血源性人细小病毒的分子流行病学分析与人细小病毒B19非结构蛋白功能研究

《血源性人细小病毒的分子流行病学分析与人细小病毒B19非结构蛋白功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号学号１５１１３０ｆＵＵＤＣ密级公开军事科学院硕士学位论文血源性人细小病毒的分子流行病学分析与人细小病毒Ｂ１９非结构蛋白功能研究Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｉｄｅｍ－ｐｉｏｌｏｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｂｌｏｏｄｂｏｎｅｇｈｕｍａｎａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐｈｕｍａｎａｒｖｏｖｉｒｕｓＢ１９ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｒｏｔｅｉｎｓｐｐ作者姓名钟亚迪学科专业免疫学指导教师章金刚研究员答辩主席鲁凤民教授学樹位授予单位军事科学院论日期２０１８年５月２５日 原创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作新取得的研，论文中不包含其他究成果？尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外人已经发表和撰写过的研究成果：也不包含为获得军事科学院或其他教育机构的一本研究所做的任何贡献均已学位或证书而使用过的材料．与我同工作的同志对在论文中作了明确的说明并表示谢意。＋＋非：．与人细小病学位论文题目血源性人钿小病毒的分子流行病学分析．毒Ｂ１９＋结构蛋白功能研究殳互通’曰学位论文作者签名：牛日期：年＞月了学位论文版权使用授权书＇本人完全了解军事科学院有关保留．使用学位论文的规定。本人授权军事科学院可以保留并向国家有关部ｎ或机构送交论文的复印件和电子文棰，允许论文，可被查阅和借阅；可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行抬索、。以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文（保密学位论文在解密后适用本授权书）Ｂ１９非学位论文题目：血源性人细小病砉的分子流行病学分析与人妇小病毒结构蛋白功能研究日ｆ曰学位论文作者签名：期：况４年夂月＾了？－ｑ作者指导教师签名：日期？如以年ｓ月ｑ＼Ｉ 军事科学院硕士学位论文目录缩略词表（Abbreviation）.........................................................................................................Ⅲ摘要...............................................................................................................................................1Abstract..........................................................................................................................................3前言................................................................................................................................................5第一部分我国献血/献浆人群中人细小病毒B19和人细小病毒4的分子流行病学分析..8摘要................................................................................................................................................8Abstract...........................................................................................................................................81材料与方法..............................................................................................................................101.1材料...................................................................................................................................101.2血浆样品的准备与处理...................................................................................................111.3血浆样品中病毒核酸的提取...........................................................................................111.4B19V-PARV4双重核酸检测体系对血浆样品的检测....................................................121.5人细小病毒B19核酸阳性样品中目的片段的TA克隆...............................................121.6目的片段的核苷酸序列测定...........................................................................................141.7核苷酸序列多重比对及系统发育分析...........................................................................152结果..........................................................................................................................................152.1单人份献血者血浆中B19V和PARV4的核酸阳性率..................................................152.2混合原料血浆中B19V和PARV4的核酸阳性率...........................................................152.3B19V的NS1-VP1u区基因片段的克隆及鉴定...............................................................162.4B19V基因组近全长的克隆及鉴定..................................................................................172.5核苷酸序列测定结果.......................................................................................................182.6单人份献血者血浆中B19V的基因型鉴定.....................................................................182.7混合原料血浆中B19V的基因型鉴定............................................................................193讨论..........................................................................................................................................203.1原料血浆中B19V的核酸阳性率高于其在单人份献血者血浆....................................203.2原料血浆中PARV4的核酸阳性率高于其在单人份献血者血浆..................................213.3关于B19V核酸阳性样品中的毒株基因型鉴定............................................................214小结..........................................................................................................................................21第二部分人细小病毒B19非结构蛋白X和7.5kDa的功能研究.........................................23摘要..............................................................................................................................................24Abstract.........................................................................................................................................241材料与方法..............................................................................................................................24I 军事科学院硕士学位论文1.1材料...................................................................................................................................231.2UT7/Epo-S1细胞的常规培养...........................................................................................271.3工具质粒pEGFP-hLC3B的构建与鉴定.........................................................................271.4真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HA-7.5kDa和pcDNA3.1(+)-HA-X的构建与鉴定.......291.5重组质粒转染UT7/Epo-S1细胞......................................................................................311.6免疫印迹检测蛋白的表达...............................................................................................321.7激光共聚焦显微镜观察荧光自噬小体...........................................................................332结果..........................................................................................................................................342.1常规培养的UT7/Epo-S1细胞.........................................................................................342.2工具质粒pEGFP-hLC3B的构建与鉴定结果.................................................................342.3pcDNA3.1(+)-HA-7.5kDa和pcDNA3.1(+)-HA-X的构建与鉴定结果.........................352.4自噬体膜标记蛋白和内质网应激相关蛋白的免疫印迹检测.......................................392.5荧光自噬小体的观察.......................................................................................................413讨论..........................................................................................................................................423.1非结构蛋白7.5kDa和X对内质网应激和细胞自噬影响的初步探索........................423.2关于本研究中观察荧光自噬小体的研究方法...............................................................433.3关于鉴定非结构蛋白7.5kDa诱导细胞自噬的待完善处..............................................434小结..........................................................................................................................................44结论..............................................................................................................................................45参考文献......................................................................................................................................46与学位论文密切相关的文献综述..............................................................................................51在学期间取得的学术性成果（全文）.....................................................................................61个人简历.....................................................................................................................................74致谢.............................................................................................................................................75II 军事科学院硕士学位论文缩略词表（Abbreviation）缩写英文名称中文名称AAVsAdeno-associatedvirus腺相关病毒ATF-6Activatingtranscriptionfactor6活化转录因子6B19VHumanparvovirusB19人细小病毒B19bpBasepair碱基对CHOPPro-apoptoticCCAAT/enhancer-binding凋亡相关蛋白protein-homologousproteinDEPCDiethylpyrocarbonate焦炭酸二乙酯DMEMDMEMDulbecco'sModifiedEagleMedium细胞培养液DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPsDeoxy-ribonuleosidetriphosphates脱氧核糖核苷三磷酸ERSEndoplasmicreticulumstress内质网应激FBSFetalbovineserum胎牛血清HBoVHumanBocavirus人博卡病毒HBVHepatitisBVirus乙型肝炎病毒HCVHepatitisCVirus丙型肝炎病毒HIVHumanImmunodificiencyVirus人类免疫缺陷病毒IRE1Inositol-requiringenzyme1肌糖必需酶1ITRsInvertedterminalrepeats末端倒置重复序列kbkilobasepair千碱基对kDaKilodalton千道尔顿LC3BMicrotubuleassociatedproteinlightchain3微管相关蛋白轻链3mLMilliliter毫升NTCNotemplatecontrol无模板阴性对照NATNucleicacidamplificationtechnology核酸扩增检测技术ntNucleotide核苷酸ORFOpenreadingframe开放阅读框PARV4Parvovirus4细小病毒4PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应III 军事科学院硕士学位论文PERKPER-likeERkinase蛋白激酶样内质网激酶qPCRRealtimefluorescencequantitativepolymerase实时荧光定量聚合酶链chainreaction式反应RT-PCRReversetranscriptionpolymerasechainreaction反转录聚合酶链式反应SDS-PAGESodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegel十二烷基磺酸钠-聚丙烯electrophoresis酰胺凝胶电泳LMicroliter微升UPRUnfoldedproteinreaction未折叠蛋白反应IV 军事科学院硕士学位论文血源性人细小病毒的分子流行病学分析与人细小病毒B19非结构蛋白功能研究摘要人细小病毒B19（HumanparvovirusB19,B19V）和人细小病毒4（Humanparvovirus4,PARV4）可以感染人类，且可经血液及血液制品传播。我国捐献血液/血浆时未对其中的B19V和PARV4进行检验，我国血液制品企业在生产血液制品时也未对它们进行筛查，且常规的病毒去除/灭活技术难以有效地将人细小病毒去除/灭活。血源性人细小病毒（B19V和PARV4）的存在对我国捐献的血液/血浆和我国血液制品的使用存在着不可忽视的安全隐患。因此，B19V和PARV4对临床用血和血液制品的潜在威胁越来越引起人们的关注。为了更好地保障我国临床用血和血液制品的病毒安全性，我们有必要对我国献血/献浆人群中的B19V和PARV4进行分子流行病学分析。因此，在本研究的第一部分，我们使用B19V-PARV4双重核酸检测体系对我国西安地区3200例单人份献血者血浆和我国某血液制品企业54份混合原料血浆进行了B19V和PARV4的核酸检测。为了解B19V不同基因型的分布状况，本研究基于B19V基因组中NS1-VP1u区的核苷酸序列或基因组近全长序列进行克隆测序后，经多重序列比对，最后基于此NS1-VP1u区的核苷酸序列或基因组近全长序列进行了系统发育分析，对B19V核酸阳性血浆样品进行了毒株的基因分型。结果显示，在我国西安地区3200例单人份献血者血浆中，B19V核酸阳性的样品有12份，总阳性率为0.38%；而PARV4核酸阳性的样品有4份，总阳性率为0.13%。B19V核酸阳性样品中有4份样品鉴定为1a亚型，2份样品鉴定为1b亚型。在我国某血液制品企业54份混合原料血浆中，B19V核酸阳性的样品有5份，总阳性率为9.26%；而PARV4核酸阳性样品有11份，总阳性率为20.37%。B19V核酸阳性样品中有1份样品成功进行了基因组近全长克隆，其基因型鉴定为1b亚型。B19V感染宿主细胞并造成细胞损害或引起宿主细胞死亡。当宿主细胞的自噬水平提高时，被B19V感染的宿主细胞更容易存活。鉴于被B19V感染的细胞存在此种现象，我们认为对B19V的蛋白功能进行细胞自噬方面的研究是有必要的。多数病毒在感染细胞后，会在宿主细胞的内质网内合成大量的病毒蛋白，引起细胞内质网应激。内质网应激可能与细胞自噬存在一定的联系。因此在本研究的第二部分，我们进行了B19V蛋白在诱导细胞自噬和内质网应激方面的初步探索。