《杭州地区犬细小病毒血清与分子流行病学的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
l|I[1lIlUIIIllll一————————————————————————————————一Y1713604单位代码：10335研究生学号：20617057杭州地区犬细小病毒血清及分子流行病学研究硕士研究生：魏巍指导教师：方维焕教授论文评阅人：杜爱羞熬援——题尘!握硒究旦一——王二盛巫究旦一——-___---_l____●_-__-●____-_--___-___-___————————————一。答辩委员会主席：王蓬熬援———委员：．鱼送茧熬援一——型羞渲副婴究虽一——-————————●-_____———●●———-—————————一一答辩日期：2008年6月12日 }‘-·IIro‘··--『 目录目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1Abstract⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5第一部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6第一章犬细小病毒研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．CPV的发现及危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯72．CPV的一般生物学特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．72．1分类地位与形态⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72．2理化特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．82．3血凝特性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯82．4细胞培养特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．82．5流行病学特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．6致病机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯93．CPV的分子生物学特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lO3．1基因组特征⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯103．2主要蛋白及功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯113．3CPV进入细胞的机制及其在胞内的迁移⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯124．CPV的起源与演化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．144．1CPV的起源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。144．2CPV的演化⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．144．3CPV变异的分子基础⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯165．CPV诊断方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯175．1临床症状和病理变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯175．2病毒学诊断方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯175．2．1电镜观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．175．2．2病毒分离与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．】85．3免疫学诊断方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯185．3．1血凝与血凝抑制(HA．HI)试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．185．3．2酶联免疫吸附试验(ELISA)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．185．3．3胶体金免疫层析法(GICA)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯195．4分子生物学诊断方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯195．4．1PCR方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．195．4．2核酸探针技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯205．4．2核酸杂交技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯206．CPV疫苗研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯207．小结与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．21参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．23第二部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．28第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯291．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．291．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．29 ———————————————————————————————————————————————————————————————一～__目录1．1．1病料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．291．1．2细胞及其培养基⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．291．1．3主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯301．1．4引物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯301．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．301．2．1病料的PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯301．2．2病毒分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．311．2．3病毒鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯311．2．4病毒纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．341．2．5滴度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯341．2．6电镜观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．341．2．7毒株分型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．342．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．362．1病料的PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．362．2病毒分离⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．362．3病毒鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯372．3．1PCR鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯372．3．2血凝与血凝抑带O(HA．HI)试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．372．3．3间接免疫荧光(IFA)实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．382．3．4病毒纯化和滴度测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．382．3．5电镜观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯382．4毒株分型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯392．4．1PCR扩增VP2基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．392．4．2序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯393．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．40参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．42第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．441．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯441．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．441．1．1菌种、载体及血清⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．441．1．2主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。451．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．451．2．1引物设计与合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯451．2．2病毒DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯451．2．3PCR扩增VP2基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯451．2．4PCR产物的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．451．2．5重组质粒在大肠杆菌中的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．471．2．6重组蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯481．2．7Western．blot分析重组蛋白反应原性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．491．2．8间接ELISA方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．501．2．9杭州地区犬细小病毒血清流行病学调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯502．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．512．1PCR扩增CPVVP2基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。512．2重组质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5】．II． 目录2．2．1重组质粒的PCR鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．512．2．2重组质粒的测序鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯512．3重组VP2蛋白的可溶性分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一512．4重组Ⅵ，2蛋白的纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯522．5Western．blot分析重组蛋白反应原性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一522．6间接ELlSA方法的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．532．7杭州地区犬细小病毒血清流行病学调查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．533．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．54参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．57第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．581．材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．591．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．591．1．1病料与疫苗⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．591．1．2载体和菌种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯j⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯591．1。3主要试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．591．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．591．2．1引物设计与合成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯591．2．2病料的PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．591．2．3PCR扩增阳性病料的VP2基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．591．2．4PCR产物的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．601．2．5重组质粒的测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯601．2．6CPV弱毒苗VP2基因的扩增与测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．601。2．7序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．602．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯602．1病料的PCR检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯602．2阳性病料VP2基因的扩增和测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯612．3CPV弱毒苗VP2基因的扩增和测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯622．4杭州地区CPVVP2基因的遗传进化分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～622．5CPVVP2基因的变异分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．643．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．72参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯76结论与建议⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯78攻读硕士期间的科研成果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯79致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。80．．III．． 摘要犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)是Eugster于1977年从患出血性肠炎犬的粪便中新发现的～种小DNA病毒，属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)猫细小病毒亚群。病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，并可引起幼犬的心肌炎，对养犬业危害很大。CPV基因组为单股负链DNA，全长为5323bv，编码非结构蛋白(NSl、NS2)和结构蛋白(VPl、VP2)。结构蛋白VP2是病毒衣壳蛋白的主要成分，并可以诱导机体产生中和抗体，决定病毒的抗原性和宿主范围。自从早期CPV-2出现以来，CPV己演化出多种新抗原型，先是CPV-2a于1979年被分离，随后CPV-2b于1984年被发现。目前，CPV-2在犬群中已被CPV-2a和CPV-2b所取代。最近，另～种新的抗原型CPV-2c被发现，并被证实存在于意大利、越南、西班牙、德国、英国、美国以及乌拉圭等国家。本研究主要目的是：(1)建立犬细小病毒血清抗体间接ELISA检测方法，并对杭州地区CPV血清流行病学进行调查；(2)从分子流行病学角度，探明杭州地区犬细小病毒的流行和变异情况。采集疑似病犬粪便，采用同步培养法接种胎猫肾细胞进行病毒分离与鉴定。通过PCR检测、HA．HI试验、IFA鉴定、电镜观察和空斑纯化，获得一株犬细小病毒，并命名为HZ0761。F81细胞感染后24h出现明显的细胞病变；在病料和感染的F81细胞中均扩增出CPVVP2基因的特异性片段；病毒液可凝集猪红细胞，血凝价为l：28，其血凝性能被特异性抗体所抑制；IFA可见特异性亮绿色荧光；电镜观察感染的F81核内可见20nm左右的病毒颗粒。病毒液的TCID50为1048／mL，VP2基因序列分析显示该毒株为CPV02a。以HZ0761基因组为模板，扩增其VP2基因全长，构建重组表达质粒pET30a．VP2。