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：密级：．ｍＩａ＃ＨＵＡＺＨＯＮＧＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ‘博士学位论文ＰｈＤＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究ＥＰＩＤＥＭＩＯＬＯＧＹＲＥＳＥＡＲＣＨＯＦＨＥＰＡＴＩＴＩＳＥＡＭＯＮＧＰＥＯＰＬＥＡＮＤＡＮＩＭＡＬＳＩＮＳＯＵＴＨＥＲＮＡＲＥＡＯＦＸＩＮＪＩＡＮＧ研究生元ＣＡＮＤＪＵＮＹＵＡＮＩＤＡＴＥ：ＷＵ：＆２０１３３０２０１００３９ＵＤＥＩＴＮＯ．：预防兽医学专业：ＭＡＪＯＲ：ＰＲＥＶＥＮＴＩＶＥＶＥＴＥＲＩＮＡＲＹＭＥＤＩＣＩＮＥ金梅林教授导师：ＳＵＰＥＲＶＩＳＯＲ：ＰＲＯＦＥＳＳＯＲＪＩＮＭＥＩＬＩＮ中国武汉ＷＵＨＡＮＣＨＩＮＡ，二○一七年十二月一号 华中农业大学博士学位论文新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究EPIDEMIOLOGYRESEARCHOFHEPATITISEAMONGPEOPLEANDANIMALSINSOUTHERNAREAOFXINJIANG博士研究生:武军元学号:2013302010039指导教师:金梅林教授指导小组:陈焕春院士吴斌教授周锐教授钱平教授周红波教授张安定教授专业：预防兽医学研究方向：动物病原分子生物学获得学位名称：农学博士获得学位时间：2017年12月华中农业大学动物医学院二○一七年十二月 本研究由国家自然科学基金项目（31160513）资助 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究目录摘要....................................................................................................................................iAbstract...............................................................................................................................iv缩略词表...........................................................................................................................vii第1章文献综述...............................................................................................................11.1前言..............................................................................................................................11.2戊型肝炎流行病学研究进展......................................................................................21.2.1戊型肝炎病毒的病原学...........................................................................................21.2.2戊型肝炎病毒的分子生物学...................................................................................31.2.3不同物种戊型肝炎病毒的研究史..........................................................................181.2.4HE的流行病学........................................................................................................231.2.5HE的临床症状及免疫损伤....................................................................................281.2.6HE的检测方法........................................................................................................291.2.7HE的疫苗研究........................................................................................................301.2.8HE的预防与控制....................................................................................................321.3问题与展望................................................................................................................32本研究目的和意义...........................................................................................................33第2章新疆南疆地区不同人群戊型肝炎病毒抗体和抗原检测...............................342.1前言............................................................................................................................342.2材料与方法................................................................................................................342.2.1样品来源.................................................................................................................342.2.2主要试剂.................................................................................................................352.2.3主要仪器.................................................................................................................352.2.4HEV-IgG抗体检测..................................................................................................352.2.5HEV-IgM抗体检测.................................................................................................362.2.6HEV-Ag检测...........................................................................................................372.2.7统计学分析.............................................................................................................382.3结果与分析................................................................................................................382.3.1不同年龄人群HEV-IgG检测结果........................................................................38I 