我们通过分子克隆和细胞转染技术使UT7/Epo-S1细胞中表达B19V的非结构蛋白X和7.5kDa。然后，通过LC3B-Ⅱ的转化分析和研究膜型LC3B在自噬小体膜上的聚集来鉴定细胞自噬的诱导情况。结果显示非结构蛋白7.5kDa可以诱导UT7/Epo-S1细胞1 军事科学院硕士学位论文自噬，而X蛋白没有这种效果。这表明在B19V诱导宿主细胞自噬的分子机制中，非结构蛋白7.5kDa可能发挥着重要的作用。通过免疫印迹分析了转染细胞中的内质网应激相关蛋白Bip和CHOP的表达情况，结果显示非结构蛋白X和7.5kDa的存在不能使UT7/Epo-S1细胞中Bip蛋白和CHOP蛋白的表达发生显著地上调。这表明非结构蛋白X和7.5kDa不能诱导UT7/Epo-S1细胞产生内质网应激的效应。综上所述，本研究内容分成两部分。第一部分为我国献血/献浆人群中人细小病毒B19和人细小病毒4的分子流行病学分析，并对其中存在的B19V进行了基因型鉴定。这部分研究工作有助于我们了解B19V和PARV4在我国的流行状况和B19V不同基因型在我国的分布状况，并为更好地保障我国血液制品的病毒安全性提供必要的基础性数据。第二部分为人细小病毒B19非结构蛋白7.5kDa和X在诱导细胞自噬和内质网应激方面的功能研究，对阐明B19V感染细胞的分子机制有一定的参考和借鉴意义。关键词：人细小病毒B19；人细小病毒4；核酸检测；基因型鉴定；非结构蛋白2 军事科学院硕士学位论文Molecularepidemiologicalanalysisofblood-bornehumanparvovirusesandstudyonthefunctionofHumanparvovirusB19nonstructuralproteinsAbstractHumanparvovirusB19(B19V)andHumanparvovirus4(PARV4)caninfecthumanandcanbetransmittedthroughbloodandbloodproducts.Chineseplasma-derivedmedicinalproductsmanufacturesdonotscreenthemwhentheyproducebloodproducts.Itisdifficulttoremove/inactivatehumanparvoviruseffectivelybyconventionalvirusremoval/inactivationtechnique.Therefore,thepotentialthreatofB19VandPARV4toclinicalbloodandbloodproductshasattractedmoreandmoreattention.InordertoprotecttheviralsafetyofclinicalbloodandbloodproductsinChina,itisnecessaryforustocarryoutmolecularepidemiologicalanalysisofB19VandPARV4inblood/plasmadonation.Therefore,inthefirstpartofthisstudy,WeusedB19V-PARV4duplexnucleicacidtestingsystemtodetectthenucleicacidofB19VandPARV4in3200singleblooddonationplasmasamplesfromXi'anareaand54mixedsourceplasmasamplesfromaChineseplasma-derivedmedicinalproductsmanufacture.InordertounderstandthedistributionofdifferentgenotypesofB19V,thenucleotidesequenceofNS1-VP1uregionorthenear-full-lengthsequenceofthegenomeofB19Vwereclonedandsequencedinthisstudy.Aftermultiplesequencealignment,phylogeneticanalysiswascarriedoutbasedonthenucleotidesequenceornear-full-lengthsequenceoftheNS1-VP1uregion.GenotypingofB19Vnucleicacidpositiveplasmasampleswascarriedout.Theresultsshowthatthereare12positivesamplesofB19Vnucleicacidinplasmaof3200singledonationsinXi'anofChina,withatotalpositiverateof0.38%,while4sampleswerepositiveforPARV4nucleicacidwithatotalpositiverateof0.13%.Foursampleswereidentifiedas1asubtypeofB19Vand2sampleswereidentifiedas1bsubtypeofB19V.Thereare5positivesamplesofB19VnucleicacidintheChineseplasma-derivedmedicinalproductsmanufacture,withatotalpositiverateof9.26%,while11samplesarepositiveforPARV4nucleicacidwithatotalpositiverateof20.37%.B19Vnucleicacidpositivesamplehadonenear-full-lengthgenomeclone.Itsgenotypeisidentifiedassubtype1bofB19V.3 军事科学院硕士学位论文B19Vinfectsthehostcellandcausescelldamageordeath.Whenthehostcellautophagylevelincreases,thehostcellinfectedwithB19Vismorelikelytosurvive.WethinkthatitisnecessarytostudythefunctionofB19Vproteininautophagy.Mostvirusessynthesizealargenumberofviralproteinsintheendoplasmicreticulumofhostcellsafterinfectingthecells.Endoplasmicreticulumstressmaybeassociatedwithautophagy.Therefore,inthesecondpartofthisstudy,weexploredtheroleofB19Vproteinininducingautophagyandendoplasmicreticulumstress.WeconstructedtheeukaryoticexpressionplasmidswhichcanexpressB19Vnon-structuralproteinsXand7.5kDainthetransfectedUT7/Epo-S1cells,respectively.WeanalyzedthetransformationofLC3B-ⅡbyWesternblotandobservedthephenomenonofmembranetypeLC3B-Ⅱaggregationonthemembraneofautophagosome.Theresultsshowthatprotein7.5kDacanincreasethelevelofautophagyinUT7/Epo-S1cellssignificantly.ButproteinXdonothavetheeffect.Theresultsuggeststhatnon-structuralprotein7.5kDamayplayanimportantroleinthemolecularmechanismofautophagyinthecellsinfectedwithB19V.Inordertostudytheeffectsofthesetwononstructuralproteinsonendoplasmicreticulumstress,Weanalyzedtheexpressionofendoplasmicreticulumstress-relatedproteins(BipandCHOP)intransfectedcellsbyWesternblot.Theresultsshowthatthepresenceofnon-structuralproteinsXand7.5kDacouldnotup-regulatetheexpressionofproteinBipandCHOPinUT7/Epo-S1cells.Itimpliesthatnon-structuralproteinXand7.5kDacouldnotinduceendoplasmicreticulumstressinUT7/Epo-S1cells.Inconclusion,thisstudyisdividedintotwoparts.ThefirstpartisthemolecularepidemiologicalanalysisofB19VandPARV4inChineseblood/plasmadonors.ThegenotypesofB19Vwereidentified,whichwashelpfulforustoknowabouttheprevalenceofB19VandPARV4andthedistributionofB19VgenotypesinChina.ThesecondpartisaboutthefunctionofhumanparvovirusB19nonstructuralprotein7.5kDaandXininducingautophagyandendoplasmicreticulumstress.ItisusefulforelucidatingthemolecularmechanismofB19Vinfectedcells.Keywords:HumanparvovirusB19;Humanparvovirus4;nucleicacidtesting;nonstructuralproteins4 军事科学院硕士学位论文前言为了保障临床用血的安全性，我国在采集捐献血液/血浆后，会对其中人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodificiencyVirus,HIV）、乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus,HBV）、丙型肝炎病毒（HepatitisCVirus,HCV）和梅毒螺旋体等四种病原体进行检验筛查，因此临床用血液/血浆相对比较安全[1]。血液制品是一种特殊的药品，以健康人血浆为原料制备而成，在创伤救治、止血等方面发挥着其他药物无法替代的作用[2]。由于其原料为人血浆，中华人民共和国药典三部对血液制品生产用人血浆的来源、采集和检验都有严格的规定。血浆收集后，需要对其进行HIV、HBV、HCV和梅毒螺旋体等病原体进行筛查[3]。因此，生产血液制品用的原料血浆中基本可以确定不包含HIV、HBV、HCV和梅毒螺旋体的污染，也相对比较安全。然而，无论是捐献的临床用血，还是用于生产血液制品的原料血浆，在进行检验筛查时未作为筛查的、可经血液或血液制品传播的病毒可能在其中存在污染，这些病毒的存在使临床用血和血液制品均存在巨大的安全隐患。1975年，人细小病毒B19（HumanparvovirusB19，B19V）由Cossart首次发现于英国南伦敦输血中心病毒参考实验室[4]，是无囊膜结构的单链DNA病毒，可经血液及血液制品传播，归属于细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒亚科（Parvovirinae）、红病毒属（Erythrovirus）[5]。2014年，国际病毒分类学委员会（theInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV）提议将其种名改为灵长目红系细小病毒1（Primateerythroparvovirus1）[6]，属于红系细小病毒属（Erythroparvovirus）。B19V有着明确的致病性。感染人体后，最常见的是儿童传染性红斑（也称为“第五病”）[7]，健康成人感染多表现为轻型自限性疾病。特殊人群感染B19V之后，则易出现严重后果：免疫功能缺陷人群感染可以引起慢性贫血；存在血液性疾病的病人感染可以引起暂时性再障危象等[8]；孕妇感染可能引起胎儿水肿、流产和死胎等[9]。此外，B19V感染与肝炎、心肌炎、脑炎、急性横惯性脊髓炎等[10-13]以及多种自身免疫性疾病也存在相关性[14,15]。目前，人们根据B19V的核苷酸序列差异将其分为三种基因型，分别是1型、2型（代表株为A6株和Lali株）和3型，它们之间的核苷酸序列差异超过10%[16]。其中，1型可以继续细分为1a亚型（代表株为Au株）和1b亚型（代表株为Vn147株）[17]；3型可以继续细分为3a亚型（代表株为V9株）和3b亚型（代表株为D91.1株）[18]。不同基因型的B19V之间，其生物学特性可能不尽相同。ChenZ等[19]专门研究了B19V的2型代表株A6株和3型代表株V9株的转录图谱。研究结果表明，V9株具有与1型毒株非常相似的转录图谱，而A6株无论是在允许细胞还是非允许细胞中，其转录图谱都不同于1型毒株。A6株只使用一个剪接受体来移除第一个内含子。在允许细胞中，1型的末端倒置重复序列（invertedterminalrepeats,ITRs）有利于V9基因组（3型代表株）复制，5 军事科学院硕士学位论文从而产生具有感染性的病毒粒子。但是对A6基因组（2型代表株）的复制没有作用。鉴于不同基因型的B19V核苷酸序列、分子特性及基因组中的元件功能有所不同，我们在思考不同基因型的B19V对人类致病的疾病类型和临床表现也可能不完全一致。国内外对健康献血者血浆、生产血液制品用的原料血浆和血液制品中存在B19V均比较关注，并对它们进行了B19V污染状况的分子流行病学调查。本实验室先前建立了可检测B19V三种基因型的通用核酸检测体系[20]，并对我国原料血浆和凝血因子类产品中B19V的污染情况进行了调查。研究结果表明，我国混合原料血浆B19V的核酸阳性率为59.49%，最高浓度可达到1.35×1010copies/mL。在血液制品因子Ⅷ、凝血酶、纤维蛋白原以及凝血酶原复合物中B19V的核酸阳性率分别是93.55%、100%、85.71%和88.89%[21]。B19V在血液及血液制品中有比较高的污染率[22]，这将对人群的身体健康造成极大的威胁。目前，一些国际组织和部分发达国家为保障输血安全/血液制品安全对B19V已经采取了监控措施。德国提出B19V载量≥105IU/mL的单人份血液不能用于输血[23]；荷兰专为孕妇和溶血性贫血病人等提供了“B19V安全血液”[24]。PPTA和FDA已将核酸扩增检测技术（Nucleicacidamplificationtechnology,NAT）作为检测B19V载量的控制措施，监控混合原料血浆中B19V核酸含量低于104IU/mL[25-27]。欧洲药典要求用于生产抗D免疫球蛋白以及S/D灭活的混合原料血浆进行B19V的NAT筛查，也设置了相同标准[28]。我国对捐献血液/血浆和生产血液制品用的原料血浆中B19V均未采取有效的监控措施，并且我国献血人群中B19V的携带率及毒株特性等也缺乏足够的基础性数据。人细小病毒4（Humanparvovirus4，PARV4）也属于细小病毒科，是在2005年由MorrisS.Jones新发现的可以感染人类的细小病毒[29]。PARV4可以感染人类，且可经血液及血液制品传播，致病性却不十分明确。它和B19V在基因组结构、理化特性和生物学特点等诸多方面非常相似[30]。国外已经有学者开始讨论对捐献血液进行PARV4核酸的筛查，以消除PARV4对临床用血和使用血液制品带来潜在的安全隐患[31]。结合以上研究背景，本实验室有必要对B19V和PARV4在我国献血/献浆人群中的携带情况及它们在原料血浆中的污染状况进行分子流行病学分析。因此，本研究的第一部分将使用B19V-PARV4双重核酸检测体系[32]对我国献血/献浆人群中B19V和PARV4进行核酸检测，从而了解两者在我国献血者血浆和生产血液制品用混合原料血浆中的污染率。对血浆样品中确定为B19V核酸阳性的样品，我们将对其中的B19V基于NS1-VP1u区或基因组近全长克隆测序[33]，以B19V不同基因型的代表毒株的核苷酸序列为参考序列，进行多重序列比对和系统发育分析，从而了解其中B19V的基因型。细胞自噬是指在外界环境因素的影响下，细胞对其内部受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和侵入其内的病原体进行降解的生物学过程，是细胞在长期进化中较为保守的一种防御机制[34]。降解过程所产生的物质和能量，还可以重新参与细胞的生命活动。因此，细胞6 军事科学院硕士学位论文可通过提高自噬水平来达到清除侵入胞内的病原体的目的。值得关注的是，AkitoshiNakashima发现B19V感染宿主细胞后，可诱导细胞自噬。细胞通过自噬效应对病毒的清除或降解，可称做Virophagy。这不仅是一个有趣的现象，也在B19V感染的防治方面显示出非常重要的意义，因为B19V主要通过诱导宿主细胞病变或细胞死亡导致疾病。该研究结果还显示B19V感染期间，细胞自噬水平的提高会使被感染细胞更易于存活[35]。许多病毒感染细胞后，会在细胞内合成病毒蛋白和进行复制活动。大量外源性病毒蛋白聚集在内质网，可以作为一种内质网应激（Endoplasmicreticulumstress,ERS）刺激宿主细胞，而宿主细胞则会启动未折叠蛋白反应（Unfoldedproteinresponse,UPR）来保护自身[36]。目前文献报道的未折叠蛋白反应信号通路包括PERK、ATF-6和IRE1三条通路[37]。B19V对宿主细胞的损伤机制中，其结构与非结构蛋白发挥着重要作用。因此，本研究拟对B19V部分蛋白的功能进行初步探索。经过文献调研，我们发现很多关于B19V蛋白功能相关的研究。它们多集中在VP1蛋白、VP2蛋白、NS1蛋白和11kDa蛋白，特别是它们在诱导细胞凋亡、炎症反应和致病机制方面的探索较多[38-44]。然而，非结构蛋白X和7.5kDa的功能研究鲜有报道。结合以上的研究背景，在本研究的第二部分，我们将对B19V的非结构蛋白X和7.5kDa在诱导细胞自噬和内质网应激方面进行初步探索。7 军事科学院硕士学位论文第一部分我国献血/献浆人群中人细小病毒B19和人细小病毒4的分子流行病学分析摘要本研究使用B19V-PARV4双重核酸检测体系对我国西安地区3200例单人份献血者血浆和我国某血液制品企业54份混合原料血浆进行了B19V和PARV4的分子流行病学调查，并对其中检测到的B19V进行了系统发育分析。基于B19V基因组中NS1-VP1u区的核苷酸序列或基因组近全长序列进行克隆测序后，经多重序列比对，最后基于此NS1-VP1u区的核苷酸序列或基因组近全长序列进行了系统发育分析，对B19V核酸阳性血浆样品进行了毒株的基因分型。结果显示，在我国西安地区3200例单人份献血者血浆中，B19V核酸阳性的样品有12份，总阳性率为0.38%；而PARV4核酸阳性的样品有4份，总阳性率为0.13%。B19V核酸阳性样品中有4份样品鉴定为1a亚型，2份样品鉴定为1b亚型。在我国某血液制品企业54份混合原料血浆中，B19V核酸阳性的样品有5份，总阳性率为9.26%；而PARV4核酸阳性样品有11份，总阳性率为20.37%。B19V核酸阳性样品中有1份基因组近全长克隆，其基因型鉴定为1b亚型。关键词：人细小病毒B19；人细小病毒4；核酸检测；基因型PartIMolecularepidemiologicalanalysisofHumanparvovirusB19andHumanparvovirus4inChineseblood/plasmadonorsAbstractThemolecularepidemiologyofB19VandPARV4in3200singledonationssamplesand54mixedsourceplasmasamplesinaChineseplasma-derivedmedicinalproductsmanufacturewereinvestigatedbyusingduplexnucleicacidtestingsystemforB19VandPARV4.PhylogeneticanalysiswascarriedoutbycloningandsequencingthenucleotidesequenceoftheNS1-VP1uregionoftheB19Vgenomeorthenear-full-lengthsequenceofthegenome,andthenthesequencewasalignedwithmultiplereferencesequences.Finally,phylogeneticanalysisandgenotypingofthevirusstrainwascarriedoutbasedonthenucleotidesequenceoftheNS1-VP1uregionorthenear-full-lengthnucleotidesequenceofthegenome.Theresultsshowedthatthereare12positivesamplesofB19Vnucleicacidinplasmaof3200singledonationsinXi'anofChina,withatotalpositiverateof0.38%,while4sampleswerepositiveforPARV48 军事科学院硕士学位论文nucleicacidwithatotalpositiverateof0.13%.Foursampleswereidentifiedas1asubtypeofB19Vand2sampleswereidentifiedas1bsubtypeofB19V.Thereare5positivesamplesofB19VnucleicacidintheChineseplasma-derivedmedicinalproductsmanufacture,withatotalpositiverateof9.26%,while11sampleswerepositiveforPARV4nucleicacidwithatotalpositiverateof20.37%.B19Vnucleicacidpositivesamplehadonenear-full-lengthgenomeclone.Itsgenotypeisidentifiedassubtype1bofB19V.Keywords:HumanparvovirusB19;Humanparvovirus4;nucleicaciddetection;genotype人细小病毒B19（HumanparvovirusB19,B19V）和人细小病毒4（Parvovirus4,PARV4）均可感染人类，且都能够经血液及血液制品传播。