TheEffectofRNASecondaryStructureontheSelf-AssemblyofViralCapsids.BiophysJ2017;113:339-347.[3]ChenL,FeiC,ZhuL,XuZ,ZouW,YangT,LinHandXiD.RNA-seqapproachtoanalysisofgeneexpressionprofilesindarkgreenislandsandlightgreentissuesofCucumbermosaicvirus-infectedNicotianatabacum.PLoSOne2017;12:e0175391.[4]CinjaS,SabineT,DariaD,ConstancaF,LiliaG,Hans-GertH,MurielleV,StephanI,AlbertHandSylviaB.CMV-,EBV-andADV-specificTcellimmunity:screeningandmonitoringofpotentialthird-partydonorstoimprovepost-transplantationoutcome.BiologyofBlood&MarrowTransplantationJournaloftheAmericanSocietyforBlood&MarrowTransplantation2013;19:1480-1492.[5]DieamantDC,BononSH,PeresRM,CostaCR,AlbuquerqueDM,MirandaEC,AranhaFJ,128 南京医科大学博士学位论文Oliveira-DuarteG,FernandesVCandSouzaCAD.Cytomegalovirus(CMV)genotypeinallogeneichematopoieticstemcelltransplantation.BmcInfectiousDiseases2013;13:310.[6]FutierE,ConstantinJM,CombaretL,MosoniL,RoszykL,SapinV,AttaixD,JungB,JaberSandBazinJE.Pressuresupportventilationattenuatesventilator-inducedproteinmodificationsinthediaphragm.CritCare2008;12:R116.[7]GhassemiF,MadadgarO,RoohvandF,RasekhianM,EtemadzadehMH,BoroujeniGRN,LangroudiAGandAzadmaneshK.[TranslationalefficiencyofBVDVIRESandEMCVIRESforT7RNApolymerasedrivencytoplasmicexpressioninmammaliancelllines].MolBiol(Mosk)2017;51:324-333.[8]GiménezE,.,Mu?Oz-CoboB,.,SolanoC,.,AmatP,.,CámaraR,DeLa,NietoJ,.,LópezJ,.,RemigiaMJ,Garcia-NoblejasA,.andNavarroD,.Functionalpatternsofcytomegalovirus(CMV)pp65andimmediateearly-1-specificCD8(+)TcellsthatareassociatedwithprotectionfromandcontrolofCMVDNAemiaafterallogeneicstemcelltransplantation.TransplantInfectiousDisease2015;17:361-370.[9]GörzerI,KerschnerH,RedlbergerfritzMandPuchhammerstöcklE.Humancytomegalovirus(HCMV)genotypepopulationsinimmunocompetentindividualsduringprimaryHCMVinfection.JournalofClinicalVirologytheOfficialPublicationofthePanAmericanSocietyforClinicalVirology2010;48:100-103.[10]ZhongJ,RistM,CooperL,SmithCandKhannaR.Inductionofpluripotentprotectiveimmunityfollowingimmunisationwithachimericvaccineagainsthumancytomegalovirus.PlosOne2008;3:e3256.[11]GratamaJW,BrooimansRA,HoltBVD,SintnicolaasK,DoornumGV,NiestersHG,LöwenbergBandCornelissenJJ.MonitoringcytomegalovirusIE‐1andpp65‐specificCD4+andCD8+T‐cellresponsesafterallogeneicstemcelltransplantationmayidentifypatientsatriskforrecurrentCMVreactivations.CytometryPartBClinicalCytometry2008;74B:211-220.[12]GreenML,LeisenringWM,XieH,WalterRB,MielcarekM,SandmaierBM,RiddellSRandBoeckhM.CMVreactivationafterallogeneicHCTandrelapserisk:evidenceforearlyprotectioninacutemyeloidleukemia.Blood2013;122:1316-1324.[13]GuoQ,ZhuN,BuMM,GuoSC,YanXJ,ChenQandChenMH.ConstructionofANewRandomShortHairpinRNALibraryBasedonmicroRNAContext.ZhongguoYiXueKeXueYuanXueBao2017;39:518-524.[14]HanleyPJ,MelenhorstJJ,NikiforowS,ScheinbergP,BlaneyJW,DemmlerharrisonG,Cruz129 南京医科大学博士学位论文CR,LamS,KranceRAandLeungKS.CMV-specificTcellsgeneratedfromnaïveTcellsrecognizeatypicalepitopesandmaybeprotectiveinvivo.ScienceTranslationalMedicine2015;7:285ra263.[15]IkutaK,MinematsuT,InoueN,KuboT,AsanoK,IshibashiK,ImamuraT,NakaiH,YoshikawaTandMoriuchiH.Cytomegalovirus(CMV)glycoproteinH-basedserologicalanalysisinJapanesehealthypregnantwomen,andinneonateswithcongenitalCMVinfectionandtheirmothers.JournalofClinicalVirologytheOfficialPublicationofthePanAmericanSocietyforClinicalVirology2013;58:474-478.[16]ItoI,AsaiA,SuzukiS,KobayashiMandSuzukiF.M2bmacrophagepolarizationaccompaniedwithreductionoflongnoncodingRNAGAS5.BiochemBiophysResCommun2017;493:170-175.[17]ItoS,PophaliP,CoW,KoklanarisEK,SuperataJ,FahleGA,ChildsR,BattiwallaMandBarrettAJ.CMVreactivationisassociatedwithalowerincidenceofrelapseafterallo-SCTforCML.BoneMarrowTransplantation2013;48:1313-1316.[18]JeonEJ,TadamuraK,MurakamiT,InabaJI,KimBM,SatoM,AtsumiG,KuchitsuK,MasutaCandNakaharaKS.rgs-CaMDetectsandCounteractsViralRNASilencingSuppressorsinPlantImmunePriming.JVirol2017;91:[19]KingBR,HershkowitzD,EisenhauerPL,WeirME,ZieglerCM,RussoJ,BruceEA,BallifBAandBottenJ.AMapoftheArenavirusNucleoprotein-HostProteinInteractomeRevealsthatJuninVirusSelectivelyImpairstheAntiviralActivityofDouble-StrandedRNA-ActivatedProteinKinase(PKR).JVirol2017;91:[20]LaRC,LongmateJ,LaceySF,KaltchevaT,SharanR,MarsanoD,KwonP,DrakeJ,WilliamsBandDenisonS.ClinicalEvaluationofSafetyandImmunogenicityofPADRE-Cytomegalovirus(CMV)andTetanus-CMVFusionPeptideVaccinesWithorWithoutPF03512676Adjuvant.JournalofInfectiousDiseases2012;205:1294-1304.[21]LoureiroJandPloeghHL.Antigenpresentationandtheubiquitin-proteasomesysteminhost-pathogeninteractions.AdvImmunol2006;92:225-305.[22]MartíngandulC,PérezromeroP,GonzálezronceroFM,BerdaguerS,GómezMA,LageE,SánchezM,CisnerosJMandCorderoE.ClinicalimpactofneutropeniarelatedwiththepreemptivetherapyofCMVinfectioninsolidorgantransplantrecipients.JournalofInfection2014;69:500-506.[23]NavarroD,San-JuanR,ManuelO,Gimã©NezE,Fernãn-RM,HirschHH,GrossiPA,AguadoJMandGroupECSS.Cytomegalovirusinfectionmanagementinsolidorgantransplant130 南京医科大学博士学位论文recipientsacrossEuropeancentersinthetimeofmoleculardiagnostics:AnESGICHsurvey.TransplantInfectiousDisease2017;e12773.[24]DvorakJA,KobayashiS,KazuhiroA,FujiwaraT,TakeuchiTandNagaoE.Theapplicationoftheatomicforcemicroscopetostudiesofmedicallyimportantprotozoanparasites.JournalofElectronMicroscopy2000;49:429.[25]GlassM,BuscheA,WagnerK,MesserleMandBorstEM.Conditionalandreversibledisruptionofessentialherpesvirusproteins.NatureMethods2009;6:577-579.[26]PapadopoulouA,GerdemannU,KatariUL,TzannouI,LiuH,MartinezC,LeungK,CarrumG,GeeAPandVeraJF.Activityofbroad-spectrumTcellsastreatmentforAdV,EBV,CMV,BKV,andHHV6infectionsafterHSCT.ScienceTranslationalMedicine2014;6:242ra283.[27]GirouardD,GallantJ,AkiyoshiDE,NunnariJandTziporiS.FailuretopropagateCryptosporidiumspp.incell-freeculture.JournalofParasitology2006;92:399-400.[28]RoeCJ,SiddiquiMT,LawsonDandCohenC.RNAInSituHybridizationforEpstein-BarrVirusandCytomegalovirus:ComparisonWithInSituHybridizationandImmunohistochemistry.ApplImmunohistochemMolMorphol2017;[29]SchmidthieberM,LabopinM,BeelenD,VolinL,EhningerG,FinkeJ,SociéG,SchwerdtfegerR,KrögerNandGanserA.CMVserostatusstillhasanimportantprognosticimpactindenovoacuteleukemiapatientsafterallogeneicstemcelltransplantation:areportfromtheAcuteLeukemiaWorkingPartyofEBMT.Blood2013;122:3359-3364.[30]TamisierL,RousseauE,BarrailleS,NemouchiG,SzadkowskiM,MailleretL,GrognardF,FabreF,MouryBandPalloixA.QuantitativetraitlociinpeppercontroltheeffectivepopulationsizeoftwoRNAvirusesatinoculation.JGenVirol2017;98:1923-1931.[31]ThomsonKJ,MackinnonSandPeggsKS.CMV-specificcellulartherapyforacutemyeloidleukemia?Blood2012;119:1088-1090.[32]TormoN,SolanoC,BenetI,NietoJ,DelCR,LópezJ,GarcianoblejasA,MuñozcoboB,CostaEandClariMA.ReconstitutionofCMVpp65andIE-1-specificIFN-γCD8(+)andCD4(+)T-cellresponsesaffordingprotectionfromCMVDNAemiafollowingallogeneichematopoieticSCT.BoneMarrowTransplantation2011;46:1437-1443.[33]BhalchandraS,LudingtonJ,CoppensIandWardHD.IdentificationandcharacterizationofCryptosporidiumparvumClec,anovelC-typelectindomain-containingmucin-likeglycoprotein.Infection&Immunity2013;81:3356.[34]WangZ,ZhouW,SrivastavaT,RosaCL,MandarinoA,FormanSJ,ZaiaJA,BrittWJandDiamondDJ.AFusionProteinofHCMVIE1exon4andIE2exon5StimulatesPotentCellular131 南京医科大学博士学位论文ImmunityinanMVAVaccineVector.Virology2008;377:379-390.[35]YongMK,CameronPU,SlavinM,MorrisseyCO,BerginK,SpencerA,RitchieD,ChengAC,SamriAandCarcelainG.IdentifyingCytomegalovirus(CMV)complicationsusingtheQuantiferon-CMVassayafterAllogeneicHematopoieticStemCellTransplantation.JournalofInfectiousDiseases2017;215:[36]CheckleyW,JrWA,JaganathD,ArrowoodMJ,ChalmersRM,ChenXM,FayerR,GriffithsJK,GuerrantRLandHedstromL.Areviewoftheglobalburden,noveldiagnostics,therapeutics,andvaccinetargetsforcryptosporidium.LancetInfectiousDiseases2015;15:85.