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文2.3.2不同地域人群HEV-IgG检测结果........................................................................382.3.3不同族别人群HEV-IgG检测结果........................................................................392.3.4不同职业人群HEV-IgG检测结果........................................................................392.3.5不同年龄人群HEV-IgM检测结果........................................................................402.3.6不同地域人群HEV-IgM检测结果........................................................................412.3.7不同族别人群HEV-IgM检测结果........................................................................412.3.8不同职业人群HEV-IgM检测结果........................................................................422.3.9不同年龄人群HEV-Ag检测结果..........................................................................422.3.10不同地域人群HEV-Ag检测结果........................................................................432.3.11不同族别人群HEV-Ag检测结果........................................................................432.3.12不同职业人群HEV-Ag检测结果........................................................................442.4讨论.............................................................................................................................44第3章新疆南疆地区主要经济动物戊型肝炎病毒抗体和抗原检测..........................483.1前言.............................................................................................................................483.2材料与方法.................................................................................................................483.2.1样品来源..................................................................................................................483.2.2主要试剂..................................................................................................................493.2.3主要仪器..................................................................................................................493.2.4HEV-Ab抗体检测....................................................................................................493.2.5HEV-Ag检测............................................................................................................503.2.6统计学分析..............................................................................................................503.3结果与分析.................................................................................................................503.3.1猪戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果............................................................503.3.2牛戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果............................................................513.3.3马鹿戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果.........................................................523.3.4鸡戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果............................................................533.3.5犬戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果............................................................543.3.6绵羊戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果........................................................553.4讨论.............................................................................................................................56第4章新疆南疆地区戊型肝炎分子流行病学调查......................................................60II 