将重组质粒转化EcoliRosetta株，经IPTG诱导，重组蛋白以包涵体形式表达。Western．blot表明重组蛋白可以与CPV阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。利用纯化后的重组蛋白为抗原，初步建立了CPV血清抗体间接ELISA检测方法。同时利用IFA和ELISA方法对杭州地区犬群CPV血清流行病学进行调查：共检测血清84份，IFA阳性56份，阳性率66．7％，ELISA阳性54份，阳性率64．3％。以IFA为标准计算ELISA方法的敏感性为79．3％，特异性为76．9％。 摘要为探明杭州地区CPV的流行和变异情况，共收集病料样品58份。经PCR检测阳性51份，占87．9％。PCR扩增阳性病料的VP2基因，PCR产物经纯化后，克隆入pMDl8．T载体中，进行序列测定。结果显示：51份病料样品中，CPV-2a45份，占88．2％；CPV-2b6份，占11．8％。分型过程中发现在42份2a和3份2b中均出现两处连续核苷酸变异(970T—A、971A—T)。从系统进化树可以看出，CPV杭州株2a型与2b型各自形成明显的分支，970／971突变株在各自基因型分支内部也形成了明显的分支，说明CPV杭州株在进化上开始显露其自身的特点。利用SNAP对VP2基因进行分析发现，整个VP2基因较为保守。根据dN-dS值和extropy值可将VP2分为三个保守区和两个易变区。在四个主要的抗原表位区中，Loop3和Loop4是最易发生抗原漂移的区域，是新突变株发生突变的主要区域，也是需要重点调查和监测的区域。通过与疫苗株序列的比较，我们发现该地区野毒株以CPV-2a为主并与疫苗株亲源关系较远。本研究初步探明了杭州地区犬细小病毒的存在和流行情况，CPV以2a型为主，初步建立了CPV血清抗体间接ELISA诊断方法，通过对病毒变异特点的分析，为更好预防和控制该病奠定了基础。关键词：犬细小病毒；VP2基因；血清流行病学；分子流行病学． AbstractCanineparvovirus(CPV)issmallDNAvirusefirstrecognizedindogswithhemorrhagicenteritisin1977byEugster．Thevirusisamemberofthefelineparvovirus(FPV)subgroup，classifiedintoautonomousparvovirusofthefamilyParvoviridae．Itisanon-envelopedviruscontainingapproximately5．2kbofasingle—strandednegative-senseDNA，andcausesacutehemorrhagicgastroenteritis，leucopenia,nauseaandoccasionallyfatalmyocarditisinyoungpuppies．Thegenomeencodestwononstructuralproteins(NS1andNS2)andtwostructuralproteinsⅣP1andVP2)．ThecapsidVP2isimportanttothedeterminationofantigenicityandhostrangeofCPVandalsoinducesneutralizingantibody．SincetheemergenceofCPV-2，theantigenicvariantCPV-2awasisolatedin1979．Then，anothervariantcalledCPV-2bwasidentifiedin1984．Presently，theoriginalCPV-2nolongercirculatesinthedogpopulation，whereassubtype2aand2baredistribmedworldwide．Recently,anotherantigenicstraindesignatedCPV-2cWasidentifiedinItaly,Vietnam，Spain，Germany,UnitedKingdom，America，andUruguay．ThemainobjectivesofthisstudyweretoestablishanindirectELISAforserologicalinvestigationofCPVbasedontherecombinantVP2protein，andtoanalyzeitsdominatingsubtypeofvirusesinHangzhouandtheirgeneticdiversity．Toisolatecanineparvovirus(CPV)，embryonicfelinekidneycellline(F81)wasinoculatedwitllfecalspecimensfromdogssuspectedofhavingCPVinfection．OneisolateofCPV,tdesignatedasHZ0761，WaspurifiedbyplaqueformationandcharacterizedbyHAtest,immunofluorescenceassayonF81cellsandelectronmicroscopicobservationaswellassequenceanalysis．The221bpproductsspecificforCPVVP2genewereamplifiedbyPCRfromfecalspecimensandinfectedF81cellsinwhichcytopathiceffect(CPE)Wasfoundafter48hourspostinfection．Theviralstockcouldagglutinateredbloodcellsofpigsattiterof26，whichwasinhibitablebymonoclonalantibodyspecifictoCPV．VisiblesignalswereobservedininfectedcellsbyIFA．Thevirusparticlesabout20nlninsizewereobservedunderelectronmicroscope．TCIDsoofthevirusstockWastitredas104～／mL．Moreover,sequencingofVP2geneindicatedthattheisolatewasCPV-2asubtype．GenomicDNAofCPVHZ0761WasextractedandusedtOamplifythefulllengthVP2gene．TherecombinantexpressionplasmidpET30a-VP2wasconstructedandtransformedintoE．coliRosetta．AfterinductionbyIPTG,thefusionproteinwasfoundtobeinclusion．Western．blotanalysisshowedtherecombinantproteinreacted．3． AbstractwiththepositiveserumofCPV．AfoundationalindirectELlSAwastheninitiallyestablishedtodetecttheantibodyagainstCPVusingpurifiedVP2recombinantproteinasthecoatingantigen．Atotalof84serumsampleswerecollectedtoexamineCPVseroprevalenceindogsofHangzhoubyIFAtestandELISA．Fifty—sixsamples(66．7％)wereCPVpositivebyIFA，whileFifry—foursamples(64．3％)werepositivebyELISA．ThesensitivityandspecificityofELISAwere79．3％and76．9％respectively,usingIFAtestasthereferencemethod．Atotalof58fecalsampleswerecollectedtoexaminetheprevalenceofdominatingsubtypesandgeneticvariationofCPVinHangzhou，China．Fifty—onesamples(87．9％)wereCPVpositivebyPCR．TheVP2geneWaSamplifiedandsequencedfrom51PCR-positivesamples，andtheresultsindicatedthat45isolates(88．2％)belongtoCPV-2a,6(11．6％)toCPV-2b．Twoconsecutivenxacleotidedifferences(T—Aat970andA—Tat971)weredetectedin42of45CPV一2aisolatesand3of6CPV一2bisolates．PhylogeneticanalysisshowedthatbothCP'V-2aandCPV-2bisolatesinHangzhouformedauniquecluster．VariabilityofthefLllllengthVP2aminoacidsequencesof46CPVisolateswasanalyzedbythedifferencesbetweennon—synonymous(㈣andsynonymous(cts)ratesandtheentropyvalues．Twovariableandthreeconservedregionsaswellassomespecificpositionsweredefmed．MajorityofthepositionswithinVP2areconservative，whiletkeepitopedomainsmainlyconcentratedinvariableregionsofVP2includingtwoepitopedomains(Loop3andLoop4)havemorepositivelyselectedpositions．ThisstudyrevealsthatrecentisolatesfromHangzhouarepredominaxatlyof2asubtypeandtheyhaveshiftedawayfromvaccinestrainsusedinthearea．TogetherwiththeVP2-basedELISA，thefindingsfromthisstudyprovidesomebasisforsurveillanceandeffectivecontrolofCPV2intheregion．Keywords：Canineparvovirus；VP2gene；Serologicalepidemiology；2vlolecularepidemiology-4- 刖再前言犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)是Eugster于1977年从患出血性肠炎犬的粪便中新发现的一种小DNA病毒。病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，幼犬的易感性高，并可引起幼犬的心肌炎，发病率为50．100％，死亡率为10。50％，对养犬业危害很大。1982年，梁士哲等首先报道了该病毒在我国的存在，次年徐汉坤等正式报道了本病的流行。1995年公安部南昌警犬基地通过对全国送检样品进行犬细小病毒血凝抑制抗体调查显示我国各地均有犬细小病毒病存在和广泛流行，在造成巨大损失的同时，也给我国军警犬、野生动物、实验犬及民间养犬业带来严重危害。CPV属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)猫细小病毒亚群。病毒粒子呈圆形，直径20．22nm，无囊膜。CPV对理化因素的抵抗力较强且具有较强的血凝活性，能在犬和猫的肠、肺、肾细胞中增殖。基因组为单股负链DNA，全长为5323bp。基因组互补链(C链)上有两个主要的开放阅读框(OI讧)，5’端编码非结构蛋白(NSl、NS2)；3’端编码结构蛋白(VPl、VP2)。VP2是病毒衣壳蛋白的主要成分和具有血凝活性的部分，并可以诱导机体产生中和抗体，决定病毒的抗原性和宿主范围。CPV自1977年被发现以来，通过抗原漂移在抗原性、宿主范围及血凝性上发生了变化，产生多种抗原亚型，在DNA病毒中属于高度变异的一种病毒。尽管近年来临床上常采用疫苗预防，但免疫失败现象还是屡有发生，可能与毒株变异有关。通过对CPVVP2基因变异研究有助于了解CPV的进化和变异趋势，从而为更好地预防和控制该病奠定基础。本论文涉及的研究内容包括：(1)犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定；(2)犬细小病毒VP2基因的表达，间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查；(3)基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究。目的是初步探明杭州地区犬细小病毒血清流行病学状况、主要流行基因型及基因变异情况，为更有效地防制犬细小病毒感染奠定基础。 第一部分文献综述．6． 第一章犬细小病毒研究进展犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)是Eugster于1977年从患出血性：肠炎犬粪便中发现的一种小DNA病毒。病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，幼犬的易感性高，并可引起幼犬的心肌炎。现已发现该病毒存在于世界所有养犬国家于地区，发病率为50．100％，死亡率为10．50％，对养犬业危害很大。目前公认CPV只有一个抗原型，但在其出现的短短几年内已发生了一系列抗原漂移，在抗原性、宿主范围及血凝性上发生了变化，产生多种抗原亚型。目前，国内外许多学者正在对CPV的致病机理、流行病学特征、免疫机制以及诊断治疗方法等进行深入的研究。1．CPV的发现及危害犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)是Eugster于1977年从患出血性肠炎犬粪便中发现的一种小DNA病毒。随后，在加拿大、澳大利亚、比利时、法国、新西兰、英国、日本等十多个国家被证实【l】。病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，幼犬易感性高，并可引起幼犬的心肌炎，发病率为50—100％，死亡率为10．50％，对养犬业危害很大【2】。1982年，梁士哲等首先报道了该病毒在我国的存在，次年徐汉坤等正式报道了本病的流行【3】。1995年，公安音B南昌警犬基地通过对全国送检样品进行犬细小病毒血凝抑制抗体调查显示，阳性率为42％，各地犬群均有阳性病例，证明我国各地均有犬细小病毒病存在和广泛流行。未经免疫的幼犬发病率高达90％以上，致死率为30．100％，在造成巨大损失的同时，也给我国军警犬、野生动物、实验犬及民间养犬业带来严重危害。2．CPV的一般生物学特性2．1分类地位与形态CPV属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒属(Parvovirus)，与猫泛白细胞减少症病毒(Felinepanleukopeniavirus，FPLV)、貂肠炎病毒(Minkenteritisvires，MEV)、浣熊细小病毒(Raccoonparvovirus，RPV)等同属猫细小病毒亚群14,5]。致肠炎的犬细小病毒与1967年Binn等从健康犬中分离到的 第一章犬细小病毒研究进展犬微小病毒(Minutevirusofcanine，MVC)，虽然在形态、大小上十分相似，但在核酸酶切图谱、蛋白抗原特性、细胞培养特性及血凝特性等方面与CPV明显不同【61。为避免混淆，将犬微小病毒与犬细小病毒分别称为犬细小病毒1型(CPV．1)和犬细小病毒2型(CPV．2)。CPV病毒粒子呈圆形，分为实心和空心两种，直径20．22llrn，呈20面体立体对称，无囊膜，衣壳由32个长约3-4nm的壳粒组成。2．2理化特性CPV对理化因素的抵抗力较强，4．10"C可存活180d，室温保存90d感染性仅轻度下降，在粪便和固体污染物上的病毒可存活数月至数年。对乙醚、醇类、氯仿、去氧胆酸盐有抵抗力，而福尔马林、D．丙内酯、次氯酸钠、氨水、氧化剂及紫外线均能伎其失活。病毒粒子分子量约为6×106KD，基因组占整个病毒粒子分子量的25—34％，沉降系数为23．27S，在CsCl密度梯度离心时，大部分感染性病毒粒孑位于1．38．1．429／cm3密度节，小部分感染性病毒粒子位于1．45—1．479／cm3密度节，空衣壳和含有不完整基因组的病毒粒子分别位于1．30．1．329／cm3和1．35．1．379／cms密度节【11。2．3血凝特性CPV有较强的血凝活性，同样条件下CPV的血凝活性至少比同属的FPLV和MEV高8倍【31。CPV可以凝集猪、猴、马、猫和仓鼠的红细胞，在应用硼酸盐缓冲液和病毒调节稀释剂(VriusAdjustingDiluent，VAD)的条件下能凝集犬和绵羊的红细胞【刀。其中对猪红细胞的凝集效果最好且在4。C、pH7．2时血凝活性最强【81。实心、空心病毒粒子都具有血凝活性，甲醛灭活对其血凝活性影响不大。2．4细胞培养特征CPV能在犬和猫的肠、肺、肾的原代和传代细胞中增殖，并能产生细胞病变(CPE)，表现为细胞细长、拉网、破碎、脱落，病毒粒子大量聚集形成嗜酸性核内包涵体。目前，常用胎猫肾传代细胞(F81)和狗肾传代细胞(N1DCK)进行病毒的分离和传代培养。病毒在F81细胞中增殖可引起细胞脱落、崩解和 第一章犬细小病毒研究进展破碎等明显的细胞病变，而在MDCK细胞中虽能良好增殖，却无明显病变，常形成核内包涵体，有时会出现细胞圆缩。病毒复制完全依赖宿主细胞DNA的复制机制，且主要在细胞周期的S期晚期和G2早期进行。因此，在进行体外病毒培养传代时，必须同步接种或在24h内接种。2．5流行病学特征CPV主要感染犬，也可感染貂、狐、狼等犬科动物。各种年龄和品种的犬均可感染。但以刚断乳至90日龄的幼犬发病较多，病情也较严重。洋犬的发病率远高于土犬，占发病犬的95％以上，且疗程长，难治愈。该病无明显季节性，一年四季都有发生，但以天气寒冷的冬春季多发。气候突变、阴雨寒冷、饲料品质不良、暴饮暴食等应激因素均可促进本病的发生。病犬是主要的传染源，病毒主要随被污染的饲料、饮水，经消化道进入机体，人工皮下、肌肉或静脉接种也能引起发病。病毒单纯感染，犬症状较轻，有时仅见体温升高与血细胞减少，需要其他病原生物共同感染才会出现严重的临床症状。CPV自然感染的潜伏期为7．14d，人工感染的潜伏期为3．4d。病犬主要呈出血性肠炎综合征，表现为体温升高、呕吐、腹泻，粪便带有血液呈番茄汁样，迅速脱水，急性衰竭而死。幼犬还可呈心肌炎综合征，常无先兆而突发心力衰竭，或在肠炎康复之后突发充血性心衰，表现为呻吟、干咳、可视粘膜发绀、呼吸极度困难，常在数小时内死亡。2．6致病机理MeuIlier【9,10J铞JMacartneytll-131等对CPV感染的发病机理进行了详尽研究。感染是由病毒侵入所致，最小感染剂量尚不清楚，但似乎非常小，或许小至100个TCIDso。这种情况再加上感染动物排泄的大量病毒(100亿TCID50／g粪)和病毒的高环境耐受性足以说明CPv出现后快速蔓延及世界范围流行的原因【14】。病毒侵入后第2天在口咽部复制，通过血流转播到其它器官，第3．5天出现病毒血症【15】。虽然通常肠炎症状明显，但CPV感染是全身性的，病毒通过血流而不是肠腔到达肠粘膜。基于这个原因，血清抗体效价与保护极为相关，被动获得的抗体在足够量时完全可以保护动物。直到口服CPV后4．5天，临床上才明显表现 第一章犬细小病毒研究进展出肠炎症状。一般认为潜伏期为3．8天，第3天首次排毒，并常在明显的临床症状出现之前排毒【21。CPV感染的病理变化主要取决于病毒感染细胞所需要的条件。因此，病毒复制主要在肠、淋巴组织和骨髓等细胞分裂增殖旺盛的组织器官。细胞也必、须具有适当病毒受体，因为并不是所有细胞增殖旺盛的组织都受影响。加速细胞．增殖有利于病毒复制，加重病理变化和临床症状。因此，如果感染犬冠状病毒先于CPV，冠状病毒通过破坏更多的成熟绒毛上皮细胞来刺激肠腺胚上皮的增殖，导致双重感染，比其它任何一种感染都严重。在肠道内，细小病毒的复制杀死了肠上皮细胞，导致上皮脱落、绒毛变短，病犬表现呕吐和腹泻。淋巴坏死和骨髓增殖细胞的破坏导致淋巴细胞减少，严重者出现泛白细胞减少症。．CPV感染能很快产生免疫，临床症状一出现即可检出循环抗体，而在临床发病期间迅速达到高峰。能否迅速产生免疫反应决定临床症状严重与否的关键因素，能限制病毒血症的程度和持续时间的动物，其症状就较缓和，康复I的机会就较大。