[37]ZhouWD,LongmateJ,LaceySF,PalmerJM,GallezhawkinsG,ThaoL,SpielbergerR,NakamuraR,FormanSJandZaiaJA.ImpactofdonorCMVstatusonviralinfectionandreconstitutionofmultifunctionCMV-specificTcellsinCMV-positivetransplantrecipients.Blood2009;113:6465-6476.[38]AssfalgR,AlupeiMC,WagnerM,KochS,GonzalezOG,SchellingA,Scharffetter-KochanekKandIbenS.CellularsensitivitytoUV-irradiationismediatedbyRNApolymeraseItranscription.PLoSOne2017;12:e0179843.[39]AudouxJ,SalsonM,GrossetCF,BeaumeunierS,HolderJM,CommesTandPhilippeN.SimBA:AmethodologyandtoolsforevaluatingtheperformanceofRNA-Seqbioinformaticpipelines.BMCBioinformatics2017;18:428.[40]KotloffKL,NataroJP,BlackwelderWC,NasrinD,FaragTH,PanchalingamS,WuY,SowSO,SurDandBreimanRF.Burdenandaetiologyofdiarrhoealdiseaseininfantsandyoungchildrenindevelopingcountries(theGlobalEntericMulticenterStudy,GEMS):aprospective,case-controlstudy.Lancet2013;382:209-222.[41]BousquetMS,MaJJ,RatnayakeR,HavrePA,YaoJ,DangNH,PaulVJ,CarneyTJ,DangLHandLueschH.MultidimensionalScreeningPlatformforSimultaneouslyTargetingOncogenicKRASandHypoxia-InducibleFactorsPathwaysinColorectalCancer.ACSChemBiol2016;11:1322-1331.[42]MoradaM,LeeS,Gunther-CumminsL,WeissLM,WidmerG,TziporiSandYarlettN.ContinuouscultureofCryptosporidiumparvumusinghollowfibertechnology.InternationalJournalforParasitology2016;46:21-29.[43]MüllerJandHemphillA.Invitroculturesystemsforthestudyofapicomplexanparasitesinfarmanimals.InternationalJournalforParasitology2013;43:115-124.[44]ChenSW,ZhuJ,MaJ,ZhangJL,ZuoS,ChenGW,WangX,PanYS,LiuYCandWangPY.Overexpressionoflongnon-codingRNAH19isassociatedwithunfavorableprognosisin132 南京医科大学博士学位论文patientswithcolorectalcancerandincreasedproliferationandmigrationincoloncancercells.OncolLett2017;14:2446-2452.[45]DeAlmeidaCV,ZamameJA,RomagnoliGG,RodriguesCP,MagalhaesMB,AmedeiAandKanenoR.Treatmentofcoloncancercellswith5-fluorouracilcanimprovetheeffectivenessofRNA-transfectedantitumordendriticcellvaccine.OncolRep2017;38:561-568.[46]PoveyJF,O'MalleyCJ,RootT,MartinEB,MontagueGA,FearyM,TrimC,LangDA,AlldreadRandRacherAJ.Rapidhigh-throughputcharacterisation,classificationandselectionofrecombinantmammaliancelllinephenotypesusingintactcellMALDI-ToFmassspectrometryfingerprintingandPLS-DAmodelling.JournalofBiotechnology2014;184:84-93.[47]GengR,TanX,ZuoZ,WuJ,PanZ,ShiW,LiuR,YaoC,WangG,LinJ,QiuL,HuangWandChenS.SyntheticlethalshorthairpinRNAscreeningrevealsthatringfingerprotein183confersresistancetotrametinibincolorectalcancercells.ChinJCancer2017;36:63.[48]HuangFT,ChenWY,GuZQ,ZhuangYY,LiCQ,WangLY,PengJF,ZhuZ,LuoX,LiYH,YaoHRandZhangSN.ThenovellongintergenicnoncodingRNAUCCpromotescolorectalcancerprogressionbyspongingmiR-143.CellDeathDis2017;8:e2778.[49]LallanaE,RiosdelaRosaJM,TirellaA,PellicciaM,GennariA,StratfordIJ,PuriS,AshfordMandTirelliN.Chitosan/HyaluronicAcidNanoparticles:RationalDesignRevisitedforRNADelivery.MolPharm2017;14:2422-2436.[50]LeeM,LaphamA,BrimmellM,WilkinsonHandPackhamG.InhibitionofproteasomaldegradationofMcl-1bycobaltchloridesuppressescobaltchloride-inducedapoptosisinHCT116colorectalcancercells.Apoptosis2008;13:972-982.[51]LianY,XuY,XiaoC,XiaR,GongH,YangP,ChenT,WuD,CaiZ,ZhangJandWangK.Thepseudogenederivedfromlongnon-codingRNADUXAP10promotescolorectalcancercellgrowththroughepigeneticallysilencingofp21andPTEN.SciRep2017;7:7312.[52]MilacicV,BanerjeeS,Landis-PiwowarKR,SarkarFH,MajumdarAPandDouQP.Curcumininhibitstheproteasomeactivityinhumancoloncancercellsinvitroandinvivo.CancerRes2008;68:7283-7292.[53]MurdoccaM,MangoR,PucciS,BioccaS,TestaB,CapuanoR,PaolesseR,SanchezM,OrlandiA,diNataleC,NovelliGandSangiuoloF.Thelectin-likeoxidizedLDLreceptor-1:anewpotentialmoleculartargetincolorectalcancer.Oncotarget2016;7:14765-14780.[54]SukhthankarM,YamaguchiK,LeeSH,McEnteeMF,ElingTE,HaraYandBaekSJ.Agreenteacomponentsuppressesposttranslationalexpressionofbasicfibroblastgrowthfactorin133 南京医科大学博士学位论文colorectalcancer.Gastroenterology2008;134:1972-1980.[55]CroughTandKhannaR.Immunobiologyofhumancytomegalovirus:frombenchtobedside.ClinicalMicrobiologyReviews2009;22:76.[56]BoeckhMandGeballeAP.Cytomegalovirus:pathogen,paradigm,andpuzzle.JournalofClinicalInvestigation2011;121:1673.[57]LilleriDandGernaG.Strategiestocontrolhumancytomegalovirusinfectioninadulthematopoieticstemcelltransplantrecipients.Immunotherapy2016;8:1135-1149.[58]BironKK.Antiviraldrugsforcytomegalovirusdiseases.AntiviralResearch2006;71:154.[59]AshrafA,ChakravartiA,RoyP,KarPandSiddiquiO.FrequencyofnucleotidesequencevariationsintheinternalribosomeentrysiteregionofhepatitisCvirusRNAisolatedfromrespondingandnon-respondingpatientswithhepatitisCvirusgenotype3infection.Virusdisease2016;27:251-259.[60]CoteRJandDatarRH.Therapeuticapproachestobladdercancer:identifyingtargetsandmechanisms.CritRevOncolHematol2003;46Suppl:S67-83.[61]FreitasS,MartinsR,CamposA,AzevedoJ,OsorioH,CostaM,BarrosP,VasconcelosVandUrbatzkaR.Insightsintothepotentialofpicoplanktonicmarinecyanobacteriastrainsforcancertherapies-CytotoxicmechanismsagainsttheRKOcoloncancercellline.Toxicon2016;119:140-151.[62]CottinghamMGandCarrollMW.RecombinantMVAvaccines:dispellingthemyths.Vaccine2013;31:4247-4251.[63]GómezCE,PerdigueroB,García-ArriazaJ,CepedaV,Sánchez-SorzanoCÓ,MotheB,JiménezJL,Muñoz-FernándezMÁandGatellJM.APhaseIRandomizedTherapeuticMVA-BVaccinationImprovestheMagnitudeandQualityoftheTCellImmuneResponsesinHIV-1-InfectedSubjectsonHAART.PlosOne2015;10:e0141456.[64]RyanU,PapariniA,MonisPandHijjawiN.It'sofficial–Cryptosporidiumisagregarine:Whataretheimplicationsforthewaterindustry?WaterResearch2016;105:305–313.[65]ShahiduzzamanM,DyachenkoV,ObwallerA,UnglaubeSandDaugschiesA.CombinationofcellcultureandquantitativePCRforscreeningofdrugsagainstCryptosporidiumparvum.VeterinaryParasitology2009;162:271-277.[66]HardwickNR,CarrollM,KaltchevaT,QianD,LimD,LeongL,ChuP,KimJ,ChaoJandFakihM.p53MVAtherapyinpatientswithrefractorygastrointestinalmalignancieselevatesp53-specificCD8+T-cellresponses.ClinicalCancerResearchAnOfficialJournalofthe134 南京医科大学博士学位论文AmericanAssociationforCancerResearch2014;20:4459.[67]KhandelwalN,ChanderY,RawatKD,RiyeshT,NishanthC,SharmaS,JindalN,TripathiBN,BaruaSandKumarN.EmetineinhibitsreplicationofRNAandDNAviruseswithoutgeneratingdrug-resistantvirusvariants.AntiviralRes2017;144:196-204.[68]MeyerJ,HarrisSA,SattiI,PoultonID,PoyntzHC,TannerR,RowlandR,GriffithsKL,FletcherHAandMcshaneH.ComparingthesafetyandimmunogenicityofacandidateTBvaccineMVA85Aadministeredbyintramuscularandintradermaldelivery.Vaccine2013;31:1026-1033.[69]SinghA,GroverS,SinhaS,DasM,SomvanshiPandGroverA.MechanisticPrinciplesBehindMolecularMechanismofRifampicinResistanceinMutantRNAPolymeraseBetaSubunitofMycobacteriumtuberculosis.JCellBiochem2017;[70]SponsellerJK,GriffithsJKandTziporiS.TheEvolutionofRespiratoryCryptosporidiosis:EvidenceforTransmissionbyInhalation.ClinicalMicrobiologyReviews2014;27:575-586.[71]MitaniS.Evaluationofantiviraltherapyofherpes-viridaeinfectionswithaciclovirinchildhood.RinshoYakuri/japaneseJournalofClinicalPharmacology&Therapeutics2010;18:719-722.[72]ElkingtonR,WalkerS,CroughT,MenziesM,TellamJ,BharadwajMandKhannaR.ExVivoProfilingofCD8+-T-CellResponsestoHumanCytomegalovirusRevealsBroadandMultispecificReactivitiesinHealthyVirusCarriers.JournalofVirology2003;77:5226.[73]LinSR,YangHC,KuoYT,LiuCJ,YangTY,SungKC,LinYY,WangHY,WangCCandShenYC.TheCRISPR/Cas9SystemFacilitatesClearanceoftheIntrahepaticHBVTemplatesInVivo.MolecularTherapyNucleicAcids2014;3:e186.[74]JentarraGM,HeckMC,YounJW,KiblerK,LanglandJO,BaskinCR,AnanievaO,ChangYandJacobsBL.VacciniaviruseswithmutationsintheE3Lgeneaspotentialreplication-competent,attenuatedvaccines:scarificationvaccination.Vaccine2008;26:2860-2872.[75]GorlaSK,KavithaM,ZhangM,LiuX,SharlingL,GollapalliDR,StriepenB,HedstromLandCunyGD.Selectiveandpotentureainhibitorsofcryptosporidiumparvuminosine5'-monophosphatedehydrogenase.JournalofMedicinalChemistry2012;55:7759-7771.[76]HakkiM,MarshallEE,DeNiroKLandGeballeAP.BindingandnuclearrelocalizationofproteinkinaseRbyhumancytomegalovirusTRS1.JournalofVirology2006;80:11817-11826.