考虑到它们的存在可使我国临床用血和血液制品的使用存在病毒安全隐患，本实验室有必要对B19V和PARV4在我国献血/献浆人群中的携带情况及它们在原料血浆中的污染状况进行分子流行病学调查。鉴于不同基因型B19V的分子特性及感染人类后所带来的临床表现存在差异，对我国献血/献浆人群中B19V毒株进行系统发育分析也是必要的。本实验室具有对人细小病毒研究的前期基础，先前建立了可以同时检测B19V和PARV4核酸的实时荧光定量PCR（Realtimefluorescencequantitativepolymerasechainreaction,qPCR）检测体系，这极大地方便了本研究对我国献血/献浆人群中的B19V和PARV4的核酸检测工作。图1为本研究第一部分的技术路线。图1技术路线图对我国献血/献浆人群中B19V和PARV4进行分子流行病学分析，并对其中存在的B19V进行毒株基因型鉴定，这些工作将为保障我国捐献的血液/血浆及血液制品的病毒安全性提供重要的基础数据。9 军事科学院硕士学位论文1材料与方法1.1材料1.1.1样品陕西省血液中心（西安市中心血站）提供的3200份单人份献血者血浆；国内某血液制品公司提供的54份生产用混合原料血浆，每份混合原料血浆由5000-8000例单人份血浆混合而成。1.1.2主要试剂高纯度病毒核酸提取试剂盒，购自Roche公司；PhusionhighfidelityDNA聚合酶，购自NEB公司；EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶，购自NEB公司；高纯度质粒小提试剂盒，购自天根公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自天根公司；普通DNA纯化试剂盒，购自天根公司；pMD18-T载体克隆试剂盒，购自Takara公司；PremixTaq酶，购自Takara公司；DNA标准参照物DL500、DL2000购自Takara公司；无水乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司；dATP和dNTPs，购自Takara公司；琼脂糖，购自Biowest公司；琼脂粉，购自北京化学试剂公司；胰蛋白胨和酵母提取物，购自Oxoid公司。1.1.3质粒和菌株TOP10感受态细胞，购自天根公司；B19V的感染性克隆pB19-M20，由美国NIH心肺血液研究所SusanWong博士赠予；B19V的参考品质粒和竞争性内标重组噬菌粒，由本实验室保存；pMD18-T载体，购自Takara公司；1.1.4主要设备和仪器生物安全柜，购自上海力康公司，HF1200；洁净工作台，购自北京亚泰科隆仪器公司；恒温水浴锅，购自Pharmaciabiotech公司；微型高速离心机，购自Eppendorf公司；实时荧光定量PCR，购自Bio-Rad公司，CFX96RealTimeSystem；PCR仪器，购自ABI公司，Veriti96wellThermalcycler；10 军事科学院硕士学位论文电泳仪及电源，购自Bio-Rad公司；分光光度计，购自GE公司；恒温振荡器，购自太仓市科教器材厂；电子天平，购自湘平公司；紫外分析仪，购自北京市六一仪器厂；凝胶成像仪，购自GE公司，ImageQuant350。1.2血浆样品的准备与处理先把单人份献血者血浆样品按照每10人份混合成minipool形式，进行人细小病毒的核酸检测。确定人细小病毒核酸阳性的minipool样品再进行拆分检测，从而确定人细小病毒核酸阳性的单人份血浆样品例数。具体方法为3200例单人份献血者血浆样品分别取出100μL，每10人份充分混匀，从而获得320份minipool形式的血浆样品。将320份minipool形式的血浆样品和54份混合原料血浆样品分别取出200μL。将此374份血浆样品分别加入噬菌体内标，使其终浓度为10copies/μL。1.3血浆样品中病毒核酸的提取确保在运行良好的生物安全柜中进行病毒核酸提取的全部过程。使用高纯度病毒核酸提取试剂盒，严格按照该试剂盒说明书进行操作。实验前准备工作：（1）配制蛋白酶K溶液：取出预装有蛋白酶K冻干粉的药瓶，向其中加入5mLElutionBuffer，充分摇晃溶解。按照1mL/tube分装后，冻存于-20℃。（2）配制Poly（A）溶液：取出预装有Poly（A）冻干粉的药瓶，向其中加入0.5mLElutionBuffer，充分摇晃溶解。按照50μL/tube分装后，冻存于-20℃。（3）操作时，从-20℃取出一支50μLPoly（A），平衡至室温。加入2.5mLBindingBuffer充分混匀。确保每次工作时均使用新混匀的溶液。（4）配制InhibitorRemovalBuffer溶液：向其中加入20mL无水乙醇，充分混匀，保存于室温。（5）配制WashBuffer溶液：向其中加入40mL无水乙醇，充分混匀，保存于室温。病毒核酸提取实验步骤：（1）向200μL的血浆样品中加入新鲜配制的含Poly（A）的BindingBuffer和50μL蛋白酶K溶液，立即混合均匀。短暂离心使管壁不残留液体，置于72℃孵育10分钟。（2）加入100μLBindingBuffer并混合均匀。（3）将过滤柱放于收集管中，将（2）中的液体加入过滤柱中，8000g离心1min，丢弃收集管。11 军事科学院硕士学位论文（4）将过滤柱放于新的收集管中，加入500μLInhibitorRemovalBuffer，8000g离心1min，丢弃收集管。（5）将过滤柱放于新的收集管中，加入450μLWashBuffer，8000g离心1min，丢弃收集管。将此步骤重复进行一次。（6）将过滤柱放于新的收集管中，最大转速（约13000g）离心15s，丢弃收集管。（7）将过滤柱放于无菌1.5mL离心管中，加入50μLElutionBuffer，8000g离心1min。（8）获得的核酸溶液冻存于-20℃备用。1.4B19V-PARV4双重核酸检测体系对血浆样品的检测将试剂盒提取的320份单人份献血者血浆和54份原料血浆的病毒核酸溶液作为实时荧光定量PCR的待检样品。使用的检测体系为B19V-PARV4双重核酸检测体系[32]，可以实现对B19V和PARV4核酸的同时检测。检测时，每个待检测样品设置三个复孔。同时，每次检测均设置NTC（Notemplatecontrol,无模板阴性对照）和阳性对照（B19V和PARV4的参考品质粒）。反应体系包括：PlatinumQuantitativePCRSuperMix-UDG10μL，B19F500nmol/L，B19R500nmol/L，B19P250nmol/L，PARV4F900nmol/L，PARV4R900nmol/L，PARV4P250nmol/L，fjM13F500nmol/L，fjM13R500nmol/L，fjM13P250nmol/L，模板3μL，加无菌去离子水至20μL。反应条件为：50℃2min；95℃2min；95℃15s、56℃30s，40个循环。1.5人细小病毒B19核酸阳性样品中目的片段的TA克隆1.5.1分型引物的设计与合成经过调研文献[33]，分别合成了基于B19V基因组中NS1-VP1u区核苷酸序列的分型引物（表1）和基于B19V近基因组全长序列的分型引物（表2）。引物均由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。表1基于B19V基因组NS1-VP1u区核酸序列的分型引物名称引物序列（5’-3’）位置*（nt）扩增子长度（bp）FX1FCACTATGAAAACTGGGCAA1855-18731124FX1RACAATTCTTCATCTGCTAC2960-2978FX2FAAACTGGGCAATAAACTACAC1863-18831110FX2RCTTCATCTGCTACCGTCCAA2953-2972注：*参考序列为GenBankNo.M13178。12 军事科学院硕士学位论文表2基于B19V基因组近全长序列的分型引物名称引物序列（5’-3’）位置*（nt）扩增子长度（bp）e0001fCCGGAATTCGACGTCACAGGAAATGACG1–195028e5011rCCGGAATTCGACGTCACAGGAAATGAC5011–5028注：*参考序列为GenBankNo.AX003421。“GAATTC”为限制性内切酶EcoRⅠ的酶切位点。1.5.2目的片段的PCR扩增（1）巢式PCR扩增NS1-VP1u区的基因片段第一次PCR反应：以单人份献血者血浆经病毒核酸提取的样品中B19V核酸阳性样品为模板，实验设置NTC（无模板阴性对照）和阳性对照（B19V的感染性克隆pB19-M20）。反应体系包括PhusionHFDNA聚合酶0.5µL，5×PhusionHFbuffer10µL，0.2mMdNTPs，引物FX1F和FX1R均为500nM，模板2µL，加无菌去离子水至50µL。反应条件为98℃，30s。98℃变性7s，51°C退火30s，72℃延伸30s，设置35个循环。72℃延伸7min。第二次PCR反应：以第一次反应产物为模板进行第二次PCR实验。反应体系包括PhusionHFDNA聚合酶0.5µL，5×PhusionHFbuffer10µL，0.2mMdNTPs，引物FX2F和FX2R均为500nM，模板2µL，加无菌去离子水至50µL。反应条件为98℃，30s。98℃变性7s，60°C退火30s，72℃延伸30s，35个循环。72℃延伸7min。巢式PCR获得的产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其扩增片段的长度。（2）PCR扩增基因组近全长的序列以混合原料血浆经病毒核酸提取所得样品中B19V核酸阳性的样品为模板，实验设置NTC（无模板阴性对照）和阳性对照（B19V的感染性克隆pB19-M20）。反应体系包括PhusionPhusionHFDNA聚合酶0.5µL，5×phusionGCbuffer10µL，0.2mMdNTPs，引物e0001f和e5011r均为500nM，DMSO1.5μL，模板2µL，加无菌去离子水至50µL。反应条件为98℃，30s预变性。98℃变性7s，70°C30s，72°C2min30s，35个循环。72℃延伸7min。基因组近全长克隆的PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其扩增片段的长度。1.5.3PCR产物的TA克隆及鉴定（1）PCR产物加PolyA尾向各PCR产物中分别加入dATP（终浓度为10μM）和20μL的premixTaq酶。置于72℃继续反应30min。13 军事科学院硕士学位论文（2）胶中回收目的DNA片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离已经加PolyA尾的核酸片段，并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将胶中目的核酸片段回收。从回收获得的DNA溶液取出10μL再次进行电泳，以确保本次回收实验成功。（3）连接根据pMD18-T载体TA克隆试剂盒说明书，配制总体积为10μL的连接反应体系。反应体系为SolutionⅠ5μL，pMD18-T质粒1μL，插入片段3μL，水1μL。充分混匀后，置于16℃静置3h。（4）转化○1从-70°C冰箱迅速取出100uL的感受态细胞TOP10，冰浴融化。○2向100uL的感受态细胞中加入10uL连接产物，冰上静置30min。○342°C热激90s后，迅速将离心管转移到冰浴中，静置3-5min。○4加入900uL无抗性的LB液体培养基（37°C预热），37°C振荡培养40-50min。○54000rpm离心2min，弃900uL上清液，剩余液体重悬菌体沉淀。○6将菌液均匀涂布在含有氨苄西林的LB琼脂培养基上，37°Ｃ培养14h。（5）转板及菌落PCR鉴定从LB琼脂培养基上挑选圆形单菌落，转移至新的培养板上，同时进行菌落PCR鉴定。PCR反应体系为premixTaq酶12.5μL，上、下游引物均为500nM，加无菌水至25μL。反应条件同最初扩增目的片段的PCR反应条件。（6）扩大培养阳性克隆及提取质粒将菌落PCR鉴定为阳性的菌落点入盛有5mLLB培养液（含氨苄西林）的无菌小试管中。盖紧试管塞，置于37℃恒温振荡器中振荡培养12h。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，具体操作参见试剂盒说明书（此处略）。（7）酶切鉴定重组质粒使用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，使用EcoRⅠ进行单酶切。将提取的质粒测定浓度及A260/A280，根据浓度计算待酶切的质粒量为1μg。单、双酶切反应体系为Smartcut5uL，EcoRⅠ酶1uL，（SalⅠ酶1uL），质粒1μg，无菌水补至50uL。反应条件为37℃静置1h。1.6目的片段的核苷酸序列测定单人份献血者血浆中B19V核酸阳性样品基于NS1-VP1u区进行TA克隆后，将NS1-VP1u区的序列经双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定；混合原料血浆中B19V核酸阳性样品基于基因组近全长进行TA克隆后，将基因组近全长序列经双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定。14 军事科学院硕士学位论文该项内容委托中美泰和生物技术（北京）有限公司进行。1.7核苷酸序列多重比对及系统发育分析使用Mega7软件，将B19V核酸阳性样品的NS1-VP1u区核苷酸序列和基因组近全长核苷酸序列分别与B19V的三种基因型代表毒株的核苷酸序列进行多重比对。B19V的三种基因型代表株有：1a亚型的Au株（GenBankNO.M13178.1）、1b亚型的Vn147株（GenBankNO.DQ357064）、2型的A6株（GenBankNO.AY064475）和Lali株（GenBankNO.AY044266.2）、3a亚型的V9株（GenBankNO.AX003421）和3b亚型的D91.1株（GenBankNO.AY083234.1）。使用Mega7软件中的neighbor-joiningmethod对B19V不同基因型代表株的核苷酸序列和样品的核苷酸序列进行系统发育分析，并构建进化树。2结果2.1单人份献血者血浆中B19V和PARV4的核酸阳性率qPCR实验结果中的结果判定方法为：3个复孔均为阳性者，判定结果为阳性。仅2个复孔为阳性者，判定为疑似阳性。使用巢式PCR扩增目的片段，若不能扩增目的片段，则判定为阴性。若能够扩增出目的片段，则判定为阳性。仅1个或0个复孔为阳性者，判定结果为阴性。3200份单人份献血者血浆中，B19V核酸阳性的样品有12份（阳性率为0.38%），PARV4核酸阳性的样品有4份（阳性率为0.13%）。图2实时荧光定量PCR检测单人份献血者血浆中的B19V和PARV4核酸2.2混合原料血浆中B19V和PARV4的核酸阳性率qPCR实验结果中的结果判定方法同“2.1”。54份生产血液制品用混合原料血浆中，B19V核酸阳性的样品有5份（阳性率为9.26%），PARV4核酸阳性样品有11份（阳性率为20.37%）。15 军事科学院硕士学位论文图3实时荧光定量PCR检测混合原料血浆中的B19V和PARV4核酸2.3B19V的NS1-VP1u区基因片段的克隆及鉴定（1）NS1-VP1u区基因片段的巢式PCR扩增单人份献血者血浆中B19V核酸阳性样品经巢式PCR扩增其NS1-VP1u区基因片段，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。从结果图4可以看到，无模板阴性对照没有扩增出目的条带，这表明实验体系没有污染，结果可信。而样品泳道均可见目的条带，其PCR产物大小符合预期（1110bp）。扩增出的核酸片段可以用于后续的连接等实验中。图4B19V核酸阳性样品巢式PCR产物电泳图M:DL5000marker;a-d:扩增样品;ntc:无模板阴性对照（2）菌落PCR鉴定将PCR扩增的NS1-VP1u区基因片段与pMD18-T载体连接及转化TOP10感受态细胞。经过氨苄西林的LB培养基筛选后，分别从板上挑选5个圆形单菌落进行PCR鉴定。从结果图5可以看出，阳性对照孔有明显的目的条带，而阴性对照孔没有扩增出目的条带，这表明该实验体系可信。从样品孔的结果可以看出，各个菌落克隆均可以扩增出目的片段（1110bp）。这表明挑选的这些菌落克隆均为转化成功的阳性菌落。图5菌落PCR鉴定结果16 军事科学院硕士学位论文M:DL5000marker;a-o:挑选的单菌落;pos:阳性对照;ntc:无模板阴性对照（3）酶切鉴定将菌落PCR鉴定阳性的克隆进行扩大培养，并抽提质粒。获得重组质粒后，进行酶切鉴定。使用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，使用限制性内切酶EcoRⅠ进行单酶切。从结果图6可以看出，单酶切产物长度符合预期（3862bp），双酶切产物长度也符合预期（2692bp+1110bp）。图6酶切鉴定结果M:DL5000marker;a-d:阳性质粒用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切;e-f:阳性质粒用EcoRⅠ单酶切2.4B19V基因组近全长的克隆及鉴定（1）基因组近全长核酸片段的PCR扩增混合原料血浆中B19V核酸阳性样品经基因组近全长PCR扩增，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。从结果图7可以看出，无模板阴性对照没有扩增出目的条带，而样品孔的PCR产物大小符合预期（5028bp）。图7B19V核酸阳性样品的基因组近全长PCR结果M:DL10000marker;a:样品;ntc:无模板阴性对照17 军事科学院硕士学位论文（2）菌落PCR鉴定将PCR扩增的基因组近全长核酸片段与pMD18-T载体连接及转化TOP10感受态细胞。经过氨苄西林的LB培养基筛选后，分别从板上挑选6个圆形单菌落进行PCR鉴定。从结果图8可以看出，阳性对照孔有明显的目的条带，而阴性对照孔没有扩增出目的条带，这表明该实验体系可信。挑选的菌落样品中仅一个克隆（5号克隆）可以扩增出目的片段（5028bp）。图8菌落PCR鉴定结果M:DL10000marker;a-f:挑选的单菌落;ntc:无模板阴性对照;pos:阳性对照（3）酶切鉴定将菌落PCR鉴定阳性的克隆进行扩大培养，并抽提质粒。获得重组质粒后，进行酶切鉴定。使用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切，使用限制性内切酶EcoRⅠ进行单酶切。从结果图9可以看出，单酶切产物长度符合预期（7720bp），双酶切产物长度也符合预期（2692bp+5028bp）。图9酶切鉴定结果M:DL10000marker;a:阳性质粒用EcoRⅠ单酶切;b:阳性质粒用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切2.5核苷酸序列测定结果对酶切鉴定正确的TA克隆质粒样品交给中美泰和生物技术（北京）有限公司经双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定，获得其核苷酸序列。GenBankaccessionnumbers分别是：MH151117，MH151118，MH151119，MH151120，MH151121。18 军事科学院硕士学位论文2.6单人份献血者血浆中B19V的基因型鉴定基于NS1-VP1u区基因，经过TA克隆获得的重组质粒一共有6个，分别代表来自六个血浆样品中的B19V的NS1-VP1u区基因。使用MEGA软件，进行序列多重比对后。使用neighbor-joiningmethod对B19V不同基因型代表株的核苷酸序列和样品NS1-VP1u区的序列进行系统发育分析，并构建进化树。从结果图10可以看出，系统发育树可分为明显的三个分支，B19V的三种基因型各自位于其中一支。而研究样品中有4份样品与1a亚型的Au株形成了紧密的一簇，有2份样品与1b亚型的Vn147株形成了紧密的一簇。12310028100191001a-Au-M13178.11b-Vn147-DQ35706484-29910059-2.seq2-Lali-AY044266.21002-A6-AY0644753b-D91.1-AY083234.11003a-V9-AX0034210.0050图10基于NS1-VP1u区序列构建B19V进化树2.7混合原料血浆中B19V的基因型鉴定基于基因组近全长序列，经过TA克隆获得的重组质粒有1个，代表来自一份血浆样品中的基因组近全长序列。使用MEGA软件，进行序列多重比对后。使用neighbor-joiningmethod对B19V不同基因型代表株的核苷酸序列和样品基因组近全长序列进行系统发育分析，并构建进化树。从结果图11可以看出，系统发育树可分为明显的三个分支，B19V的三种基因型各自位于其中一支。而研究样品与1b亚型的Vn147形成了紧密的一簇。