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究4.1前言............................................................................................................................604.2材料与方法................................................................................................................604.2.1样品来源.................................................................................................................604.2.2主要试剂.................................................................................................................604.2.3主要仪器.................................................................................................................614.2.4引物设计与合成.....................................................................................................614.2.5样品处理.................................................................................................................614.2.6粪便及胆汁样品HEV总RNA的提取.................................................................624.2.7肝脏样品HEV总RNA的提取.............................................................................624.2.8HEVRNART-nPCR检测.......................................................................................634.2.9PCR产物的纯化回收..............................................................................................644.2.10回收产物的T/A连接...........................................................................................654.2.11连接产物的转化...................................................................................................654.2.12重组质粒的PCR鉴定..........................................................................................664.2.13序列测定与系统进化分析...................................................................................684.3结果与分析................................................................................................................694.3.1新疆南疆地区HEVRNA检测结果......................................................................694.3.2戊型肝炎病毒检测序列的核苷酸同源性比较.....................................................704.3.3戊型肝炎病毒检测序列的系统进化分析.............................................................714.4讨论............................................................................................................................73第5章结论.................................................................................................................75参考文献...........................................................................................................................76附录.........................................................................................................................103致谢.........................................................................................................................104III 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究摘要戊型肝炎（HepatitisE,HE）是重要的人兽共患传染病，也是严重影响公共卫生安全的病毒性肝炎之一，戊型肝炎的分布特征具有全球性，在澳大利亚、美国和新西兰等环境卫生和经济水平比较发达的国家，戊型肝炎主要呈散发流行，而在亚洲等发展中国家戊型肝炎已经成为严重危害人和多种家畜健康的主要传染病之一。在中国，戊型肝炎依然是影响公共环境卫生安全的主要因素之一，新疆是我们国家人源戊型肝炎流行比较严重的地区，新疆南疆地区曾经暴发过至今为止全世界发病人数最多、经济损失和社会危害最大的一次流行，戊型肝炎已经成为新疆南疆当地不可忽视的公共卫生问题。为此，本研究论文对新疆南疆地区人和部分家畜戊型肝炎的流行现状进行了系统的分子流行病学研究，主要研究成果如下：1.新疆南疆地区不同人群戊型肝炎病毒抗体和抗原检测从新疆南疆喀什、库尔勒、和田以及阿克苏地区的市民当中随机采集血清样品2980份，血清样品信息记录完整。其中,汉族1328份，维吾尔族1652份，女性1521份，男性1459份，样品主要包括32份屠宰场工人血清、85份家畜及肉品销售人员血清、220份超市服务人员血清，160份餐饮服务人员血清，2483份其他人员血清。依次采用养生堂有限公司万泰药业的IgG、Ag和IgM系列ELISA检测试剂盒，分别对采集的血清样品进行戊型肝炎病毒IgG抗体、Ag（抗原）和IgM抗体检测，以系统了解新疆南疆地区不同人群戊型肝炎的流行状况。结果表明，在HEV-IgG的调查分析中，各检测年龄段人群均有HEV的感染，不同年龄组间IgG阳性率差异具有2统计学意义（=98.627，df=6，P=0.000），以50-59岁人群的阳性率最高；从血清样本的地域来源分析，库尔勒、阿克苏、喀什以及和田的阳性率依次为：6.81%、8.14%、12.89%和15.38%，不同地域来源样本间阳性率差异具有统计学意义2（=34.838，df=3，P=0.000）；维吾尔族和汉族的阳性率分别为12.53%和7.76%，不同族别之间抗体阳性率差异极显著(p=0.000﹤0.01)；不同从业人群当中，餐饮从业人员、超市从业人员、家畜及肉品接触人员、屠宰场工作人员和其他从业人员的阳性率依次为：2.50%、3.18%、16.47%、31.25%和11.08%，不同职业人群HEV-IgG2阳性率差异具有统计学意义（=42.498，df=4，P=0.000），其中，从事屠宰行业的屠夫IgG阳性率显著高于其它行业人员的阳性率。