[77]UnterholznerLandBowieAG.Theinterplaybetweenvirusesandinnateimmunesignaling:recentinsightsandtherapeuticopportunities.BiochemicalPharmacology2008;75:589-602.[78]BrandtT,HeckMC,VijaysriS,JentarraGM,CameronJMandJacobsBL.TheN-terminal135 南京医科大学博士学位论文domainofthevacciniavirusE3L-proteinisrequiredforneurovirulence,butnotinductionofaprotectiveimmuneresponse.Virology2005;333:263-270.[79]TziporiSandWidmerG.Ahundred-yearretrospectiveoncryptosporidiosis.TrendsinParasitology2008;24:184-189.[80]ElkingtonR,Naglaa,#x,ShoukryH,WalkerS,CroughT,FazouC,KaurA,Christopher,#x,WalkerMandKhannaR.Cross-reactiverecognitionofhumanandprimatecytomegalovirussequencesbyhumanCD4cytotoxicTlymphocytesspecificforglycoproteinBandH.EuropeanJournalofImmunology2004;34:3216–3226.[81]HallerOandWeberF.Pathogenicviruses:smartmanipulatorsoftheinterferonsystem.CurrTopMicrobiolImmunol2007;316:315-334.[82]GernaG,SarasiniA,PatroneM,PercivalleE,FiorinaL,CampaniniG,GallinaA,BaldantiFandRevelloMG.Humancytomegalovirusserumneutralizingantibodiesblockvirusinfectionofendothelial/epithelialcells,butnotfibroblasts,earlyduringprimaryinfection.JournalofGeneralVirology2008;89:853-865.[83]CuiX,MezaBP,AdlerSPandMcvoyMA.Cytomegalovirusvaccinesfailtoinduceepithelialentryneutralizingantibodiescomparabletonaturalinfection.Vaccine2008;26:5760.[84]WangDandShenkT.Humancytomegalovirusvirionproteincomplexrequiredforepithelialandendothelialcelltropism.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica2005;102:18153-18158.[85]HahnG,RevelloMG,PatroneM,PercivalleE,CampaniniG,SarasiniA,WagnerM,GallinaA,MilanesiGandKoszinowskiU.HumanCytomegalovirusUL131-128GenesAreIndispensableforVirusGrowthinEndothelialCellsandVirusTransfertoLeukocytes.JournalofVirology2004;78:10023.[86]LazzarottoT,VaraniS,GabrielliL,SpezzacatenaPandLandiniMP.NewAdvancesintheDiagnosisofCongenitalCytomegalovirusInfection.Intervirology1999;42:390-397.[87]ManleyTJ,LuyL,JonesT,BoeckhM,MutimerHandRiddellSR.ImmuneevasionproteinsofhumancytomegalovirusdonotpreventadiverseCD8+cytotoxicT-cellresponseinnaturalinfection.Blood2004;104:1075-1082.[88]KaranisPandAldeyarbiHM.EvolutionofCryptosporidiuminvitroculture.InternationalJournalforParasitology2011;41:1231-1242.136 南京医科大学博士学位论文附录1缩略语FBSFetalbovineserum胎牛血清ODOpticaldensity光密度DTTDithiothreitol二硫苏糖醇ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验PCRPolymerasechainreacrion多聚酶链式反应AmpAmpicillin氨节青霉素PBSPhosphatebuffersaline磷酸缓冲液HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶rmpRotationperminute每分钟转速SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠kDaKiloDalton千道尔顿FabFragmentofantigenbinding抗原结合片段CMVCytomegalovirus巨细胞病毒FRFragmentregion抗体骨架区CDRComplementaritydeterminingregion互补性决定区137 南京医科大学博士学位论文附录2抗HCMV兔源单克隆抗体可变区核酸序列45个抗HCMV兔源单克隆抗体重链可变区核酸序列>3.4HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTAACGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGCAGAGTCTCTGGAATAGACCTCAGTGCTAATGAAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAGAGGGGCTGGAATGGATCGGAACCCTTAGTTATCATAATATCCCACATTATGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGACCTCAAAATCACCAGTCCGACATCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGGCAGAGTGTTCACCAGTACTTCTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>15.1HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTGCTTATTCAGTGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAATCATTGGTCATTCTGGTAACACATACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCACTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTTTGTGCCAGAGAGGATTATAGATACGGTGACTATGGTTATTACTGGGACTTTAACTTCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>21.4HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGTCGCCTGATAAGGCCTGGAGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCCATGAAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAGAGGGGCTGGTGTGGATCGCCACCATTAGTTATGATCATACCCCATACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGTCAGAGTGTTCACCGGTACTGCTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCTTCA>30.2HCAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCTTCTGCATTCTCCTTCAGTAGCAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATGCATTTATGGTGGTGATGCCACCACATACTTTGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAGCCTCGTCGCCCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAAAGTATGCTGGTACTTATTTTTCCCGCTACTTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA>41.1HCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGCCGCCTGGTCAAGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTGACTATGTAATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAATGGATCGGAGTCATTTATGGTAGTGGTAGGATATACTACGCGGCCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCCTCTCCAGAACCTCGACCACGCTTGACCTGAAAATGACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGATCTAATAGTAATGGTGGGACTATGTATTTCAATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA138 南京医科大学博士学位论文>44.3HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGTAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCTTTGATAGGAATAGTGGCAGATATCACGCGAGCTGGGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCTCGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGTCTTATGGTAGTGACATTAGTTCCCTATATTGGTTTGACTTATGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>57.4HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGTCTACGACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCTGGAAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATCAATTGTTACTGGTAGTCGTACCACATGGTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGTCGACTACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGGGGAGTATGGTCATGATGGCTATGTTGATGGTACGATGGGATTAGGCTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>58.5HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTAACGCCTGGAGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTGCTTATTCAGTGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTCATTCTGGTAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTTTGTGCCAGAGAGGATTATAGATACGGTGACTATGGTTATTACTGGGACTTTAACTTCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCTTCA>60.6HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGGGAGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAATAACGCCTATTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGTTGGTAGTAGTGGTGGCACTTACTACGCGAGTTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAGCCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGGCCAGTCTGGCAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGAGTTTGCTTATTATGGTTATATTGATGCTGGTTGGGCTTATGTTCCATATGGCATGGACCTCTGGGGCCCAGGGACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>62.5HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACCCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAACAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTTGATCGCATGCATTTATACTATTATTGGTAACACATGGTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATAGATATTACTATAGTGATCCTTATACTGGTTATGCTTATGCTACGGGTTTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>70.7HCAGTCGGTGGAGGAGTCCAGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGTTACCACATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATATATTAATTATAATAATAATCCATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGCTCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACTCGGCCACGTATTTCTGTGCCAGAGCAGCTGGTAATTATTATGTGGGTGCCTTAAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA139 