19 军事科学院硕士学位论文3b-D91.1-AY083234.11003a-V9-AX0034212-Lali-AY044266.21002-A6-AY0644751a-Au-M13178.1100451001b-Vn147-DQ3570640.0100图11基于近基因组全长序列构建B19V进化树3讨论B19V和PARV4可以感染人类，且经血液及血液制品传播是它们重要的传播方式，本研究所叙述的血源性人细小病毒是指可以经血液及血液制品传播的B19V和PARV4。由于在捐献血液/血浆时，这两种病毒不作为筛查病原体，因此两者在我国捐献血液/血浆中可能存在不同程度的污染。而我国血液制品生产用的血浆在混合为原料血浆时，也不筛查B19V和PARV4，且常规的病毒去除/灭活技术无法有效地将两者去除/灭活，因此它们在我国血液制品中也存在不同程度的污染。基于此现状，对我国献血/献浆人群和血液制品的混合原料血浆中的B19V和PARV4进行分子流行病学调查和生物学特性分析显得格外重要。3.1原料血浆中B19V的核酸阳性率高于其在单人份献血者血浆国内外对B19V在血液及血液制品中的污染率已经有了不少报道。总体来看，B19V在混合原料血浆和血液制品中的核酸阳性率普遍较高（6.5%-100%），而在献血者血浆中的核酸阳性率较低（0.005%-1.3%）[22]。在献血者血浆中的B19V的核酸阳性率与混合原料血浆、血液制品中的阳性率差距这么大的原因是，生产血液制品用的混合原料血浆为成千上万份的单人份血浆混合而成，只要这些单人份血浆中有一份为B19V核酸阳性，整个血浆池就会成为B19V核酸阳性。本实验室对B19V和PARV4的核酸检测工作具有一定的研究基础。从最初建立的可检测B19V三种基因型的通用核酸检测体系[20]到目前建立的B19V-PARV4双重核酸检测体系[32]，这些核酸检测技术的改进极大方便了本研究对血浆样品中细小病毒的核酸检测工作。本实验室先前的研究结果表明我国混合原料血浆和血液制品因子Ⅷ、凝血酶、纤维蛋白20 军事科学院硕士学位论文原以及凝血酶原复合物中B19V的核酸阳性率较高，约59.49%-100%，且最高浓度可达到1.35×1010copies/mL[21]。本研究获得的结果是，在单人份献血者血浆中B19V核酸阳性率为0.38%。而在生产血液制品用混合原料血浆中，B19V核酸阳性率为9.26%，显著高于单人份献血者血浆中的阳性率。本研究所获得的B19V核酸检测结果与国内外的其他研究小组的结果比较接近。3.2原料血浆中PARV4的核酸阳性率高于其在单人份献血者血浆国外有一些关于单人份献血者血浆中筛查PARV4核酸阳性率的报道，它们分别是0%（英国）[45]、0%（意大利）[46]、3%-4%（巴西、泰国和北美）[47-49]和17%（伊朗）[50]。而PARV4在混合原料血浆或血液制品中核酸阳性率总体上稍高于其在单人份献血者血浆的阳性率，为4%-33%[49,51]。本实验室先前对PARV4也有相关的研究，在我国三家血液制品企业的195份混合原料血浆进行PARV4的核酸检测，其阳性率为26.15%[52]。而在本研究中获得的结果是，单人份献血者血浆中PARV4核酸阳性率为0.13%。在生产血液制品用混合原料血浆中，PARV4核酸阳性率为20.37%，也远高于单人份献血者血浆中的阳性率。3.3关于B19V核酸阳性样品中的毒株基因型鉴定单人份献血者血浆基于NS1-VP1u区进行克隆测序和系统发育分析显示，样品中有4份初步鉴定为1a亚型，2份鉴定为1b亚型。后续需要对此6份样品进行近全长克隆，才能真正地确定其基因型。在混合原料血浆中qPCR检测获得的5份B19V核酸阳性样品中，能够成功克隆测序的样品仅1份，最终鉴定为1b亚型。无法成功克隆的原因可能是样品中的B19V核酸断裂、不完整导致无法成功进行近全长克隆的PCR实验。在获得B19V的基因组近全长序列后，经与不同基因型代表株进行多重序列比对，然后构建进化树，从而可以确认该阳性样品中的B19V毒株的基因型。考虑到混合原料血浆为5000-8000份单人份血浆混合而成，结合先前的研究数据，我们认为在混合原料血浆中的B19V核酸阳性率更高，且更可能获得B19V核酸高拷贝的样品。而单人份献血者血浆中的阳性率和B19V核酸拷贝数高的可能性比较低。因此，本研究中直接对混合原料血浆中的阳性样品进行了近全长克隆测序和鉴定基因型。而单人份献血者血浆则先基于某一段基因（NS1-VP1u区）进行初步的鉴定，之后再对其进行近全长克隆测序，这一点应列入下一步的研究工作中。4小结本研究使用B19V-PARV4双重核酸检测体系，对我国西安地区3200例单人份献血者血浆进行B19V和PARV4的核酸检测。研究结果显示，3200例单人份献血者血浆中，B19V核酸阳性的样品有12份，总阳性率为0.38%；而PARV4核酸阳性的样品有4份，总阳性率为0.13%。B19V核酸阳性样品中有4份样品鉴定为1a亚型，有2份样品鉴定为1b亚21 军事科学院硕士学位论文型。本研究对我国某血液制品企业共计54份生产用混合原料血浆进行了B19V和PARV4的核酸检测。研究结果显示，54份生产用混合原料血浆中，B19V核酸阳性的样品有5份，总阳性率为9.26%；而PARV4核酸阳性样品有11份，总阳性率为20.37%。B19V核酸阳性样品中有1份样品成功地获得了其基因组近全长序列，其基因型鉴定为1b亚型。通过对我国西安地区单人份献血者血浆及我国某血液制品企业的原料血浆中的B19V和PARV4进行分子流行病学调查，并对其中存在的B19V基因型进行鉴定，我们了解了B19V和PARV4在我国的流行状况和其中的B19V基因型分布情况。这对保障我国临床用血和使用血液制品的病毒安全性提供了重要的基础数据。22 军事科学院硕士学位论文第二部分人细小病毒B19非结构蛋白X和7.5kDa的功能研究摘要本研究对B19V的非结构蛋白X和7.5kDa在诱导细胞自噬和诱导内质网应激方面进行了初步探索。通过分子克隆技术构建了B19V的非结构蛋白X和7.5kDa真核表达质粒pcDNA3.1-HA-X和pcDNA3.1-HA-7.5kDa，将它们分别转染UT7/Epo-S1细胞，使转染细胞中表达蛋白X或蛋白7.5kDa。通过免疫印迹进行了LC3B-Ⅱ的转化分析和借助激光共聚焦显微镜观察了膜型LC3B（LC3B-Ⅱ）在自噬小体膜上聚集为斑点状的现象。结果显示，非结构蛋白7.5kDa可以诱导UT7/Epo-S1细胞自噬，而X蛋白没有这种效果。这表明在B19V诱导宿主细胞自噬的分子机制中，非结构蛋白7.5kDa可能发挥着重要的作用。通过免疫印迹分析了转染细胞中的内质网应激相关蛋白Bip和CHOP的表达情况，结果显示非结构蛋白X和7.5kDa的存在不能使UT7/Epo-S1细胞中Bip蛋白和CHOP蛋白的表达发生显著地上调。这表明非结构蛋白X和7.5kDa不能诱导UT7/Epo-S1细胞产生内质网应激的效应。关键词：人细小病毒B19；X蛋白；7.5kDa蛋白；细胞自噬；内质网应激PartⅡResearchonthefunctionofHumanparvovirusB19nonstructuralproteinXand7.5kDaAbstractWemainlyfocusontheroleofB19Vnon-structuralproteinsXand7.5kDaininducingautophagyandendoplasmicreticulumstress.WeconstructedtheeukaryoticexpressionplasmidspcDNA3.1-HA-XandpcDNA3.1-HA-7.5kDa,whichcanexpressB19Vnon-structuralproteinsXand7.5kDainthetransfectedUT7/Epo-S1cells,respectively.WeanalyzedthetransformationofLC3B-ⅡbyWesternblotandobservedthephenomenonofmembranetypeLC3B-Ⅱaggregationonthemembraneofautophagosomebylaserconfocalmicroscopy.Theresultsshowthatprotein7.5kDacanincreasethelevelofautophagyinUT7/Epo-S1cellssignificantly.ButproteinXdonothavetheeffect.Theresultsuggeststhatnon-structuralprotein7.5kDamayplayanimportantroleinthemolecularmechanismofautophagyinthecellsinfectedwithB19V.Inordertostudytheeffectsofthesetwononstructuralproteinsonendoplasmicreticulumstress,Weanalyzedtheexpressionofendoplasmicreticulumstress-relatedproteins(BipandCHOP)intransfectedcellsbyWesternblot.Theresultsshow23 军事科学院硕士学位论文thatthepresenceofnon-structuralproteinsXand7.5kDacouldnotup-regulatetheexpressionofproteinBipandCHOPinUT7/Epo-S1cells.Itimpliesthatnon-structuralproteinXand7.5kDacouldnotinduceendoplasmicreticulumstressinUT7/Epo-S1cells.Keywords:HumanparvovirusB19;proteinsX;protein7.5kDa;autophagy;endoplasmicreticulumstress人细小病毒B19感染细胞后，可以通过多种方式损害宿主细胞。而AkitoshiNakashima的研究结果显示B19V感染的细胞在自噬水平提高时，宿主细胞更易于存活[35]。细胞自噬是细胞在长期进化中较为保守的一种防御机制，可以对侵入细胞内的病原体进行降解。多数病毒感染细胞后，会在细胞内质网内合成大量的病毒蛋白，这些外源性病毒蛋白的大量聚集作为引起内质网应激的刺激，通常引发未折叠蛋白反应来保护细胞[36]。而病毒感染细胞诱导的细胞自噬，其发生机制可能与未折叠蛋白反应的信号通路存在联系。对B19V诱导细胞自噬和内质网应激的分子机制进行探索，对提高宿主细胞对B19V感染的抵抗力有重要意义。目前，人们对B19V蛋白的功能研究逐渐增多，但对其非结构蛋白X和7.5kDa的功能研究却很少报道。本研究主要对非结构蛋白X和7.5kDa在诱导细胞自噬和诱导细胞产生内质网应激方面做了初步的探索性研究。图12为本研究第二部分的技术路线图。图12技术路线图1材料与方法1.1材料1.1.1主要试剂DMEMBasic细胞培养液，购自Gibco公司；胎牛血清，购自Hyclone公司；24 军事科学院硕士学位论文Trizol试剂，购自SigmaAlderich公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇、无水甲醇、多聚甲醛，购自国药集团化学试剂公司；无Rnase/Dnase的DEPC水，购自天根公司；M-MuLV反转录酶试剂盒，购自ThermoScitntific公司；phusionHFDNA聚合酶试剂盒，购自NEB公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自Qiagen公司；T4DNA连接酶，购自Takara公司，限制性内切酶Xho1和EcoR1，购自NEB公司；琼脂糖，购自Biowest公司；琼脂粉，购自北京化学试剂公司；胰蛋白胨和酵母提取物，购自Oxoid公司；重组人促红细胞生成素，购自三生药业；转染试剂盒，购自Lonza公司；去内毒素质粒提取试剂盒，购自Qiagen公司；MG132，购自MerckMillipore公司；Rapamycin，购自SigmaAlderich公司；DMSO，购自Amresco公司；蛋白酶抑制剂，购自Roche公司；RIPA细胞裂解液，购自碧云天公司；BCA法蛋白含量测定试剂盒，购自北京鼎国昌盛公司；4-20%预制梯度胶，购自南京金斯瑞公司；蛋白预染marker（10-180kDa），购自Thermofisher公司；封闭液，购自Rockland公司；PVDF膜，购自MerckMillipore公司；HA标签抗体，购自CellSignalingTechnology公司；Bip抗体，购自CellSignalingTechnology公司；CHOP抗体，购自CellSignalingTechnology公司；LC3B抗体，购自CellSignalingTechnology公司；β-actin抗体，购自proteintech公司；羊抗兔、羊抗鼠荧光二抗（680RD和800CW），均购自LI-COR公司；左旋多聚赖氨酸，购自SigmaAlderich公司；DAPI染色液，购自碧云天公司。1.1.2主要溶液配制25 军事科学院硕士学位论文PBS，由本实验自己配制（10×浓度配方：氯化钠80g，氯化钾2g，十二水合磷酸氢二钠35.82g，磷酸二氢钾2.7g。pH值调整至7.2-7.4）；4%多聚甲醛，由本实验室自己配制（4g多聚甲醛溶于100mL的PBS，调整pH=7.2-7.4）；MOPSrunningbuffer，由本实验室自己配制（Trisbase6.06g，MOPS10.46g，SDS1.0g，EDTA0.3g，加去离子水定容至1L。）Transferbuffer，由本实验室自己配制（10×浓度配方：29g甘氨酸，58gTrisbase，SDS3.7g，调整pH=8.0，定容至1L。使用时，按照体积比为Transferbuffer：甲醇：水=1：2：7混匀。）TBST，由本实验室自己配制（10×浓度配方：80gNacl，24.1gTrisbase，15mlHcl，调整pH=7.4~7.6，定容至1L。使用时，加入终浓度0.1%的Tween20）。1.1.3质粒、菌株和细胞人胚肾293T细胞（HEK293T细胞），由本实验室自己保存；真核表达载体pEGFP-C1，购自北京鼎国昌盛生物技术公司；DH5α感受态细胞，购自Takara公司；真核表达载体pcDNA3.1(+)-HA，由本实验室自己保存；B19V感染性克隆pB19-M20及其敏感细胞UT7/Epo-S1，均由NIH心肺血液研究所SusanWong博士惠赠。1.1.4主要仪器设备普通光学显微镜，购自Olympus公司；低温高速离心机，购自Biofuge公司，PrimoR；分光光度计，购自GE公司；恒温水浴锅，购自PharmaciaBiotech；恒温振荡器，购自太仓市科教器材厂；洁净工作台，购自北京亚泰科隆仪器公司；电泳仪及电源，购自Bio-Rad公司；电转染仪，购自Lonza公司，AMAXANuceofectorII；细胞孵育箱，购自ThermoScientific公司；低速离心机，购自上海手术器械厂；超声波细胞破碎机，购自宁波新芝公司，SCIENTZ-ⅡD；酶标仪，购自MolecularDevices公司，SpectraMaxM5；荧光显微镜，购自Leica公司，DMI300；蛋白电泳槽及湿式转膜仪，购自Bio-Rad公司；双色红外成像系统，购自LI-COR公司，Odyssey；26 军事科学院硕士学位论文激光共聚焦显微镜，购自CarlZeiss公司，LSM880。1.2UT7/Epo-S1细胞的常规培养该细胞属于悬浮生长细胞，不贴壁生长。使用的DMEMbasic细胞培养液中需要含有10%的胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）和2unit/mL人促红细胞生成素（Epo）。需要特别提醒的是，该细胞需要Epo存在时才能正常地增殖。细胞的适宜生长密度约为5×105cells/mL。常规培养时，本实验室使用无菌6孔板作为细胞生长的容器，静置于细胞培养箱中培养（37℃，培养箱中含5%CO2）。每天于光学显微镜下观察细胞状态，每两天更换一次培养液并将细胞量调整至适宜密度。1.3工具质粒pEGFP-hLC3B的构建与鉴定1.3.1人源LC3B基因的引物设计与合成经过文献调研[53]，选择了表3中人源LC3B基因的上、下引物序列。将这段引物在NCBI网址进行BLAST，发现它能特异性地扩增人源LC3B基因（GenBankAccessionNo.NM_022818）。预期的扩增片段为人源LC3B基因的开放阅读框（OpenReadingFrame,ORF）。引物序列由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。表3人源LC3B基因ORF的扩增引物名称引物序列（5’-3’）扩增子长度（bp）hLC3B-FCCGCTCGAGCTATGCCGTCGGAGAAGACCTTC398hLC3B-RCGGAATTCTTTACACTGACAATTTCATCCC1.3.2提取HEK293T细胞的总RNA（下面的步骤为1mLTrizol对应的试剂加入量）（1）取1mL的Trizol加入HEK293T细胞的培养瓶中，使之遍布瓶底。用一次性细胞刮刀轻刮瓶底细胞使之聚到瓶底一处角落，把Trizol处理的这些细胞转移到1.5mL离心管中，轻轻摇晃混匀。细胞用Trizol处理后，可暂存于-70°C。（2）加入0.2mL的氯仿，上下摇晃至混合均匀，室温静置10min。（3）将混合液在4°C条件下，10000g离心15min。可以观察到样品分为3层（上层为无色水相，RNA主要分布其中；下层为黄色有机相；中间隔着一层白色薄状物质）。（4）把上层水相转移到新的1.5mL离心管中，避免吸走中间层。（5）加入0.5mL异丙醇（异丙醇可沉淀水相中的RNA），混匀后室温放置10min。（6）将静置后的混合液在4°C条件下，10000g离心10min，可以观察到有白色沉淀析出。（7）小心移除上清，加入1mL的75%乙醇。在4°C条件下，7500g离心5min。（8）小心移除上清，将沉淀静置晾干10min。（9）加入50uL无Rnase的水，用无菌吸头轻轻吸打使RNA溶解。27 军事科学院硕士学位论文（10）使用分光光度计测提取的总RNA浓度及A260/A280，溶液可暂存于-70°C。1.3.3RNA反转录获得cDNA（1）取10μg提取的总RNA作为模板，加入1uLOligo（dt）15作为引物。两者混匀后，置于70°C，反应5min。（2）反应结束后，迅速转移到冰上。（3）加入10×buffer2μL，2.5mMdNTP4μL，Rnasin20U（0.5μL）,M-MuLV12U（1μL），加无菌蒸馏水至20μL。需要提前配好此工作液。（4）室温静置10min后，置于42°C反应1h。即可获得cDNA。1.3.4RT-PCR扩增人源LC3B基因以上一步获得的cDNA为模板，以hLC3B-F和hLC3B-R为引物进行PCR。实验设置NTC（无模板阴性对照）。反应体系包括：phusionHFDNA聚合酶0.5uL，5×HFBuffer10μL，0.2mMdNTP，引物hLC3B-F和hLC3B-R分别500nM，cDNA2uL，加无菌去离子水至50uL。反应条件为：94℃预变性5min。94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，设置35次循环。72℃延伸10min。1.3.5胶中回收目的DNA片段将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将胶中的目的片段回收。从回收获得的DNA溶液取出10μL再次进行电泳，以确保本次回收实验成功。1.3.6目的基因与pEGFP-C1载体分别双酶切使用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ分别对扩增的目的基因和载体pEGFP-C1进行双酶切，使它们暴露出粘性末端，以利于下一步的连接。各取0.5μg进行酶切反应。双酶切体系包括：Smartcut5uL，XhoⅠ酶1uL，EcoRⅠ酶1uL，待酶切底物0.5μg，加入无菌去离子水补至50uL。两个酶切体系的反应条件均为37℃反应1h。酶切完成后，再经1%琼脂糖凝胶电泳，并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将胶中的酶切过的目的DNA片段和酶切过的载体片段回收。1.3.7目的基因与pEGFP-C1载体连接按照目的基因与载体的拷贝数比值5：1，计算两者相应的体积比。其连接反应体系为载体1μL，插入片段4μL，T4DNA连接酶1μL，10×buffer1μL，无菌水3μL。反应条件为16℃静置12h。1.3.8转化28 军事科学院硕士学位论文使用当日配制的含有卡那霉素的LB培养板进行转化。（1）从-70°C冰箱迅速取出100uL的感受态细胞DH5α，冰浴融化。（2）向100uL的感受态细胞中加入10uL连接产物，冰上静置30min。（3）42°C热激90s后，迅速将离心管转移到冰浴中，静置3-5min。（4）加入900uL无抗性的LB液体培养基（37°C预热），37°C振荡培养40-50min。（5）4000rpm离心2min，弃900uL上清液，剩余液体重悬菌体沉淀。（6）将菌液均匀涂布在含有氨苄西林的LB琼脂培养基上，37°Ｃ培养14h。1.3.9转板及菌落PCR鉴定从LB琼脂培养基上挑选圆形单菌落，转移至新的培养板上，同时进行菌落PCR鉴定。PCR反应体系为premixTaq酶12.5uL，上、下游引物均为500nM，加无菌水至25uL。反应条件同最初扩增目的片段的PCR反应条件。1.3.10扩大培养及重组质粒抽提将菌落PCR鉴定为阳性的菌落点入盛有5mLLB培养液（含卡那霉素）的无菌小试管中。盖紧试管塞，置于37℃恒温振荡器中振荡培养12h。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，具体操作参见试剂盒说明书（此处略）。1.3.11重组质粒pEGFP-hLC3B的鉴定（1）酶切鉴定使用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，使用EcoRⅠ进行单酶切。将提取的质粒测定浓度及A260/A280，根据浓度计算待酶切的质粒量为1μg。