在HEV-IgM的检测分析中，仅有i 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文7份血清样品呈现阳性，阳性率为0.23%，在HEV-Ag的检测分析中，仅有2份血清样品呈现阳性，阳性率为0.07%。2.新疆南疆地区主要经济动物戊型肝炎病毒抗体和抗原检测从新疆南疆阿克苏、喀什、库尔勒以及和田地区采集动物血清样品共计7840份，其中，血清来源主要包括：绵羊血清2700份、牛血清1110份、猪血清1660份、马鹿血清410份、犬血清160份、鸡血清1800份。采用万泰公司的戊型肝炎病毒总抗体（Ab）ELISA检测试剂盒以及戊型肝炎病毒抗原（Ag）ELISA检测试剂盒，分别对采集的动物血清样品进行戊型肝炎病毒Ab和Ag检测，以系统了解戊型肝炎在新疆南疆地区主要经济动物中流行的状况。结果表明，在HEV-Ab的检测分析中，猪HEV-Ab阳性率为53.25%(884/1660)，不同猪群阳性率差异极显著(P=0.006﹤0.01)，其中，3月龄以上猪的HEV-Ab抗体阳性率（56.00%）高于3月龄以下猪的HEV-Ab抗体阳性率（49.09%）；牛HEV-Ab阳性率为7.03%(78/1110)，不同年龄组HEV-Ab2阳性率差异具有统计学意义（=43.106，df=2，P=0.000），其中，4岁以上牛的HEV-Ab抗体阳性率（18.82%）高于2岁以下牛的HEV-Ab抗体阳性率（3.75%）；马鹿HEV-Ab阳性率为32.4%(133/410)，不同年龄段鹿群HEV-Ab抗体阳性率差异2具有统计学意义（=166.041，df=2，P=0.000），其中，2-4岁鹿的HEV-Ab抗体阳性率（43.8%）高于2岁以下鹿的HEV-Ab抗体阳性率(9.33%)；鸡HEV-Ab阳性率为1.56%(28/1800)，其中，喀什、阿克苏、和田以及库尔勒的HEV-Ab抗体阳性率依次为：1.71%、1.50%、1.78%、1.25%，不同地域来源鸡血清样本阳性率差异无统2计学意义（=0.458，df=3，P=0.928）；犬HEV-Ab阳性率为13.13%(21/160)，农村饲养犬的HEV-Ab抗体阳性率（25.46%）高于城市家养犬的HEV-Ab抗体阳性率（6.67%），差异极显著(P=0.001﹤0.01)，5岁以上、2-5岁和2岁以下犬的抗体阳性2率依次为10.71%、16.84%和5.41%，阳性率差异无统计学意义（=3.207，df=2，P=0.201），各品种犬抗体阳性率依次为：25.71%、6.52%、7.90%、0.00%和18.18%，2阳性率差异无统计学意义（=9.425，df=4，P=0.051），雄性犬的HEV-Ab抗体阳性率（19.77%）显著高于雌性犬的HEV-Ab抗体阳性率（5.41%），差异极显著(P=0.007﹤0.01)；绵羊HEV-Ab阳性率为30.00%(810/2700)，各地区绵羊HEV-Ab阳性率差2异具有统计学意义（=46.113，df=3，P=0.000），其中，喀什地区的HEV-Ab抗体ii 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究阳性率为37.65%，库尔勒地区的HEV-Ab抗体阳性率为21.67%，差异极显著(P=0.000﹤0.01)。在HEV-Ag的检测分析中，所有检测样品仅有26份猪血清样品呈现阳性，阳性率为1.57%。3.新疆南疆地区戊型肝炎分子流行病学调查从新疆南疆地区采集绵羊肝脏300份、胆汁400份、粪便2400份，猪粪便100份，人源HEV-IgM阳性的血清样本7份、人源HEV-Ag阳性的血清样本2份（第2章试验筛选），HEV-Ag阳性的猪血清样本26份（第3章试验筛选）。根据戊型肝炎病毒各基因型ORF2开放阅读框的保守区序列，采用primerpremier5.0引物设计软件设计一套套式PCR引物，对上述采集的组织以及血清样品进行RT-nPCR检测，HEVRNA阳性的PCR产物进行克隆，测序。应用核苷酸序列分析软件DNAStar对本研究扩增的序列与戊型肝炎病毒基因Ⅰ-Ⅳ型的代表毒株序列进行同源性比较，应用软件MEGA5的neighbour-joining方法构建检测毒株的系统进化树，分析其遗传演化关系。结果表明，3235份检测样品中15份HEVRNA呈阳性，总阳性率为0.46%，其中，绵羊肝脏样品4份，猪粪便样品11份，15个检测样品序列之间的核苷酸同源性为97.4%-100%，检测样品序列与基因Ⅰ-Ⅳ型HEV的同源性分别为：81.6%-86.3%、84.2%-85.3%、80.0%-85.8%和84.2%-97.9%，系统进化分析显示，检测样品序列集聚形成一个分支，且与国内基因Ⅳ型人源检测株T1和新疆猪源检测株swCH25处于同一分支，属于4d亚型，遗传进化分析提示，4d亚型HEV具有跨物种感染的潜在性，其在新疆南疆地区的人、猪和羊之间可能保持循环感染。关键词：新疆；戊型肝炎；人兽共患病；流行病学；RT-nPCRiii 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文AbstractHepatitisEoneofthevirushepatitisisimportantzoonosiswhichisdistributedworldwide,itissporadicindevelopedcountrysuchasAmerica,NewZealandandAustralia.Indevelopingcountry,ithasbeenaimportantloimianotonlyforpeoplebutalsoforanimals.Inchina,XinjiangisoneofHepatitisEdisasterarea,during1988-1998year,aoutbreakofHepatitisEhappenedinthisarea,itisthebiggestoneuptonow,whichhasledtoenormouseconomicloss.HepatitisEhasbeenoneoftheseriouspublichealthproblem,sothisthesiscarryoutasystemicepidemiologicalstudyforHepatitisEinXinjiangNanjiang,Thebelowisthefundamentaloutcome:1.DetectionofantibodyandantigenaboutdifferentpopulationsinXinjiangNanjiangAtotalof2980serumsamplesofpeoplewerecollectedfromKashi,Korla,HetianandAksu,allofthesampleswererecordaccurateinformation,1328of2980serumsamplesareHannationalitypeoplesamples,1652areUygurnationalitysamples,1521arefemalesamples,1459aremasculinesamples.Theserumsamplescontain32slaughtermansamples,85Livestockandmeatsalespersonsamples,220supermarketpopulationsamples,160foodservicepopulationsamples,2483otherssamples.TheELISAkitproducedbyBeijingwantaicompanywereappliedtodetectHEV-IgG,HEV-AgandHEV-IgM,soastostudytheseroprevalenceofhepatitisEinXinjiangNanjiangarea.TheresultindicatethatintheanalysisofHEV-IgG50-59yearsoldpeoplehasthemaximumlevelofpositiverate,therewasastatisticalsignificanceofpositiverate2amongpopulationwithdifferentages(=98.627,df=6,P=0.000);ThepositiverateofKorla,Aksu,KashiandHetianwas6.81%,8.14%,12.89%and15.38%separately,there2wasastatisticaldifferenceamongeachadministrativeareas(=34.838,df=3,P=0.000);Thepositiverateofuygurnationalityandhannationalitypeoplewere12.53%and7.76%,italsohasastatisticaldifferenceofpositiveratebetweenraces(p=0.000﹤0.01);Thepositiverateoffoodservicepopulation,supermarketpopulation,livestockandmeatsalesperson,slaughtermanandotherswere2.50%,3.18%,16.47%,31.25%and11.08%iv 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究separately,therewasastatisticalsignificanceamongeachoccupationalpopulation2(=42.498,df=4,P=0.000),thepositiveratewasremarkablydifferencebetweenslaughtermanandotherpopulations.IntheanalysisofHEV-IgM,therewereonly7positivesamples,thepositiveratewas0.23%.IntheanalysisofHEV-Ag,onlyhas2positivesamples,positiveratewas0.07%.2.DetectionofantibodyandantigenabouteconomicanimalsinXinjiangNanjiangAtotalof7840serumsamplesofanimalsincluding2700sheepbloodserumsamples,1110cowbloodserumsamples,1660swinebloodserumsamples,410deerbloodserumsamples,160dogbloodserumsamplesand1800chickenbloodserumsamples,werecollectedfromAksu,Kashi,KorlaandHetian,allofthesampleswererecordaccurateinformation.TheELISAkitwereappliedtodetectHEV-AbandHEV-IgM,soastostudytheseroprevalenceofhepatitisEineconomicanimalsofXinjiangNanjiangarea.TheresultindicatethatintheanalysisofHEV-Abthepositiverateofswinewas53.25%(884/1660),therewasaprominentstatisticaldifferencebetweenageranges,being56.00%over3yearsold,49.09%below3yearsold(P=0.006﹤0.01);Thepositiverateofcowwas7.03%(78/1110),therewasastatisticaldifferenceamongeachgroups2(=43.106,df=2,P=0.000),being18.82%over4yearsold,3.75%below2yearsold;Thepositiverateofdeerwas32.4%(133/410),therehadbeenastatisticaldifference2amongeachagegroups(=166.041,df=2,P=0.000),being43.8%of2-4yearsold,9.33%below2yearsold;ThetotalpositiverateofchickenfromKashi,Aksu,HetianandKorlawas1.56%(28/1800),thepositiveratewere1.71%,1.50%,1.78%and1.25%2respectively,therehadnobeenastatisticaldifference(=0.458,df=3,P=0.928);Thepositiverateofdogwas13.13%(21/160),thestatisticaldifferencewasextraordinaryprominentbetweenruraldog(25.46%)andurbandog(6.67%)(P=0.001﹤0.01),thepositiverateofover5yearsold,2-5yearsoldandbelow2yearsoldwere10.71%,16.84%and5.41%respectively,therewasnoastatisticaldifferenceamongeachage2groups(=3.207,df=2,P=0.201),thepositiverateamongbreedgroupswere25.71%,v 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文6.52%,7.90%,0.00%and18.18%respectively,therewasalsonoastatisticaldifference2(=9.425,df=4,P=0.051),therewasaextraordinaryprominentdifferenceofpositiveratebetweenmaledog(19.77%)andfemaledog(5.41%)(P=0.001﹤0.01);Thetotalpositiverateofsheepwas30.00%(810/2700)，therewasastatisticaldifferenceamong2eachareagroups(=46.113,df=3,P=0.000),thedifferencewasextraordinaryprominentbetweenKashi(37.65%)andKorla(21.67%)(P=0.000﹤0.01).IntheanalysisofHEV-Ag,onlyhas26positiveswinebloodserumsamples,positiveratewas1.57%.3.MolecularepidemiologyinvestigationofhepatitisEinXinjiangNanjiangDetectivespecimensincluded300sheepliver,400sheepbile,2400sheepfeces,100swinefeces,7HEV-IgMpositivehumanbloodserum,2HEV-Agpositivehumanbloodserumand26HEV-AgpositiveswinebloodserumwerecollecttedfromXinjiangNanjiang.RT-nPCRwasusedtodetectspecimenswithprimerstargetingHEVORF2regions,ThefinalPCRproductwasclonedandsequenced,percentidentitywascalculatedwithDNAstar,phylogenetictreeswereconstructedbyMEGAsoftware.Theresultindicatethat15specimensinclude4sheepliverand11swinefecesof3235werepositive,positiveratewas0.46%,Sequenceanalysisindicatedthatthese15HEVstrainsshared97.4%-100%nucleotidehomologywitheachotherandhadidentitiesof81.6%-86.3%,84.2%-85.3%,80.0%-85.8%and84.2%-97.9%withthecorrespondingregionsofreferenceHEVgenotypes1,2,3and4,respectively.phylogeneticanalysisbasedonalignmentofpartialORF2sequencesrevealedthatthe15strainsinthecurrentstudyformedasinglelineageandwereonthesamebranchasT1andswCH25,allofwhichbelongtogenotype4,subtype4d.phylogeneticanalysissuggestthat4dsubtypeofHEVhaspotentialityofinfectionamongdifferentspecies,whichmaycancircleamonghuman,swineandsheepinXinjiangNanjiang.keywords:Xinjiang;HepatitisE;Amphixenosis;Epidemiology;RT-nPCRvi 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究缩略词表(Abbreviation)缩写英文名称中文名称Abantibodies抗体Agantigens抗原Ampampicillin氨苄青霉素cDNAcomplementaryDNA互补cDNAdNTPdeoxynucleatrdediphosphate脱氧核苷酸三磷酸DNAdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸enzyme-linkedimmunosobentELISA酶联免疫吸附试验assayHEHepatitisE戊型肝炎HEVHepatitisEVirus戊型肝炎病毒HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IEMimmunoelectronmicroscope免疫电子显微镜IFAImmunofluorescentassay免疫荧光试验TheInternationalCommitteeonICTV国际病毒分类委员会TaxonomyofVirusesIgMimmunoglobulinM免疫球蛋白MIgGimmunoglobulinG免疫球蛋白GIgAimmunoglobulinA免疫球蛋白AL/mlliter/milliter升/毫升LBluria-bertanibrothLB培养基molmolar摩尔nmnanometer纳米NationalCenterforNCBI国家生物技术信息中心BiotechnologyInformationODopticaldensitydifference吸光度差ORFopenreadingframe开放读码框架vii 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应RNAribonucleicacid核糖核酸reversetranscriptasepolymeraseRT-PCR反转录聚合酶链式反应chainreactionr/minrevolutionsperminute每分钟转数SPFspecificpathogen-free无特定病原WBwesternblotting免疫印迹viii 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究第1章文献综述1.1前言戊型肝炎（HepatitisE,HE）是重要的人兽共患传染病之一，戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）是其病原，粪口途径主要引起该病的暴发流行，血液传播途径主要引起该病的散发流行。戊型肝炎感染对象主要以青年和壮年为主，感染以后患者表现出黄疸症状，与甲型肝炎的临床症状十分相似，感染往往呈现自限性经过，怀孕的妇女感染以后症状和危害相对比较严重，可导致流产，死亡率可以达到20%-30%（Balayanetal1983,Kamili2011,KamarandBendall2012），戊型肝炎呈现全球分布，在亚洲、非洲和中美洲等卫生条件相对较差的发展中国家，戊型肝炎是严重危害当地人类健康的病因之一，也是影响公共卫生安全的主要因素（EmersonandPurcell2003,PurcellandEmerson2008,Kabaetal2013），在欧、美等发达国家戊型肝炎主要由动物传播所致且呈散发流行（Abeetal2006,Daltonetal2008,Meng2010,Colsonetal2010）。戊型肝炎病毒只有一个血清型，根据世界范围内不同分离株核苷酸序列的差异，目前把不同物种来源的戊型肝炎病毒分为四个基因型，其中，1型和2型戊型肝炎病毒只感染人类，1型戊肝病毒主要在发展中国家孟加拉国、苏丹和中国等国家有所分布，2型戊肝病毒最初只在墨西哥有报道，近年来，纳米比亚、尼日尼亚和埃及也有流行分布的报道，3型和4型戊型肝炎病毒不但可以感染人类，而且还可以感染多种动物，3型戊肝病毒呈全球分布，主要分布在发达国家和地区，譬如：欧美、新西兰和澳大利亚等，中国近年也有3型戊型肝炎病毒感染的报道，并且存在3型病毒和4型病毒混合感染的现象（Ningetal2008,于水生等2008,Lietal2009），基因4型戊肝病毒主要分布在东亚和欧洲一些国家和地区。鉴于戊型肝炎病毒分离株的不断增加，以及新变异株的出现，Smith等从核酸水平对戊肝病毒的分类划分提出了新的标准（Smithetal2013）。目前，多种动物已有感染HE的报道，并且逐步从鸡（Zhaoetal2010）、鼠（Johneetal2010）、野猪（Takahashietal2011）、雪貂（Rajetal2012）、蝙蝠（Drexleretal2012）和鳟鱼（Battsetal2011）等多个物种体内分离鉴定出HEV的变种。自1997年Meng等（Meng1997）首次报道美国当地猪群中分离的戊肝病毒和美国本土人源1 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文戊型肝炎病毒具有99%的同源性之后，各国学者纷纷开展了对不同物种HEV的研究，葛胜祥等（葛胜祥等2003）对商品猪HEV感染开展了比较系统的流行病学调查，研究结果表明，国内商品猪感染HEV已经非常普遍，庄辉团队（Gengetal2011,Liuetal2013）从北京地区兔体内分离到HEV的变种，基于全基因序列的遗传进化分析表明变种的兔源HEV具有跨物种传播的可能性。新疆是我国HE的高发地区，曾在1988－1998年间该病大规模暴发流行，是目前为止全球规模最大的一次暴发流行，共计发病119280例，死亡707例（Ayeetal1992）。国家卫生部传染病疫情统计报告数据表明，2002－2004年间，我国人源戊型肝炎病例平均每年以40％的速度在逐年增长，戊型肝炎已经成为中国地区重要的健康安全隐患问题。1.2戊型肝炎流行病学研究进展1.2.1戊型肝炎病毒的病原学戊型肝炎病毒在电镜下呈二十面体结构对称，直径大小约32-34nm，是肝炎病毒科(HepeviridaeFamily)肝炎病毒属(Hepevirus)的成员，病毒粒子具有单股正链基因组RNA，病毒粒子外面没有囊膜包裹，基因组RNA呈现两种不同的形态，完整的戊肝病毒粒子在梯度蔗糖离心时的沉降系数为183S-185S，基因组缺陷的戊肝病毒粒子沉降系数为165S，具有电荷透亮区。戊肝病毒对氯化铯等外界因素比较敏感，3基因组序列完整的病毒粒子在氯化铯中的浮密度为1.30g/cm，在酒石酸钾/甘油中的3浮密度为1.29g/cm，戊型肝炎病毒在肠道消化道等弱碱性环境中能够相对稳定存在，在镁离子和锰离子存在的碱性条件下可以稳定存在，液氮中可以长期保存该病毒，反复冻融可以使得病毒活力下降（Lietal1997），电镜下病毒粒子的形态结构如图1所示。2 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究图1电镜下HEV的形态结构Fig1ElectronmicroscopypictureofHEV(ThispicturewasobtainedfromtheCentersforDiseaseControlandPrevention)前苏联科学家Balayan于1983年首次从患者粪便中发现类似戊型肝炎病毒样颗粒，并推断该戊肝样病毒颗粒为小RNA病毒（Balayanetal1983）。