南京医科大学博士学位论文>76.3HCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACCCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAACAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTTGATCGCATGCATTTATACTAGGATTACTAACACATGGTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAAGCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTACTTCTGTGCGAGAGATAGATATTACTATAGTGATCCTTATACTGGTTATGCTTATGCTACGGGGTTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>90.4HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAATAGTTATGAAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAACGATTGGTTATGGTGGTATTACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGTCGACCACAATGGATCTAAGGATCGCCAGGCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGTTGTTCACCAGTACTGCTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>117.8HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAACAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGTATGCATTTATGCTGGTAGTAGTGGTTTCACTTACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAGATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATAGGGGTTACTATACTTATGGTTATGCTGGTTATGGTTATGGTATGGATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>124.4HCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCCGGATTCTCCCTCAGTAGCTGCAACATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGGGGCTGGAGTGGATCGGATACATTGCTGCCAGTGGTGACGCATTCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAGAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCGCGTATTTCTGTGCCAGAGGTTCCTATGCTGCTTATAATGCTTGGGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>202.3HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGTACTGCCTCTGGATTCACCATCGGTAGCGACTACTGGATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTCGTGATGTTGGTGGTGGTCACACTTTCTACGCGAGCTGGGCGGAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGGCAGCGGCGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGAGATAATGATGGTGATTGGTTCTATTTTGATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>203.5HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTTTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGGACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGGGGCTGGAGTGGATCGGATACATTTGGAGTAGTGGTACCTCATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTGCAAATCACCGGGCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGGGGGATCGGTGGTGATAATTATGGTGATATTTGGTTGGATCTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA140 南京医科大学博士学位论文>210.4HCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATACATTTGGAGTGGTGGTAGCACATACTACGCGAGTTGGGCGAAAGGCCGATTCGCCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCCAAAAATGGTGATAATGGGCAGTTGGATCTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>212.6HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTAGTAGTGGTAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGGATATAGCTACGATGACTATACCCCCTTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>216.5HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGTACTGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCGACTACTGGATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTCGTGATGTTGGTGGTGGTCACACTTTCTACGCGAGCTGGGCGGAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGGCAGCGGCGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGAGATAATGATGGTGATTGGTTCTATTTTGATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>223.4HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTGCTTATTCAGTGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTCATTCTGGTAACACATACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCTGACAATCGAGGACACGGCCACCTATTTTTGTGCCAGAGAGGATTATAGATACGGTGACTATGGTTATTACTGGGACTTTAACTTCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>228.8HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACAGCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCCACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGCTACATTAGTGGTAGTGGTAGTGCATCCTACGCGAGCTGGGTGAATGGGCCATTCGCCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGAGGGCTGGGCGTTGGGTTGGATCTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>230.7HCAGTCCGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGGCTCTGGATTCTCCCTCAGCAACTACGACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTAGTGGTAATAATCCATCCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATAGCCTGCCTTTTACTGATGATAGTACTGATTACTTTGCCTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>240.8HCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTAACGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGCGGAGTCTCTGGAA141 南京医科大学博士学位论文TAGACCTCAGTGCTAATGAAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAGAGGGGCTGGAATGGATCGGAACCCTTAGTTATCATAATATCCCACATTATGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGACCTCAAAATCACCAGTCCGACATCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGGCAGAGTGTTCACCAGTACTTCTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>247.8HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACCCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAACAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTTGATCGCATGCATTTATACTAGGATTACTAACACATGGTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAAGCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTACTTCTGTGCGAGAGATAGATATTACTATAGTGATCCTTATACTGGTTATGCTTATGCTACGGGGTTTAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>250.5HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTAACGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGCAGAGTCTCTGGAATAGACCTCAGTGCTAATGAAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAGAGGGGCTGGAATGGATCGGAACCCTTAGTTATCATAATATCCCACATTATGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAGCCTCGACCACGGTGGACCTCAAAATCACCAGTCCGACATCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGGCAGAGTGTTCACCAGTACTTCTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>269.6HCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTATCCCTCAGTAACTACAACATGGGCTGGGTCCGCCAGGGTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGCTTCATTAATGCTGGCAGTACAATATACTACGCGAACTGGGCAAAAGGCCGATTCACCATATCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTCAAAATCACCAGTCCGATAATCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGAAGATAGTTATGGTGGTTTTTTTGTCTTGGATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>270.7HCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGGCACTCACCTGCACAGCCTCTAGATTCTCCCTCAGTAGTAACCACATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGATATATTAATTATAATAATAATCCATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGCTCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACGTATTTCTGTGCCAGAGCAGCTGGTAATTATTATGTGGGTGCCTTGAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>271.1HCAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGCAGCTACGACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATACATTTGGAGTGGTGGTATCACGGACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCATCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAAATTTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA>272.7HCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGGGGGATCCCTGAAACTCTCCTGCAAAGCCTCTGGATTTGATGTTAGTAGTTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGGTACATTGA142 南京医科大学博士学位论文TCCTGTTTTTGGTACCACATACTACGCGAGCTGGGTGAATGGCCGATTCACCATCTCCAGCCACAACGCCCAGAACACGCTGTATCTGCAACTGAACAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGACCAATACACATGGTACTGGTGGCTATTACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>275.2HCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCGACTACTGGATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTCGTGATGTTGGTGGTGGTGACACTTTCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGGCAGCGGCGGACACGGCCACCTATTACTGTGCGAGAGATAATGATGGTGATTGGTTCTATTTTGATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCTTCA>276.1HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGGGACCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTGGCAGCTATTACATGTGTTGGGTCCGCCAGGCTCCTGGGACGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGATGGTGATTTGAGTGGTAGCGCTTACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCGGCACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAGTGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGAGGGGCCAGTTGGTGTTGGTAGTATTTATTTGGGGTTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>283.7HCAGTCGGTGGAGGAGTCCAGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATACATTTGGAGTGGTGGTAGCACATACTACGCGAGTTGGGCGAAAGGCCGATTCGCCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCCAAAAATGGTGATAATGGGCAGTTGGATCTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>289.3HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGGCTCTGGATTCTCCCTCAGCAACTACGACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTAGTGGTAATAATCCATCCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATAGCCTGCCTTTTACTGATGATAGTACTGATTACTTCGCCTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCAGCTCTTCA>292.1HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGAAGCTATGGAGTGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATACATTTGGAGTGGTGGTAGGACGGACTACGCGAGCTGGGTGAATGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCATCTATTTTTGTACCACGGAGGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA>295.5HCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCCGAGGGATCCCGGACATTCACCTGCACAGCTTCTGGATTCTCCTTCAGTAACAACTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGAGGATCGCATGCATTTATCCTGGTGGTAGCGGTAGTCTTTATTACGCGGACTGGGCGAGTGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGGCAGCCGCGGACACGGCCACCCATTTCTGTGCGAAATCTATTGGTA143 