单、双酶切反应体系为Smartcut5uL，EcoRⅠ酶1uL，（XhoⅠ酶1uL），质粒1μg，无菌水补至50uL。反应条件为37℃静置1h。（2）核苷酸序列测定对酶切鉴定正确的质粒样品经双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定，该项内容委托中美泰和生物技术（北京）有限公司进行。1.4真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HA-7.5kDa和pcDNA3.1(+)-HA-X的构建与鉴定1.4.1人细小病毒B19非结构蛋白X和7.5kDa编码序列的引物设计与合成从GenBank下载B19VJ35毒株的核苷酸序列（GenBankNo.AY386330.1）。使用PrimerPremier5.0软件，严格遵循引物的设计原则，分别根据B19V基因组编码蛋白X和7.5kDa的核苷酸序列，设计了相应的扩增引物（表2）。引物序列由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。29 军事科学院硕士学位论文表2B19V非结构蛋白X和7.5kDa编码序列的扩增引物编码引物序列a碱基位置b扩增子长度蛋白（5’-3’）（nt）（bp）XForward:GGAATTCCCATGGACAGTTATCTGACC2874-2892265Reverse:GCGCGGCCGCTTATTCCCAACTTAGCC3102-31197.5kDaForward:GGAATTCCCATGCAGATGCCCTCCACCCAG2084-2105244Reverse:GCGCGGCCGCTTACAACTTCGGAGGAAACTGGGC2284-2308注：aGAATTC：EcoRⅠ酶切位点；GCGGCCGC：NotⅠ酶切位点；CC：防止移码突变的保护碱基。b碱基位置参照B19V的J35毒株核苷酸序列（GenBankNo.AY386330.1）。1.4.2PCR扩增非结构蛋白7.5kDa和X的基因片段以B19V的感染性克隆pB19-M20为模板，使用表2中的上、下游引物进行PCR。实验设置NTC（无模板阴性对照）。反应体系包括：phusionHFDNA聚合酶0.5uL，5×HFBuffer10μL，0.2mMdNTP，上、下引物分别500nM，1ng感染性克隆pB19-M20作模板，加无菌去离子水至50uL。反应条件为：98°C预变性3min。98°C变性30s，72℃退火30s，72°C延伸1min，35个循环。72°C延伸5min。1.4.3目的DNA回收将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将胶中的目的片段回收。从回收获得的DNA溶液取出10μL再次进行电泳，以确保本次回收实验成功。1.4.4目的基因与pcDNA3.1(+)-HA载体分别双酶切使用限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ分别对扩增的目的基因和载体pcDNA3.1(+)-HA进行双酶切，使它们暴露出粘性末端，以利于下一步的连接。各取0.5μg进行酶切反应。双酶切体系包括：Smartcut5uL，NotⅠ酶1uL，EcoRⅠ酶1uL，待酶切底物0.5μg，加入无菌去离子水补至50uL。三个酶切体系的反应条件均为37℃反应1h。酶切完成后，再经1%琼脂糖凝胶电泳，并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将胶中的酶切过的目的DNA片段和酶切过的载体片段回收。1.4.5目的基因与pcDNA3.1(+)-HA载体的连接按照目的基因与载体的拷贝数比值5：1，计算两者相应的体积比。其连接反应体系为载体1μL，插入片段5μL，T4DNA连接酶1μL，10×buffer1μL，无菌水2μL。反应条件为16℃静置12h。1.4.6转化、转板、菌落PCR鉴定、扩大培养阳性克隆及提取质粒30 军事科学院硕士学位论文使用当日配制的含有氨苄西林的LB培养板进行转化。方法同1.3.8-1.3.10，此处略。1.4.7重组质粒pcDNA3.1(+)-HA-7.5kDa和pcDNA3.1(+)-HA-X的鉴定（1）酶切鉴定使用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，使用EcoRⅠ进行单酶切。将提取的质粒测定浓度及A260/A280，根据浓度计算待酶切的质粒量为1μg。单、双酶切反应体系为Smartcut5uL，EcoRⅠ酶1uL，（NotⅠ酶1uL），质粒1μg，无菌水补至50uL。反应条件为37℃静置1h。（2）核苷酸序列测定对酶切鉴定正确的质粒样品经双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定，该项内容委托中美泰和生物技术（北京）有限公司进行。1.5重组质粒转染UT7/Epo-S1细胞待转染的质粒需要提前做去除内毒素的处理，有利于提高转染后细胞的存活率。本实验室使用的转染方法为电穿孔的物理转染方法，具体步骤如下：（1）将常规培养的细胞收集至15mL无菌离心管中，1000rpm离心5min，去除上清。（2）加入1mLDMEMbasic细胞培养液重悬细胞沉淀，混合均匀。（3）使用细胞计数板，对细胞进行计数，获得细胞密度的数值。（4）细胞计数后，经过计算，取2×106个细胞至无菌的1.5mL离心管中，并添加细胞培养液至1mL。放入细胞孵育箱中静置，备用。（5）配制细胞营养液：DMEMbasic细胞培养液中含10%FBS和2U/mLEpo。充分混合均匀后，取1ml加入到无菌24孔板的板孔中（共10个孔）。将24孔培养板置于细胞孵育箱中静置，备用。（6）取一个无菌1.5mL离心管，在其中加入500uL细胞营养液。将离心管置于细胞孵育箱中静置，备用。将细胞培养液的温度保持在37℃，有利于提高转染后细胞的存活率。（7）将待转染细胞取出，6000rpm离心30s，小心地去除上清液，避免重悬细胞。（8）每管加入100uL配制好的转染试剂solutionR，轻轻重悬细胞，加入去内毒素级的供转染质粒3μg。用试剂盒配套的吸管吸取细胞/质粒混合液转入电极槽中，放置于AMAXANuceofectorII仪器中，选择X-005程序进行转染。（9）转染后使用原吸管吸出细胞，转移至孵育的500uL细胞培养液中。然后再转移至24孔板中（每孔加入60μL）。在细胞培养箱中培养（刚刚转染的细胞比较脆弱，尽量避免剧烈晃动）。（10）转染后的细胞，每天在光学显微镜下观察一次，以了解转染后的细胞状态。31 军事科学院硕士学位论文1.6免疫印迹检测蛋白的表达1.6.1提取细胞总蛋白待转染后第72h，开始提取细胞总蛋白。需要注意，在提取细胞总蛋白期间，尽量保证样品一直处于低温环境。具体步骤如下：（1）在普通光学显微镜下观察细胞状态，确定细胞适宜提取总蛋白。（2）将细胞收集至15mL无菌离心管中，1000rpm离心5min，去除上清。（3）再使用PBS洗涤3遍，每次1000rpm离心5min，去除上清。（4）在细胞沉淀中加入50μL细胞裂解液RIPA（含有1×浓度的蛋白酶抑制剂），重悬细胞沉淀。（5）使用超声波细胞破碎机，设置“30son，30soff”模式处理样品。（6）超声破碎后，将样品转移至4℃离心机进行14000g离心5min。（7）收集上清至新的离心管中，此上清液即为细胞总蛋白，暂存于-70℃。1.6.2BCA法测定蛋白含量使用BCA法蛋白含量测定试剂盒对样品中的蛋白含量进行测定。为了提高测定的准确性，样品和标准品均设置3个复孔。具体实验步骤参照试剂盒操作说明书进行（略）。使用酶标仪在562nm的波长下读取OD值，根据OD值和标准品蛋白的浓度建立标准曲线，根据标准方程计算样品中的蛋白含量。1.6.3免疫印迹实验（1）样品准备经过BCA法测定蛋白含量后，加入适当体积5×loadingbuffer，混匀并煮沸10min。稍做离心，按照各样品上样量为80μg蛋白的量计算上样体积。再使用1×loadingbuffer补充上样体积至相同体积（即上样量为80μg，上样体积为15μL）。（2）SDS-PAGE电泳○1将预制胶安装在电泳槽上，槽内加入适量MOPSrunningbuffer，检查内槽不向外槽渗漏。○2按照预定上样体积及顺序小心地加入样品及蛋白marker。○3按照说明书推荐的电泳条件进行，140V持续55min。（3）蛋白转移至PVDF膜○1SDS-PAGE电泳结束后，将预制胶塑料板撬开，小心取出其中的凝胶。○2测量凝胶的长和宽，剪取与胶大小相仿的厚滤纸和PVDF膜。将PVDF膜的浸泡在无水甲醇中预处理半分钟。○3制作转膜用的“三明治”结构：以海绵支撑物、厚滤纸、胶、PVDF膜、厚滤纸、海绵支撑物的顺序依次叠放，叠放过程中避免残留气泡。32 军事科学院硕士学位论文○4安装转膜装置（整个装置放入碎冰中），按PVDF膜在阳极，凝胶在阴极的方式连接电源，设置转膜条件为：恒流200mA持续2h。（4）封闭从装置中取出PVDF膜用TBST稍做冲洗，然后用封闭液室温孵育1h。（5）一抗孵育及洗膜去除封闭液，将PVDF膜放入抗体孵育袋中，加入足量的一抗，4℃孵育12h。孵育完成后，将PVDF膜放入TBST洗液中，放在摇床上轻轻摇晃5min，然后更换新的TBST洗液共进行3次。（6）二抗孵育及洗膜洗涤后，将PVDF膜置于抗体孵育袋中，加入足量的荧光标记的二抗，室温孵育1h。孵育完成后，将PVDF膜放入TBST洗液中，避光放在摇床上轻轻摇晃5min，然后更换新的TBST洗液共进行3次。（7）近红外激发显像洗涤完成后，将待分析的PVDF膜置于PBS溶液中。使用红外荧光扫描成像系统进行激发显像，保留实验数据图。1.7激光共聚焦显微镜观察荧光自噬小体1.7.1载玻片的预处理载玻片需要预先使用多聚赖氨酸预处理，有利于细胞粘附在载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察时有利于细胞维持静止不动的位置。具体处理步骤为：将干净的载玻片使用多聚赖氨酸的PBS溶液（浓度为0.01%g/mL）室温浸泡1h。然后，使用蒸馏水轻轻漂洗载玻片（轻摇）1h，每20min更换一次蒸馏水。取出载玻片室温晾干，并置于紫外线环境照射4h。1.7.2实验细胞的分组设计本实验分为四个组。第一组pcDNA3.1-HA-7.5kDa和pEGFP-hLC3B共转染72h后的细胞组；第二组pcDNA3.1-HA空载体和pEGFP-hLC3B共转染72h后的细胞组；第三组pEGFP-hLC3B转染66h后的细胞加入10μMRapamycin处理6h的细胞组；第四组pEGFP-hLC3B转染66h后等量DMSO处理6h的细胞组。1.7.3转染后第72h观察荧光自噬小体（1）样品细胞的准备样品为上述实验细胞分组中的待固定及染色处理的细胞。（2）洗涤细胞把四组转染后的细胞分别收集到15mL离心管中，1000rpm离心5min。去除上清液，33 军事科学院硕士学位论文加入1mLPBS重悬细胞，并转移至1.5mL离心管中。使用PBS洗涤细胞两遍（6000rpm离心30s）。（3）固定细胞用4%多聚甲醛轻轻重悬细胞，室温静置15min。使用PBS洗涤2遍（6000rpm离心30s）。（4）细胞核染色按照说明书要求的1:1000的体积比稀释DAPI染色液，并加入到各管细胞中轻轻混匀，室温静置5min。用PBS洗涤细胞两次（6000rpm离心30s）。再加入300μL的PBS重悬细胞。（5）使用多聚赖氨酸处理的载玻片制片并观察在载玻片上滴加10μL的细胞液，盖上超薄盖玻片（0.13-0.17mm）。借助激光共聚焦显微镜观察细胞中的荧光斑点（这些斑点实际为自噬小体的显影）。在观察细胞时，确保是随机选取的完好细胞进行观察，确保无论是否有细胞自噬水平的改变都有均等的机会被观察到。观察两个通道的显影信号，其中FITC通道用于观察荧光自噬小体，DAPI通道用于观察细胞核的完整状态。2结果2.1常规培养的UT7/Epo-S1细胞UT7/Epo-S1细胞属于悬浮生长细胞，依赖Epo才能正常增殖。因此，每天观察细胞状态，确保实验细胞增殖旺盛，状态良好。图13为普通光学显微镜下的常规培养细胞。图13常规培养的UT7/Epo-S1细胞2.2工具质粒pEGFP-hLC3B的构建与鉴定结果2.2.1人源LC3B基因的PCR扩增结果从HEK293T细胞中提取总RNA，通过反转录获得cDNA。以此cDNA为模板进行PCR扩增人源LC3B基因的开放阅读框。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像仪中观察扩增片段的长度。结果图14显示，PCR扩增产物的长度符合预期（预期34 军事科学院硕士学位论文398bp）。图14人源LC3B的PCR扩增产物M:DL1000DNAmarker;a-d:扩增样品;ntc:无模板阴性对照2.2.2菌落PCR鉴定结果将人源LC3B的PCR扩增产物和真核表达载体pEGFP-C1通过粘性末端进行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。经卡那霉素抗性筛选后，在培养板上挑选15个圆形单菌落，进行菌落PCR鉴定。PCR实验中设置有阳性对照和无模板阴性对照。结果图15显示，绝大部分单菌落为阳性克隆，有两个单菌落为阴性克隆。下一步，可以挑选一个阳性克隆进行扩大培养和抽提质粒。图15菌落PCR鉴定结果M:DL1000DNAmarker;a-o:挑选的单菌落;pos:阳性对照;ntc:无模板阴性对照2.2.3pEGFP-hLC3B酶切鉴定结果通过菌落PCR筛选出阳性克隆进行扩大培养和提取质粒后，使用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行酶切鉴定。结果图16显示，使用XhoⅠ酶切后的产物长度大小符合预期（5129bp），使用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的产物长度大小也符合预期（4731bp+398bp）。35 军事科学院硕士学位论文图16酶切鉴定结果M:DL1000marker;a:阳性质粒用EcoRⅠ单酶切;b:阳性质粒用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切2.2.4核苷酸序列测定结果经酶切鉴定正确的质粒样品交给中美泰和生物技术（北京）有限公司经双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定，序列测定结果显示其序列正确。2.2.5工具质粒pEGFP-hLC3B转染细胞后荧光显微镜下观察结果将构建的pEGFP-hLC3B质粒经去内毒素处理后，取3μg通过电穿孔物理转染方式转染UT7/Epo-S1细胞（细胞量为2×106cells）。结果图17显示，在转染后第24h，可以通过荧光显微镜观察到转染细胞发出了大量的绿色荧光。图17转染后24h镜下明场和荧光下的细胞图像2.2.6融合蛋白EGFP-hLC3B的免疫印迹鉴定结果在转染后第72h，收集细胞并提取细胞总蛋白。经BCA法测定其蛋白含量，取80μg蛋白样品进行免疫印迹实验，以鉴定细胞总蛋白中含有目的蛋白EGFP-hLC3B。结果图18显示，能够检测到目的蛋白EGFP-hLC3B的特异性条带，其分子量大小与DNASTAR软件计算的理论值相近，约44.3kDa。这表明构建的pEGFP-hLC3B工具质粒能够在UT7/Epo-S1细胞中表达出目的蛋白。36 军事科学院硕士学位论文图18免疫印迹鉴定结果2.3pcDNA3.1(+)-HA-7.5kDa和pcDNA3.1(+)-HA-X的构建与鉴定结果2.3.1非结构蛋白7.5kDa和X的编码序列的PCR扩增结果以B19V的感染性克隆pB19-M20为模板，进行PCR扩增非结构蛋白7.5kDa和X的编码序列，之后将PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳。从结果图19和20可以看出，扩增出的目的片段大小符合预期长度（非结构蛋白7.5kDa编码序列的长度244bp，非结构蛋白X编码序列的长度为265bp）。图19非结构蛋白7.5kDa编码序列的PCR扩增结果M:DL1000DNAmarker;a,b:扩增7.5kDa编码序列;ntc:无模板阴性对照图20非结构蛋白X编码序列的PCR扩增结果M:DL1000DNAmarker;a-e:扩增X编码序列;ntc:无模板阴性对照2.3.2菌落PCR鉴定结果37 军事科学院硕士学位论文将非结构蛋白7.5kDa和X编码区序列的扩增片段与真核表达载体pcDNA3.1(+)-HA通过粘性末端连接，其连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。经氨苄西林抗性筛选后，挑选LB培养板上单个圆形菌落，进行菌落PCR鉴定。结果图21为7.5kDa编码序列的菌落PCR鉴定结果，可看出所挑选的单菌落均为阳性克隆。结果图22为X编码序列的菌落PCR鉴定结果，可看出所挑选的单菌落均为阳性克隆。下一步，可以各挑选一个阳性菌落进行扩大培养和质粒抽提。图217.5kDa编码序列的菌落PCR鉴定结果M:DL5000DNAmarker;a-m:挑选的单菌落;ntc:无模板阴性对照图22X编码序列的菌落PCR鉴定结果M:DL1000DNAmarker;a-k:挑选的单菌落;ntc:无模板阴性对照2.3.3pcDNA3.1(+)-HA-7.5kDa/X酶切鉴定结果将菌落PCR鉴定为阳性的菌落克隆进行扩大培养。提取质粒后使用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ分别进行酶切鉴定。结果图23表明，使用EcoRⅠ单酶切后的产物长度大小符合预期（两者均为5.4kb），使用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后的产物长度大小也符合预期（分别为5.4kb+244bp和5.4kb+265bp）。38 军事科学院硕士学位论文图23酶切鉴定结果M1:DL5000marker;M2:DL1000marker;a,b:阳性质粒用EcoRⅠ单酶切;c,d:阳性质粒用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切2.3.4核苷酸序列测定结果经酶切鉴定正确的质粒样品交给中美泰和生物技术（北京）有限公司经双脱氧链终止法进行核苷酸序列测定，序列测定结果显示其序列正确。2.3.5融合蛋白HA-7.5kDa和HA-X的免疫印迹鉴定结果将构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HA-7.5kDa和pcDNA3.1(+)-HA-X分别通过电穿孔物理转染方式转染UT7/Epo-S1细胞。在转染72h后收集细胞总蛋白，经BCA法测定蛋白含量。取80μg蛋白样品进行免疫印迹实验，以鉴定细胞总蛋白中含有目的蛋白HA-7.5kDa和HA-X。结果图24显示，能够检测到目的蛋白（HA-7.5kDa和HA-X）的特异性条带（蛋白分子量大小分别约为21kDa和20kDa）。这表明构建的真核表达质粒能够在UT7/Epo-S1细胞中实现表达。图24免疫印迹检测蛋白HA-7.5kDa和HA-X2.4自噬体膜标记蛋白和内质网应激相关蛋白的免疫印迹检测2.4.1鉴定B19V的非结构蛋白7.5kDa和X在诱导细胞自噬中的作用将真核表达质粒pcDNA3.1-HA-7.5kDa和pcDNA3.1-HA-X分别转染UT7/Epo-S1细胞，细胞量为2×106cells，质粒量均为3μg。在转染后第72h提取细胞总蛋白，经BCA法测定蛋白含量后，取80μg蛋白样品进行免疫印迹实验，以检测其中的自噬体标记蛋白LC3B，并对比各实验组之间LC3-I向LC3-II的转化情况。该研究同时转染了pcDNA3.1-HA的空载体作为对照组，并使用转染试剂盒配套的39 军事科学院硕士学位论文pmax-GFP对照质粒，用于评估转染效率。另外，特别设置了细胞自噬的常用诱导剂Rapamycin（使用DMSO溶解，作用浓度为10μM）刺激UT7/Epo-S1细胞6h，作为诱导细胞自噬的阳性对照，以及等量的DMSO（实际非常微量）加入UT7/Epo-S1细胞6h，作为阴性对照。到达相应的时间节点时，采用同样的方法进行提取细胞总蛋白和免疫印迹实验。结果图25显示，pcDNA3.1-HA-7.5kDa和pcDNA3.1-HA-X的转染组分别能够检测到目的蛋白HA-7.5kDa和HA-X的特异性条带。各组蛋白中均能够检测到自噬体标记蛋白LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ，各组蛋白中的内参照β-actin蛋白条带均非常清晰，且条带密度差异较小。以LC3B-Ⅱ条带密度除以LC3B-Ⅰ条带密度，用这一比值来评估自噬水平的高低。结果图26显示，Rapamycin处理组（诱导细胞自噬的阳性对照）的比值明显比空载体转染组和DMSO组高，这表明Rapamycin的存在使细胞自噬水平得到了明显地提高。pcDNA3.1-HA-7.5kDa转染组与空载体转染组相比较，前者的比值明显比后者高，这表明HA-7.5kDa的存在使细胞自噬水平得到了明显地提高。而pcDNA3.1-HA-X转染组、空载体转染组和DMSO组相比较，这三组的LC3B-Ⅱ/Ⅰ值均相对偏低，且结果相近。综合图25和图26的研究结果，可以初步认为HA-7.5kDa可以增强细胞自噬水平，HA-X对细胞自噬水平没有增强作用。图25免疫印迹鉴定结果图26LC3B-Ⅱ/Ⅰ条带密度比值40 军事科学院硕士学位论文2.4.2鉴定B19V的非结构蛋白7.5kDa和X在诱导内质网应激中的作用将真核表达质粒pcDNA3.1-HA-7.5kDa和pcDNA3.1-HA-X分别转染UT7/Epo-S1细胞，细胞量为2×106cells，质粒量均为3μg。在转染后第72h提取细胞总蛋白，经BCA法测定蛋白含量后，取80μg蛋白样品进行免疫印迹实验，以检测其中内质网应激的标志蛋白Bip和CHOP。该研究同时转染了pcDNA3.1-HA的空载体作为对照组，使用转染试剂盒配套的pmax-GFP对照质粒，用于评估转染效率。另外，该研究特别设置了内质网应激诱导剂MG132（作用浓度为10μM）刺激UT7/Epo-S1细胞16h，作为内质网应激的阳性对照。在化学药物MG132刺激常规培养细胞16h后，采用同样的方法进行提取细胞总蛋白和免疫印迹实验。