Worm（Wormetal2002）等曾经根据病毒粒子的大小和病毒粒子的物理学特性将其归为杯状病毒科，但是，与没有囊膜的杯状病毒比较，该病毒粒子表面相对比较光滑，而且病毒粒子比较小，病毒粒子的编码框与杯状病毒有明显的区别，杯状病毒的第三位阅读框架（Openreadingframe3,ORF3）位于碳末端，而该分离病毒的第三位阅读框架位于第一位和第二位阅读框架之间，该分离病毒与杯状病毒的核苷酸序列有很大的差别。鉴于上述原因，2004年第8次国际病毒分类委员会(TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)上该分离病毒被初步列为戊型肝炎病毒科(FamilyHepeviridae)，戊型肝炎病毒属(GenusHepevirus)，该分离病毒为本科属下唯一的成员。第12届国际病毒性肝炎和肝病研讨会上该分离病毒最终被分类为戊型肝炎病毒科(HepeviridaeFamily)，戊型肝炎病毒属(HepevirusGenus)（Emersonetal2004）。1.2.2戊型肝炎病毒的分子生物学HEV的基因组结构及编码蛋白戊型肝炎病毒的基因组核苷酸长约7.5kb(7.2-7.6kb)，为典型的线性RNA病毒，基因组呈单链正股分子结构，编码结构包括5’端非编码区、开放阅读框ORF1、ORF2、ORF3、3’端非编码(NC)，以及3’端多聚poly(A)尾巴结构，该结构由150-200个腺苷酸残基组成。反向遗传学研究表明，5’末端的非编码序列对病毒感染性克隆3 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文的影响最大，能够使得体外或体内转录产物的感染性降低甚至丧失，在病毒复制之初，3’非编码序列能够特异性结合病毒RdRP，3’的非编码序列的碱基数在7个以下时对体内或者体外转录物的感染性影响相对较小，3’的非编码序列的碱基数过多同样会使得转录物的感染性降低甚至丧失，poly(A)尾巴结构的长度在病毒复制中亦有关键作用，poly(A)尾巴碱基数有特定的阈值，当碱基数小于阈值时转录本的活性就会降低（MizutaniandColonno1985,Sarnow1989,Klumpetal1990）。目前，国内外已分离克隆的戊型肝炎病毒均具有相似的基本结构，不同分离株也表现出核苷酸序列差异的准种特性。在目前普遍接受的戊型肝炎病毒四个基因型中，基因1型、基因2型和基因3型具有相似的基因组结构，ORF2和ORF3广泛重叠，ORF1和ORF3只具有一个氨基酸的重叠（见图2）。基因4型戊型肝炎病毒由于在开放阅读框ORF3的第二个密码子AUG之后插入了一个核苷酸“U”，这一变化导致ORF2的起始密码子前移，从而使得ORF2的编码蛋白增加了14个氨基酸，ORF3的编码蛋白却减少了9个氨基酸，最终使得ORF3完全包含在ORF2中（王佑春等2001,赵慧等2009）（见图3）。图2基因1-3型戊型肝炎病毒基因组结构Fig2TheHEVgenomeofgenotypeI–III图3基因4型戊型肝炎病毒基因组结构Fig3TheHEVgenomeofgenotypeⅣ戊型肝炎病毒的3个开放阅读框表达各种不同类型的蛋白质，其编码蛋白如图4所示，目前，三个开放阅读框ORFs的生物学功能已经基木清楚。4 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究图4HEVORFs的编码蛋白质Fig4ThecodingproteinofHEVgenomeORF1：开放阅读框ORF1的编码区核苷酸在不同分离株有所不同，ORF1起始于病毒基因组5ˊ非编码区核苷酸的第28位碱基，终止于3ˊ5107位碱基，长约5kb，编码约1690个氨基酸的多聚蛋白质，该多聚非结构蛋白包含多个与病毒复制有关的蛋白质，在ORF1氨基酸序列上从N端到C端依次为：甲基化转移酶、Y结构域、宏结构域、半胱氨基酸蛋白酶、“铰链区”结构域、X结构域、RNA解旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。ORF1第2011-2325nt为戊型肝炎病毒的高变区，编码约100个氨基酸的蛋白序列，其变异比整个ORF1核酸序列要高，对应的氨基酸序列变异达14%，该区域为大部分戊型肝炎病毒分离株的高变区，该高变区与戊型肝炎病毒的遗传进化有关。反向遗传学研究表明，戊型肝炎病毒5ˊ碱基的忠实性在HEV感染性克隆的构建中至关重要，Zhang等（Zhangetal2001）发现戊型肝炎病毒5ˊ的碱基G对于HEV转录物保持感染性是至关重要的，RNA依赖的RNA聚合酶中GDD的完整性在HEV的复制过程中发挥重要的作用。Ojha等（OjhaandLole2016a,OjhaandLole2016b）最近研究表明戊型肝炎病毒ORF1编码蛋白的宏结构域与人的铁蛋白(FTL)轻链亚基特异性结合，在体外培养的肝癌细胞上HEV宏结构域的存在不影响铁蛋白的表达水平，但是使得铁蛋白的分泌降低，布雷菲德菌素a可以进一步增强这种抑制作用，影响铁代谢的两个重要的转铁蛋白和转铁蛋白受体在表达HEV宏结构域的细胞中没有变化，HEV宏结构域通过直接与铁蛋白的绑定结合阻止了铁蛋白参与细胞代谢从而降低了免疫系统对HEV的免疫监视作用。通过对155个肝细胞5 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文蛋白筛查分析，鉴定出了与HEVORF1编码的功能性结构域相互作用的肝细胞蛋白质。ORF1功能性结构域和肝细胞蛋白质的相互作用表明，HEV感染体细胞后充分使用了细胞内碳水化合物代谢、能量产生以及体内铁平衡过程中重要的蛋白质。Chatterjee等（Chatterjeeetal2016）以pSK-HEV2为骨架构建了12个分别包含基因1-4型HEV的感染性克隆，结果表明，ORF1蛋白结构域和宿主细胞特异性受体的互作是影响病毒在宿主细胞内复制以及病毒是否能够侵入宿主细胞的因素。Parvez（Parvezetal2015）推测ORF1“X结构域”在病毒复制过程中的调控作用依赖于“Asn,Asn,His,Gly,Gly,Gly”这一片断结构，“X结构域”的Appr-1″-pase活性决定了ORF1在HEV致病性中的作用。Parvez（Parvez2013）构建了ORF1区域突变的HEV-SAR55复制子，并在S10-3细胞上检测了复制子的活性，结果表明'PCP-catalytic'and'X-substrate'亚基在HEV复制过程中起到了不可缺少的蛋白酶作用。Nan等（Nanetal2014）首次发现HEV在肝癌细胞上生长时ORF1编码的非结构蛋白可以抑制β-干扰素的分泌表达，并进一步明确了ORF1编码的非结构蛋白如何并在哪一步骤影响β-干扰素的具体表达，这一发现为HEV致病机制的研究奠定了基础。ORF2：ORF2是主要的蛋白编码区，长约长2kb，编码660个氨基酸，包括结构蛋白和非结构蛋白，ORF2编码的结构蛋白是HEV基因工程疫苗研究的焦点，研究表明，ORF2编码的结构蛋白含有多个抗原表位，ORF2编码蛋白3’端的氨基酸序列已被认为是HEV主要抗原蛋白的富集区。在HEV基因组结构中，ORF2编码区的核苷酸序列最稳定，但是，与ORF3重叠部分编码的氨基酸变异较大（Graffetal2008）。Zhang等（Zhangetal2016）通过共免疫沉淀、pull-down和ELISA技术发现HEVORF2编码蛋白直接与ASGR1和ASGR2的胞外结构域结合，宿主对HEV的敏感性与细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的表达水平有关，ASGPR通过与ORF2编码蛋白结合进一步调节HEV感染细胞的吸附与侵入步骤。Taherkhani等（Taherkhanietal2015）用含有112-608位氨基酸截短的HEVORF2蛋白质刺激感染戊型肝炎恢复病人的外周血单核细胞，来评估刺激细胞的细胞因子、γ-干扰素和细胞增殖反应的变化，结果发现，截短的HEVORF2蛋白能够诱导刺激细胞产生大量的γ-干扰素、细胞因子12以及强烈的细胞增殖反应，但是，产生细胞因子10和细胞因子4的量比较少，该截短蛋白可以有效诱导机体的细胞免疫反应，可以作为HEV候选疫苗。