南京医科大学博士学位论文CTGGTAGTGCTTATATAATGGGGGCTGGCTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>302.1HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTTATAGTGGTAACAGCTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGGATATAGCTACGATGACTATACCCCCTTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>316.2HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGTTACCACATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATATATTAATAATAATGATAATCCATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGCTCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCAAGGACACGGCCACGTATTTCTGTGCCAGAGCAGCTGGTAATTACTATGTGGGTGCCTTGAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>324.4HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCCCAGTAGCTACAACATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGGGGCTGGAGTGGATCGGATACATTAGTACTAGTGGTAACACATTCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAGAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACGTATTTCTGTGCCAGAGGTTCCTATGTTGCTTATAATGCTTGGGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>331.4HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACCACATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTAATAATTATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGGCAAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAAGTCCTGGGATTCCTGGTTATAATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCTTCA>339.4HCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATCTATGGTGGTAGTGGCAGAACATGGTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGATATTATGATGGTAGTATTTATTTTAGTATATACTTGGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA>340.6HCAGTCGGTGAAGGAGTCCGAGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGTACTGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCGACTACTGGATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTCGTGATGTTGGTGGTGGTCACACTTTCTACGCGAGCTGGGCGGAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGGCAGCGGCGGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGAGATAATGATGGTGATTGGTTCTATTTTGATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>345.1H144 南京医科大学博士学位论文CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCGACTACTGGATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTCGTGATGTTGGTGGTGGTGACACTTTCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGGCAGCGGCGGACACGGCCACCTACTACTGTGCGAGAGATAATGATGGTGATTGGTTCTATTTTGATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>347.3HCAGTCGCTGGAGGAGTCCGAGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTACCTATGCAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGTATCATTGGTAGTAGTGGTGGCGCATACTACGCGAGCTGGGCGAAGGGCCGATGCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCGTAAGTCTCTATACCTACGATGACTATGCTGATTACTTCTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA>350.1HCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGACCTGGTCAAGCCTGGGGCATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAACAGCTACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGTATGCATTTATGCTGGTAGTAGTGGTTTCACTTACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAGATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGAGATAGGGGTTACTATACTTATGGTTATGCTGGTTATGGTTATGGTATGGATTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA45个抗HCMV兔源单克隆抗体轻链可变区核酸序列>3.4KGAGCTCGATCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCGTCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACGTAGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCGCCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTTTGCATCCACTCTGACATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGCTATGGTTATACTGGTGTTGGTTATGATTATGCTTTCGGCGGCGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>15.1KGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGGTAGCAGATTAGCCTGGTATCAGCAGGAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTCATCTACAGGACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATATGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAAGACCATGATGATATTAGTCATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>21.4KGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCGCCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGGCGGCACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCTCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCTCATCAAGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTTATGGTGTTGGTTTTAGTAGTACTTATGGTGATGCTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA145 南京医科大学博士学位论文>30.2KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGGGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGACAACATTTACAGTGGTTTGGCCTGGTATCGGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCGAGCTCCTGATCTATGGTGTATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGTGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGTACTATTGGTCCTGTTGGTAGTAGTTTTGGTGATCCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>41.1KGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCGCCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAGTTGCCAGGCCAGTCGGAGTGTTTATAATGAAAACTATGTAGCCTGGTTTCAGCATAAACCAGGGCAGCCTCCCAAACTCCTGATCTATACTACATCCATTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAGGGCCGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATTAGTGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGATTATGATGATAATGAGGAGAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA>44.3KGAGCTCGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGTCAGGCCAGTGAGAGCATTTACAGTGGTTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATTTACCAGGCATCCACTCTGGCATCAGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTAGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTTTAGTAGTAGTAATGTTGATAATCTTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA>57.4KGAGCTCGATCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCGCCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGGCGGCACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCTCATCAAGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTTATGGTGTTGGTTTTAGTAGTACTTATGGTGATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGCTGGAGATCCTA>58.5KGAGCTCGATCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATTATTGTCAAAGCTATGTTTATAGTAGTAGTACTGCTGATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>60.6KGAGCTCGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAGCATTAACAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGGCAGCCTCCCAAGCCCCTGATCTATAGGGCATCCACTCTGACATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAGGGGCAGTGGATCCGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTGAATGTCCTTTTAGTGGTGGTAGTGGCCGTGTTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA>62.5KGAGCTCGATCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCA146 