结果图27显示，分别在转染后的细胞中检测到了相应目的蛋白HA-7.5kDa和HA-X的特异性条带。在内质网应激阳性对照组中Bip蛋白的特异性条带密度明显大于其他三组（HA-X组、HA-7.5kDa组和空载体组）。在内质网应激阳性对照组中可以检测到CHOP蛋白的特异性条带，而在其他三组中均未能检测到相应蛋白的特异性条带。另外，各组的β-actin内参照的特异性条带均非常明显，且条带之间的密度差异很小。以上现象表明，融合蛋白HA-X和HA-7.5kDa均不能引起UT7/Epo-S1细胞产生明显的内质网应激的表现。图27免疫印迹鉴定结果2.5荧光自噬小体的观察本实验分为四组：第一组pcDNA3.1-HA-7.5kDa和pEGFP-hLC3B共转染72h后的细胞组；第二组pcDNA3.1-HA空载体和pEGFP-hLC3B共转染72h后的细胞组；第三组pEGFP-hLC3B转染66h后的细胞加入10μMRapamycin处理6h的细胞组；第四组pEGFP-hLC3B转染66h后等量DMSO处理6h的细胞组。到达相应的时间节点时，将细胞收集起来，并做固定、DAPI染色等处理，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞内的荧光自噬小体，并对比各组之间这些荧光斑点的数量差异。数量越多，表明细胞自噬水平越高。结果图28显示，各组细胞均能够观察到绿色荧光斑点（每一个斑点代表一个自噬小体），但是这些荧光斑点在各组之间的数量存在区别。图像背景中存在绿色荧光，但是这41 军事科学院硕士学位论文些绿色荧光是弥散状态的，属于胞质型LC3B，即LC3B-Ⅰ。发生细胞自噬时，胞质型LC3B会酶解掉一小段多肽变成自噬小体上模型LC3B，即LC3B-Ⅱ。结果图28中的空载体与pEGFP-hLC3B的共转染组、DMSO组也存在一些自噬小体，这些数量并不多的绿色荧光自噬小体提示UT7/Epo-S1细胞存在基础水平的自噬表现。Rapamycin刺激组和DMSO组对比，前者的荧光斑点明显多于后者，这表明Rapamycin能够明显地增强细胞自噬水平，这是细胞自噬阳性对照的情况。而pcDNA3.1-HA-7.5kDa、pEGFP-hLC3B共转染组与空载体、pEGFP-hLC3B共转染组相比，前者的荧光斑点明显多于后者，这表明融合蛋白HA-7.5kDa能够明显地增强细胞自噬水平。这一研究结果与“2.4.1”中的免疫印迹的实验结果相互支持。图28激光共聚焦显微镜观察各组荧光自噬小体3讨论目前，B19V蛋白的功能研究已经有了一定的发现。其中，VP1蛋白、VP2蛋白、NS1蛋白和11kDa蛋白的研究较多[38-44]，特别是病毒蛋白的细胞毒性和诱导细胞凋亡的功能、VP1u的磷脂酶A2活性和非结构蛋白的反式激活作用等，而非结构蛋白7.5kDa和X蛋白的研究却鲜见报道。本研究初步探索了非结构蛋白7.5kDa和X蛋白对宿主细胞产生的影响。通过构建B19V非结构蛋白7.5kDa或X的真核表达质粒，并转染UT7/Epo-S1细胞来观察7.5kDa蛋白或X蛋白对细胞产生的影响。3.1非结构蛋白7.5kDa和X对内质网应激和细胞自噬影响的初步探索研究结果显示，在转染后72h的UT7/Epo-S1细胞中确实表达了B19V的非结构蛋白7.5kDa或X，然而它们却不能诱导细胞产生内质网应激的表现。因此，我们认为B19V的42 军事科学院硕士学位论文非结构蛋白7.5kDa或X很可能并不定位在细胞的内质网，而是在其他亚细胞结构上。我们准备在下一步研究工作中，构建pEGFP-7.5kDa和pEGFP-X真核表达质粒，将它们分别转染UT7/Epo-S1细胞，从而对非结构蛋白7.5kDa或X的亚细胞定位进行研究。非结构蛋白7.5kDa或X的亚细胞定位的研究结果将有助于我们了解其是否确实未定位在内质网，从而可以帮助我们分析其未引起内质网应激表现的原因。研究结果还显示，蛋白7.5kDa可以显著提高UT7/Epo-S1细胞自噬水平，而蛋白X却没有这种诱导UT7/Epo-S1细胞自噬的效果。因此，我们认为B19V感染细胞后，非结构蛋白7.5kDa在诱导宿主细胞自噬的过程中发挥着重要的作用。我们将针对非结构蛋白7.5kDa能够诱导UT7/Epo-S1细胞自噬这一研究结果，继续探究其分子机制。鉴定7.5kDa蛋白是否与某些自噬相关蛋白产生直接或间接的相互作用，或间接作用于自噬相关基因的表达。3.2关于本研究中观察荧光自噬小体的研究方法通过激光共聚焦显微镜观察荧光自噬小体是人们常用的细胞自噬研究方法，通常可分为两种方式。第一，细胞免疫荧光实验检测细胞内源性LC3B蛋白。借助荧光标记的二抗，可以观察到细胞自噬时膜型LC3B聚集，镜下表现为荧光斑点。第二，外源基因瞬时转染细胞，在细胞中过表达GFP-LC3B，也可以观察到细胞自噬时荧光斑点现象。另外，也有学者建立表达GFP-LC3B的稳定转染细胞系，但这可能存在GFP-LC3B表达量低的情况，有时可能检测不到荧光信号。本研究中的观察方法是借助外源基因瞬时转染细胞，在细胞中表达重组的EGFP-LC3B进行的。我们在使用人工构建的工具质粒pEGFP-hLC3B瞬时转染UT7/Epo-S1细胞后，细胞中大量表达了EGFP-hLC3B融合蛋白。这些LC3B蛋白一方面和EGFP融合表达，另一方面属于外源基因转染细胞后的过表达方式，并且电穿孔转染对细胞刺激可能比较剧烈。这些外源因素或多或少地会影响细胞自噬的水平。过量表达的高水平LC3B使得我们在使用激光共聚焦显微镜观察时，发现存在少量的荧光自噬小体定位在细胞核内。因此，我们准备下一步研究细胞自噬时，考虑使用LC3B单克隆抗体检测细胞内源性的LC3B。因为细胞免疫荧光检测内源性的LC3B时，可以完全避免转染操作对细胞的剧烈刺激，且此时的LC3B完全属于细胞内自然表达的产物，而非人工构建表达的产物，这样的研究结果可能更接近事实。3.3关于鉴定非结构蛋白7.5kDa诱导细胞自噬的待完善处在非结构蛋白7.5kDa诱导UT7/Epo-S1细胞自噬的鉴定实验中，本研究仅选用了两种方法，分别是免疫印迹分析LC3B-Ⅱ转化情况和观察荧光自噬小体的聚集程度。实际上，在免疫印迹实验中可以对细胞中p62蛋白的降解情况进行分析。p62蛋白在自噬小体和溶酶体融合后，会被降解。下一步研究中，在免疫印迹实验中分别检测LC3B和p62两种自43 军事科学院硕士学位论文噬流中参与的蛋白，可能会使实验结果更有说服力。另外，本研究还将借助电镜来观察自噬小体的形态结构，以了解自噬小体中包裹的内容物是否含有受损的细胞器或其他亚细胞结构。对自噬小体中内容物的观察有利于我们更深入地了解B19V感染后的细胞损伤机制。4小结通过构建的B19V非结构蛋白7.5kDa和X的真核表达质粒转染UT7/Epo-S1细胞，使得细胞中表达了带有HA标签的B19V非结构蛋白7.5kDa或X。免疫印迹结果表明B19V非结构蛋白7.5kDa能够增强UT7/Epo-S1细胞的自噬水平，而非结构蛋白X没有这种效果。激光共聚焦显微镜观察结果也表明B19V非结构蛋白7.5kDa能够增强UT7/Epo-S1细胞的自噬水平。本研究结果表明B19V非结构蛋白7.5kDa和X均不能刺激UT7/Epo-S1细胞产生明显的内质网应激。这表明B19V诱导细胞自噬的过程中存在非结构7.5kDa蛋白的参与，而非结构蛋白X可能不参与其中。另外，鉴于细胞中内质网应激指示蛋白没有因为非结构蛋白7.5kDa或X的存在而发生表达水平的上调，这表明B19V诱导细胞自噬可能不是通过未折叠蛋白反应信号通路。44 军事科学院硕士学位论文结论本研究分为两部分，第一部分是对我国献血/献浆人群中B19V和PARV4进行了分子流行病学调查，并对其中存在的B19V进行了基因型鉴定。该研究对保障我国捐献的血液/血浆及血液制品的病毒安全性具有重要意义。而第二部分是B19V的非结构蛋白X和7.5kDa在诱导细胞自噬与内质网应激方面的初步探索，这对深入了解B19V对宿主细胞损害机制的相关研究具有参考和借鉴意义。本研究可得出如下结论：1.在3200例单人份献血者血浆中，B19V核酸阳性的样品有12份，总阳性率为0.38%；而PARV4核酸阳性的样品有4份，总阳性率为0.13%。B19V核酸阳性样品中有4份样品鉴定为1a亚型，有2份样品鉴定为1b亚型。2.在54份生产用混合原料血浆中，B19V核酸阳性的样品有5份，总阳性率为9.26%；而PARV4核酸阳性样品有11份，总阳性率为20.37%。B19V核酸阳性样品中有1份近基因组全长克隆，其基因型鉴定为1b亚型。3.B19V的非结构蛋白7.5kDa可显著提高细胞自噬水平，而非结构蛋白X没有这种作用。这表明非结构蛋白7.5kDa可能在B19V诱导细胞自噬的分子机制中发挥重要的作用。另外，B19V的非结构蛋白7.5kDa和X蛋白均不能使细胞产生内质网应激，不表现未折叠蛋白反应的表现。这表明7.5kDa蛋白诱导细胞自噬的途径可能不是通过未折叠蛋白反应的信号通路。45 军事科学院硕士学位论文参考文献[1]LapercheS,LefrereJJ,MorelP,PoucholE,PozzettoB.Bloodtransfusion:controlofinfectiousrisks[J].PresseMed,2015,44(2):189-99.[2]王卓,赵雄,吕茂民,章金刚.血液制品的现状与展望[J].生物工程学报,2011,27(05):730-46.[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典二〇一五版三部[S].[4]CossartYE,FieldAM,CantB,WiddowsD.Parvovirus-likeparticlesinhumansera[J].Lancet,1975,1(7898):72-3.[5]KingAMQ,AdamsMJ,CarstensEB,LefkowitzEJ(eds)(2011)Virustaxonomy,ninthreportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses[M].ElsevierAcademicPress,London.[6]TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses—MasterSpeciesList2013-version2.[7]ServeyJT,ReamyBV,HodgeJ.ClinicalpresentationsofparvovirusB19infection[J].AmFamPhysician,2007,75(3):373-6.[8]BrownKE.Theexpandingrangeofparvoviruseswhichinfecthumans[J].RevMedVirol,2010,20(4):231-44.[9]ZhouY,BianG,ZhouQ,GaoZ,LiaoP,LiuY,HeM.Detectionofcytomegalovirus,humanparvovirusB19,andherpessimplexvirus-1/2inwomenwithfirst-trimesterspontaneousabortions[J].JMedVirol,2015,87(10):1749-53.[10]BihariC,RastogiA,RangegowdaD,ChowdhuryA,SaxenaP,GargH,SarinSK.ParvovirusB19associatedacutehepatitisandhepatosplenomegaly[J].ClinResHepatolGastroenterol,2014,38(1):e9-10.[11]VigneswaranTV,BrownJR,BreuerJ,BurchM.ParvovirusB19myocarditisinchildren:anobservationalstudy[J].ArchDisChild,2016,101(2):177-80.[12]WatanabeT,KawashimaH.AcuteencephalitisandencephalopathyassociatedwithhumanparvovirusB19infectioninchildren[J].WorldJClinPediatr,2015,4(4):126-34.[13]SuzukiM,YotoY,IshikawaA,AsakuraH,TsutsumiH.AcutetransversemyelitisassociatedwithhumanparvovirusB19infection[J].JChildNeurol,2014,29(2):280-2.[14]KerrJR.TheroleofparvovirusB19inthepathogenesisofautoimmunityandautoimmunedisease[J].JClinPathol,2016,69(4):279–91.[15]ThammasriK,RauhamäkiS,WangL,FilippouA,KivovichV,MarjomäkiV,NaidesSJ,GilbertL.HumanparvovirusB19inducedapoptoticbodiescontainalteredself-antigensthat46 军事科学院硕士学位论文arephagocytosedbyantigenpresentingcells[J].PLoSOne,2013,8(6):e67179.[16]ServantA,LapercheS,LallemandF,etal.Geneticdiversitywithinhumanerythroviruses:identificationofthreegenotypes[J].JVirol,2002,76(18):9124-34.[17]ToanNL,DuechtingA,KremsnerPG,etal.PhylogeneticanalysisofhumanparvovirusB19,indicatingtwosubgroupsofgenotype1inVietnamesepatients[J].JGenVirol,2006,87(Pt10):2941-9.[18]ParsyanA,SzmaragdC,AllainJP,CandottiD.IdentificationandgeneticdiversityoftwohumanparvovirusB19genotype3subtypes[J].JGenVirol,2007,88(Pt2):428-31.[19]ChenZ,GuanW,ChengF,ChenAY,QiuJ.MolecularcharacterizationofhumanparvovirusB19genotypes2and3[J].Virology,2009,394(2):276-85.[20]贾俊婷,郭逸,赵雄,马玉媛,章金刚.人细小病毒B19三种基因型通用核酸检测体系的建立与评价[J].军事医学,2015,39(03):174-8.[21]贾俊婷,马玉媛,郭逸,赵雄,赵福广,章金刚.原料血浆和凝血因子类产品中人细小病毒B19污染情况调查[J].军事医学,2015,39(03):169-73.[22]马玉媛,贾俊婷,章金刚.血液及血液制品中人细小病毒B19的检测及其意义[J].临床输血与检验,2016,18(03):201-4.[23]SchmidtM,ThemannA,DrexlerC,BayerM,LanzerG,MenichettiE,LechnerS,WessinD,ProkophB,AllainJP,SeifriedE,HourfarMK.BlooddonorscreeningforparvovirusB19inGermanyandAustria[J].Transfusion,2007,47(10):1775-82.[24]HealthCounciloftheNetherlands.BloodProductsandParvovirusB19.HealthCounciloftheNetherlands:TheHague,2002.publicationno.2002/07E.[25]FDA.GuidanceforIndustry:NucleicAcidTesting(NAT)toReducethePossibleRiskofHumanParvovirusB19TransmissionbyPlasma-DerivedProducts.July2009.Availablefrom:http://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm071592.htm.[26]PPTAvoluntarystandardparvovirusB19.PlasmaProteinTherapeuticsAssociation.August2003.Availablefrom:http://www.pptaglobal.org/component/search/?searchword=B19&searchphrase=all&Itemid=101.[27]PPTA.QSEALNATTestingStandard(Version2.0).Annapolis(MD):PlasmaProteinTherapeuticsAssociation.June2013.Availablefrom:http://www.ppta.globalorg/images/qseal/NATTestingV2.pdf.47 军事科学院硕士学位论文[28]CouncilofEurope.EuropeanPharmacopoeia.6thed.Strasbourg:CouncilofEuropePublishing;2008.Humanplasma(pooledandtreatedforvirusinactivation).monograph1646.[29]JonesMS,KapoorA,LukashovVV,SimmondsP,HechtF,DelwartE.NewDNAvirusesidentifiedinpatientswithacuteviralinfectionsyndrome[J].JVirol,2005,79(13):8230-8236.[30]郭逸,马玉媛,段勇,叶世辉,章金刚.新型细小病毒PARV4的特性及其与人细小病毒B19的关系[J].中国输血杂志,2014,27(07):781-5.[31]MatthewsPC,SharpC,SimmondsP,KlenermanP.Humanparvovirus4'PARV4'remainselusivedespiteadecadeofstudy[J].F1000Res,2017,6:82.[32]JiaJ,ZhongY,GuoY,HuangfuC,ZhaoX,FangC,FanR,MaY,ZhangJ.SimultaneousdetectionanddifferentiationofhumanparvovirusB19andhumanparvovirus4byaninternallycontrolledmultiplexquantitativereal-timePCR[J].MolCellProbes,2017,10(36):50-57.[33]ServantA,LapercheS,LallemandF,MarinhoV,DeSaintMaurG,MeritetJF,Garbarg-ChenonA.Geneticdiversitywithinhumanerythroviruses:identificationofthreegenotypes[J].JVirol,2002,76(18):9124-34.[34]KlionskyDJ,AbdelmohsenK,AbeA,etal.Guidelinesfortheuseandinterpretationofassaysformonitoringautophagy(thirdedition)[J].Autophagy,2016,12,1–222.[35]NakashimaA,TanakaN,TamaiK,KyuumaM,IshikawaY,SatoH,YoshimoriT,SaitoS,SugamuraK.SurvivalofparvovirusB19-infectedcellsbycellularautophagy[J].Virology,2006,349:254-63.[36]FungTS,TorresJ,LiuDX.TheemergingrolesofviroporinsinERstressresponseandautophagyinductionduringvirusinfection[J].Viruses,2015,2834-57.[37]ZhangK,KaufmanRJ.Signalingtheunfoldedproteinresponsefromtheendoplasmicreticulum[J].JBiolChem,2004,279(25):25935-8.[38]ZhiN,MillsIP,LuJ,WongS,FiliponeC,BrownKE.MolecularandfunctionalanalysesofahumanparvovirusB19infectiousclonedemonstratesessentialrolesforNS1,VP1,andthe11-kilodaltonproteininvirusreplicationandinfectivity[J].JVirol,2006,80(12):5941-50.[39]HsuTC,ChiuCC,ChangSC,ChanHC,ShiYF,ChenTY,TzangBS.HumanparvovirusB19VP1uproteinasinflammatorymediatorsinducesliverinjuryinnaïvemice[J].Virulence,2016,7(2):110-8.48 军事科学院硕士学位论文[40]MoffattS,TanakaN,TadaK,NoseM,NakamuraM,MuraokaO,HiranoT,SugamuraK.Acytotoxicnonstructuralprotein,NS1,ofhumanparvovirusB19inducesactivationofinterleukin-6geneexpression[J].JVirol,1996,70(12):8485-91.