这可以解释为什么当灭活疫苗保护减弱时仍能使犬不发病，对感染的记忆反应之快足以缩短病毒血症。如果犬在感染的急性阶段幸存下来，通常台邑迅速和完全地从肠炎症状康复，甚至在致命的病例，都有肠粘膜再生的例证。免疫是长期的和完全的，间隔两年再受到攻击也能抵抗感染【161。3．CPV的分子生物学特征3．1基因组特征CPV基因组为单股负链DNA，全长为5323bp。基因组互补链(C链)上包含两个主要的开放阅读框(ORF)，5’端编码非结构蛋白(668个氨基酸)，即早期转录的调节蛋白(NSl、NS2)；3’端编码结构蛋白(722个氨基酸)，即晚期转录的调节蛋白(VPl、VP2)[17,iS】。其编码区是互相重叠的，两吟ORF分别有各自独立的启动子，即早期启动子和晚期启动子，两者的mRNA．终止于共同的Poly(A)末端，Poly(A)序列下游有TATA序列，这些序列的转录激活对于启动子的活性具有重要的作用【19】。CPV基因组另一显著特点是3’和5’端各有一段回文序列折叠成的T形或Y形发夹结构，一般由120．160bp组成，可作为复制时的引物，在复制过程中不需要其他病毒的协助，成为自主复制性细小病 第一章犬细小病毒研究进展毒(Autonomouslyreplicatingparvovirus)。病毒DNA在感染细胞的核中以末端的发夹结构为引物借助宿主细胞的DNA聚合酶和拓扑异构酶以链鼍换的方式进行复制，即先形成复制型DNA(I江DNA)，随后以此为模板复制出大量子代DNA。在复制过程中必须依赖宿主细胞的某些功能，所以只有在细胞分裂最旺盛的DNA合成期之前接种病毒才能发生增殖，这也许是CPV对分裂旺盛的心肌细胞、小肠上皮细胞及骨髓干细胞最具亲和力的原因。3．2主要蛋白及功能CPV基因组主要编码四种蛋白，包括由早期转录物翻译的非结构蛋白NSl和NS2，由晚期转录物翻译的结构蛋i刍VPI和VP2。完整病毒粒子含有3种蛋白VPl(83I①)、VP2(67KD)和VP3(65KD)，在空衣壳蛋白中只含有VPlglVP2两种蛋白。CPV粒子表面由60个蛋白亚单位装配而成，VP2占90％，而VPl占10％。VPl和VP2是由病毒DNA转录的mRNA通过可变剪接而形成的。VPl氨基酸序列包含整个VP2氨基酸序列，并终止于共同的C端。VPlI：LVP2多出143个氨基酸残基，且富含碱性氨基酸，对于病毒从细胞外转移到细胞内起重要作用。结构蛋白VP2是由8组反平行的p折叠链和插入反向平行的p折叠链之间的4个环组成，是病毒衣壳蛋白的主要成分和具有血凝活性的部分，并可以诱导机体产生中和抗体，决定了病毒的抗原性和宿主范围。VP2基因编码的多肽能自我装配成类病毒粒子，是良好的抗原转运载体，能诱导很强的细胞免疫。VP3仅存在于完整的病毒粒子衣壳蛋白中，是VP2N端水解掉15．20个氨基酸形成的，它只在衣壳装配和病毒基因组包装后出现，其相对量随着感染进程的发展而增加。CPV起初合成的蛋白是非结构蛋白，非结构蛋白的转录本要比结构蛋白的转录本出现的早，一个或两个非结构蛋白负责对细小病毒的基因表达行使调控作用。有一些研究表明，细小病毒基因组编码合成的NSl对病毒基因表达具有反式激活功能【4】。NSl和NS2在合成后，均发生磷酸化，而衣壳蛋白则在N端发生羧基化，但VP2在翻译后也可进行磷酸化，当衣壳蛋白在昆虫细胞中合成时，能够自我组装形成病毒粒子。高分辨率的x射线分析CPV的衣壳，由8组反向平行的p折叠和4个镶嵌于p折叠的大环(Loop)组成。Loop3和Loop4通常组成长的GH环，Loopl、3、4来自三个不同VP2分子彼此紧密靠近、延长、相互作用于三倍体亚单位。这些亚单位 高度缠绕在三倍体轴处形成2．2nm的突起，在这些突起上含有大部分与病毒抗原性相关的残基【211。N端大部分离开五倍体轴而位于衣壳外表面，另一个重要的抗原位点(2L21peptide)已证明位于N端【22。241。研究发现，CPV至少有三个抗原表位区：1)Loopl和Loop3附近的区域；2)二倍体对称轴的下陷和三倍体对称轴突起之间的区域；3)临近三倍体对称轴突起的中心区。环的结构决定了病毒的许多性质，从抗原角度来看，两个重要的中和位点由这些环决定【221。位点A来vP2的Loopl和Loop2以及三倍体分子Loop4。Loop2在形成这个抗原位点时的作用表现在222、224位点变异的结果。位点A涉及的抗原漂移还通过Loop4上1构426残基，使CPV形成2a型和2b型。位点B位于Loop3的延长部分三倍体突起的肩部，包括299、300、302残基。实际上，CPV的300位点残基是最易突变的残基。单克隆抗体识别的这两个决定簇影响血凝抑制【211。然而，这些改变不影响体内交叉保护。VPl和VP2蛋白在病毒感染过程中起着极为重要的作用。缺失VPl或VP2蛋白的突变体均丧失了对宿主细胞的再感染性。对CPV结构蛋白的分析及编码基因突变的研究发现，CPV衣壳蛋白某些区域，甚至几个残基对CPV感染细胞有重要影响，如93位残基以及邻近300位区域对CPV适应细胞有重要影响。3．3CPV进入细胞的机制及其在胞内的迁移CPV首先结合至宿主细胞的转铁蛋白受体(Transferrinreceptor，YfR)，进而通过包涵素介导的内吞作用进入细胞内部并被转运至内涵体【251。Vihinen．Ranta[26】等使用胞质内抗体微量注射技术研究VPl在CPV感染中的作用，发现VPl特异性抗体可有效抑制病毒增殖，提示在CPV进入细胞核之前需要暴露VPl蛋白。VPlN端在CPV进入宿主细胞过程中具有重要作用，缺失该部位的病毒粒子不能引起增殖性感染f271。Tullis[281等己证实VPlN端含有核定位信号。Zadofit29】等还在VPlN端发现磷脂酶A2(PhospholipaseA2，PLA2)样结构域。通过PLA2抑制剂的抑制反应及点突变，发现PLA2在CPV增殖周期的核周聚集和早期基因表达等一些过程中不可或缺p01。几乎所有细小病毒都需要借助受体介导的内吞作用对细胞进行感染。CPV主要通过包涵素介导的内吞作用，被快速摄入宿主细胞。之后CPV在细胞内的转运是一个相对缓慢的过程。针对YfR抗体在注入细胞4h后能减弱CPV感染， 第一章犬细小病毒研究进展可能是由于处于感染中的病毒衣壳在内吞体中仍与TfR受体相关联，这席中联系可能自CPV衣壳被摄入细胞始要持续数小时。针对完整CPV衣壳的抗僻在注入细胞4h或更长时间后也可有效抑制病毒感染，提示衣壳是缓慢从吞泡呻释放出来的。CPV衣壳被摄入数小时内迁移至核周区域，通过荧光原位杂交等技术发现至少8h内病毒DNA与其衣壳共同处于核周区。CPV从内吞泡释放入胞质的详细机制尚不得而知，但仍推测在释放过程中不存在内吞泡的完全裂角珲现象。有关CPV从内涵体释放处被转运至核孔的详细过程并不清楚，有学者认为通过内涵体迁移将病毒转运至核周区，通过主动运输将病毒粒子或其I)NA转运至核孔。胞质中含有由微管、肌动蛋白、中型微丝等交织组成的网格状结构，该结构可限制500KD以上的大分子复合物自由扩散。将CPV衣壳注入细胞质后其将快速聚集到核周区，且大多数衣壳在3．6h内进入核内。把微管进行解聚合处理后，上述迁移过程则受到抑制。电镜图片显示CPV衣壳与微管蛋白的肌动蛋白在体内相互作用，胞内的CPV蓰壳可与肌动蛋白中链被同时沉淀。这说明微管和肌动蛋白可促进CPV在胞庹内的迁移，并协助其进入细胞核。Suikkallen【3l】等认为PLA2活性所在的VPlN端在CPV抵达溶酶体后(感染后3-8h)将被暴露出来。溶酶体内部的酸性环境可激活PLA2，从而进一步改变膜的通透性。PLA2抑制剂可抑制CPV进入宿主细胞的现象提示PLA2对有效感染的重要作用。当趋溶酶体药物存在时，VPl的暴露则不足以使CPV穿入细胞质，提示除PLA2外可能还有其它因素如VP3受体也参与了CPV的穿膜过程。通过向细胞培养物提供大小不一的若丹明．右旋糖苷复合物及走鱼溶酶体药物，P破er【32】等研究了CPV洞穿内涵体膜的能力。在感染后8h相对分子量为3000的右旋糖苷从内涵体泡中释放出来，而大部分分子量为10000昀右旋糖苷仍滞留其中。这说明CPV感染并不会使内涵体泡受到破坏，可能是白于感染过程中PLA2的作用导致内涵体膜的通透性明显改变。这些结果均提示PLA2在CPV穿膜过程中的重要作用【33】，但CPV仍需要具有pH依赖性的其它因素以便从内涵体中释放出来。 第一章犬细小病毒研究进展4．CPV的起源与演化4．1CPV的起源不断出现的新病毒及其潜在致病性给人类和动物不断的威胁。上世纪七十年代末，犬中出现又一种病毒，被命名为犬细小病毒(CanineParvovirus．CPV)。这种细小病毒在全世界范围迅速传播，并且引起大量犬发病死亡，死亡率高达50．100％。血清学回顾溯源试验显示，1976年收集的血清中存在有阳性样品。综合各种对CPV分子进化研究结果发现，病毒的出现至少要提前10年【34】。关于CPV的起源有多种猜想，被广泛接受的猜想有两种：一种认为CPV来源于FPLV的变异株【35。381；另一种认为CPv是从感染其它食肉动物如水貂或狐狸的相关病毒进化而来。大部分研究者更倾向于后者。通过分析VP2、NSl基因序列，MEV与CPV亲缘关系较FPLV与CPV近【38'391。1983年从芬兰北极狐狸分离出的病毒株蓝狐细小病毒(Bluefoxparvovirus，BFPV)，表现出间于FPLV与CPV的一些特征。Truyenl40’41】等报道从德国红狐狸体内分离到一株类似CPV中间体的细小病毒有l处FPLV特有的非同义置换。尽管这株红狐狸细小病毒有可能来源于传统CPV的突变，但仍然表明德国的红狐狸可能是CPV祖先的原始宿主。这些发现表明，犬科动物中的一些动物如貂和狐狸，有可能作为CPV祖先的贮存体。4．2CPV的演化1978年，CPV-2刚出现时引起大量犬发病死亡，死亡率高达50．100％。但之后CPV-2很快发生了变异，Parrisht42】等利用单克隆抗体发现了新的变异株，命名为CPV-2a，并指出大约在1979．1981年之间，CPV-2在抗原性和基因型上被变异株CPV-2a取代。1981年以后，CPV-2已经很少被分离到了。1984年，在美国通过特异性单克隆抗体检测到新的变异株CPV-2b，并逐步流行开来【431。到1988年，CPV-2b已成为美国发病犬中最常分离到的抗原型。Cpr4-2a和CPv-2b比最初的CPV-2对犬的细胞更适应，而且宿主范围更广，可以感染猫，并在某些情况下可引起猫发病m】。美国、日本以及欧洲许多国家对CPV的研究都表明CPV-2a、CPV-2b已经在世界范围内取代了CPV-2[35,45】。CPV-2、CPV-2a和CPV-2b的抗原性十分相似，目前作为分型的VP2氨基酸位点为第300位(CPV-2为Ala，CPV-2a和CPV-2b为Gly)和第426位(CPV-2和CPV-2a为 第一章犬细小病毒研究进展Asn，CPV-2b为Asp)。2000年Ikeda[461等报道在豹猫中分离到一种新的细小病毒，通过特异性单抗HI试验被证实为CPV，命名为CPV-2c，其VP2氨基酸第300位变为Asp，而426位点则有两种情况，一种与CPV-2a相同，而被命名为CPV-2c(a)；一种与CPV-2b相同，而被命名为CPV-2c(b)。CPV-2c能否感染犬并致病有待进一步研究。2001年，Buonavoglia【471等在意大利发现两株CPV的VP2氨基酸第426位变为Glu。Nakamura[48】等通过特异性单抗HI试验证实该突变导致了CPV抗原性的变化。随着相同突变毒株相继在越南【461、美国【491被发现和在意大利的流行【501，Decaro[501等将其命名CPV-2c。此后，西班牙【51】、英国【52】以及乌拉圭㈣又相继报道了该突变株的出现。针对相继出现的突变株，需要提出一种更为合理的分型标准与命名方法。在我国CPV-2曾在20世纪80年代初流行，1986年后的分离株主要为CPV-2a。近年来，我国CPV-2a和CPV-2b广泛并存，CPV-2a占优势地位，但CPV-2b的出现频率正逐渐升高，将来极有可能取代CPV-2a成为主要基因型【541。CPV-2c虽然没有在我国分离到，但尚不能排除其不存在于我国犬科动物体内。目前，我国CPV分离株与各型参考毒株的同源性超过98％，虽然没有形成明显的CPV中国支，但仍需要对其进化变异进行监控调查。另外，CPV的宿主范围有不断扩大的趋势，有报道从狐狸、猎豹、西伯利亚虎、狼以及貉中检测或分离到了CPV。可见CPV能在种间传播流行并不断进化，所以很有必要对CPV进行分子流行病学调查，了解其抗原变异和流行情况。CPV-2a是介于CPV-2和CPV-2b之间的一种抗原型，CPV-2b被认为是从CPV-2a变异来的。CPV-2a是通过什么方式变为CPV-2b的，有无中间过渡型等还需要进一步研究。如果将以CPV-15(CPV-2a，1984年分离)为代表的CPV-2a和以CPV-IM(CPV-2a，2000年分离)为代表的CPV-2a与CPV-2b比较，可以发现CPVolM与CPV-2b只差426一个氨基酸位点，而CPV-15与CPV-2b除相差位点426外还差位点555。而CPV-2与CPV-2b的位点555是一致的，这说明位点555在CPV-2a中先是突变而后又回复了该突变。位点555的突变又与病毒基因组末端的重复序列密切相关，因此有必要对病毒的变异进行调查监控，以便全面认识该病毒的进化过程。 第一章犬细小病莓研究进展4．3CPV变异的分子基础为进一步研究CPV不断出现的变异和导致变异的基础，Chang[551等和Horiuchi[39】等相继利用重组描绘及点突变等分子生物学技术分析了CPV和FPLV分离株的感染性克隆。事实上，宿主范围、抗原结构、血凝pH依赖性等两者间的所有已知差异都是由VP2蛋白的两个氨基酸残基决定的。FPLV和CPV的VP2蛋白第93位氨基酸分别为Lys和Asn，第323位氨基酸分别为Asp和Asn[201。将CPVVP2蛋白中的这两个位点中任何一个改为FPLV相应自勺位点都会显著降低病毒在犬细胞中的复制能力。而将FPLVVP2蛋白中的这两个位点中任何一个改为CPV相应的位点则会显著提高病毒在犬细胞中的复书Ij能力。此外，只有当第93位氨基酸是Asn时特异的单抗才与CPV结合，若是Asp则失去结合能力。因此CPV特异的抗原表位也是由第93位氨基酸决定的。而两种病毒的血凝pH依赖性主要取决于第323位氨基酸，当该位点为Asn时CPV和FPLV都在血凝实验中展示出类似CPV的pH依赖性，而当该位点为Asp时，二者则展示出类似FPLV的pH依赖性。虽然CPV的宿主范围主要由VP2蛋白的第93和323位氨基酸决定，但Parri“56】等利用在猫细胞中传代培养筛选出的CPV-2突变株揭示了其它氨基酸位点也对病毒的感染能力具有主要作用。该突变株不但丧失了感染犬及犬细胞的能力，而且由于抗原性也产生变化而不再能被特异性单抗中和。随后的重组分析表明CPV-2突变株VP2蛋白的第300位氨基酸由野生型的Ala变为Asp，第301位氨基酸由Ile变为Val。通过对一系列点突变株的深入分析，研究人员发现大多数突变都降低了病毒感染犬的能力，这意味着VP2蛋白的原女台结构和构象对确保病毒的宿主范围很重要【57】。Ll锄aSf58]等确定了一株CPV突变株的原子结构(该突变株VP2蛋白第300位氨基酸由Ala变为Asp)，并发现此位点与VP2蛋白上的一个Lys位点形成了一个氢键，这使得衣壳蛋白结构更加稳定。虽说该区域与病毒的宿主范围并无直接关系，但该区域附近的结构却在随后出现的CPV-2a、CPV-2b宿主范围的扩大发挥了作用，并且这些结构可能有助于在全球范围内筛选出更新的CPV毒株。 第一章犬细小病毒研究进展5．CPV诊断方法 第一章犬细小病毒研究进展5．2．2病毒分离与鉴定常用胎猫肾或胎犬肾的原代或传代细胞进行病毒的分离。粪便病料应先离心，再过滤除菌后同步接种细胞培养物。最简便的病毒鉴定方法是接种后3．5d用荧光抗体检测细胞中的病毒，或测定培养液的血凝性。该方法虽特异性、敏感性较强，但技术设备要求高且费时费力，不便进行快速诊断。5．3免疫学诊断方法5．3．1血凝与血凝抑制(HA—HI)试验HA和HI试验是常用的血清学试验。1980年C锄ichael【591等将HA和HI正式用于CPV检测。此法简单、敏感、可靠、经济，在兽医临床和疫病普查中应用最多。叶俊华‘删等应用HI试验，对我国十二个省、市1186份犬血清进行检测，阳性率为42％。范泉水【6l】等对HA和HI方法进行了改进，检测的样品均以巯基乙醇处理，可提高阳性检出率。HA实验中需要用新鲜的红细胞，因为与操作者k-N新D供体猪的问题，HA只能在特殊的实验室中操作。其他动物的红细胞如猫和怔i河猴的红细胞也可以使用，但是很难获得大量的红细胞同时造价昂贵。为确认反应特异性，应使用预先添加了CPV抗血清或单抗的粪样提取物再次进行HA试验。另外，印度学者建立了一种简单、快速的免疫诊断方法【62】，即协同凝集试验(COAT)，用于检测犬粪便中CPV抗原。将含有蛋白A的金黄色萄球菌CowanI株用CPV抗血清致敏，将CPV标准抗原或血凝价大于28的犬粪上清与致敏菌液混合，在2-3minFq即可发生凝集。该试验与HA试验一致，且该方法比琼扩敏感，适于现地应用。5．3．2酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA方法是一种灵敏、快速，适合大规模检测的诊断方法。常用诊断CPV的ELISA方法包括竞争ELISA、间接ELlSA等。Mathysl63i)嗣CPV．2单抗建立了竞争ELISA法进行CPV的诊断；Mildbrandf删等使用两株不同的CPv单抗建立了双抗体夹,L,ELISA。1994年澳大利亚CSL公司研制出ELSIA快速诊断的试剂盒，该试剂盒操作简单、快速、敏感性和特异性较高，但价格昂贵，难于推广。刘宏伟【65】等等用CPV单克隆抗体和多克隆抗体，采用夹，bELISA方法，成功研制-[CPV快速诊断试剂盒。刘剑郁【66】等用犬肾细胞增殖CPV，纯化后作为包被抗原，建立检 第一章犬细小病毒研究进展测CPV血清抗体的间接ELISA方法，对20份免疫犬血清进行检测，阳性检出率为85％，明显高于HI试验(65％)，符合率为80％。李慕瑶【67】等用原核表达的VP2蛋白作为包被抗原，建立检NcPv血清抗体的间接ELISA方法，对55份临床犬血清进行检测，阳性率为83．3％，高于HI试验(74．2％)，符合率为89．1％，说明该方法比HI试验具有更高的敏感性。5．3．3胶体金免疫层析法(GICA)免疫层析是出现于20世纪80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它是在免疫渗滤的基础上建立的一种简单快速的免疫学检测技术。免疫层析方法多以条状纤维层材料为固相，通过毛吸作用使样品溶液在层析条上移动，同时使样品中待测物与层析材料上针对待测物的受体(抗原或抗体)发生高特异性、高亲合性的免疫反应。在层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或目标测定带而得到直观的试验现象，而游离的标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。Esfandiari[68】等应用免疫层析法和4种ELISA法对犬、猫、貂的粪便样品进行了检测分析比较，发现该方法L匕ELISA法更加灵敏和特异。王中力【69】等利用胶体金标记单克隆CPV表面抗体，制成检测CPV抗原的胶体金免疫层析法检测试纸条。用该法检测cPV抗原只需一步加样，2．5min内就能判定结果，具有敏感性高，特异性强，稳定性好，操作简便、快速，分析结果准确，易于判定等优点。5．4分子生物学诊断方法5．4．1PCR方法目前已有多种PCR方法用于CPV的检测。这些方法【7∞直接从分泌物、排泄物等非均质样品中提取DNA进行检测。由于粪样中含有较多的PCR反应抑制剂，因此反应前只得进行繁杂的样品前处理，如去污剂处理、酚抽提甚或层析等。Mochizuki【71】等在酚一氯仿抽提后使用了巢式PCR。Schulll(㈣等人运用降落PCR(Touch—downPCR)检测犬、猫粪样中的细小病毒。该方法能够特异性扩增粪样中的病毒DNA，而样品也只需经简单煮沸处理即可。该方法的灵敏性较高，每个反应检测下限约为10个传染性病毒颗粒，相当于每克未经处理粪样含100个病毒粒子。灵敏度约为电镜观察的10．100倍。Decaro[51等开发出 第一章犬细小病毒研究进展Real-timePCR方法来检测腹泻犬只粪便中的CPV并进行量化分析。经证实该方法具有很高的特异性和灵敏度，能在102．108数量级范围内精确测出CPVDNA含量。该方法具有较高的可重复性。Real．timePCR有助于研究人员深入了解CPV感染过程及致病机理，尤其感染的确切时间范围及与样品中病毒含量的关系，也可在疫苗测试时对攻毒动物进行精确监控。5．4．2核酸探针技术核酸探针技术敏感性高，不受病毒活力的影响，可检出呈免疫复合结合状态的病毒粒子，对CPV感染早、中、后期均有良好的检出率，在临床诊断和口岸检疫上有良好的应用前景。赵永军【731等将提纯的貂肠炎病毒RFDNA用HindIII酶切，收回700bp片段C并克隆至质粒pBR322qb，构建重组质粒PBM，用【01．32P]dATP标记片段C和PBM，用光生物素，分别制成放射性同位素和光生物素核酸探针，采用打点杂交技术将其用于CPV检测。