南京医科大学博士学位论文GTCAGAGCATCAGTAGTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATCACTGTCAATGTACTTATGGTAGTAGTAGTAGTAGTGGTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGCCCTCAAA>70.7KGAGCGCGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTGGCAACCTCTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATTACTGTCAACAGGGTTATATGATTACTAATGTTGAGAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>76.3KGAGCTCGATCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCGGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCGGGCCAGTCAGAGCATTAGCAACTACTTTTCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATCACTGTCAAAGCACTTATGGCAGTAGTAGTAGTAGTGGTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>90.4KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCTGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGACCGTTAATAGCTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAATCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTTTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGCTATTATTATAGTGGTAGTAGTTATGGTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>117.8KGAGCTCGATCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAGTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATAAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTTATGGTAGTAGTAGTAGTAGTGCTTATGGGCGTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGAAATCAAA>124.4KGAGCTCGATATGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCGGCTGTTGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAAGAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGCCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACAATCAGCGAAGTACAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCTATTATAGTGGTTATATTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>202.3KGAGCTCGATCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGGTAGCAGATTAGCCTGGTATCAGCAGGAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTCATCTACAGGACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATATGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGC147 南京医科大学博士学位论文GACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAAGACCATGATGATATTAGTCATGCTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA>203.5KGAGCTCGATCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCTCTCAGAGTGTTTATAATAAGAACGCCTTATCCTGGTTTCAGCAGAAACTAGGGCAGCCTCCCAAACTCCTGATCTACAAGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGACGTGCAGTGTGACGACGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGGTTATAGTACGACTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>210.4KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCTGTGTCTGCCGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAACTGCCAGACCAGTCAGAGTCTTTATAATAACAACTTCTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCGAATTTAGTTGTAGTAGTGCTGATTGTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>212.6LGAGCTCGTGCTGACTCAGTCACCCTCCCTGTCTGCGTCTCTGGGCACAACAGCCAGACTCACCTGCACCCTGAGCACTGGCTACAGTGTTGGCAAGTACCCTTTAGTGTGGCTCCAGCAGGTGCCAGGGAGGCCTCCCAGGTATCTCCTGACCTACCACACAGAAGAATTTAAACACCAGGGCTCCGGGGTGCACAGCCGCTTCTCTGGATCCAAGGACACCTCAGAGAATGCAGGTGTCCTGAGCATCTCTGGTCTGCAGCCCGAGGACGAGGCCGACTATTACTGTGCTACAGCTCATGCTACTGAGAGCAGCCTCCATTATGTGTTCGGCGGAGGGACCCAGCTGACCGTCACAGGC>216.5KGAGCTCGAGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACGGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGGTAGCAGATTAGCCTGGTATCAGCAGGAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTCATCTACAGGACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATATGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAAGACCATGATGATATTAGTCATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>223.4KGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCGCCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAGTTGCCAGGCCAGTCGGAGTGTTTATAATGAAAACTATGTAGCCTGGTTTCAGCATAGACCAGGGCAGCCTCCCAAACTCCTGATCTATACTACATCCATTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAGGGCCGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATTAGTGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGATTATGATGATAATGAGGAGAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGCTGGAGATCCTA>228.8KGAGCTCGTGATGACCCAGACTGCATCGTCCGTGTCTGCAGCAGTGGGAGGCACAGTCACCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTATTGATAAGAACTGGCTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATAGTGGTGATATTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA148 南京医科大学博士学位论文>230.7KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCTGTGTCTGCCGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAACTGCCAGACCAGTCAGAGTCTTTATAATAACAACTTCTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCGAATTTAGTTGTAGTAGTGCTGATTGTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>240.8KGAGCTCGTGATGACCCACCCTCCAGCCTCCGTGTCTGCACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCACAACATTGGTAGCAGATTACCCTGGTATCAGCAGGAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTCATCTACAGGACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCACCGGCAGCGGATATGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAAGACCATGATGATATTAGTCATGCTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA>247.8KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCGGGCCAGTCAGAGCATTGGCAACTACTTTTCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCGTCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATCACTGTCAAAGCACTTATGGCAGTAGTAGTAGTAGTGGTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>250.5KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATCAGTAGTTACTTATCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGTACTTATGGTAGTAGTAGTAGTAGTGGTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>269.6KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGGTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAGCATTTATAGCTCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTACTGATTTATAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCGAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTGGAGTAATATTAATGTTGACAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>270.7KGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTGGCAACCTCTTAGCCTGGTATCAGCAGGAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATTACTGTCAACAGGGTTATATGATTACTAATGTTGAGAATGCTTTCGGCGGGGGGACCAATGTGGAAATCAAA149 南京医科大学博士学位论文>271.1KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAGCCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTGGTGCTAATTTAGCCTGGTATCACCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCCTCCAATCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGTACTTATTATGGTAGTGGAAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGCTGGAGATCCTA>272.7KGAGCTCGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTGGTAGTAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGTAATTATTATCTTAATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>275.2KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGGTAGCAGATTAGCCTGGTATCAGCAGGAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATATGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAAGACCATGATGATATTAGTCATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCGAA>276.1KGAGCTCGATCTGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCACAACATTAACACTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCTCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTTTAATAGTCTTAATGTTGAAAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>283.7KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCTGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCAAGACCAGTCAGAGTGTTTATAATAACAACTTCTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATCTGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCGAATTTAGTTGTATTAGTGCTGATTGTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA>289.3KGAGCTCGATATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGAACCCGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGGGCATTTACGACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCAGCCATTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTATTATAGTAGTAGTACTGACAGGAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>292.1KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAACTGCCAGGCCA150 