[42]WuJ,ChenX,YeH,YaoM,LiS,ChenL.Nonstructuralprotein(NS1)ofhumanparvovirusB19stimulateshostinnateimmunityandbluntstheexogenoustypeIinterferonsignalinginvitro[J].VirusRes,2016,222:48-52.[43]ChenAY,ZhangEY,GuanW,ChengF,KleiboekerS,YankeeTM,QiuJ.Thesmall11kDanonstructuralproteinofhumanparvovirusB19playsakeyroleininducingapoptosisduringB19virusinfectionofprimaryerythroidprogenitorcells[J].Blood,2010,115(5):1070-80.[44]LuoY,QiuJ.HumanparvovirusB19:amechanisticoverviewofinfectionandDNAreplication[J].FutureVirol,2015,10(2):155-67.[45]MaplePA,BeardS,ParryRP,BrownKE.TestingUKblooddonorsforexposuretohumanparvovirus4usingatime-resolvedfluorescenceimmunoassaytoscreenseraandWesternblottoconfrmreactivesamples[J].Transfusion,2013,53(10pt2):2575–84.[46]ValleriniD,BarozziP,QuadrelliC,BoscoR,PotenzaL,RivaG,GregoriniG,SandriniS,TironiA,MontagnaniG,DePalmaM,TorelliG,DelwartE,LuppiM.Parvovirusesinblooddonorsandtransplantpatients,Italy[J].EmergInfectDis,2008,14(1):185–6.[47]SlavovSN,KashimaS,Rocha-JuniorMC,Silva-PintoAC,OliveiraLC,Eis-HübingerAM,CovasDT.Humanparvovirus4inBrazilianpatientswithhaemophilia,beta-thalassaemiamajorandvolunteerblooddonors[J].Haemophilia,2015,21(1):e86–8.[48]SimmonsR,SharpC,McClureCP,RohrbachJ,KovariH,FrangouE,SimmondsP,IrvingW,RauchA,BownessP,KlenermanP;SwissHIVCohortStudy.Parvovirus4infectionandclinicaoutcomeinhigh-riskpopulations[J].JInfectDis,2012,205(12):1816–20.[49]FryerJF,DelwartE,HechtFM,BernardinF,JonesMS,ShahN,BaylisSA.Frequentdetectionoftheparvoviruses,PARV4andPARV5,inplasmafromblooddonorsandsymptomaticindividuals[J].Transfusion,2007,47(6):1054–61.[50]AsiyabiS,NejatiA,ShojaZ,ShahmahmoodiS,JalilvandS,FarahmandM,GorzinAA,NajafiA,HajiMollahoseiniM,MarashiSM.Firstreportofhumanparvovirus4detectioninIran[J].JMedVirol,2016,88(8):1314–8.[51]SchneiderB,FryerJF,OldenburgJ,etal.FrequencyofcontaminationofcoagulationfactorconcentrateswithnovelhumanparvovirusPARV4[J].Haemophilia,2008,14(5):978-86.[52]MaYY,GuoY,ZhaoX,WangZ,LvMM,YanQP,ZhangJG.HumanparvovirusPARV4inplasmapoolsofChineseorigin[J].VoxSang,2012,103(3):183-5.49 军事科学院硕士学位论文[53]李昊文,刘丽,任远,郭安臣,王雅杰.GFP-LC3真核表达载体构建、定位及胶质瘤U87稳定转染细胞系筛选[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,7(21):9614-8.50 军事科学院硕士学位论文与学位论文密切相关的文献综述人细小病毒B19的蛋白功能［摘要］人细小病毒B19可以感染人类，并对人类致病，但其致病机制一直不甚清楚。B19V感染细胞后，通过某些机制对宿主细胞造成损伤或者引起宿主细胞死亡。在其损伤宿主细胞的过程中必然与B19V蛋白存在联系，因此深入研究B19V基因组编码蛋白的生物学功能将有助于研究其和宿主细胞之间的相互影响和探讨其致病机制，并为防治B19V相关疾病有着积极的推动作用。本文主要对近年来B19V蛋白的功能研究进行了综述。［关键词］人细小病毒B19；病毒蛋白；功能研究HumanparvovirusB19caninfecthumanbeingsandcausedisease,butthemechanismoftheinfectionhasbeenunclear.ThehostcellsareusuallydamagedafterbeinginfectedwithB19V.Intheprocessofdamagingthehostcells,B19Vproteinsmusthavebeenplayingacomplicatedrole.Therefore,furtherstudyonthebiologicalfunctionofB19VgenomeencodedproteinwillbehelpfultostudytheinteractionbetweenB19VandhostcellsandthepathogenesisofB19Vgenomecodingprotein.InordertopreventandcureB19Vrelateddiseases,thestudiesonthefunctionofB19Vproteinsinrecentyearsarereviewedinthispaper.Keywords:HumanparvovirusB19;viralprotein;studyonfunction1975年，人细小病毒B19（HumanparvovirusB19，B19V）首次发现于英国南伦敦输血中心病毒参考实验室[1]。目前，我们已经明确B19V可对人类致病，但其致病机制尚不清楚。为更好地管控其传播和防治B19V相关疾病，研究人员对其结构特点和蛋白功能进行了探索。本文主要综述了B19V蛋白功能的研究发现及其致病机制的研究进展，并提出可能的研究方向，为更有的放矢地研究B19V提供指引作用。1.基本特点及致病性B19V的结构简单，是无囊膜结构的单链DNA病毒。它是由两个衣壳蛋白包裹一条DNA单链而形成的正二十面体结构，直径仅20.5-25.0nm。图1透射镜下的B19V[2]（scalebar:100nm）51 军事科学院硕士学位论文在分类学上，B19V属于细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒亚科（Parvovirinae）、红病毒属（Erythrovirus），且是红病毒属的代表种[3]。2014年，国际病毒分类学委员会（theInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）提议将其种名改为灵长目红系细小病毒1（Primateerythroparvovirus1）[4],属于红系细小病毒属（Erythroparvovirus）。B19V的基因组结构及编码蛋白与其他细小病毒相似。基因组是一条单链DNA，全长约5.6kb，有一个P6启动子位于基因图第6单位和两个多聚腺苷酸信号[3]，两端有相同的383nt末端倒置重复序列（Invertedterminalrepeats，ITRs），前365nt可以形成回文结构，而此回文结构被认为是DNA复制过程的引物。基因组包含两个大的开放阅读框（Openreadingframe，ORF），左侧的ORF编码非结构蛋白NS1，右侧的ORF编码衣壳蛋白VP1和VP2。B19V的基因组还编码三个小的非结构蛋白11kDa蛋白、X蛋白和7.5kDa蛋白（图1）。图1B19V基因组结构与编码蛋白[5]［6］B19V有着明确的致病性。最常见的是儿童传染性红斑（也称为“第五病”），健康成人感染多表现为轻型自限性疾病。特殊人群感染B19V之后，则易出现严重后果：免疫功能缺陷人群感染可以引起慢性贫血；存在血液性疾病的病人感染可以引起暂时性再障危象等[7]；孕妇感染可能引起胎儿水肿、流产和死胎等[8]。此外，B19V感染与肝炎、心肌炎、脑炎、急性横惯性脊髓炎等[9-12]以及多种自身免疫性疾病也存在相关性[13,14]。2.B19V结构蛋白VP1结构蛋白VP1是B19V中分子量最大的病毒蛋白，约为86kDa，但其仅占衣壳蛋白成分的5%[15]。VP1包含一段长226个氨基酸的特殊序列，是VP1在N端比VP2多出来的序列，被称为VP1独特区域（VP1-uniqueregion，VP1u）。VP1u主要位于病毒衣壳表面，不仅包含病毒中和表位[16,17]。B19V能够成功地感染其敏感细胞的前提是其结构蛋白和宿主细胞表面的受体红细胞糖苷脂结合[18-20]。已有报道实验室内纯化出的重组VP1u可以与B19V颗粒竞争进入细胞，且VP1u吸附的细胞和B19V感染的细胞类型相同[21]。这一研究发现表明在B19V感染细胞过程中，VP1u和宿主细胞表面受体之间的相互作用可能决定易感细胞的类型。52 军事科学院硕士学位论文VP1蛋白的磷脂酶A2基序同源区也位于VP1u。磷脂酶A2活性将产生溶血磷脂胆碱。溶血磷脂胆碱为病毒有效感染所必需，关键位点的氨基酸突变将有可能降低甚至失去磷脂[22，23]酶A2活性和病毒感染性。另外，它也是B19V的感染性克隆具有感染性的必要条件[24]。重组VP1u可诱导小鼠心肌和肝脏发生炎症反应[25-27]。通过给小鼠皮下注射能过表达VP1u蛋白的COS细胞，会观察到VP1u表达升高的同时，IL-6、IFN-γ和磷酸化的STAT1等多种炎症因子的表达水平也显著增高。MusaabAhmed等对VP1在B19V相关心肌疾病中的病理生理学功能进行了系列研究，发现VP1蛋白对细胞钙离子内流、钠钾ATP酶活性、钾离子通道Kv1.3和Kv1.5及内向整流钾离子通道Kir2.1的调控作用均依赖磷脂酶A2的活性。第一，VP1蛋白可下调内向整流钾通道Kir2.1，通过磷脂酶A2依赖性的溶血磷脂胆碱抑制Kir2.1通道，进而抑制钠钾ATP酶的活性[28]。当钠钾ATP酶活性受到抑制的时候，细胞膜内外的离子浓度不能维持正常，细胞将因为肿胀而死亡[29]。第二，VP1蛋白可下调宿主细胞钾离子通道蛋白Kv1.3和Kv1.5的表达，钾离子通道的下调将引起宿主细胞肿胀死亡，这可能是引起心肌内皮细胞功能不全的原因之一。另外，有些细胞类型的增殖需要钾离子通道Kv1.3蛋白发挥功能[30]。第三，VP1蛋白可上调上皮细胞钠离子通道ENaC的表达。ENaC表达上调也能引起的内皮细胞膨胀和硬化[31]。3.B19V结构蛋白VP2结构蛋白VP2是组成B19V衣壳的主要蛋白成分，约占衣壳成分的95%[15]。借助原核表达系统大肠杆菌，人们可以在实验室制备出大量的VP2蛋白，且能在体外自我组装成病毒样颗粒（Virus-likeparticles，VLPs）[32,33]，且具有很好的热稳定性：37°C时稳定存在，且绝大部分的颗粒在80°C处理30min后依然不会被灭活。但是，pH值的变化可以影响VP2蛋白的自我组装过程。VP2蛋白的这三个特点使其具有一定的应用价值。比如，已经有研究者使用VP2自我组装成的病毒样颗粒作为保护性抗原载体来运载炭疽杆菌的抗原决定簇[34]，VP2蛋白在此方面的应用将极大地促进亚单位疫苗的研究与发展。4.B19V主要非结构蛋白NS1NS1蛋白是最主要的非结构蛋白，结构保守，包含多个功能结构域：N端含有核酸内切酶结构域；中间包含NTP-结合结构域和解螺旋酶基序；C端参与启动子的反式激活过程。NS1蛋白仅在宿主细胞核内表达[15]，主要是通过与核内的DNA相互作用来发挥功能，包括参与B19V基因组复制、转录、翻译形成衣壳蛋白和包装等病毒复制周期的系列活动。在B19V的复制周期中，NS1蛋白特异地结合病毒DNA复制起始点，发挥其解螺旋酶和核酸内切酶活性参与复制过程[35]。人们普遍认可的B19V复制方式是滚动发卡模型：单链53 军事科学院硕士学位论文DNA首先以发卡结构为引物形成双链结构，5’端和3’端在宿主细胞内的连接酶作用下发生连接，此时DNA形成双链结构。NS1蛋白特异性地切割末端复制位点（Terminalreplicationsite，TRS），从而使合成链继续向前延伸，并形成ITR结构（图2）[36]。双链形式的DNA转录出mRNA，用于表达病毒的各种蛋白。图2B19V基因组复制的滚动发卡模型NS1蛋白可以反式激活P6启动子，而P6启动子控制B19V所有蛋白的表达[37]。另外，NS1蛋白的反式激活功能也会对其他病毒的复制周期产生影响，比如：持续感染B19V的艾滋病患者，其体内的HIV-Ⅰ和B19V可能同时感染同一个靶细胞。此时，B19V的NS1蛋白对HIV-Ⅰ病毒蛋白的表达会产生影响，可以反式激活HIV-Ⅰ的Tat蛋白[38]。NS1蛋白对细胞内的多种转录因子有激活作用，通过反式激活细胞内的转录激活子，影响宿主细胞基因的表达，从而引起TNF-α和IL-6的表达增加导致炎症反应[39-41]。NS1蛋白也可激活宿主细胞的防御素、IFN-I和Toll样受体，从而激活宿主先天免疫应答[42,43]。NS1蛋白有细胞毒性。NS1蛋白包含一个高度保守的NTP-结合基序，这是NS1蛋白发挥细胞毒性的结构基础。NS1蛋白转染非允许细胞后，在没有病毒复制和病毒颗粒积累的情况下，也存在细胞毒性[44,45]。B19V的各蛋白中，NS1是最早被发现可诱导细胞凋亡的蛋白。NS1蛋白可能通过死亡受体(TNF受体1)介导的外源性细胞凋亡途径诱导凋亡，有研究表明NS1蛋白通过显著刺激细胞周期蛋白依赖性激酶p21/WAF1蛋白的表达，诱导UT7/Epo-S1细胞和293T细胞在G1期停滞，从而产生细胞凋亡效应[46]。有研究证明，NS1蛋白可以通过激活ATR-CDC25C-CDK1通路诱导UT7/Epo-S1细胞在G2期停滞，导致细胞凋亡[47]。NS1蛋54 军事科学院硕士学位论文白也可以诱导COS-7细胞中线粒体相关的前凋亡蛋白Bax和Bad的表达，且能够检测到Caspase3和Caspase9活化，而Caspase8和死亡受体Fas没有活化。这提示在COS-7细胞中，NS1蛋白可能通过线粒体起始的内源性途径诱导细胞凋亡[48]。5.B19V小的非结构蛋白11kDa蛋白主要存在于细胞质中，仅少量表达在细胞核内[49]，含有94个氨基酸，脯氨酸的比例高达15%。脯氨酸富集区可分为3个区域，且与SH3结构域的配体序列相似[50]。其脯氨酸富集区可以和Grb2（Growthfactorreceptor-bindingprotein2，生长因子受体结合蛋白2）或者其他含有SH3结构域的蛋白相互作用。因此，B19V相关疾病的致病机理涉及到11kDa蛋白与宿主细胞内某些信号分子的竞争性结合，如11kDa蛋白和鸟嘌呤核苷酸交换因子Sos竞争Grb2的结合位点，从而改变胞内正常信号通路引起疾病。另外，11kDa蛋白能够上调Hela细胞内的NF-κB的转录活性，从而激活炎症因子IL-6的表达[51]。在不同的细胞中，11kDa蛋白对B19V其他蛋白有不同的影响。在COS-7细胞中阻断11kDa蛋白表达，将不会影响B19V其他蛋白的表达；而在UT7/Epo-S1细胞中阻断11kDa蛋白表达，将引起B19V衣壳蛋白表达量显著减少，但不影响衣壳蛋白mRNA的水平，这表明UT7/Epo-S1细胞中表达的11kDa对B19V衣壳蛋白的翻译过程有重要的调控作用[20]。AaronYunChen等[52]研究了B19V诱导的红系祖细胞凋亡效应。他们发现病毒感染细胞期间，11kDa的表达量至少是NS1蛋白的100倍。通过RNAi技术抑制11kDa蛋白的表达，可以发现细胞凋亡水平将会明显减弱。这些研究结果表明B19V引起红系祖细胞死亡的主要效应蛋白为11kDa蛋白，NS1蛋白也能够诱导红系祖细胞凋亡，而7.5kDa蛋白没有这种功能。先前人们认为B19V基因组的转录和翻译过程是靠NS1蛋白激活P6启动子完成的。近期，在Hela细胞中发现X蛋白也显著地上调P6启动子活性，但11kDa蛋白和7.5kDa蛋白对基因组中的P6启动子没有这种激活作用[53]。目前，7.5kDa蛋白的功能有待探索。6.问题与展望B19V的致病机制一直不甚清楚，深入研究B19V基因组编码蛋白的生物学功能将有助于研究其和宿主细胞之间的相互影响和探讨其致病机制，并为防治B19V相关疾病有着积极的推动作用。目前，B19V的蛋白功能研究已经有了一定的发现。其中，VP1蛋白、VP2蛋白、NS1蛋白和11kDa蛋白的研究较多，特别是病毒蛋白的细胞毒性和诱导细胞凋亡的功能、VP1u的磷脂酶A2活性和非结构蛋白的反式激活作用等。ZhiNing[20]等还提出了B19V产生病毒样颗粒的必要条件，这包括VP1蛋白、NS1蛋白、11kDa蛋白和完整的ITR序列。而X蛋白和7.5kDa的功能研究鲜见报道。55 军事科学院硕士学位论文从现有的研究发现来看，人们对B19V的了解是远远不够的。我们还需要继续深入研究其引起的细胞水平、亚细胞水平和分子水平的效应以逐渐阐明其和宿主细胞之间的相互作用方式、影响过程和结局。而细胞自噬是一个值得关注的生物现象，当病原体入侵细胞时发生的异自噬（Xenophagy）有可能清除入侵细胞的病原体，从而发挥重要的防御功能。现已证实B19V感染可以引起其敏感细胞系UT7/Epo-S1发生自噬，且此时适当水平的细胞自噬有利于被感染细胞的存活[54]。本实验室构建了B19V基因组编码蛋白的真核表达质粒，为鉴定参与诱导细胞自噬的B19V蛋白奠定了研究基础[55]，从而可帮助探究参与诱导细胞自噬的病毒蛋白是否与胞内的某些蛋白受体相互作用或者显著激活胞内某些重要的信号通路。这些问题的提出将为B19V感染细胞相关的研究提供崭新的思考方向，这些问题的阐明将有利于我们深入了解B19V和宿主细胞之间的相互影响过程及结局。参考文献[1]CossartYE,FieldAM,CantB,WiddowsD.Parvovirus-likeparticlesinhumansera[J].Lancet,1975,1(7898):72-3.[2]HeegaardEDandBrownKE.HumanparvovirusB19.ClinicalMicrobiologyReviews[J].2002,15(3):485–505.[3]KingAMQ,AdamsMJ,CarstensEB,LefkowitzEJ(eds)(2011)Virustaxonomy,ninthreportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses[M].ElsevierAcademicPress,London.[4]TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses—MasterSpeciesList2013-version2.[5]Adamson-SmallLA,IgnatovichIV,LaemmerhirtMG,HobbsJA.PersistentparvovirusB19infectioninnon-erythroidtissues:possibleroleintheinflammatoryanddiseaseprocess[J].VirusRes,2014,190:8-16.[6]ServeyJT,ReamyBV,HodgeJ.ClinicalpresentationsofparvovirusB19infection[J].AmFamPhysician,2007,75(3):373-6.[7]BrownKE.Theexpandingrangeofparvoviruseswhichinfecthumans[J].RevMedVirol,2010,20(4):231-44.[8]ZhouY,BianG,ZhouQ,GaoZ,LiaoP,LiuY,HeM.Detectionofcytomegalovirus,humanparvovirusB19,andherpessimplexvirus-1/2inwomenwithfirst-trimesterspontaneousabortions[J].JMedVirol,2015,87(10):1749-53.[9]BihariC,RastogiA,RangegowdaD,ChowdhuryA,SaxenaP,GargH,SarinSK.ParvovirusB19associatedacutehepatitisandhepatosplenomegaly[J].ClinResHepatolGastroenterol,2014,38(1):e9-10.56 军事科学院硕士学位论文[10]VigneswaranTV,BrownJR,BreuerJ,BurchM.ParvovirusB19myocarditisinchildren:anobservationalstudy[J].ArchDisChild,2016,101(2):177-80.[11]WatanabeT,KawashimaH.AcuteencephalitisandencephalopathyassociatedwithhumanparvovirusB19infectioninchildren[J].WorldJClinPediatr,2015,4(4):126-34.