此后，用光生物素标记的PBM探针检测接种疫苗后时间不长犬的粪便样品71份，检出的阳性率为91．5％。5．4．2核酸杂交技术核酸杂交技术可用于鉴定样品中的CPV，对于冷冻样品更加敏感。Remond[74】等运用DNA杂交技术对CPV疫苗株的部分DNA片段进行了克隆测序。Ter锄oto【75】等分别用ELISA、DNA杂交、HA、EM方法检测TCPV患犬的粪便样品并进行了相互比较，结果ELISA与HA之间的相关性最高(94．4％)：ELISA与DNA杂交之间的相关性较低(73．3％)；而ELISA与EM之间的相关性最低(60．9％)。现在，一种新的核酸杂交技术——原位杂交法已广泛得到应用，Decaro[761等用原位杂交法对自然感染而诱发肠炎和心肌炎病犬病料中的CPV进行检测。6．CPV疫苗研究进展本病的预防最早使用福尔马林灭活的FPLV疫苗，也曾少量试用过FPLV弱毒疫苗，虽然CPV和FPLV之间有共同的抗原组成，能发生交叉血清学反应，但FPLV的免疫效果远不如CPV。Eugster[771等用犬源灭活苗预防CPV，取得良好的效果。CPV同源灭活苗用于预防CPV肠炎较FPLV、MEV异源苗好，产生抗体水平比异源苗高2．4倍，免疫期亦长2．4倍，但CPV灭活苗不能刺激犬体产生足够的胃肠道局部抗体，呈隐性带 第一章犬细小病{耄研究进展毒状态，而成为传染源。CPV弱毒苗常与犬瘟热病毒、犬副流感病毒、狂犬病病毒、犬传染，陛肝炎病毒等弱毒苗联合使用，相互间无干扰现象，但母源抗体对CPV弱毒苗影响较大，由于母源抗体的干扰，因此用犬五联弱毒疫苗进行免疫，常达不到保护作用。目前我国某研究所从貂体中分离得到一株细小病毒CR86106，能克服母源抗体的干扰，遗传稳定，免疫效果好，已成为我国预防CPV的最有效弱毒疫苗株。虽然较传统弱毒苗株有良好的免疫应答和较长的免疫期，但该疫苗存在毒力返强的危险，使其应用受到了一定限制。CPV灭活苗和弱毒疫苗各自存在的不足使免疫犬未能得到完全有效的保护，许多国家均有犬群免疫后暴发CPV的报道，引起了世界各国的重视，国内外学者纷纷对此进行了深入研究，致力于寻求更安全有效的疫苗。当前，基因工程疫苗及核酸疫苗的研究已取得了极大的进展。用含CPVVPl基因的真核表达质粒免疫犬，攻毒保护试验证明基因疫苗能够保护犬不被CPV感染。Gilbert[78,79]等在昆虫杆状病毒表达系统中表达YcpvVP2蛋白，10119的表达蛋白即可使犬获得良好的免疫；Langeveldll5'24】等合成VP2N端两段多肽，分别免疫犬后均能产生免疫保护作用。此外，针对第二个多肽3．10个氨基酸的单克隆抗体还可以区别野毒感染和疫苗免疫；Jiang[801等将CPV的VPl基因插入真核载体构建了pGT36VPl重组质粒，将此核酸疫苗免疫犬，取得了良好的效果。杨德威【81】等将细小病毒PIREsneoVP2基因作为DNA疫苗免疫犬，可激发免疫力而没有致病性。杨玲【821用大肠埃希菌系统成功表达了CPVVP2基因，并对其表达产物进行了初步研究，结果表明该表达产物能诱导机体产生中和抗体，为基因工程疫苗的进一步研制提供了有益的参考价值。7．小结与展望犬细小病毒感染是由犬细小病毒引起的一种以出血性肠炎和非化脓性心肌炎为特征的犬的急性传染病，具有感染率高、发病急、病程短、死亡率高等特点，已经成为目前危害我国养犬业的重要疫病之一。结构蛋白VP2是病毒衣壳蛋白的主要成分和具有血凝活性的部分，并可以诱导机体产生中和抗体，决定了病毒的抗原性和宿主范围。VP2基因编码的多肽能自我装配成类病毒粒子，是良好的抗原转运载体，能诱导很强的细胞免疫。 第一章犬细小病毒研究进展CPV是二十世纪70年代后期出现的一种单链DNA病毒，并引起大量犬发病死亡。关于新病毒出现的机制尚不十分清楚，但是改变宿主范围是它们共同的现象。新出现的病毒具有高度的毒力和致病性被认为是由病毒对宿主的不适应造成的。CPV的出现是通过基因突变而改变宿主范围而产生新病毒的一个典型例子。通过对CPV的宿主范围变异研究，有助于进一步揭示新病毒出现的机制从而对其出现和流行进行预防和控制。CPV出现后很快发生了一系列变异，在DNA病毒中属于免疫，但免疫失败现的分子流行病学研究从而为更好的预防和 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第二部分 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定摘要：采集疑似CPV感染犬的粪便，采用同步培养法接种胎猫肾细胞进行病毒分离鉴定。通过PCR检测、HA．HI试验、IFA鉴定、电镜观察和空斑纯化，获得一株犬细小病毒，命名为Hz0761．感染的F81细胞24h后出现明显的细胞病变；在病料和感染的细胞中均扩增cevVP2基因的特异性片段；病毒液可凝集猪红细胞，血凝价为1：28，其血凝性能被特异性抗体抑制；IFA可见特异性荧光；电镜观察感染的细胞核内可见20nm左右的病毒颗粒。病毒液的TCID50为104～／mL，VP2基因序列分析显示该毒株为CPV-2a。犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)属于细小病毒科细小病毒属猫细小病毒亚群，基因组为负单股DNA，是引起犬细小病毒病的重要病原⋯。病犬以呕吐、出血性肠炎、白细胞减少为主要特征，幼犬的易感性高，并可引起幼犬的心肌炎，发病率为50．100％，死亡率为10．50％，对养犬业危害很大I21。1978年Appel[3】等首次从患有肠炎的病犬体内分离获得该病毒，随后在许多国家和地区的犬科动物中相继发现。目前已证实有CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)5个亚型，并通过不断的抗原漂移产生新的突变株㈦】。国内由徐汉坤16]等首先报道了该病的流行。本研究以杭州地区疑似病犬粪便为病料，通过PCR检测、接种F81细胞、HA试验、IFA检测、电镜观察和空斑试验等，进行CPV的分离鉴定和纯化，并对分离株进行基因分型。1．材料与方法1．1材料1．1．1病料实验所用病料为杭州某宠物门诊疑似病犬的粪便，病犬表现体温升高、呕吐、血样腹泻、脱水等症状。1．1．2细胞及其培养基胎猫肾细胞系(embryonicfelinekidneycellline，F81)购自中国科学院上 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定海细胞生物研究所，RPMll640培养基购自Invitrogen公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。1．1．3主要试剂UNIQ．10柱式病毒DNA小量抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；TaqplusDNA聚合酶、羊抗鼠IgG-FITC均购自北京鼎国生物科技有限公司；PrimerSTARTMHSDNA聚合酶购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自Axygen公司；犬瘟热犬细小病毒二联活疫苗购自英特威公司；抗犬细小病毒单克隆抗体购自世纪元亨公司；1．1．4引物本实验所用引物均有上海英骏生物技术有限公司负责合成。1．2方法1．2．1病料的PCR检测1．2．1．1引物设计根据GenBank中CPV基因组全序列(accessionno．NC一001539)设计一对扩增CPVVP2基因221bp片段的引物P1、P2，序列如下：P1：5'-GAAAACGGATGGGTGGAAAT-3’P2：5'-AGTTGCCAATCTCCTGGA兀-3’1．2．1．2模板制备采用UNIQ．10柱式病毒DNA小量抽提试剂盒，从粪便中提取病毒基因组DNA，具体操作如下：1)取少量粪便放入离心管内，加入3009LTE缓冲液混匀，12000rpm离心5min，取上清煮沸10min，随后冰浴5min；2)取上清200pL至eppendoff管中，依次加入40％LDVIBuffer和39LProteinaseK(20mg／mL)，混匀，55"C保温5min；3)加入260pL无水乙醇，混匀，用1-mLTip头将样品全部转移至tYNIQ一10柱，柱子放入2mL收集管中，10000rpm室温离心lmin；4)取下UNIQ．10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，加入 —————————————————————————————————～一第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定500pLWashSolution，10000rpm室温离心lmim5)重复步骤4)一次；6)取下UNIQ．10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，10000rpm室温离心lmin，以除去残留的WashSolution；7)将UNIQ一10柱子放入一新的eppendorf管中，在柱子中央加20wEElutionBuffer，室温放置2min：8)12000rpm室温离心lmin，eppendorf管中的液体即作为PCR反应模板。9)以同样方法处理犬细小病毒犬瘟热二联疫苗作为阳性模板，以ddH20作为阴性模板。1．2．1．3PCR反应按北京鼎国公司提供的TaqplusDNA聚合酶说明书配置PCR反应体系：模板3此，10XPCRbuffer39L，10raMdNTPs0．6此，引物各0．6“L，Taq酶0．89L，加ddH20至309L。反应条件：94。C预变性3min，94。C变性lmin，54。C退火30s，72"C延伸20s，25个循环后72"C延伸5min。反应结束后取5儿进行电泳检测。1．2．2病毒分离1．2．2．1粪便样品处理取lg粪便加入9mLRPMll640培养液混匀后，加入5009L氯仿，充分混匀后4000rpm离心15min，取上清过滤除菌，．70。C保存备用。1．2．2．2病毒分离将处理好的样品按培养液体积的1／10同步接种刚消化分瓶的F81细胞，置37"C5％C02中静置培养。每隔12h观察细胞的生长情况。待细胞病变达80％以上时刮取细胞并离心收集，培养液重悬后反复冻融三次，12000rpm离心10rain，取上清．70℃保存作为盲传或鉴定用的病毒液。1．2．3病毒鉴定1．2．3．1PCR鉴定按1．2．1中方法进行，以病毒液为模板，以犬瘟热犬细小病毒二联疫苗毒作为阳性对照，正常F81细胞培养物作为阴性对照。 第二章犬细小病毒HZ076l株的分离与鉴定1．2．3．2血凝与血凝抑制(HA。HI)试验1．2．3．2．1猪红细胞悬液的制备1)采集健康猪血液置灭菌离心管中，加入2倍体积的生理盐水，2000rpm离心10rain，弃上清，反复洗涤3次；2)用O．02MPBS(pH7．0)重悬，制成10％红细胞悬液；3)缓慢加入等量戊二醛，室温搅拌醛化2．3h至红细胞呈褐色：4)用0．01MPBS(pH7．0)反复洗涤5次，并配成20％红细胞悬液；51加入硫酸汞使弃终浓度为O．1％，置于4"C保存备用。61醛化后的红细胞呈咖啡色，形态完好无自凝现象，在蒸馏水中不溶血。1．2．3．2．2血凝(HA)试验1)本试验采用微量法在96孔V形板上进行，起始孔浓度为1：2，然后进行连续2倍稀释，最后加入等体积红细胞悬液，置于4"C作用lh，待对照孔红细胞完全沉淀后再读取结果，操作方法见表1。2)判定标准：红细胞沉于板底呈点状判为不凝，红细胞呈松散状判为凝集，根据凝集程度的不同可分为：100％凝集@)、75％凝集(抖+)、50％凝集(++)、25％凝集(+)。其血凝价(凝集单位)以红细胞100％凝集的病毒液的最高稀释倍数表示。表1．血凝试验操作表Table1Procedureforhemagglutinationtest眺0．0c2叫M仉。5)：5F5)：5)?5F5F5)：5)?5)?5>：5)篓病毒液(mL)0．050．05o．050．05o．05二。二嚣乏篙o．05o．051．2．3．2．3血凝抑制(HI)试验1)本实验采用抗犬细小病毒单克隆抗体作为血凝抑制的抗体，起始孔浓度为1：2，然后进行连续2倍稀释，分别加入等体积的病毒液(4个 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定凝集单位)，37℃作用1h后，最后加入红细胞悬液，置于4"C作用1h，待抗体对照孔红细胞完全沉淀后再读取结果，操作方法见表2。2)判定标准：在抗体对照不发生凝集，抗原对照完全凝集的前提下进行判定。红细胞沉于板底呈点状判为不凝，红细胞呈松散状判为凝集，根据凝集程度的不同可分为：100％凝集(群)、75％凝集(+++)、50％凝集(++)、25％凝集(+)。其血凝抑制效价以红细胞凝集完全被抑制的抗体最大稀释倍数表示。表2．血凝抑制试验操作表Table2Procedureforhemagglutinationinhibitiontest1．2．3．3间接免疫荧光试验(IFA)1)将F81细胞以105／mL接种24孔板，500rtL／孑L，并按培养液1／10体积同步接种病毒液，同时设不接毒的细胞孔作为阴性对照；2)3)4)5)6)7)8)9)37℃5％C02中静置培养24h后，停止培养，用0．02MPBS洗涤三次；．20℃预冷80％丙酮溶液固定15rain；PBS洗涤3次，每次5rain；抗CPV单抗作为一抗，用含O．5％脱脂奶粉的PBS进行100倍稀释，加入培养孔中(300rtL／孑L)，37℃作用1h；PBS洗涤3次，每次5min；每孔加入300}tL羊抗鼠IgG．FITC(200倍稀释)，37。C避光作用45min：PBS洗涤3次，每次5min：50％甘油PBS封底，并置于荧光显微镜下观察结果。 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定1．2．4病毒纯化病毒纯化采用空斑技术【11，应用双层琼脂糖法，挑选出犬细小病毒单克隆株。1)将F81细胞以105／mL接种24孔板，2mL／Zj：L，并按培养液1／10体积同步接种连续10倍稀释的病毒液，同时设不接毒的细胞孔作为阴性对照；2)37。C5％C02中静置培养36h后，吸出培养液，并用适量D．Hank’S液轻轻冲洗一次；31等体积2×RPMll640与1．5％琼脂糖混合后覆盖6孔板(2mL／孑L)；4)37"C5％C02中倒置培养48h；5)等体积2×RPMll640与2％琼脂糖混合后，加入1／100体积的O．1％中性红溶液，充分混匀后覆盖6孔板(1mL／孔)；6)37"C5％C02中避光倒置培养24h后，观察空斑生成情况；7)用弯头吸管吸取空斑及其上层琼脂糖，并同步接入含有F81细胞的24孔板中，37℃5％C02中培养，扩增传代。8)反复进行3次纯化过程，得到犬细小病毒单克隆株。1．2．5滴度测定1)将纯化病毒液作连续10倍稀释：．2)各稀释度取0．1mL病毒液，加入0．9mLF81细胞液(105／mL)；3)每个稀释度接种8个孔，培养24h后，通过IFA观察病毒增殖情况；4)根据Reed．Muench【7,81法计算TCID50。1．2．6电镜观察1)将病毒液按培养液体积的1／10同步接种F81细胞，24h后刮取细胞并离心收集；2)2．5％戊二醛固定过夜，1．5％琼脂糖包埋；3)制备细胞超薄切片，透射电镜观察。1．2．7毒株分型1．2．7．1引物设计参考GeneBank公布的CPV序列设计一对扩增VP2全基因的引物：VP2．1：5’．AAGCCGGTGCAGGACAAG-3’．≈4． 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定VP2—2：5’一’I”I’C。IAGG’I‘GC。IAG。11I‘GAIA一3’1．2．7．2病毒DNA的提取采用UNIQ一10柱式病毒DNA小量抽提试剂盒，从感染CPV的F81细胞中提取病毒基因组DNA，具体操作如下：1)取适量细胞液反复冻融三次后，12000rpm离心5min；2)取上清200FL至eppendorf管中，依次加入400p．LDVIBuffer和3肛LProteinaseK(20mg／mL)，混匀，55℃保温5mira3)加入2609L无水乙醇，混匀，用I-mLTip头将样品全部转移至UNIQ-10柱，柱子放入2mL收集管中，10000rpm室温离心lmin；4)取下UNIQ．10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，加入500止WashSolution，10000rpm室温离心1mira5)重复步骤4)一次；6)取下UNIQ．10柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回收集管，10000rpm室温离心lmin，以除去残留的WashSolution；7)将UNIQ．10柱子放入一新eppendorf管中，在柱子中央加209LElutionBuffer，室温放置2mira8)12000rpm室温离心lmin，eppendorf管中的液体即为病毒基因组DNA。1．2．7．3PCR反应按PrimerSTAR刑HSDNA聚合酶说明书配置PCR反应体系：模板39L，5×PCRbuffer6pL，dNTPmix2．4此，引物各0．6pL，PrimerStar0．39L，加ddH20至309L。反应条件：94"C预变性3min，94"C变性15s，54"C退火15s，72。C延伸90s，25个循环后72。C延伸10min。反应结束后取59L进行电泳检测。、1．2．7．4PCR产物回收及测序在紫外灯-Fd,心切下目的条带，用Axygene公司的DNA回收纯化试剂盒进行回收：1)按300肛L／100mg凝胶的比例加入DE-ABuffer，置于75"C水浴中6-8min，每2min混匀一次，使胶彻底熔化；2)补加入1／2DE．A体积的DE．BBuffer，混匀；3)将回收柱套于2mL离心管中，上述已熔化的琼脂糖胶转移至柱内， 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定12000rpm室温离心1min。取下柱子，倒掉收集管中的废液；4)将柱子放入同一个收集管中，加入500pLWashSolutionl，12000rpm室温离心30s；5)倒掉收集管中的废液，将柱子放入同一个收集管中，加入700uLLWashSolution2，12000rpm室温离心lrain；6)取下柱子，倒掉收集管中的废液，将柱子放回到同一个收集管中，12000rpm室温离心lmim7)将柱子放入一个新的1．5mL微量离心管中，在柱子膜中央打口25皿ddH20，室温放置2min(55．80℃洗脱效果更好)；8)12000rpm室温离心lmin，离心管中的液体就是回收产物；9)取10此回收产物送往英骏公司进行测序，并用DNAstar软件对序列进行分析。2．结果2．1病料的PCR检测将病料进行PCR检测，结果阳性对照与所检病料均扩增出约221bp的条带，与理论值相符，阴性对照无任何条带，如图1。l23M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图1．病料中CPV的PCR检测Fig．1PCRdetectionofCPVinfecalsample1-Negativecontrol：2一Fecalsample；3一Positivecontrol；M—DL2000DNAMarker2．2病毒分离正常F81细胞为扁平不规则多边形，细胞紧密相连，细胞均质而透明(图2，A)。病料接种F81细胞，24h后出现明显的拉网现象(图2，B)，36h后可见细胞变圆脱落(图2，C)，48h后细胞脱落超过80％(图2，D)。 —I-—-———————’———————●———————————————-——_————_———————————————————————————————————————————————————一⋯图2．接种病料后FSl细胞的形态学变化Fig．2MorphologiechangesofF81cellsinoculatedwithfecalsampIeA二No珊alF81cells；B,C，D．FS1cellsinoculatedfecalsampleafter24，36，48h2．3病毒鉴定2．3．1PCR鉴定将病如图3。毒液进行PCR鉴定，结果病毒液与阳性对照均扩增出221bp的条带，12M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3．感染细胞中CPV的PCR检Fig．3PCRdetectionofCPVininfected1-Infectedcell；2-Positivecontrol；M—DL2000测F81cellDNAMarker2．3．2血凝与血凝抑制(1IA—HI)试验血凝试验表明：待检病毒液具有明显的血凝活性，血凝价为28。血凝抑制试．37- 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与签定验表明：待检病毒液的血凝活性能被抗犬细小病毒单克隆抗体所抑制。2．3．3间接免疫荧光(IFA)实验接种病毒36h后则出现特异性亮绿色荧光(图4，A)，荧光主要见于细胞核，正常F81细胞无荧光出现(图4，B)。