南京医科大学博士学位论文GTCAGAGTGTTTATAATGACAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCGCCTGATCTATTATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTATTACTGTCTAGGCAGTTATGATTGTAGTAGTGCTGATTGTTATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>295.5KGAGCTCGAGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCATCAGTTGCCAGGCCAGTAAGAGTGTTTATAATAACAATGCCTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAACTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGTTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTATTGTGCAGGCGGTTATAGTATTATTAGTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>302.1KGAGCTCGATCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCGCCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGGCGGCACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCTCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGCATCTGGGGTCTCATCAAGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTTATGGTGTTGGTTTTAGTAGTACTTATGGTGATGCTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA>316.2KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGACCATTGGCAACCTCTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCGCCCTCCCAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGCGACAGAATTCACACTCACCATCAGAGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTATTATTGTCAACAGGGTTATATGATTACTAATGTTGAGAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA>324.4KGAGCTCGATCTGACCCAGACTGCATCCCCCGTGTCTGCGGCTGTTGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAATAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACAATCAGCGAAGTACAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCTATTATAGTGGTTATATTTATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>331.4KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCTGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAGTTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTAATAACAACTGGTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGTGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACAATCAGCGAAGTGGTGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAGGCGATCTTACTGGTTGGATTTGGGCTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA>339.4KGAGCTCGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGGTAGCAGATTAGCCTGGTATCAGCAGGAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTCATCTACAGGACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATATGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGC151 南京医科大学博士学位论文GACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAAGACCATGATGATATTAGTCATGCTTTCGGCGGAGGGACCAATGAGGAAATCAAA>340.6KGTGCTCGATCTGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGGTAGCAGATTAGCCTGGTATCAGCAGGAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTCATCTACAGGACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATATGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAAGACCATGATGATATTAGTCATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA>345.1KGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGGTAGCAGATTAGCCTGGTATCAGCAGGAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGACATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATATGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTATTGTCAAGACCATGATGATATTAGTCATGCTTTCGGCGGAGGGACCAATGTGGAAATCAAA>347.3LGAGCTCGTGCTGACTCAGTCACCCTCCCTATCTGCGTCTCTGGGCACAACAGCCAGACTCACCTGCACCCTGAGCACTGGCTACAGTGTTGGCAAGTACCCTTTAGTGTGGCTCCAGCAGGTGCCAGGGAGGCCTCCCAGGTATCTCCTGACCTACCACACAGAAGAATTTAAACACCAGGGCTCCGGGGTGCACAGCCGCTTCTCTGGATCCAAAGACACCTCAGAGAATTCGTTTGTCCTGCGCATCTTTGGGCTGCAGCCTGAGGACGAGGCCGACTATTACTGTGTTACTGCTCATCCTACTGAGAGCAGCCTCCATTATGTGTTCGGCGGAGGGACCCAGCTCACCGTCACAGGC>350.1KGAGCTCGATATGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTACAGCTGTTGGAGGCACAGTCAGCATCAGTTGCCAGTCCGGTCAGAATGTTTGGACTAACGACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAGGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGGAGGCACTTTCCTTAGTAATGGTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA152 南京医科大学博士学位论文附录3抗HCMV人源单克隆抗体可变区氨基酸序列21个抗HCMV兔源单克隆抗体重链可变区氨基酸序列>122HQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGDAISGSNYYWGWIRQPPGKGLQWIGSIYHTGSTFYNPSFSSRVTLSVDTSKNQFSLKLISVNAADTAVYYCARRIRGYSGTYDWGQGTLVTVSS>126HQLXLQESGPVLVKPSETLSLTCSVSGGSISSGTYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTSYNPSLHSRVTMSVDSSKNHFSLDLTSVTAADTAVYYCVRDRTDFIVVSYDAMDVWGQGTMVTVSS>155HQLQLQESGPVLVKPSETLSLTCSVSGGSISSGTYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTSYNPSLHSRVTMSVDSSKNHFSLDLTSVTAADTAVYYCVRDRTDFIVVSYDAMDVWGQGTMVTVSS>41HQLQLQESGPVLVKPSETLSLTCSVSGGSISSGTYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTSYNPSLHSRVTMSVDSSKNHFSLDLTSVTAADTAVYYCVRDRTDFIVVSYDAMDVWGQGTMVTVSS>83HQLQLQESGPVLVKPSETLSLTCSVSGGSISSGTYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGNTSYNPSLHSRVTMSVDSSKNHFSLDLTSVTAADTAVYYCVRDRTDFIVVSYDAMDVWGQGTMVTVSS>144HQIQLVQSGAEVKAPGASVKVSCKVSGYNLASFGISWLRQAPGQGLEWMGWITAYSKNIKYAEKVQDRLSLTTDTSTNTAYMELRSLRSDDTALYYCVRGVGYDSSGLDYWGPGTLVTVSS>147HQIQLVQSGAEVKAPGASVKVSCKVSGYNLASFGISWLRQAPGQGLEWMGWITAYSKNIKYAEKVQDRLSLTTDTSTNTAYMELRSLRSDDTALYYCVRGVGYDSSGLDYWGPGTLVTVSS>88HQVQLVQSGSELKKPGASVRVSCKASGYTFTSHAMNWVRKAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRYVFSVDTSVTTAYLQIRSLKSDDTAVYYCVRDSDCSGGNCYYDYDYGMDVWGQGTTVTVSS>151HQVQLVQSGAEVKRPGSSVRVSCRASGGSFSNYIIHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTDYAQKFQGRVTTVADESTATAYMELSSLRFEDTAMYYCARLKCTGGDCYNLHAFDVWGQG>145HQVELQQWGAGLLKPAETLSLTCAVHGGSFNTYYWTWIRQSPGRGLEWIGEINHSGSTDYNPSFKSRVTILGDTSKNQLSLKLDSVTAADTAVYYCARGRTFFDSRGYYYWGQGTLVTVSS>162HQVELQQWGAGLLKPAETLSLTCAVHGGSFNTYYWTWIRQSPGRGLEWIGEINHSGSTDYNPSFKSRVTILGDTSKNQLSLKLDSVTAADTAVYYCARGRTFFDSRGYYYWGQGTLVTVSS153 南京医科大学博士学位论文>194HQVELQQWGAGLLKPAETLSLTCAVHGGSFNTYYWTWIRQSPGRGLEWIGEINHSGSTDYNPSFKSRVTILGDTSKNQLSLKLDSVTAADTAVYYCARGRTFFDSRGYYYWGQGTLVTVSS>23HQVELQQWGAGLLKPAETLSLTCAVHGGSFNTYYWTWIRQSPGRGLEWIGEINHSGSTDYNPSFKSRVTILGDTSKNQLSLKLDSVTAADTAVYYCARGRTFFDSRGYYYWGQGTLVTVSS>24HQVELQQWGAGLLKPAETLSLTCAVHGGSFNTYYWTWIRQSPGRGLEWIGEINHSGSTDYNPSFKSRVTILGDTSKNQLSLKLDSVTAADTAVYYCARGRTFFDSRGYYYWGQGTLVTV>62HQVELQQWGAGLLKPAETLSLTCAVHGGSFNTYYWTWIRQSPGRGLEWIGEINHSGSTDYNPSFKSRVTILGDTSKNQLSLKLDSVTAADTAVYYCARGRTFFDSRGYYYWGQGTLVTVSS>14HQVQLLQSGADVKKPGASLKVSCKASGYTFIGYYVHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGVTNFAQKFQGRVTMTRDTSTDTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDVVMSAVPFPHNFYGMDVWGQGTTVTVSS>25HEVQLVESGAEVKKPGALVKVSCKASGYTFTNYAIHWVRQASGQRLEWMGWINAGRGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDAAVYFCARDESTGDYYYYMDVWGKGTTVSVPS>22HQLQLQESGPVLVKPSETLSLTCSVSGGSISSGTYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYHSGSTSYNPSLHSRVTMSVDSSKNHFSLDLTSVTAADTAVYYCVRDRTDFIVVSYDAMDVWGQGTMVTVSS>154H1QVELQQWGAGLLKPAETLSLTCAVHGGSFNTYYWTWIRQSPGRGLEWIGEINHSGSTDYNPSFKSRVTILGDTSKNQLSLKLDSVTAADTAVYYCARGRTFFDSRGYYYWGQGTLVTVSS>7HEVQLLESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSINSGHYYWSWIRQHPVKGLEWIGHIYYSGTTYYNTSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLTSVTAADTAVYYYARAEGYCSGGRCPINWFDPWGQGTLVTVSS>8HEVQLLESGGAVVQPGGSLTLSCAASGFTFDDHAMHWVRQAPGKGLEWVSLISWDGASTYYADSVRGRFTISRDNSKNSLYLQMDSLRPEDTALYYCAKDIVDYSNPPDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS21个抗HCMV兔源单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列>122KDIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQDISSYVAWYQQKPGNAPKLLISSASTLPSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNNFGPGTTVDIK>151KDIQLTQSPSFLSASVGDRVSITCRASQGISNDLAWYQQRPGKAPKLLIYAASTLHSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQVDTYPLTFGPGTKVDIK>41K154 