[12]SuzukiM,YotoY,IshikawaA,AsakuraH,TsutsumiH.AcutetransversemyelitisassociatedwithhumanparvovirusB19infection[J].JChildNeurol,2014,29(2):280-2.[13]KerrJR.TheroleofparvovirusB19inthepathogenesisofautoimmunityandautoimmunedisease[J].JClinPathol,2016,69(4):279–91.[14]ThammasriK,RauhamäkiS,WangL,FilippouA,KivovichV,MarjomäkiV,NaidesSJ,GilbertL.HumanparvovirusB19inducedapoptoticbodiescontainalteredself-antigensthatarephagocytosedbyantigenpresentingcells[J].PLoSOne,2013,8(6):e67179.[15]OzawaK,YoungN.CharacterizationofcapsidandnoncapsidproteinsofB19parvoviruspropagatedinhumanerythroidbonemarrowcellcultures[J].JVirol,1987,61(8):2627–30.[16]RosenfeldSJ,YoshimotoK,KajigayaS,AndersonS,YoungNS,FieldA,WarrenerP,BansalG,CollettMS.UniqueregionoftheminorcapsidproteinofhumanparvovirusB19isexposedonthevirionsurface[J].JClinInvest,1992,89(6):2023-9.[17]KawaseM,MomoedaM,YoungNS,KajigayaS.MostoftheVP1uniqueregionofB19parvovirusisonthecapsidsurface[J].Virology,1995,211(2):359-66.[18]LeisiR,DiTommasoC,KempfC,RosC.TheReceptor-BindingDomainintheVP1uRegionofParvovirusB19[J].Viruses,2016,8(3):61.[19]BrownKE,AndersonSM,YoungNS.ErythrocytePantigen:cellularreceptorforB19parvovirus[J].Science,1993,262(5130):114-7.[20]ZhiN,MillsIP,LuJ,WongS,FiliponeC,BrownKE.MolecularandfunctionalanalysesofahumanparvovirusB19infectiousclonedemonstratesessentialrolesforNS1,VP1,andthe11-kilodaltonproteininvirusreplicationandinfectivity[J].JVirol,2006,80(12):5941-50.[21]LeisiR,RuprechtN,KempfC,RosC.ParvovirusB19uptakeisahighlyselectiveprocesscontrolledbyVP1u,anoveldeterminantofviraltropism[J].JVirol,2013,87(24):13161-7.[22]ZádoriZ,SzeleiJ,LacosteMC,LiY,GariépyS,RaymondP,AllaireM,NabiIR,TijssenP.AviralphospholipaseA2isrequiredforparvovirusinfectivity[J].DevCell,2001,1(2):291-302.[23]DorschS,LiebischG,KaufmannB,vonLandenbergP,HoffmannJH,DrobnikW,ModrowS.TheVP1uniqueregionofparvovirusB19anditsconstituentphospholipase57 军事科学院硕士学位论文A2-likeactivity[J].JVirol,2002,76(4):2014-8.[24]FilipponeC,ZhiN,WongS,LuJ,KajigayaS,GallinellaG,KakkolaL,Söderlund-VenermoM,YoungNS,BrownKE.VP1uphospholipaseactivityiscriticalforinfectivityoffull-lengthparvovirusB19genomicclones[J].Virology,2008,374(2):444-52.[25]NieX,ZhangG,XuD,SunX,LiZ,LiX,ZhangX,HeF,LiY.TheVP1-uniqueregionofparvovirusB19inducesmyocardialinjuryinmice[J].ScandJInfectDis,2010,42(2):121-8.[26]BogomolovasJ,ŠimoliūnasE,RinkūnaitėI,SmalinskaitėL,PodkopajevA,BironaitėD,WeisCA,MarxA,BukelskienėV,GretzN,GrabauskienėV,LabeitD,LabeitS.AnovelmurinemodelofparvovirusassociateddilatedcardiomyopathyinducedbyimmunizationwithVP1-uniqueregionofparvovirusB19[J].BiomedResInt,2016,2016:1627184.[27]HsuTC,ChiuCC,ChangSC,ChanHC,ShiYF,ChenTY,TzangBS.HumanparvovirusB19VP1uproteinasinflammatorymediatorsinducesliverinjuryinnaïvemice[J].Virulence,2016,7(2):110-8.[28]AhmedM,ElviraB,AlmilajiA,BockCT,KandolfR,LangF.Down-regulationofinwardlyrectifyingKir2.1K+channelsbyhumanparvovirusB19capsidproteinVP1[J].JMembrBiol,2015,248(2):223-9.[29]AlmilajiA,SzteynK,FeinE,PakladokT,MunozC,ElviraB,TowhidST,AlesutanI,ShumilinaE,BockCT,KandolfR,LangF.Down-regulationofNa/K+ATPaseactivitybyhumanparvovirusB19capsidproteinVP1[J].CellPhysiolBiochem,2013,31(4-5):638-48.[30]AhmedM,AlmilajiA,MunozC,ElviraB,ShumilinaE,BockCT,KandolfR,LangF.Down-regulationofK+channelsbyhumanparvovirusB19capsidproteinVP1[J].BiochemBiophysResCommun,2014,450(4):1396-401.[31]AhmedM,HonischS,PelzlL,FezaiM,HosseinzadehZ,BockCT,KandolfR,LangF.Up-regulationofepithelialNa+channelENaCbyhumanparvovirusB19capsidproteinVP1[J].BiochemBiophysResCommun,2015,468(1-2):179-84.[32]KajigayaS,FujiiH,FieldA,AndersonS,RosenfeldS,AndersonLJ,ShimadaT,YoungNS.Self-assembledB19parvoviruscapsids,producedinabaculovirussystem,areantigenicallyandimmunogenicallysimilartonativevirions[J].ProcNatlAcadSciUSA,1991,88(11):4646-50.[33]Sánchez-RodríguezSP,Münch-AnguianoL,EcheverríaO,Vázquez-NinG,Mora-PaleM,58 军事科学院硕士学位论文DordickJS,Bustos-JaimesI.HumanparvovirusB19virus-likeparticles:invitroassemblyandstability[J].Biochimie,2012,94(3):870-8.[34]OgasawaraY,AmexisG,YamaguchiH,KajigayaS,LepplaSH,YoungNS.Recombinantviral-likeparticlesofparvovirusB19asantigencarriersofanthraxprotectiveantigen[J].InVivo,2006,20(3):319-24.[35]TewarySK,ZhaoH,DengX,QiuJ,TangL.ThehumanparvovirusB19non-structuralprotein1N-terminaldomainspecificallybindstotheoriginofreplicationintheviralDNA[J].Virology,2014,449:297-303.[36]LuoY,QiuJ.HumanparvovirusB19:amechanisticoverviewofinfectionandDNAreplication.FutureVirol,2015,10(2):155-67.[37]DoerigC,HirtB,AntoniettiJP,BeardP.NonstructuralproteinofparvovirusesB19andminutevirusofmicecontrolstranscription[J].JVirol,1990,64(1):387-96.[38]SolN,MorinetF,AlizonM,HazanU.Trans-activationofthelongterminalrepeatofhumanimmunodeficiencyvirustype1bytheparvovirusB19NS1geneproduct[J].JGenVirol,1993,74(9):2011-4.[39]RaabU,BeckenlehnerK,LowinT,NillerHH,DoyleS,ModrowS.NS1proteinofparvovirusB19interactsdirectlywithDNAsequencesofthep6promoterandwiththecellulartranscriptionfactorsSp1/Sp3[J].Virology,2002,293(1):86-93.[40]MoffattS,TanakaN,TadaK,NoseM,NakamuraM,MuraokaO,HiranoT,SugamuraK.Acytotoxicnonstructuralprotein,NS1,ofhumanparvovirusB19inducesactivationofinterleukin-6geneexpression[J].JVirol,1996,70(12):8485-91.[41]FuY,IshiiKK,MunakataY,SaitohT,KakuM,SasakiT.RegulationoftumornecrosisfactoralphapromoterbyhumanparvovirusB19NS1throughactivationofAP-1andAP-2[J].JVirol,2002,76(11):5395-403.[42]HsuGJ,TzangBS,TsaiCC,ChiuCC,HuangCY,HsuTC.EffectsofhumanparvovirusB19onexpressionofdefensinsandToll-likereceptors[J].ChinJPhysiol,2011,54(5):367-76.[43]WuJ,ChenX,YeH,YaoM,LiS,ChenL.Nonstructuralprotein(NS1)ofhumanparvovirusB19stimulateshostinnateimmunityandbluntstheexogenoustypeIinterferonsignalinginvitro[J].VirusRes,2016,222:48-52.[44]OzawaK,AyubJ,KajigayaS,ShimadaT,YoungN.ThegeneencodingthenonstructuralproteinofB19(human)parvovirusmaybelethalintransfectedcells[J].JVirol,1988,62(8):2884-9.59 军事科学院硕士学位论文[45]MomoedaM,WongS,KawaseM,YoungNS,KajigayaS.Aputativenucleosidetriphosphate-bindingdomaininthenonstructuralproteinofB19parvovirusisrequiredforcytotoxicity[J].JVirol,1994,68(12):8443-6.[46]NakashimaA,MoritaE,SaitoS,SugamuraK.HumanparvovirusB19nonstructuralproteintransactivatesthep21/WAF1throughSp1[J].Virology,2004,329(2):493-504.[47]XuP,ZhouZ,XiongM,ZouW,DengX,GanaieSS,KleiboekerS,PengJ,LiuK,WangS,YeSQ,QiuJ.ParvovirusB19NS1proteininducescellcyclearrestatG2-phasebyactivatingtheATR-CDC25C-CDK1pathway[J].PLoSPathog,2017,13(3):e1006266.[48]HsuTC,WuWJ,ChenMC,TsayGJ.HumanparvovirusB19non-structuralprotein(NS1)inducesapoptosisthroughmitochondriacelldeathpathwayinCOS-7cells[J].ScandJInfectDis,2004,36(8):570-7.[49]StAmandJ,AstellCR.Identificationandcharacterizationofafamilyof11kDaproteinsencodedbythehumanparvovirusB19[J].Virology,1993,192(1):121-31.[50]FanMM,TamburicL,Shippam-BrettC,ZagrodneyDB,AstellCR.Thesmall11kDaproteinfromB19parvovirusbindsgrowthfactorreceptor-bindingprotein2invitroinaSrchomology3domain/ligand-dependentmanner[J].Virology,2001,291(2):285-91.[51]董衍明,黄玉,彭建新,李毅.B19病毒11kDa蛋白对Hela细胞内NF-κB信号通路的影响[J].生物工程学报,2013,29(07):965-73.[52]ChenAY,ZhangEY,GuanW,ChengF,KleiboekerS,YankeeTM,QiuJ.Thesmall11kDanonstructuralproteinofhumanparvovirusB19playsakeyroleininducingapoptosisduringB19virusinfectionofprimaryerythroidprogenitorcells[J].Blood,2010,115(5):1070-80.[53]DongY,HuangY,WangY,XuP,YangY,LiuK,TijssenP,PengJ,LiY.Theeffectsofthe11kDaproteinandtheputativeXproteinonthep6promoteractivityofparvovirusB19inHelacells[J].VirusGenes,2013,46(1):167-9.[54]NakashimaA,TanakaN,TamaiK,KyuumaM,IshikawaY,SatoH,YoshimoriT,SaitoS,SugamuraK.SurvivalofparvovirusB19infectedcellsbycellularautophagy[J].Virology,2006,349(2):254-63.[55]钟亚迪,贾俊婷,范瑞,马丽敏,马玉媛,章金刚.人细小病毒B19基因组编码蛋白真核表达质粒的构建与鉴定[J].生物技术通讯,2017,28(05):618-622.60 军事科学院硕士学位论文在学期间取得的学术性成果（全文）61 军事科学院硕士学位论文62 军事科学院硕士学位论文63 军事科学院硕士学位论文64 军事科学院硕士学位论文65 军事科学院硕士学位论文66 军事科学院硕士学位论文67 军事科学院硕士学位论文68 军事科学院硕士学位论文69 军事科学院硕士学位论文70 军事科学院硕士学位论文71 军事科学院硕士学位论文72 军事科学院硕士学位论文73 军事科学院硕士学位论文个人简历姓名：钟亚迪性别：男民族：汉族出生年月：1992年9月出生地：河南省鹿邑县主要学习经历：2010年9月—2015年7月，河南科技大学临床医学专业获学士学位2015年9月—2018年7月，军事科学院免疫学专业获硕士学位硕士期间发表的论文：1.人细小病毒B19基因组编码蛋白真核表达质粒的构建与鉴定[J].钟亚迪#,贾俊婷#,范瑞,马丽敏,马玉媛*,章金刚*.生物技术通讯,2017,28(05):618-622.2.SimultaneousdetectionanddifferentiationofhumanparvovirusB19andhumanparvovirus4byaninternallycontrolledmultiplexquantitativereal-timePCR[J].JiaJ#,ZhongY#,GuoY,HuangfuC,ZhaoX,FangC,FanR,MaY*,ZhangJ*.MolCellProbes,2017,10,36:50-57.3.ExistenceofvarioushumanparvovirusB19genotypesinChineseplasmapools:genotype1,genotype3,putativeintergenotypicrecombinantvariantsandnewgenotypes[J].JiaJ,MaY,ZhaoX,HuangfuC,ZhongY,FangC,FanR,LvM,ZhangJ.VirolJ,2016,13(1):155.4.五指山小型猪不同器官内猪内源性反转录病毒的存在与表达[J].范瑞,贾俊婷,钟亚迪,马丽敏,冯书堂,马玉媛,章金刚.生物技术通讯,2018,29(01):50-54.硕士期间参与申请的专利：猴B病毒实时荧光定量PCR方法及其通用引物、MGB探针与试剂盒.马玉媛,章金刚,贾俊婷,马丽敏,赵雄,王延琳,范瑞,钟亚迪.申请号：CN201711089450.2（公开状态）。硕士期间获得的奖励：2015年08月24日，被军事医学科学院研究生部评为“军训优秀学员”；2015年12月16日，被军事医学科学院研究生部评为“优秀学员”；2016年12月21日，由军事医学科学院野战输血研究所给予嘉奖一次；2017年12月18日，由军事医学研究院卫生勤务与血液研究所给予嘉奖一次。74 军事科学院硕士学位论文致谢本研究是在导师章金刚研究员和指导老师马玉媛副研究员的悉心指导和严格要求下完成的，在此谨向章老师和马老师表示最衷心的感谢和最诚挚的敬意。感谢章老师给予我如此珍贵的学习机会和如此有意义的成长经历。在这三年的学习过程中，我不仅获得了专业知识和专业技能，而且开阔了思路和眼界。更为重要的是，这期间我学到了许多做人的道理和做事的方法，这些收获将使我受益终生。章老师渊博的专业知识、严谨的做事态度、热爱工作和乐于工作的心态，给我树立了学习的榜样，让我很受鼓舞和有益的影响。我将永远珍惜这段师生情意，在未来的工作岗位上努力工作和学习，以优秀的工作成绩答谢恩师的栽培。感谢马玉媛老师在本课题研究过程中给予我孜孜不倦的指导和引路，让我在遇到困难时，不放弃并能坚持进行很多有益的尝试。我很感激马玉媛老师经常性的鼓励、建议和成长教育；感谢贾俊婷博士手把手的教学和示范，教给我严谨的科学素养和规范的研究技术，让我养成了良好的工作习惯；感谢吕茂民博士、赵雄博士、杨姝老师、王建国老师、王延琳博士和尹惠琼博士在生活中给我的关心和照顾；感谢皇甫超济博士在生活中给予我很多重要的建议和无私的帮助；感谢闫晶晶硕士让我在难过时能够体会到温暖的安慰；感谢姬长甫硕士、张晋超硕士、孙珍珠硕士、范瑞硕士和王蕊实验师给我的生活带来了很多欢乐。感谢西安市中心血站和美国国立卫生研究院心肺血液研究所提供的实验材料。感谢蒋兴伟博士、王艳冰博士、章俊博士、张市会硕士、宋祥博士给予的建议和帮助；感谢栾尧参谋和闫魁干事在生活中的鼓励和无私帮助；感谢院、所领导在学习和工作中的支持和帮助。感谢选培办张永健主任和龙凯宁干事对我学习上的鼓励和关心；感谢国防生大队王健主任等老师一直在我身后鼓励和督促我。最后，我特别感谢我的父亲和母亲，如果没有他们的辛苦养育和竭尽全力的支持，我不可能一路走到这里。2018年5月75