图4．IFA检测FSl细胞中的CPVFig．4IdentificationofCPVinFSlcellsbyIFAA-F81cellsinoculatedwithCPV；B-NormalF81cells2．3．4病毒纯化和滴度测定根据双层琼脂法，进行三次空斑纯化，得到犬细小病毒的单克隆株，并命名为HZ0761。根据Reed．Muench法计算病毒液的TCID50为104～／mL。2．3．5电镜观察病毒感染的F81细胞肿胀呈椭球形，胞膜破裂，胞浆中出现空泡，核内充满病毒颗粒(图5，A104X)。将细胞核放大可见20nm左右的病毒颗粒，可分为实心、空心两种(图5，B105×)。图5．FSl细胞和其核内CPV病毒粒子的电镜观察Fig．5UltramicroscopicobservationofCPVparticleswithFSlcell(A)anditsnucleus(B) 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定2．4毒株分型2．4．1PCR扩增VP2基因2．4．2序列分析PCR产物进行回收和测序，将其序列与CPV各型参考株序列进行比较(表3、表4)，参考分型标准【9'1o】为CPV-2a型。表3．VP2基因中发生非同义置换的碱基Table3Thelion-synonymoussubstitutesofbasesintheVP2geneStrainsPositionofthebaseGenetype14612593028898999139709711123127612781318MajorityCATCGTAGATAHZ0761幸G幸·事·AT卑幸。串CPV·2aCPV．bV154·ATCG幸事A·事·CPV·2G●'I‘LCPV．V204·●·●·+幸CPV．2aG+GCPV．2b 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定表4．VP2基因中发生非同义置换的氨基酸Table4Thenon-synonymoussubstitutesofaminoaeidsintheVP2gene3．讨论CPV无囊膜，用氯仿处理粪便可使囊膜病毒失活，有利于CPV的分离和纯化。CPV完全依赖宿主细胞DNA的复制机制进行复制，主要在细胞周期的S期晚期和G2早期【11：21。因此，病毒的接种最好采用同步接种方式。控制粪便处理物的接种量(按培养液体积的1／10，1／20进行接种)可降低粪便中毒素对细胞的毒害作用，从而提高病毒分离的成功率。细胞系的选择也至关重要，作者曾选用MDCK细胞和Veto细胞进行病毒分离，但效果不理想，后选用FSl细胞分离，则可见明显的细胞病变，可能是因为CPV对不同细胞系的敏感性不同【”，14】。CPV-2自1977年被发现以来，已出现了5个亚型[15,16]。通过序列比较发现本分离株与各型参考毒株(M38245、AB054217、AB054221、AF401519、AB054222、AB054224)的同源性在99％以上。但是仍然发现了两处新的变异，分别为21nlr一越a(61A—G)和3241姐一Ile(970T—A和971A-"T)，其生物(CPV-2b)(b))1(CPV-2a)(CPV-2)卜—————一0．001图7．HZ0761株VP2基因的系统进化树Fig．7PhylogeneticanalysisofVP2geneofCPVHZ0761isolate 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与苍定美国、日本以及欧洲许多国家对CPV的研究都表明CPV-2a、CPV-2b已经在世界范围内取代了CPV-2t17,18】。目前我国流行的毒株也属于CPV-2a和CPV-2b，其中CPV-2a占主导地位【191。另外，CPV的宿主范围有不断扩大的趋势，有报道从狐狸、猎豹、西伯利亚虎、狼以及貉中检测或分离到CPVt20-221。可见CPV能在种间传播流行并不断进化，所以很有必要对CPV进行分子流行病学调查，了解其抗原变异和流行情况。本研究建立了犬细小病毒分离、鉴定及纯化方法，并从杭州地区疑似病犬粪便中分离获得一株犬细小病毒，研究结果表明CPV-2a存在于我国杭州地区犬群中，这是杭州地区犬细小病毒分离的首次报道，为进一步研究CPV感染和发病机制奠定了基础。 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定参考文献【1】殷震，刘景华．动物病毒学[MI．北京：科学技术出版社，1997．【2】蔡宝祥．家畜传染病学【M】．第四版．北京：中国农业出版社，2001．7．【3】AppelM．J．，ScottF．W．，andCarmichaelL．E．Isolationandimmunisationstudiesofacanineparco—likevirusfromdogswithhaemorrhagicenteritis[J]．TheVeterinaryRecord．1979(105)：156—159．【4】KangB．K．，SongD．S．，LeeC．S．，eta1．PrevalenceandgeneticcharacterizationofcanineparvovirusesinKoreatJ]．ViresGenes．2008．[5】TruyenU．，GmenbergA．，ChangS．F．，eta1．Evolutionofthefeline—subgroupparvovirusesandthecontrolofcaninehostrangeinvivo[J]．JournalofVirology．1995(69)：4702．4710．【6】徐汉坤，金淮，郭宝发，等．某犬群暴发犬病毒性肠炎的流行病学和临床病理学观察阴．畜牧与兽医．1983(5)：8．10．【7】PizziM．Samplingvariationofthefiftypercentend-point，determinedbytheReed-Muench(Behrens)method叨．HumanBiology；allinternationalrecordofresearch．1950(22)：151-190．【8】ZamoiskiiE．A．【EvaluationofReed—Muenchmethodindeterminationofactivityofbiologicalpreparations．】【J】．ZhumalMikrobiology,Epidemiology,Immunobiology．1956(27)：77-83．【9】ParrishC．R．，AquadroC．F．，StrassheimM．L．，eta1．Rapidantigenic-typereplacementandDNAsequenceevolutionofcanineparvovims[J]．JournalofVirology．1991(65)：6544—6552．【10】BattilaniM．，ScagliariniA．，TisatoE．，eta1．AnalysisofcanineparvovirussequencesfromwolvesanddogsisolatedinItaly[J]．TheJournalofGeneralVirology．2001(82)：1555-1560．【11】BasakS．andTurnerH．Infectiousentrypathwayforcanineparvovirus[J]．Virology．1992(186)：368—376．【12】DecaroN．，CampoloM．，DesarioC．，eta1．Maternally—derivedantibodiesinpupsandprotectionfromcanineparvovimsinfection[J]．Biologicals．2005(33)：261-267．[13】ParrishC．R．Hostrangerelationshipsandtheevolutionofcanineparvovirus[J]．VeterinaryMicrobiology．1999(69)：29-40．【14】HuefferK．andParrishC．R．Parvovirushostrange，celltropismandevolution[J]．CurrentOpinioninMicrobiology．2003(6)：392-398．【15】DecaroN．，DesarioC．，AddieD．D．，eta1．Thestudymolecularepidemiologyofcanineparvovirus，Europe[J]．EmergingInfectiousDiseases．2007(13)：1222·1224．【16】DecaroN．，EliaG，Martellav．，eta1．Characterisationofthecanineparvovirustype2variantsusingminorgroovebinderprobetechnology[J]．JournalofVirologicalMethods．2006(133)：92—99．【17】PereiraC．A．，MoneziT．A．，MehnertD．U．，eta1．MolecularcharacterizationofcanineparvovirusinBrazilbypolymerasechainreactionassay[J]．VeterinaryMicrobiology．2000(75)：127-133．[18】WangH．C．，ChenW．D．，LinS．L．，eta1．PhylogeneticanalysisofcanineparvovirusVP2geneinTaiwan[J]．VirusGenes．2005(31)：171．174．【19】谢之景，夏咸柱，扈荣良，等．犬细小病毒基因型的调查【J】．中国兽医学报．2004(24)：421—424．．42． 第二章犬细小病毒HZ0761株的分离与签定【20】TruyenU．Emergenceandrecentevolutionofcanineparvovirus[J]．VeterinaryMicrobiology．1999(69)：47—50．【21】SteinelA．，MunsonL．，vailVuurenM．，eta1．Geneticcharacterizationoffelineparvovirussequencesfromvariouscarnivores[J]．TheJournalofGenerflVirology．2000(81)：345-350．【22】QinQ．，LoeffierI．K．，LiM．，eta1．Sequenceanalysisofacanineparvovirusisolatedfromaredpanda(Ailurusfulgens)inChina[J]．VirusGenes．2007(34)：299—302。．43． 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查摘要：以CPVHZ0761基因组为模板，扩增其VP2基因全长，构建重组表达质粒pET30a-VP2．将重组质粒转化EcoliRosetta株，经IPTG诱导重组蛋白以包涵体形式得到了表达．Western．blot表明重组蛋白可以与CPV阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性．以纯化后的重组蛋白为抗原，初步建立了CPV血清抗体间接ELISA诊断方法。利用IFA实验和ELISA对杭州地区犬群CPV血清流行病学进行调查：共检测血清84份，IFA阳性56份，阳性率66．7％，ELISA阳性54份，阳性率64．3％。以IFA为参考依据，计算ELISA的敏感性为79．3％，特异性为76．9％。CPV基因组为单股负链DNA，全长为5323bp。完整病毒粒子含有VPl、VP2和VP3三种蛋白，在空衣壳蛋白中只含有VPl和VP2两种蛋白。结构蛋白VP2是病毒衣壳蛋白的主要成分和具有血凝活性的部分，并可以诱导机体产生中和抗体，决定了病毒的抗原性和宿主范围。本研究以HZ0761基因组为模板，扩增VP2基因全长，将其克隆入原核表达载体pET-30a中，构建重组表达质粒pET30a．VP2。将重组质粒转化E．coliRosetta株，经IPTG诱导重组蛋白以包涵体形式表达。Western．blot表明重组蛋白可以与CPV阳性血清发生特异性反应，具有良好的反应原性。以纯化后的重组蛋白为包被抗原，初步建立了CPV血清抗体间接ELISA诊断方法。利用IFA实验和该ELISA对杭州地区犬群CPV血清流行病学进行调查：共检测血清84份，其中IFA阳性56份，阳性率66．7％，ELISA阳性54份，阳性率64．3％。以IFA实验为标准计算ELISA的敏感性为79．3％，特异性为76．9％。1．材料与方法1．1材料1．1．1菌种、载体及血清E．coliRosetta株、原核表达载体pET-30a由本实验室保存；CPV阳性血清购自解放军军需大学兽药研究中心：CPV阴性血清由浙江大学动物医院提供；犬血清样品84份，采自杭州地区犬群。 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查1．1．2主要试剂UNIQ一10柱式病毒DNA小量抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；胶回收纯化试剂盒购自Axygene公司；PCR反应所需试剂、各类限制性内切酶及其相关试剂均购自TaKaRa公司；镍琼脂糖凝胶FF柱购自北京卓冠科技有限公司；羊抗犬IgG．HRP、羊抗犬IgG．FITC均购自上海晶美公司；NC膜购自美国PALL公司；其他试剂均为分析纯。1．2方法1．2．1引物设计与合成根据GenBank中CPV基因组全序列(accessionno．NC001539)可知，VP2基因位于病毒基因组的2786—4540位，全长1755bp，编码584个氨基酸。利用DNAStar软件设计一对引物如下：VP2-l：5’-TA鱼堡笪Z要￡ATGAGT(谈rGGAGCAGTT-3’VP2—2：5’-TA￡匹丝堡TATGrrAATATA肼TCT-3’VP2．1、VP2-2分别含有BamHI、XhoI酶切位点，并由上海英骏生物技术有限公司负责合成。1．2．2病毒DNA的提取采用UNIQ—10柱式病毒DNA小量抽提试剂盒，从感染CPV的F81细胞中提取病毒基因组DNA，具体操作同第二章1．2．7．2。1．2．3PCR扩增VP2基因按TaKaRa公司提供的PrimerSTAR刑HSDNA聚合酶说明书配置PCR反应体系：模板3肛L，5XPCRbuffer6此，dNTPmix2．4止，引物各0．6I．tL，PrimerStar0．3I．tL，加ddH20至30此。反应条件：94"C预变性3min，94"C变性15s，50℃退火15s，72"C延伸90s，25个循环后72"C延伸10min。反应结束后取5pL进行电泳检测。1．2．4PCR产物的克隆1．2．4．1PCR产物的纯化在紫外灯下小心切下目的条带，用Axygene公司的DNA回收纯化试剂盒．45． 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血．清流{亍病学调查进行回收，步骤同第二章1．2．7．4。1．2．4．2PCR产物的克隆1．2．4．2．1pET-30a质粒的提取1)1．5mL菌液，12000rpm离心30s，弃培养基；2)用100斗LSolutionI悬浮细菌；3)加入200gLSolutionII，盖紧管口，快速颠倒数次，冰浴5min；4)加入150gL预冷的SolutionIII，盖紧管口，温和颠倒数次，冰浴5min；5)12000rpm离心5mini6)上清转入新的eppendorf管，加入等体积的饱和酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)，12000rpm离心5mini7)将水相转入新的eppendorf管，加入1／10体积的3M乙酸钠和两倍体积的无水乙醇，室温放置10min后12000rpm离心10min；8)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤一次，自然干燥至酒精完全挥发，用含10,g／mLRNase的TEbuffer溶解质粒。1．2．4．2．2PCR产物和pET-30a质粒的酶切1)pET-30a质粒和PCR产物经BamHI、XhoI双酶切，其酶切体系如下：pET-30a质粒／PCR产物81．tL，10×Kbuffer59L，限制性内切酶各2．5}tL，加ddH20至50I_tL。轻弹混匀，稍离心后置37"C水浴中作用6h，质粒和PCR产物各作3管重复。2’)酶切产物经胶回收试剂盒纯化后，经1％琼脂糖电泳估计浓度。1．2．4．2．3连接反应回收的酶切产物用连接试剂盒连接，连接体系为：PCR产物／BamHI+XhoI4．5¨L，pEX-30a／BamHI+Xh010．5gL，Ligationsolution5止，混匀后16'C连接过夜。1．2．4．2．4转化1)取2001．tL的大肠杆菌Rosetta株感受态细胞，冰上解冻至刚好融化：2)取连接产物加入感受态细胞中混匀，冰浴20mini3)42℃热激60s后立即冰浴2rain；4)加入1mLLB液体培养基，37℃振荡培养45min。 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查5)5000rpm离心5min，弃1mL上清，用剩余的2001．tL上清悬浮沉淀，涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜至菌落出现。6)待菌落出现后，随机挑取多个单菌落于5mL含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。1．2．4．2．5重组质粒的鉴定1)重组质粒的PCR鉴定采用1．2．3中方法，以菌液作为PCR反应的模板，经l％琼脂糖电泳，将能够看到与目的片段大小相同的重粒质粒鉴定为阳性。2)将PCR阳性的质粒进行序列测定，测序由英骏生物科技有限公司完成。1．2．5重组质粒在大肠杆菌中的表达1．2．5．1重组菌的诱导表达1)取测序正确的阳性菌以l：100接种于含硫酸卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养3h；2)加入诱导剂IPTG至终浓度为lmM，培养4h；3)室温8000rpm离心10min收集菌体；4)弃上清后加入适量50mMPBS(pH7．4)悬浮细菌，反复吹打后，8000rpm离心10mira5)弃上清，加入培养基1／10体积的50mMPBS(pH7．4)重悬细菌，取lmL超声波破碎(300W，4S／4S，99次)；6)12000rpm离心10rain，分别取上清和沉淀进行SDS—PAGE分析。1．2．5．2重组蛋白可溶性分析1)SDS．PAGE电泳板的处理用中性洗涤剂清洗后，再用双蒸水淋然后用酒精棉球擦拭，吹风机吹干备用。2)15％分离胶的制备在10mL小烧杯中加入下列试剂：双蒸水1．1mL30％丙稀酰胺溶液2．5mL1．5M"Iris(pH8．8)1．3mL10％SDS0．05mL 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及mL清流行病学调查10％过硫酸铵O．05mLTEMED0．005mL充分混匀，立即缓慢倒入已固定好的两电泳板之间的狭槽中，马上轻轻覆盖一层双蒸水，室温静置至胶完全聚合，除去上层水相，用滤纸吸干水分。3)浓缩胶的制备在10mL小烧杯中加入下列试剂：双蒸水1．4mL30％丙稀酰胺溶液0．33mL1．0M嘶s(pH6．8)O．25mL10％SDS0．02mL10％过硫酸铵0．02mLTEMED0．002mL充分混匀，立即缓慢倒入分离胶上层的狭槽中，将样品梳插于槽上部，室温静置，待聚合完全后拔去梳子；4)样品处理分别取上清和沉淀40此，加入5XSDS—PAGE上样缓冲液lO此后，沸水浴作用10min，12000rpm离心5rain后取10止上清作为SDS．PAGE电泳样品；51电泳在电泳槽中加满电泳缓冲液，用微量上样器上样。150V，3mA，4W，电泳至溴酚蓝迁移至胶下缘结束；6)染色电泳完毕后，小心取出凝胶，置于大的平皿中，倒入染色液至浸没凝胶，于水平摇床上染色45mira7)脱色倒去染色液，加入脱色液至浸没凝胶，于水平摇床上脱色至背景消失，中间换液数次。脱色完毕后，观察目的蛋白有无表达。1．2．6重组蛋白的纯化1．2．6．1蛋白过柱纯化选择含有pET30a-VP2质粒的阳性重组菌大量诱导表达，用Ni．N'TA蛋白纯化系统进行纯化，步骤如下：1)离心收集IPTG诱导的重组细菌，50mMPBS(pH7．4)洗涤一次；2)用培养基1／10体积的8M尿素50mMPBS(pH7．