南京医科大学博士学位论文DIQMTQSPSSLSASVGDSVTITCQASQDINQFVSWYQQKPGKPPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTHFTFTISSLQPDDIATYYCQQYENLFTFGPGTKVD>126KEIVLTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQTVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYTASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSPNTFGQGTKLEIK>194LEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVGNNYLAWYQQKPGQPPRLLFYDASNRATGVPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYKTFGQGTKVEIK>155KDIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHNNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLSSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPQTFGQGTKLEI>144LQSVLTQPPSASGSPGQSVTISCTGTGSDVGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEADYYCSSFAGSNSWVFGGGTELTVL>24LQSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDIGGYNYVSWYQQHPGEAPKLMIYDVTERPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEGDYYCSSYAGTNGHYVFGTGTKVTVL>147LQSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNINTNPVNWYQHLPGTAPKLLIYSDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGNWVFGGGTKLTVL>145LSYELTQPPSVSVAPGKMARITCGGDNIGSKSVHWYQQRPGQAPVLVIRFDTDRPSRIPERFSGSNSGNTATLAISRVEAGDEADYYCQVWDSSSARLVFGGGTKLTVL>162LSYELAQPPSVSVAPGKPARIACGGDNIGGKSVHWYLQKAGQAPVLVMSYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEGDYFCQVWDRQTDHVVFGGGTKLTVL>62LSYELTQPPSVSVGPGRTARITCGANNIGSKSVHWYQQRPGQAPVLVISFDTDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYFCQVWDRTSDHVVFGGGTKLTV>23LSYELTQSPSVSVAPGKTARVTCGGDNIGMKSVHWYRQKPGRAPVLVIHYDHDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRNHQVFGGGTKLTVL>88LQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCASSTGAVTNGFYPNWFQLKPGQAPRALIYSTRNRHSWAPVRFSGSLLGGKAALTLSGVLPEDEADYYCLLSFGGAWVFGGGTKLTVL>83KDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRSDLAWYQLRPGKPPKRLIYTASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSSPYTFGQGTKLEIK155 南京医科大学博士学位论文>14LSSELTQDPAVSVALGQTVTISCHGDSLRTYSASWYQQRPGQAPVLVIYTKNNRPLGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSANHWVFGGGTKLTVL>25KPSALTQPPSVSVSPGQTASITCSGDRLDDKYASWYQQKAGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSDTYVFGTGTKVTVL>22LQSALTQPPSASGSPGQSVTISCTGTSSDIGGYNYVSWYQQHPGEAPKLMIYDVTERPSGVPDRFSGSKSGNTASLTVSGLQAEDEGDYYCSSYAGTNGHYVFGTGTKVTVL>154LQSVLTQPRSVSGSSGQSVSFSCTGTRSDVGGYKYVSWYQQHPGKAPKLLIFDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNMASLTISGLQADDEADYYCCSYAGNYTFYIFGTGTKVTVL〉7KQSALTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSDPVNWYQQLPGSAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGLYVFGTGTKVTVL>8KQSALTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGRNYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADFYCATWDDSLRGVVFGGGTKLTVL156 南京医科大学博士学位论文攻读博士学位期间发表论文与科研工作情况一、发表论文：1.FreedDC（#）,TangQ（#）,TangA（#）,DurrE,EspesethAS,CasimiroDR,ZhangN,ShiverJW,WangD,AnZ,FuTM.PentamericcomplexofviralglycoproteinHistheprimarytargetforpotentneutralizationbyahumancytomegalovirusvaccine.PNAS，2013Dec110(51)4997-5005.2.XiongS,TangQ,LiangX,ZhouT,FengZ,ZhuJ.ANovelChimericAnti-PANeutralizingAntibodyforPostexposureProphylaxisandTreatmentofAnthrax.SciRep.2015;5:11776.3.JianfeiHuang,QiTang,ChangjunWang,HuixinYu,ZhenqingFeng,JinZhub,MolecularlyTargetedTherapyofHumanHepatocellularCarcinomaXenograftswithRadio-iodinatedAnti-VEGFR2Murine-HumanChimericFabSciRep.2015;5:10660.4.QiuJR,TangQ,LinH,WangZC,LiYH,ZhuJ.ExpressionandclinicalsignificanceofTrop-2inhumanpancreaticcancer.NationalMedicalJournalofChina.2011;Jan11;91(2):103-65.HuangJ,LiangJ,TangQ,WangZ,ChenL,ZhuJ,FengZ.Anactivemurine-humanchimericFabantibodyderivedfromEscherichiacoli,potentialtherapyagainstover-expressingVEGFR2solidtumors.ApplMicrobiolBiotechnol.2011Sep;91(5):1341-51.6.LiuX,LinH,TangQ,LiC,YangS,WangZ,WangC,HeQ,CaoB,FengZ,GuanX,ZhuJ.CharacterizationofaHumanAntibodyFragmentFabandItsCalciumPhosphateNanoparticlesthatInhibitRabiesVirusInfectionwithVaccine.PLoSOne.2011;6(5)7.HuangJ,ZhangX,TangQ,ZhangF,LiY,FengZ,ZhuJ.PrognosticsignificanceandpotentialtherapeutictargetofVEGFR2inhepatocellularcarcinoma.JClinPathol.2011Apr;64(4):343-8.8.XuX,TangX,LuM,TangQ,ZhangH,ZhuH,XuN,ZhangD,XiongL,MaoY,ZhuJ.OverexpressionofMAGE-A9predictsunfavorableoutcomeinbreastcancer.ExpMolPathol.2014Dec;97(3):579-84.9.TangX,ZhouY,LiW,TangQ,ChenR,ZhuJ,FengZ.TcellsexpressingaLMP1-specificchimericantigenreceptormediateantitumoreffectsagainstLMP1-positivenasopharyngealcarcinomacellsinvitroandinvivo.JBiomedRes.2014Nov;28(6):468-75.10.HuangJ,ZhuH,WangX,TangQ,HuangH,WuK,ZhuJ,FengZ,ShiG.ThepatternsandexpressionofKDRinnormaltissuesofhumaninternalorgans.JMolHistol.2011Dec;42(6):597-603.11.LiuX,LiuQ,FengX,TangQ,WangZ,LiS,FengZ,ZhuJ,GuanX.Rabbitanti-rabies157 南京医科大学博士学位论文immunoglobulinsproductionandevaluation.TropBiomed.2011Apr;28(1):138-48.12.MaoY,WangJ,ZhangM,FanW,TangQ,XiongS,TangX,YinR,ZhuJ.AneutralizedhumanLMP1-IgGinhibitsENKTLgrowthbysuppressingtheJAK3/STAT3signalingpathway.Oncotarget.2016Dec20.13.MaoY,WangX,ZhengF,WangC,TangQ,TangX,LiangJ,ZhuJ.Thetumor-inhibitoryeffectivenessofanovelanti-Trop2Fabconjugateinpancreaticcancer.Oncotarget.2016Apr26;7(17):24810-23.二、在投及已撰写论文：1.QiTang(#),SipingXiong,,XiaochenHuang,ZhuJ.,MaoY,ZhenqingFeng.ProductionofCXCR2monoclonalantibodyandprognosticsignificanceoftheCXCR2geneinhumanhepatocellularcarcinoma.2018.Submitted2.QiTang(#),SipingXiong,XudongLiang,YiwenWang,ChangjunWang,ZhenqingFeng1*,JinZhu1,2*.HumanMonoclonalAnti-protectiveAntigenAntibodyfortheLow-dosePost-exposureProphylaxisandTreatmentofAnthrax.2018.Submitted三、科研项目：1.国家自然科学基金（面上项目），编号：81773268，双特异性cMet/TLR4CAR-T细胞通过下调肝脏CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞加强对肝细胞肝癌杀伤的研究，2017~2018，在研，主持。2.江苏省高校自然科学研究，编号：13KJB310003，全人源抗CXCR2抗体对肝癌增殖与转移的抑制作用研究，2013~2015，已结题，主持。3.江苏省普通高校学术学位研究生创新计划，衰老成纤维细胞在肝癌发生中的作用及分子机制，2011~2013，已结题，主持。4.国家自然科学基金（面上项目），编号：81773100，Trop2激活β-catenin通过Wnt信号通路促进胃癌EMT和侵袭转移，2017~2020，在研，参与。5.江苏省科技成果转化项目，编号：BA2017047，精准医疗输血检测用微柱凝胶系列产品的研发及产业化，2017~2021，在研，参与。6.江苏省社会发展项目，编号：BE2016799，新型双特异性c-Met/PD-L1CAR-T细胞对肝癌免疫治疗作用的研究，2016~2018，在研，参与。7.国家自然科学基金（面上项目），编号：81273325，全分子全人源抗狂犬病病毒中和抗体的制备、鉴定及中和表位分析，2012~2015，已结题，参与。158 南京医科大学博士学位论文8.军队特需项目研究计划，编号：2013ZX09J13110-05B，全人源寡克隆抗体药物在战时创伤感染救治中的应用,2013~2015，已结题，参与。9.江苏省临床医学专项，编号：BL2013038，新型高效EBV相关恶性肿瘤T细胞治疗技术的研发和临床应用,2014~2016，已结题，参与。四、授权发明专利：1.唐奇；熊四平；朱进；冯振卿；汪茂荣。一种全人源抗TLR4的抗体Fab及其全分子抗体IgG和应用。ZL201410765623.82.朱进；熊四平；唐奇；冯振卿。人源化抗炭疽保护性抗原PA的抗体及应用。ZL201410023684.73.王迎伟；夏梅；任琎；唐奇；邱文。杂交瘤细胞株WXR分泌的抗大鼠ATF3单克隆抗体。ZL201010278755.X4.冯振卿；黄剑飞；朱进；咸华；咸云；唐小军；唐奇。I标记抗VEGFR2嵌合Fab及其应用。ZL201310194589.9五、申请发明专利：1.唐奇；赵薇；许国贞；刘振云；熊四平；冯振卿；朱进。一种特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽及其应用。CN201610483231.12.唐奇；冯振卿；朱进；黄骁辰；贾立周。一种人鼠嵌和抗CXCR2全分子IgG及其应用。CN201711371654.53.唐奇；冯振卿；许国贞；刘振云；朱进；赵薇。一种肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽及其应用。CN201610483210.X4.唐奇；冯振卿；许国贞；刘振云；朱进；唐小军；蒯兴旺。一种肿瘤抗原PSA的CTL识别表位肽及其应用。CN201610483235.X5.唐奇；冯振卿；许国贞；刘振云；蒯兴旺；朱进；章明炯。特异性肿瘤抗原EphA2的CTL识别表位肽及其应用。CN201610483249.16.唐奇；唐小军；冯振卿；许国贞；刘振云；朱进；赵薇。特异性肿瘤抗原IL13RA的CTL识别表位肽及应用。CN201610483209.77.冯振卿；唐奇；许国贞；刘振云；朱进；唐小军；熊四平。一种HER3特异性嵌合抗原受体及其应用。CN201610483185.58.冯振卿；唐奇；许国贞；刘振云；朱进；熊四平；唐小军。一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体及其应用。CN201610483207.8159 南京医科大学博士学位论文9.冯振卿；朱进；许国贞；刘振云；唐奇；唐小军；黄骁辰。一种Her2特异性嵌合抗原受体及其应用。CN201610481411.610.冯振卿；朱进；许国贞；刘振云；唐奇；唐小军；周荧。一种c-Met特异性嵌合抗原受体及其应用。CN201610483181.711.冯振卿；朱进；许国贞；刘振云；熊四平；唐奇。一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体及其应用。CN201610481322.112.朱进；冯振卿；许国贞；刘振云；唐小军；唐奇；徐亚如。Trop2嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞及其应用。CN201610483208.2160 南京医科大学博士学位论文致谢值此论文完成之际，首先衷心感谢我的导师冯振卿教授多年来对我的悉心指导和热情关怀。冯老师严谨的科研作风令我敬佩，勇于创新的精神时刻鼓舞着我，充沛的精力和勤恳敬业的态度将激励我的一生。感谢美国德州健康科学中心安志强教授，张宁燕教授对我的科研指导和无私关怀，以及GeorgeHuang，孟维旭，法明，Joan，石芸以及Choi，邓辉在我的工作和生活方面给与的支持和帮助。感谢美国Merck公司傅同民博士，DaiWang，DanielFreed，AiminTang，FengshengLi，AdamFinnefrock在本研究中给与的技术指导和科研帮助。感谢南京军区军事医学研究所的朱进研究员多年来对我的工作、学习及生活方面给予的无私的帮助。感谢南京医科大学卫生与健康委员会抗体技术重点实验室以及病理系的任勇亚老师，徐璐老师，许宁老师，张晓老师，仇镇宁老师，王祝鸣老师，王光欧老师，感谢你们在实验安排，教学实践中提供的各种帮助。感谢与我并肩作战季敏君博士，黄剑飞博士，唐小军博士，毛园博士，熊四平博士，以及实验室所有师弟师妹，感谢你们在这段辛苦而快乐的时光中的陪伴，这也将成为我美好的回忆。感谢我的家人，谢谢你们支持和鼓励。161
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