4)重悬细菌，并超声 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查波破碎(300W，4S／4S，99次)：3)12000g离心10min，取上清作为待纯化的样品；4)混匀填料，根据培养物量及其表达水平装柱2mL，并用3个柱床体积洗涤缓冲液(含8M尿素50mMPBS)平衡柱子；5)在柱中小心加入样品，打开开关使液体流出(流速为滴／10s)；6)反复上样三次；7)用3个柱床体积的含50mM咪唑的洗涤液洗涤柱子，除去杂蛋白；8)用3mL含400mM咪唑的洗涤液洗脱蛋白，并取少量进行SDS—PAGE电泳检测蛋白纯度；9)柱床用完后，在上面小心覆盖20％乙醇适量，4"C保存。1．2．6．2Bradford法测定蛋白浓度按表1依次将试剂加入96孔板上相应孔，每种两个重复，所测样品根据蛋白电泳估测浓度选择合适量替换表中标准溶液也同时加入板中，也设两个重复，放入多功能连续光谱仪振荡，用仪器自带Bradford法程序读取数据，经过设定后仪器即自动绘制标准曲线，同时给出所测蛋白浓度。表1．重组蛋白浓度的测定Table1Quantificationofpurifiedrecombinantprotein．O．02MPBS(oL)2019．51918．51817．51716．516BSA标准试剂(uL)00．511．522．533．54Bradford工作液(“L)2002001．2．7Western．blot分析重组蛋白反应原性1)将原核表达产物、纯化后的重组蛋白及E．coliRosetta株进行SDS．PAGE，电泳步骤同上。电泳结束后，将凝胶取出，用转移缓冲液洗涤两次，用于电转移；2)转膜：剪取与需要转移的丙烯酰胺凝胶大小相同的滤纸2张、NC膜1张，用转移缓冲液浸泡15min；将1张滤纸铺在负极石墨板上，依次铺上丙稀酰胺凝胶、NC膜和另外1张滤纸，用玻璃棒来回滚动几次，以赶走气泡，再放上盖板，20V，350mA，7W转移45min： 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查3)转移完毕后，NC膜放入平皿，用TBST洗涤一次，放入新配制的5％脱脂奶粉TBST中37"C封闭2h；4)CPV阳性血清用O．5％脱脂奶粉的TBST稀释50倍后，浸入NC膜，37℃作用1h；5)用TBST洗涤NC膜5次，每次5mira6)羊抗犬IgG—HRP500倍稀释，浸入NC膜，370C作用1h；7)重复步骤5)；8)显色将适量显色底物4．CN用5mL甲醇溶解，再加入22．5mLTBS，待完全溶解后再加入151．tL30％H202，将NC膜浸入其中，待出现明显的条带或背景时，用水冲洗NC膜终止反应。1．2．8间接ELISA方法的建立以重组蛋白作为抗原，以标准阳性血清和阴性血清作为一抗，羊抗犬IgG．HRP作为二抗，进行棋盘滴定试验以优化抗原包被浓度和一抗稀释倍数，具体步骤如下：1)将纯化的重组蛋白按161．tg／mL、8rtg／mL、41．tg／mL、2t．tg／mL、1“g／mL、0．599／mL包被96孔板，每孔1009L，37℃温育2h后，4℃过夜；2)去酶标板中包被液，用2009LPBST洗涤3次，每次3mira3)5％脱脂奶粉37"C封闭2h，每孔2001tL；4)洗涤同2)，将细小病毒阳性血清和阴性血清分别用含5％脱脂奶粉的PBST稀释50倍和100倍后，加入96孔板中，每孔100pL，37"C作用1h：5)洗涤同2)；加入二抗(1000倍稀释)，每孔100pL，37℃温育1h；6)洗涤同2)，加入OPD显色液，每孔1001．tL，37℃温育10mira7)每孔加入50rtL2M硫酸，终止反应。测定OD492；8)选择阴性OD492小于0．15，且P／N值最大时的抗原包被浓度和血清稀释倍数作为最佳工作浓度。1．2．9杭州地区犬细小病毒血清流行病学调查为了探明杭州地区犬群中CPV血清流行病学，共采集犬血清84份，分别 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查用IFA实验(见第二章1．2．3．3)和ELISA对血清进行检测。2．结果2．1PCR扩增CPVVP2基因以CPV全基因组为模版，PCR扩增后在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，可见1775bp的条带，扩增产物的大小与预测结果一致(图1)。1M2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp图1．CPVVP2基因PCR产物Fig．1PCRproductofCPVVP2gene1-PCRproductofVP2gene：M—DL2000DNAMarker2．2重组质粒的鉴定2．2．1重组质粒的PCR鉴定将PCR产物克隆入原核表达载体pET-30a，并对重组质粒进行PCR鉴定，结果均与预期相符。2．2．2重组质粒的测序鉴定对PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定，测序结果表明重组质粒含有CPVVP2基因全序列，并正确的插入到相应的位置，遂将该重组质粒命名为pET30a-VP2。2．3重组VP2蛋白的可溶性分析将含有阳性重组质粒的大肠杆菌Rosetta株进行诱导表达，并取少量表达产物进行SDS—PAGE分析，结果显示重组蛋白以包涵体的形式存在于离心后的沉淀中并分别在67KD和38KD处出现两条明显条带，其中67KD处条带与DNAStar预测值相符，如图2。 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查l23M鳓j汐’缪罗”带w’帮影?n：；，腑～。鬻名■翻嘲謦⋯—哆I蕾■岫目嘲嘭如§1。瓣雾霍0‘秽；2》警够榭％口鬣岳i7。‘”“恻懈116KD．嘲b66．2KD锨45KD锄够35KD轧。翰。如‰滋镧眵25KD。翰一如私蒯醪’』”～％旃，；i‰。。二、。～。嚣。。。。‰。⋯⋯⋯～j警，18·4KD图2．重组VP2蛋白的SDS．PAGE分析Fig．2SDS-PAGEanaly’sisofrecombinantVP2protein1-InclusionbodiesofrecombinantVP2protein；2-Supematantofrecombinantbacteriumlysate；3··WholecelllysateofE．coliRosetta；M·-ProteinMarker2．4重组VP2蛋白的纯化由于重组蛋白以包涵体形式存在，因此利用含8M尿素的PBS溶解包涵体，然后通过镍离子柱进行纯化，Bradford法测定纯化后蛋白浓度为0．55nag／mL，经SDS．PAGE分析表明，67l①和38KD处出现的两条带均可被纯化，如图3。123M41】6KD66．2KD45KD35KD25KD18．4KD14．4KD图3．纯化后重组VP2蛋白的SDS．PAGE分析Fig．3SDS-PAGEanalysisofpurifiedrecombinantVP2protein1-WholecelliysateofE．coliRosetta；2-eluentof400mMimidazolebuffer；3-eluentof50mMimidazolebuffer：4-InclusionbodiesofrecombinantVP2protein；M—ProteinM：arker2．5Western．blot分析重组蛋白反应原性将纯化后的蛋白进行Western．blot分析，结果表明重组蛋白与CPW阳性血清发生特异性反应，且在67KD和38KD处出现两条阳性条带，而空菌对照则．52．鍪穆滋蹲-碜雾。 OD曲2第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查无此反应带(图4)，表明重组蛋白具有良好的反应原性。1之3M∥嬲獬嘞猁卿硼獭嬲?娶麓ll6KD$矿￡一，?。一一{“。-=7“。m，66．2KD毳’，÷l，：0一磊∥～》45KD}蝴。絮。臀4鲰删一，：《35KD参孑i：鼍甏。～，，删?25KD磊篁§，：，‰，‰*|÷18．4KD秀螽。；嚣藏‰矗名船‰。。蝴÷。。。＆。钆乒撕二：哦。嚣；一。。兹蠹勰出；≥貔A456MB86KD47KD34KD26KD20KD图4．重组VP2蛋白的SDS．PAGE(A)及Western—blot分析(B)Fig．4SDS-PAGEandwestern-blotanalysisofrecombinantVP2proteinl&4·-WholecelllysateofE．coliRosetta；2&6·-InclusionbodiesofrecombinantVP2protein；3&5-PurifiedrecombinantvP2protein；M—Proteinmarker2．6间接ELISA方法的建立棋盘滴定试验结果(图5)确定抗原最佳包被浓度为41xg／mL，一抗最佳稀释倍数为1：100。1684210_52．42．22．01．81．61．4OD．n1．21．00．80．60．40．20．0(B)一抗l叻倍稀释16g4210．5抗段浓度(ee／m1)抗段浓度(ug／m0图5．基于CPVVP2的间接ELISA条件优化Fig．5OptimizationofVP2·basedindirectELISA2．7杭州地区犬细小病毒血清流行病学调查用IFA试验对84份临床犬血清样品进行检测，血清稀释倍数为1：5t11。可见明显荧光，判为阳性(图6-A)：荧光不明显判为可疑(图6．B)；无荧光判为阴性(图6．C)。结果阳性血清56份，阳性率66．7％；阴性血清27份，阴性．53． 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流彳亍病学调查率32．1％；可疑血清1份。用所建立的间接ELISA方法对84份临床犬血清样品进行检测，取cutoff值为O．23，结果阳性血清54份，阳性率64．3％；阴性血清30份，阴性率35．7％。以IFA结果为标准，可知间接ELISA方法的敏感性为79．3％，特异性为76．9％。图6．犬血清样品CPV抗体的IFA检测Fig．6Detectionoftheanti-CPVantibodyinserumsamplesbyIFAA-positivesample；B-suspectsample；C—negativesample；D—blankcontrol3．讨论犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)基因组为单股负链DNA，全长5323bp。基因组互补链(C链)上有两个主要的开放阅读框(ORF)，5’端编码非结构蛋白(NSl、NS2)：3’端编码结构蛋白(VPl、VP2)【2捌。两个ORF分别有各自独立的启动子，但它们mRNA终止于共同的P01)，(A)末端，并通过不同的剪接方式形成不同的翻译模板【4】。传染性病毒粒子包含60个蛋白亚基，由50个VP2亚基和10个VPl亚基组成【5】。结构蛋ttvP2是由8组反平行的p折叠链和插入反向平行的D折叠 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查链之间4个的环组成，是病毒衣壳蛋白的主要成分和具有血凝活性的部分，并可以诱导机体产生中和抗体，决定了病毒的抗原性和宿主范围【6-8]。本研究扩增了CPV分离株HZ0761VP2基因全长，克隆入原核表达载体pET-30a构建重组表达载体pET30a-VP2。将重组质粒转化E．coliRosetta株，经IPTG诱导重组蛋白以包涵体形式表达。经SDS．PAGE分析后发现该原核表达体系出现两条明显的条带，分子量分别为67KD和38KD，与国内外报道相符[9,10】。其中67KD条带与软件预测值相符。利用Ni-NTA蛋白纯化系统对表达产物进行纯化，发现67KD和38KD处出现的两条带均可被纯化。推测可能是在表达过程中全长蛋白(67I①)降解为38KD和29KD两个片段，38KD片段因含有His．tag残基可被Ni．NTA吸附，29KD片段则被洗脱。Western．blot分析表明重组蛋白可以与CPV阳性血清发生特异性反应，且同样在67KD和38KD处出现两条阳性条带，进一步证实了上述推测。为了探明杭州地区犬群中CPV血清流行病学，共采集犬血清84份，经IFA检测阳性56份，阳性率66．7％，经ELISA检测阳性54份，阳性率64．3％。以IFA实验为标准可知ELISA方法的敏感性为79．3％，特异性为76．9％，其中假阳性6份，假阴性12份。推测假阳性的产生是由于包被蛋白中仍含有少量杂蛋白，而血清中的大肠杆菌抗体可与其结合而显色，因此可先让其与大肠杆菌裂解液作用一段时间，以中和非特异性抗体。推测假阴性的产生是由于不同的病毒株感染或机体处于不同的感染阶段导致某些线性表位的改变或线性表位抗体产生量的不同，而原核表达的VP2蛋白不具有其原始的空间结构，只能与血清中的线性表位抗体反应。犬细小病毒感染是有CPV引起的一种以出血性肠炎和非化脓性心肌炎为特征的犬的急性传染病，具有感染率高、发病急、病程短、死亡率高等特点，已经成为目前危害我国养犬业的重要疫病之一【ll】。叶俊华【12】等认为CPV血清抗体滴度能反映出犬只抵抗CPV感染的能力。早在1995年，叶俊华等应用血凝抑制试验，对我国12个省、市的1186份犬血清进行了检测，阳性率为42．00％112】。本研究通过IFA对杭州地区84份犬血清进行检测，结果阳性率66．7％，说明杭州地区犬群CPV抗体阳性率为66．7％。但由于CPV变异株的不断出现，宿主范围的不断扩大【l31，对CPV疫情的监测仍不容忽视。尽管近年来临床大 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流彳亍病学调查量采用疫苗进行免疫，但免疫失败现象还是屡有发生，一方面与毒株发生变异有关，另一方面与免疫程序不合理有关，而制定科学合理的免疫程序必须对血清抗体效价进行检测和监控。血凝抑制试验费时、敏感性低、检出率不高，给CPV的及时预防和治疗带来诸多不便。IFA实验虽然具有较高的敏感性和特异性以及直观性，但操作费时，对人员、材料(病毒及细胞)、仪器设备要求高，不适用于大量检测。因此，需要一种简便、快速、敏感、特异性强的检测方法对CPV血清抗体进行监控。本研究利用分子生物学方法获得了具有良好免疫反应性的重组VP2蛋白，初步建立了检测CPV抗体的间接ELISA方法，具有较高的敏感性和特异性，为CPV的诊断和防制奠定了基础。 第三章犬细小病毒间接ELISA诊断方法初步建立及血清流行病学调查【2】【3】【4】【5】【6】【8】【9】【10】【11】[12】[13】参考文献Waner’r．，MazarS．，NachmiasE．，eta1．EvaluationofadotELISAkitformeasuringimmunoglobulinMantibodiestocanineparvovirusanddistempervirus[J]．VeterinaryMicrobiology．2003(19)：588—591．ParrishC．R．，O’ConnellP．H．，EvermannJ．F．，鲥a／．Naturalvariationofcanineparvovirus[j]．Science．1985(230)：1046—1048．LopezdeTufisoJ．A．，CortesE．，MartinezC．，eta1．Recombinantvaccineforcanineparvovirusindogs[J]．JournalofVirology．1992(66)：2748-2753．WangD．，YuanW．，DavisI．，∥a／．Nonstructuralprotein-2andthereplicationofcanineparvovirus[J]．Virology．1998(240)：273—281．TsaoJ．，ChapmanM．S．，AgbandjeM．，eta1．Thethree-dimensionalstructureofcanineparvovirusanditsfunctionalimplications[J]．Science(NewYork,N．Y．1991(251)：1456—1464．。HurtadoA．，RuedaP．，NowickyJ．，甜aLIdentificationofdomainsincanineparvovirusVP2essentialfortheassemblyofvirus-likeparticles[J]．JournalofVirology．1996(70)：5422—5429．ParkerJ．S．，MurphyW．J．，WangD．，eta1．CanineandfelineparvovirusesCanusehumanorfelinetransferrinreceptorstobind．enter,andinfectcells[J]．JournalofVirology．2001(75)：3896-3902．NakamuraK．，SakamotoM．，IkedaY．，eta1．Pathogenicpotentialofcanineparvovirustypes2aand2cindomesticcats[J]．ClinicalandDiagnosticLaboratoryImmunology．2001(8)：663-668．李慕瑶，姜骞，刘家森等．犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立叨．中国兽医科学2007(3)：218-222．ParkJ．S．，ChoiB．K．，、匈ayachandranL．S．，eta1．ImmunodeteetionofCanineParvovirusinclinicalsamplesbypolyclonalantiseraagainstCPV-VP2proteinexpressedinEsherichiacoliasanantigen[J]．JournalofVirologicalMethods．2007(3)：118—124．蔡宝祥．家畜传染病学【M】．第四版．北京：中国农业出版社，2001．7．孙庆波．犬细小病毒感染流行病学与发病机理[J】．中国动物检疫．2003(20)：46．47．TruyenU．，GruenbergA．，ChangS．E，eta1．Evolutionofthefeline—subgroupparvovirusesandthecontrolofcaninehostrangeinvivo[J]．JournalofVirology．1995(69)：4702—4710．．57- 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究摘要：为探明杭州地区CPV的流行和变异情况，共收集病料样品58份。经PCR检测阳性5l份，占87．9％．PCR扩增阳性病料的VP2基因，PCR产物经纯化后，克隆入pMDl8-T中，进行序列测定．结果显示：51份病料样品中，CPV-2a45份，占88．2％；CPV-2b6份，占11．8％．在分型过程中发现970／971处出现突变，突变率88．2％。从系统进化树可以看出，CPV杭州株2a型与2b型各自形成明显的分支，970／971突变株在各自基因型分支内部也形成了明显的分支，说明CPV杭州株在遗传与进化上开始显露其自身的特点。利用SNAP对VP2基因进行分析发现，整个VP2基因较为保守。根据dN-dS值和extropy值可将VP2分为三个保守区和两个易变区．在四个主要的抗原表位区中，Loop3和Loop4是最易发生抗原漂移的区域，是CPV发生突变的主要区域，也是需要重点调查和监测的区域。通过与疫苗株序列的比较，我们发现野毒株与疫苗株亲源关系较远，可能与该地区CPV的流行有关。不断出现的新病毒及其潜在致病性给人类和动物不断的威胁。上世纪七十年代末，犬中出现又一种病毒，被命名为犬细小病毒(CanineParvovirus，CPV)。CPV在全世界范围迅速传播，并且引起大量犬发病死亡，死亡率高达50．100％。血清学回顾溯源试验显示，1976年收集的血清中存在有阳性样品。综合各种对CPV分子进化研究结果发现，病毒的出现至少要提前10年。目前己证实有CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、CPV-2c(a)、CPV-2c(b)5个亚型，并通过不断的抗原漂移产生新的突变株。CPV．2中和抗原位点位于VP2上，VP2上几个关键碱基和氨基酸的改变就会改变抗原特征和宿主范围。为探明杭州地区CPV的流行和变异情况，共收集病料样品58份。经PCR检测阳性51份，占87．9％。PCR扩增阳性病料的VP2基因，PCR产物经纯化后，克隆入pMDl8一T中，进行序列测定。结果显示：5l份病料样品中，CPV．2a45份，占88．2％；CPV．2b6份，占11．8％。在分型过程中发现970／971处出现突变，突变率88．2％。从系统进化树可以看出，CPV杭州株2a型与2b型各自形成明显的分支，970／971突变株在各自基因型分支内部也形成了明显的分支，说明CPV杭州株在遗传与进化上开始显露其自身的特点。利用SNAP对VP2基因进行分析发现，整个VP2基因较为保守。根据dN-dS值 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究和extropy值可将VP2分为三个保守区和两个易变区。在四个主要的抗原表位区中，Loop3和Loop4是最易发生抗原漂移的区域，是新突变株发生突变的主要区域，也是需要重点调查和监测的区域。通过与疫苗株序列的比较，我们发现野毒株与疫苗株亲源关系较远，可能与该地区CPV的流行有关。1．材料与方法1．1材料1．1．1病料与疫苗委托杭州地区7家宠物医院采集疑似病犬粪便或肛拭子样品，作为本研究所用病料。犬瘟热、犬细小病毒二联活疫苗购自荷兰英特威公司；犬瘟热、犬细小病毒、狂犬病、副流感，犬腺病毒五联活疫苗购自解放军军需大学兽药研究中心。1．1．2载体和菌种pMDl8一T载体购自TaKaRa公司，E．coliDH5a感受态细胞由本实验室保存。1．1．3主要试剂UNIQ．10柱式病毒DNA小量抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；胶回收纯化试剂盒购自Axygene公司；TaqplusDNA聚合酶购自北京鼎国生物科技有限公司；SuperTaqDNA聚合酶、dNTPs购自上海申能博彩生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。1．2方法1．2．1引物设计与合成同第二章1．2．7．1。1．2．2病料的PCR检测同第二章1．2．。1．2．3PCR扩增阳性病料的VP2基因按上海申能博彩公司提供的SuperTaqDNA聚合酶说系：模板39L，10×PCRbuffer39L，10mMdNTPs0．6pL， 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究Taq0．69L，加ddH20至309L。反应条件：94。C预变性3min，94。C变性30s，50℃退火30s，68℃延伸90s，25个循环后68℃延伸10min。1．2．4PCR产物的克隆1．2．4．1PCR产物的纯化采用胶回收纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，方法同第二章1．2．7．4。1．2．4．2连接反应纯化的PCR产物用连接试剂盒连接，连接体系为：PCR产物4．5此，plMDl8-T0．5此，Ligationsolution5止，混匀后16。C连接过夜。1．2．4．3转化参照第三章1．2．5．5中方法将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。37℃培养过夜，待菌落出现后，随机挑取多个单菌落于5mL含有氨苄的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。1．2．4．4重组菌的PCR鉴定以菌液为模板，按第二章1．2．1．3中体系进行PCR反应。1．2．5重组质粒的测序将PCR阳性的重组菌送往英骏公司进行序列测定。1．2．6CPV弱毒苗VP2基因的扩增与测序参照上述方法分别扩增CPV二联苗和五联苗的VP2基因，克隆入pMDl8．T后进行序列测定，测序由英骏公司完成。1．2．7序列分析通过DNAStar、MEGA3．1对测序结果进行分析。2．结果2．1病料的PCR检测共收集病料58份，PCR检测阳性5l份，阳性率87．9％。 第四章基于VP2基因的杭卅I地区犬细小病毒分子流行病学研究2．2阳性病料VP2基因的扩增和测序应用VP2．F、VP2．R扩增阳性病料的VP2基因，克隆入pMDl8．T后进行序列测定，并参照分型标准对其进行初步分析(表1)。结果CPV-2a45份，占88．2％；CPv-2b6份，占11．8％。在分型过程中还发现与各型参考毒株(M38245、AB054217、AB054221、AF401519、AB054222、AB054224)以及疫苗株相比本研究所测序列在核苷酸位点970／971处连续出现两处突变(970T一刖971A—T)，且突变率极高占88．2％。表1．CPV阳性病料统计及分型Table1StatisticsandgenetypeofCPVpositivesamplesIsolateYearGene970／971Isolate采集时间GTyepn：m97uotati／97。1nTypemutationHZ076l2007-32aYesCPV．ZDl42007．112aYesCPV．APD2007—72aYesCPV．ZDl52007．1l2aYesCPV．BDl2007-72bNoCPV．ZDl62007．112aYesCPV．JB12007．72aYeSCPV．ZDl72007．112aYesCPV．HT2007．72aNoCPV．ZDl82007．112aYesCPV．ZDl2007—72bYesCPV．ZDl92007．1l2aYesCPV．．BD22007--82aYesCPV．ZD202007．112aYesCPV．．BD32007--82aYesCPV．ZD2l2007．112aYesCPV．．BD42007．．82aYesCPV-ZD222007一l12aYesCPV—KTl2007—82aYeSCPV．ZD232007—112aYesCPV．KT22007．82aYesCPV．ZD242007．112aYesCPV-．ZD22007--82aYesCPV．ZD252007-112aYesCPV．ZD32007—82aYesCPV．ZD262007．112aYesCPV．ZD42007—92aYesCPV．ZD272007．1l2aYesCPV．ZD52007．92aYesCPV．ZD282007．112aYesCPV．ZD62007—92bNoCPV—ZD292007．122aYesCPV．ZD72007．92aYesCPV．ZD302007．122aNoCPV．ZD82007．92aYesCPV．ZD3I2007—122aYeSCPV．ZD92007．．92aYesCPV．ZD322007．122aYeSCPV．JB22007．92aYesCPV．ZD332007—122aYesCPV．JB32007．92bYesCPV．ZD342007—122aYeSCPV．KT32007—102aYesCPV．ZD352007—122bYesCPV．ZDl02007．102aYesCPV．ZD362007．122aNoCPV．ZDll2007．102aYesCPV．ZD372007．122a-yesCPV-ZDl22007-l12aYesCPV．ZD382007．122aYesCPV．ZDl32007—112bNo．61． 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究2．3CPV弱毒苗VP2基因的扩增和测序应用VP2一F、VP2．R分别扩增CPV二联苗毒株(CPV-2V)和CPV五联苗毒株(CPV-5V)的VP2基因，克隆入pMDl8一T后进行序列测定，并参照各型参考株序列对其进行比较分析(图1、表2)。结果显示CPV-2V为CPV-2型，而CPV-5V为FPLV，与参考野毒株同源性较低，并形成较明显的分支。一方面说明病料中的CPV不是来源与疫苗接种后的排毒，而是野毒感染；另一方面提示我们应该采用CPV-2a型疫苗来提高其针对性和对免疫犬的保护力。卜———————一0．002图1．CPVVP2基因的系统进化分析Fig．1PhylogenetieanalysisofCPVVP2genes2．4杭州地区cPvVP2基因的遗传进化分析b)选择杭州地区具有代表性的19株CPV野毒株和2株疫苗株与25株各地区代表毒株(表3)进行氨基酸序列比对(图2)，建立系统进化树(图3)。从序列比对结果可以看出：CPV-2a杭州株均含有CPV-2a关键分型位点(Asn．426)，并具有CPV东亚株特有的位点(297．Ala)【l】，不具有先前报道的CPV-2a关键分型位点(Ile．555)【2】，而是与CPV-2和CPV-2b～样第555位为Val。 >●J●蕾●*Q·净·'·Z●量4[-*’}·蕾·《蕾誊*··,Ire·4[-Q幽'Q∞·《·鲁··,11-·Cy譬·*·蕾·*QZ·Z·《■·量··,111．·，·H·*·-Z·Q鲁*·善·*净Q口量Q·鲁量*o《《·《·Q《·∞·∽鲁誊'·*H量·*《·*·It．*bH一·H·*··,K-Z·g·鲁一至·苫·*·*配·蟹··41"·-|}*卜··《·《鲁·*●41,41,●■．n∞．暑皇Id置>(IU．IoJ∞篁。罾∞o【Ioul暑嚣pIo《q．>rI‘I．!I基o|J>‘lUl，uIl∞ln吐墨I’∞Ip∞皇。兰∞o盘。盘一暑矗pIu《_一D-oN．>山U念vuN．>山uoN．>山UDq>山U时N．>厶UN。>厶U对N．>乱U>J厶kN．>山U*noN>．>厶U，I。△n一>．>厶U一．昏n℃。>乱U．寸oN>．>山U一寸n一>c1．>厶U．10卜oNZ>n。>厶U>N．>厶U扫IJo百_三ocI扫ocQoN∞n℃””。寸寸N∞心寸一一寸均∞n价卜n卜寸n甘Nn—nNn”。nN。。n卜岔一岔一Nn。'【一。．【n岔卜∞。∞一N蚧口一u时oc—Ir篁日hoco；_∞ofI∞c一暑荡。口。∞N厶>。口-口一叻弓一。矗。篁一—篁矗-o∞。_昌=_∞o暑∞协=o基h盎。置h∞。口。篁∞II—N∞一oB工程醐酶g辎刚双匿特刊《廿函醐NdA式妖专孙爆妊媛-上求毒}倏、『，蠹求盥晕丢撂g匪蓊}N厶>=}鞴秘哥垛 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究从系统进化树可以看出：1l株具有970／971突变的CPV-2a杭州株与北京株(B．2004、BJ004．07、BJ005．07)亲源关系较近，2株不具有970／971突变的CPV-2a杭州株与韩国株(DH426)、德国株(cPV-U6)、印度株(CPV-15)以及台湾株(LCPV-T1)亲源关系较近；在不具有970／971突变的CPV-2b杭州株中，CPV-BDl和CPV．ZD6与河南株(HN一3)亲源关系较近，而CPV-ZDl3与德国株(CPV-447)、韩国株(DH326)亲源关系较近，而3株具有970／971突变的CPV-2b杭州株(CPV-ZDl，CPVoJB3，CPV-ZD35)则在CPv-2b中国株分支内部形成独立的分支；CPV杭州株与CPV中国株和亚洲株的亲缘关系较近，在遗传进化上呈现明显的地域性，970／971突变株在各自基因型分支内部也形成了明显的分支，CPV杭州株在遗传与进化上开始显露其自身的特点。2．5CPVVP2基因的变异分析为了进一步研究CPVVP2基因的变异情况，通过SNAP(Synonymous／Non．synonymousAnalysisProgram)对19株CPV杭州株、2株疫苗株和25株各地区代表毒株的VP2氨基酸序列进行深入分析(表4、图4)。从表4可以看出，整个VP2基因比较保守，发生同义置换和非同义置换氨基酸的比例(Syn／nonsyn)为1．228。在2L21peptide、Loopl、Loop3、Loop4四个主要的抗原表位区中，2L21peptide最为保守，Syn／nonsyn为3．300；Loopl最易突变，以同义突变为主；Loop3、Loop4较易突变，且非同义突变远高于同义突变。在VRl和VR2两个易变区中，VRl同义与非同义突变相当，但与以同义突变为主；VR．2非同义突变远高于同义突变。从图4可以看出，在四个主要抗原表位区中除Loop4外，其余亲水性均较好。根据dN-dS值和extropy值可以将VP2基因分为两个易变区(VRl、VR2)和三个保守区(CRl、CR2、CR3)。可以看出，四个主要抗原表位区中除2L21peptide外，其余均位于易变区内，说明VP2的变异集中发生在抗原表位区。dN-dS值和extropy值最高的三个位点300、324、426均位于抗原表位区内，其中300、426位是分型的关键位点，也是最易突变的位点【31，324位突变普遍存在于CPV杭州株并由970、971位核苷酸突变导致，可能对VP2的抗原性具有重要影响。另外，dN-dS值和extropy值较高21、139、267位同样位于抗原表位区内，虽然突变率不是很高，但仍然不能忽视其突变可能带来的抗原性改变。 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究表3．本研究中用于遗传进化分析的CPV毒株Table3CPVstrainsusedforphylogeneticanalysisinthisstudyStrainsYearOriginoenetype蚤兰黧n。宝慧然。CPV．2V?VaccinestrainCPV一2NoCPV．5V?VaccinestrainFPLVNOHZ07612007HangzhouChinaCPV一2aYesEU213073CPV-APD2007HangzhouChinaCPV·2aYesEU213074CPV．HT2007HangzhouChinaCPV一2aNoEU213077CPV．BDl2007HangzhouChinaCPV-2bNoEU213075CPV．BD22007HangzhouChinaCPV·2aYesEU213079CPV．BD42007HangzhouChinaCPV-2aYeSEU213081CPV．JBl2007HangzhouChinaCPV一2aYesEU213076CPV．JB22007HangzhouChinaCPV·2aYesEU483509CPV．JB32007HangzhouChinaCPV-2bYeSEU483510CPV．KTl2007HangzhouChinaCPV-2aYesEU213082CPV．KT22007HangzhouChinaCPV-2aYesEU213083CPV．ZDl2007HangzhouChinaCPV-2bYesEU213078CPV．ZD42007HangzhouChinaCPV-2aYesEU483511CPV．ZD62007HangzhouChinaCPV．2bNoEU483512CPV．ZD72007HangzhouChinaCPV·2aYesEU483513CPV．ZD112007HangzhouChinaCPV一2aYesEU4835l4CPV．ZD132007HangzhouChinaCPV一2bNoEU483515CPV．ZD302007HangzhouChinaCPV一2aNoEU483516CPV．ZD352007HangzhouChinaCPV-2bYesEU483517CPV．152004IndiaCPV-2aNoDQ182620CPV．242005IndiaCPV·2aNoDQI82624CPV．b1978USACPV-2NoM38245CPV．1931991USACPV-2bNoAY742932CPV-4362003USACPV．2bNoAY742955CPV—U61995GermanyCPV一2aNoAY742935CPV．4471995GermanyCPV-2bNoAY742934CPV．U51997GermanyCPV·2cNoAY742942FPV．3141993JapanCPV一2aNoD7858597．0082003JapanCPV-2bNoAB15504CPV．56002000ItalyCPV一2cNoAY380577CPV．6952001ItalyCPV一2cNoAF401519LCPV．V1391997VietnamCPV．2c(a)NoAB054222LCPV．V2031997VietnamCPV．2c(b)NoAB054224V1541997VietnamCPV．2aNoAB054217DH3262005KoeraCPV．2bNoEF599097DH4262005KoeraCPV．2aNoEF599096Pome2005KoeraCPV．2c(a)NoEF599098LCPV-T1l998TaiwanCPV．2aNoAB054214Taichung2004TaiwanCPV．2bNoAY869724HN．32005HenanChinaCPV．2bNoDQI77497CPv．GN2005NanjingChinaCPV．2bNoDQ120515B．20042004BeijingChinaCPv．2aYesEF011664BJ004．072007BeijingChinaCPV．2aYesEF666059BJ005．072007BeijingChinaCPV．2aYesEF666060．65- 一o)／一邑．峙口。妖富扑曝姑煺卜焱种爆÷恳求凶舞袤蟋g区诮芷>=}墒亲=flfl摄 ●-囊·，·墨-·I'●●t,4●》·A1‘IkN．A‘IU》吣》No口N》^o一／(矗一uN-A．Iu●。协n一》》山u山，》山u●》AurIu暑O山●》山udoo岫竹uN-A厶U：∞一竹》～饥盎心J≯厶U》山u离心●》山u西●h—X§工uqq一岣Nn笛口廿oo●产铆卜寸寸岣竹寸nn—rn．r口N畸口N—日∞n粤竹一日Nf、山u》山u>Au》Au》山u》Au》山u一日N●f、囟u卜o●竹oo々曲卜o●寸oorI目寸oo～●曲一一日N。>山u卜自N●》Au寸口N●>Au¨岛●≯AU—eH●≯山UN曲r、●》Au．r曲—rI●>山u寸口岫●》山u～岛帕●jAUa^H吒●》Au一心PoN墨一一●≯山ud心H寸莓日寸竹一》寸一o●》^LI吣j●》Auo竹口N，》山u卜∞．妖宣扑曝妲嫱-上求储倏＼f／嚣长凶鲁衰蟮墨盟稍N山>*辋料要投 。∞口．n盘oorI妖器扑倏妲薅m隶精惧÷口f；长凶舞票蟋S区粥型>*醐糌臣垛 ^口一，(嚣小心．妖富扑堠姑臻．土隶黼惯÷最装凶鬟袤蟮g函鹕N山>*鞴牡卺妹 4PO5005,1．0520530540$SO560570580I赢面面而u__cPlruLnI剩唧LT盯珊l。^5删3R[1w珊m醒I吼v腿aⅪ啪I】}盯姗Io∞IIm矾瑚i瑚s珂IG咄tI隗x30L^PJ眦虿,,,cpv一15⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯CPV一24⋯⋯⋯’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．CPU一耵⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯---⋯⋯⋯⋯．．⋯．．．．．．CPV一=D00⋯‘⋯+‘⋯’‘⋯⋯‘⋯⋯⋯。‘⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯·‘⋯⋯⋯⋯-⋯⋯···⋯⋯⋯．．⋯．．⋯．．⋯CPV—U6⋯⋯⋯⋯⋯’⋯⋯⋯’⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-．．⋯．．．⋯⋯⋯．⋯．．⋯rPU一31哇⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。。‘。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．．．⋯⋯．．⋯．U154⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯⋯‘。⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯．．．．DH426⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘⋯‘⋯-⋯⋯⋯⋯··⋯··⋯·⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯．．．．．LCPV-T1⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯⋯．KZ0'6】-⋯⋯⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯．．．．CPU一^PD⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．．．．CPV—BD2⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’。⋯‘‘‘⋯⋯⋯‘‘⋯’‘⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯·⋯⋯⋯-·-⋯--⋯．⋯．．．．．．CPU～BD4⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-⋯⋯⋯⋯·)⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．⋯CPV一∞】．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯·--⋯⋯---⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．．CPV—JB2⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-⋯⋯⋯．L．⋯⋯-⋯．⋯．⋯⋯．⋯CpV—XT工⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯··-⋯··--L·⋯⋯．-．．⋯⋯．．⋯．．．．CPV—lcr2⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．．．．CPV一2D4⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-·⋯--⋯．．⋯⋯．．CPV—ZDl⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯·⋯．⋯．．．．⋯．．．．CPV—ZDll⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·-⋯⋯⋯．·⋯．．⋯．．．．．．．．．．．B一200哇⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯．．-⋯．．⋯．．．．．oJ004—0'⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯．oJ005—0'⋯。。⋯⋯⋯。。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯CPV—ZD工⋯⋯⋯。‘⋯’⋯。。⋯⋯⋯‘。。⋯⋯。。⋯⋯‘‘⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯--⋯⋯⋯⋯．CPU—ZD05⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯-⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯--⋯⋯⋯．．．．CPV—JB3⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯··⋯⋯⋯··⋯--·⋯⋯．．⋯⋯．．．．CPV—BDl⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．CPV—ZD6⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-⋯⋯⋯．．⋯．．．．．．．⋯CPU—ZDl3⋯⋯⋯⋯⋯’⋯’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯CPU一1拿3⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯．．CpV一436⋯⋯⋯⋯‘‘。⋯⋯⋯‘。⋯⋯⋯⋯’。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．Cpt，一哇哇’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。。⋯⋯⋯⋯。。⋯⋯‘。⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯．g’一008⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯-⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．DH026⋯⋯“⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯--⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．T4iChⅡ,"Lg⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·-·⋯·⋯·⋯⋯··⋯⋯⋯··⋯⋯⋯．⋯砌一0⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’⋯‘⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯-·⋯⋯·-··⋯·⋯·⋯⋯-．．⋯．-⋯．．⋯．．⋯CPV一筒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-⋯⋯⋯-⋯⋯-⋯---．⋯．．⋯．．⋯．CpU—U51⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．⋯．．⋯．．⋯．CPV一6P-5⋯⋯⋯’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯CPU一5600CPV二2aCPV一2bCPv-2c⋯‘。⋯⋯⋯。⋯⋯⋯。⋯’⋯⋯。。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯-⋯·⋯--⋯．·⋯LCpU—V139’‘’’‘。‘‘⋯’‘‘‘。‘。’’’‘‘。‘‘‘‘‘。。。。。。‘‘‘。⋯。。‘’。‘‘⋯‘‘。。。’⋯⋯。。⋯。’‘⋯⋯‘。。。。’。。·‘‘‘‘‘······-·----t'omeCPV-2c(a)／(b)⋯⋯⋯‘⋯。。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯’⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．．-LCpV—V203⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯---⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯CPV—b一⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘。⋯⋯‘⋯⋯·-·⋯⋯·⋯·⋯⋯⋯-⋯⋯⋯．一⋯⋯．⋯．．．⋯．．⋯．．．．．CPV-2vCPV二2⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯‘⋯⋯⋯。‘⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。’?⋯。’L⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯cp耵一5t，FPLV图2．杭州地区CPVVP2基因的序列比对Fig．2AlignmentofdeducedVP2aminoacidsequencesoffieldisolatesandvaccinestrainsinthisstudyandothersequencesobtainedfromGenBankdatabase．Sequencesareclusteredaccordingtogenetypeandisolateswith970／971mutations(indicatedbytriangle)areclusteredbydashline．DotsindicatetheSalTleaminoacidasCPV一15strain．1ettersindicateaminoaciddeviations．Thereportedputativeepitopesareindicatedinpane．TherhombusabovethesequencesindicateaminoacidpositionsdistinguishedCPVfromFPLV．AminoacidsindicatedbyasteriskarekeypositionsforCPVtyping．70 52798363191632L—Taichung(2b)IDm26(2b)I▲CPV-ZDl3(2b)lCPV-447(2b)lCPV-436(2b)ICPV-193(2b)197．008(2b)50r—一▲CPV-BDl(2b)岬AcPv-zx'6(2b)1126鬟5㈣∞I'971utationsC'PV-JB3970／971mutationsCPV-ZDlJI▲(2b)■习▲(2b)CPV-695(2c)36I-·—---一55599广一71517CPV-5600(2c)一CPV-U51(2c)BJ005-07(2a)一▲CPV-ZD4(2a)(ZDl5120／27132／37)▲CPV-ZD7(2a)(ZD9／10／19／31)CPV-24(2a)▲CPV-JBI(2a)(ZD5／14／29／34／38)一▲HZ0761(2a)(ZD3／16)B-2004(2a)▲CPV-BD2(2螂▲CPV-JB2(2a)(ZD21／25／26／33)▲CPV-ZDl1(Za)(KT3／ZDS／12／23)一▲CPV-APD(2a)(ZD2／22)一▲CPV．BD4(2a)(ZDl7／24／28)一BJ0044)7(2曲▲CPV-KI'I(2a)]▲CPV-KT2(2叠)CP、，．15(2a)▲CPV-HT(2a)(zDls)CPV-U6(2a)▲CPV-ZD30(2a)(ZD36)DH426(2a)LCPV-TI(2鱼)一FPV．314f2a)-_．——一V154(2a)一LCPV-V203【2c(b))rUCPV-V139(2c(a”59CPV-b(2)CPV-2V(2)Pome(2c(a))CPV-5V07PLV)0．002图3．杭州地区CPVVP2基因的遗传进化分析F洲ig．n3。ClusteranalysiSoftheVP2am黜acidsequencesoufenthceesfie—ld．isola．tfres。aradGevnaBccainnkeinthisstudy(indicatedbytriangleandotherseqobtameomstrains)uences11ou引IDⅢl^．7l- 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究表4．Vt'2氨基酸序列的遗传差异Table4GeneticdiversityofVP2inencodedaminoacidsequencesRegionofVP2aaposotionNo．conserved砚％c011served砚兰翌全!竺!!兰坐墨!旦塑Q翌!Z翌§Y坠!翌Q翌!Z翌VP2l一58454593．35．274．291．2282L21peptideLooplLoop3Loop4VRlVR2181323124715585．776．582．180．O87．O89．10．660．203．3000．540．331．6360．041．520．0260．040．740．0540．740．571．2980．92．910．3063．讨论CPV在全世界广泛流行，可以说凡是有犬的地方就会存在CPV的流行。在欧洲，CPV的流行情况比较复杂，并且在CPV-2a和CPV-2b流行的基础之上出现了新的突变株CPV-2c(Glu-426)。该型的出现最早可以追溯到1996年的德国，之后在2000年首次被报道流行于意大利，随着犬只的进出口而广泛流行于意大利、葡萄牙、德国等国家【41。在乌拉圭CPV-2c已成为主要的基因型【5】。在美国，CPV-2c不仅与CPv-2b一样广泛流行，而且还在第494、572位氨基酸处产生了新的突变16J。在亚洲，CPV的流行情况则相对简单，以CPV-2a为主，CPV_2b则较少，但在此基础之上也出现了新的突变株CPV-2c(a)和CPV-2e(b)。两者最早出现于越南17届J，随后出现于印度【9】和日本‘101，但只是在豹猫和猫体内被分离到，直至lJKang[111等在朝鲜犬群中分离到一株CPV-2c(a)，才证实了其在犬群中的流行。Kang等认为CPV-2c(a)和CPV-2c(b)的名称不准确，容易与CPV-2c(Glu．426)混淆，应分别命名为CPV-2a和CPV-2b的突变体(300Gly—Asp)。CPV-2c(a)的出现和宿主范围的变化过程也从一个侧面提示了CPV的起源和进化的过程。4O324O4O34彩¨盯掘¨社●82482 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究：a)I●．●I●·-●-．2L21pep'tide；Lood3j{Jt．-Ll●ll—L●I咿一峨删协(b)j{101j20工371i401{50l584．乍R1。i、1己l吼：CR31．：r：J：LIll川l7l_⋯l。1CR2ⅢIllIlIl__lIlfIll-●●●’+斗⋯’。r。’’+●●●●¨●I●I●●●●●●●●·肆。．呙。．·o+喜；i。蠹’．_·：·n●!·I●’：·：●：!·dN-dS：●I●一：●：lIntro■(Hx)y驴梆e—r”，””％”，：r警r未碱吼§●如霹，绛#箍鹈二。：●cD＼＼√＼。Position87101139267297300305324375426440Entropy0．24O．240．300．460．18O．480．300．66O．18O．850．18山讧dSO．09．0．340．16O．24O．090．240．16O．950．09O．610．09CPV二2MIVFE／sADYNTCPV-2aLTV，I墨腿EGYY，IDNT／ACPV．2bLTVY心几EGYY，ID1f人CPV-2c(a)LTVFEDYDNT／ACPV二2c(b)LTVFEDYDTCPV-2cLTVFEGY／DYDET图4．CPVVP2基因的变异分析Fig．4DepictionofgeneficdiversityofCPVVP2(a)HydrophilicityprofileofthereferenceHZ0761shownwiththehorizontalaxisrepresentingaminoacidresiduenumbersandtheverticalaxis，theaveragehydrophilicityscores．Thearrowsmarkthefourantigenicdomainsidentified．(b)Differencebetweennon．synonymousandsynonymousrates(dN-dS)andaminoacidentropyratesplot．Thetwoputativevariableregionsandthreeconservedregionsidentifiedaremarkedbyarrows．(c)ThevariableaminoacidpositionsandentropyratesandthedN-dSofthevariableregionsareindicated．-73 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究本研究说明CPV存在并流行于杭州地区犬群中，CPV-2a与CPV-2b并存，其中CPV-2a占优势地位。本研究中所有CPV-2a型病毒均含有CPV-2a特异性分型位点(Asn．426)和CPV东亚株特有位点(Ala-297)。然而，并不具有先前报道的CPV-2a关键分型位点(Ile．555)12]，而是与CPV-2和CPV-2b一样第555位为Val。在许多国家均出现了这样的CPV-2a株【12,13】，一些学者建议将其命名为“新CPV-2a’’1121或“CPV-2a过度型’’【l】’一些学者则利用该位点(Ile．555)建立了CPV型特异性PCR方法用来区分CPV-2a和CPV-2b[141。这样，随着“新CPV-2a"的出现就造成了分型的错误，进而形成了CPV-2b占优势地位的错误结论【l51。与各型参考株以及疫苗株相比本研究所测序列在核苷酸位点970／971处连续出现两处突变(970T一～97lA—T)，且突变率极高占88．2％，其中45株CPV-2a中有42株发生该突变，6株CPV-2b中有3株发生该突变，同样的突变还出现在北京株(B．2004、BJ004．07、BJ005．07)中，但在CPV-2b中发现该处突变尚属首次。该突变位于VP2抗原表位区Loop3中，与区分CPV与FPLV的323位点相邻，可能对CPV的抗原性和宿主范围具有重要影响【16】。从系统进化树可以看出，CPV杭州株与CPV中国株和亚洲株的亲缘关系较近，在遗传进化上呈现明显的地域性，其中2a型与北京株(B．2004、BJ004．07、BJ005．07)亲源关系较近，2b型与河南株(HN．3)亲源关系较近，且都形成明显的分支，970／971突变株在各自基因型分支内部也形成了明显的分支，说明CPV杭州株在遗传与进化上开始显露其自身的特点。利用SNAP对VP2基因进行分析发现，整个VP2基因较为保守。根据dN-dS值和extropy值可将VP2分为三个保守区和两个易变区。在VRl和VR2两个易变区中，VRl与以同义突变为主；VR2非同义突变远高于同义突变。在2L21peptide、Loopl、Loop3、Loop4四个主要的抗原表位区中，2L21peptide最为保守，位于CRl内；Loopl最易突变，以同义突变为主，位于VRl内；Loop3较为保守，非同义突变远远高于同义突变，位于VR2内；Loop4较易突变，且非同义突变远高于同义突变，位于VR2内。CPV通过抗原漂移不断产生新的突变[171，在四个主要的抗原表位区中，Loop3和Loop4位于易变区内，是最易发生抗原漂移的区域，是新突变株发生突变的主要区域，也是需要重点调查和监测的区域。2L21peptide最为保守，含有一个B细胞抗原表位，具有良好的免疫原性【191，因此，可以作为基因工程疫苗的候选基因。．74． 第四章基于VP2基因的杭州地区犬细小病毒分子流行病学研究在调查过程中得知在2007年3．5月间杭州地区犬群中出现了CPV的流行，表现为临床病例明显增多，发病率升高。其原因可能是因为毒株变异导致疫苗保护力下降。通过对疫苗株的VP2基因进行扩增和测序发现常用的两种疫苗毒株分别为CPV-2型和FPLV，而杭州地区已不存在CPV-2，FPLV的免疫效果也远不如CPV[18】。在野毒株变异之前尚能保护免疫动物，而随者野毒株的变异，其保护力就显得不足了。因此，建议使用CPV-2a型弱毒苗。 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攻读硕士期间的科研成果魏巍，李肖梁，帅江冰，陈宁，刘刚，方维焕．犬细小病毒HZ0761株的分离与鉴定．畜牧与兽医，2008，已录用。JiangbingShuai，WeiWei，LingliJiang，XiaoliangLi，NingChen，ZhanfengZhang，XueyanChen，WeihuanFang．CharacterizationandpotentialuseoftruncatedPCV2capsidproteinanditspolyclonalantibodyfordiagnosisofPCV2infections．Viresgenes，2007，35：619-627．JiangbingShuai，WeiWei，LingliJiang，XiaoliangLi，NingChen，WeihlaanFang．Mappingofthenuclearlocalizationsignalsofporcinecircovirustype1ORF2protein．ActaBiochimicaetBiophysicaSinica,2008，40(1)：71—77．．79．LZ王 致谢论文脱稿之际，我思绪万千，心情久久不能平静，转眼间已经在美丽的华家池畔度过了两个春秋。虽然时间短暂，但收获巨大。首先，我要特别感谢我的导师方维焕教授，本论文是在方老师的悉心指导下完成的，无论是论文选题、实验设计及论文撰写，无不浸透着导师辛勤的劳动。导师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，虽历时二载，却给以终生受益无穷之道。对方老师的感激之情是无法用言语表达的。衷心感谢动物预防医学研究所所有老师对我的关心和指导，他们是：于涟教授、周继勇教授、杜爱芳教授、马有智副教授、余旭平副教授，特别是鲍英老师，她在学习、科研、生活上给予的帮助、支持和关心。同时还要特别感谢李肖梁老师、浙江畜牧兽医总站、杭州市城市执法大队、浙江大学动物医院等7家动物医院为本实验的完成提供了巨大的帮助。毕业之际，特别感谢实验室所有共过事的师兄师姐、师弟师妹们!感谢他们对我的帮助和支持。他们是博士后江玲丽老师、吴蓓蓓老师、陈雪燕老师，博士生帅江冰、陈宁、陈健舜、赵焕灿、余盈，硕士生田国明、徐程、张战峰、应薇芳、潘自降、刘刚、扈红霞、陈阳、王淑娜、骆笑凯、朱炳林、金培婕和几位在实验室实习的本科生。此外还要感谢本实验室郑春霞和储讯政两位女士的辛勤劳动和支持。感谢我的室友丰强、李广立，他们陪我度过了两年的美好时光，给予了我大量无私的帮助以及生活上的照顾和关怀，感激之情永铭心底。感谢父母一直以来默默的关心和支持，他们为我解决了后顾之忧，永远是我生活上和事业上不断进取的精神支柱。再一次衷心感谢所有关心和帮助我的老师、同学和亲朋好友!魏巍于华池畔2008年5月◆!I八
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