6 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究Farshadpour等（Farshadpouretal2014）将HEV112-660位截短的编码蛋白在大肠杆菌BL21中进行表达，ELISA结果表明该表达蛋白可以作为开发HEV感染的诊断试剂候选蛋白。Taherkhani等（Taherkhanietal2015）将截短的HEVORF2表达蛋白质作为ELISA检测试剂的包被蛋白质，与DIA.PROHEVIgGELISAkit(DIA.PRO.Italy)进行比较，通过对220份血清的检测结果发现该包被蛋白的检出率与DIA.PROHEVIgGELISAkit(DIA.PRO.Italy)具有高度的一致性。核因子κB(NF-κB)是重要的转录因子，在机体受致病因素感染时发挥重要的作用，Surjit等（Surjitetal2012）在人肝癌细胞上表达了HEVORF2蛋白，分析发现ORF2蛋白能够直接与F-box蛋白和betatransducinrepeatcontainingprotein(βTRCP)相互作用，ORF2蛋白的过表达降低了IkappaBalpha(IκBα)与SKP1和CUL1相互作用，因此，动物机体受HEV感染时ORF2蛋白的过表达抑制了细胞核因子κB的活性。John（Johnetal2011）发现HEV感染细胞后ORF2通过激活同源蛋白前凋亡基因C/EBP的表达进而对内质网产生生物学压力，使得感染细胞产生凋亡，Parvez（Johnetal2011）构建了表达HEVORF2全长蛋白的重组杆状病毒并转染人S10-3肝癌细胞，结果发现该表达HEVORF2蛋白质的重组杆状病毒质粒能够在转染细胞中装配出新的类病毒颗粒，新装配的类病毒颗粒具有感染HepG2/C3A细胞的能力，该体外病毒装配系统的研究为HEV其它分子生物学以及HEV致病机制的进一步研究提供了新的技术借鉴。ORF2编码的结构蛋白是HEV主要的抗原表位集聚区，为了鉴定HEV抗原的分布位点，Liang（Liangetal2010）制备了缅甸株HEV、巴基斯坦株HEV和摩洛哥株HEV截短ORF2的单克隆抗体，进而鉴定HEV抗原表位的分布位点，结果发现，不同HEV分离株的基因组序列中606位的氨基酸位点对维持病毒抗原性的存在发挥着重要的作用，因此，该表位是今后HEV基因工程疫苗开发的新方向。Pan等（Panetal2010）克隆了基因4型HEV的ORF2编码区，并鉴定出覆盖氨基酸的459-607位亚区序列是重要的B淋巴细胞抗原表位区，进一步减少N端或者C端的氨基酸使得表达蛋白的反应原性明显降低，通过截短不同分离毒株N端或者C端的氨基酸可以降低不同分离毒株间的非特异性结合，这一策略可以用来检测HEVIgM，在疾病感染的早期诊断中具有重要的应用价值。ORF3：ORF3开放阅读框是HEV基因组上最小的编码框，编码氨基酸的最大长度为123个氨基酸，目前已经确定ORF3的编码产物为磷蛋白，编码蛋白的分子量约为13.57 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文kDa，研究表明，HEV感染细胞后表达ORF3蛋白广泛分布在感染细胞的细胞质、内质网和高尔基体，磷酸化的pORF3能够与MAPK/ERK细胞信号转导过程的通路蛋白Src、Hck、Fyn等结合，同时，ORF3编码的磷蛋白是细胞外调节激酶和应激活化激酶的底物，在HEV感染时细胞信号转导中发挥重要的作用，同时，与病毒粒子的装配以及HEV的免疫活性有关（Korkayaetal2001,Tyagietal2002）。Yang等（Yangetal2016）应用单克隆抗体技术、酶联免疫吸附、蛋白质印迹法和免疫荧光测定法从基因1型HEVORF3编码的多功能蛋白上鉴定出了一个线性表位，此线性表位位于ORF3编码多聚蛋白富含脯氨酸的66-75位，该表位的鉴定有利于进一步研究HEV的其它病毒蛋白以及病毒的其它生物学特性。He等（Heetal2016）首次发现在A549细胞上基因1型HEV的ORF3编码蛋白能够下调TLR3介导的NF-κB信号通路，并进一步鉴定出ORF3编码蛋白上的P2结构域与这一抑制现象有关，当ORF3表达时死亡结构域蛋白(tumornecrosisfactorreceptor1-associateddeathdomainprotein，TRADD)的表达和遍在蛋白化被下调，ORF3下调TLR3介导的NF-κB信号通路就是通过TRADD实现的，该发现为进一步研究HEV的致病机制以及HEV感染后机体细胞对HEV的免疫反应提供了新的研究视角。巨大结构域蛋白普遍存在于原核生物、高等动物人类以及正链RNA病毒中，巨大结构域蛋白参与细胞内复杂的生物学过程，HEV的巨大结构域蛋白(X-domain)由ORF1编码，该结构域蛋白直接与HEV的甲基转移酶和ORF3编码蛋白相互作用，ORF3编码蛋白与X-结构域的相互作用由N端的第35位和C端的第63-123位氨基酸基序调节，甲基转移酶和X-结构域的相互作用由N端第30-99位氨基酸基序调节，X-结构域C末端第66位、67位的异亮氨酸和101位、102位的亮氨酸可以参与对ORF3蛋白和甲基转移酶的同时调节，ORF3蛋白和甲基转移酶对X-结构域具有竞争结合作用，这一发现解释了X-结构域在HEV生命活动周期中的重要作用，也从分子层面解释了HEV的X-结构域、ORF3蛋白和甲基转移酶之间的相互作用关系（Anangetal2016）。Lei等（Leietal2016）研究发现在PMA-THP1细胞上HEVORF3表达蛋白能够抑制促炎细胞因子、趋化因子、巨噬细胞炎性蛋白、巨噬细胞集落刺激因子的有效表达，进一步研究表明，当HEVORF3表达时模式识别受体(Toll-likereceptor4,TLR4)和TNF(receptor-associatedfactor6,TRAF6)的mRNA和蛋白质表达水平下降，这种抑制作用使得IκBα上调，磷酸化IκB激酶下调，HEV感染以及肝硬化过程中巨噬细胞抗炎症反应的特性发挥着重要的作用。HEVORF3蛋白包含"PSAP"氨基酸结构域基序，8 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究该结构域基序与协助病毒粒子释放的胞内体复合物相互作用，在相当一部分有囊膜的病毒之间，该结构域基序可以相互替换，Kenney等（Kenneyetal2015）用异源的结构域基序PPPY、YPDL和PSAA替换了HEVORF3的结构域基序"PSAP"，结果发现，这一替换过程是新产生的病毒粒子不能有效地释放。准所周知，HEVORF2编码蛋白是重要的结构蛋白，分布在HEVORF2编码蛋白上的抗原表位在HEV特异性抗体的检测中发挥重要的作用，近年来研究表明，ORF3编码蛋白在HEV特异性抗体的检测中也具有潜在的作用，Wang等（Wangetal2015）发现基因4型HEVC端连续的氨基酸基序VDLP是ORF3编码蛋白表位重要的核心序列，该基序与上游原件的相互作用是其保持免疫活性所必需的，其中，上游原件中P99、P102和P103三个脯氨酸残基在VDLP保持免疫中发挥重要的作用，该发现有助于今后对HEVORF3抗原表位分布的进一步研究。哺乳动物的MAPK-JNK1/2在肝细胞中表达，MAPK-JNK1/2在感染细胞的抗凋亡信号通路中发挥作用，Parvez等（ParvezandAl-Dosari2015）近期研究表明MAPK-JNK1/2能够被HEV-ORF3激活，在病毒复制子和ORF3载体DNA共转染的细胞上，54%-66%的JNK1/2发生了磷酸化作用。Nan等（Nanetal2014）发现在稳定表达HEVORF3编码蛋白(vp13)的HeLa细胞上，由于poly(I•C)的作用干扰素的产量明显增加，该团队以荧光色素为报告基因构建了包含β干扰素的启动子，结果表明，由于ORF3编码蛋白(vp13)的存在荧光色素的表达量明显增加，荧光色素表达量的增加与其内部结构RIG-I有关，用ORF3编码蛋白(vp13)缺损的结构进行上述研究，结果表明，ORF3编码蛋白(vp13)C端结构域的完整性对于增强荧光色素的表达量是必须的，在HEV感染的肝癌细胞上，野生型HEV比ORF3编码蛋白(vp13)缺损的HEV突变体诱导产生RIG-I和β干扰素的量要高。分析四种不同基因型的HEV发现基因1型和基因3型HEV分离株可以增强RIG-I的信号肽作用，而基因2型和基4型HEV增强RIG-I的信号作用相对较小，这一发现有助于进一步对HEV侵入等致病机制的研究。为了进一步研究HEVORF3的功能，Zhou等（Zhouetal2014）采用酵母双杂交技术，以基因4型HEVORF3蛋白作为诱饵蛋白，从猪肝细胞文库中筛选与HEVORF3蛋白互作的目标蛋白质，结果，从肝细胞文库中筛选出纤维蛋白溶原酶和α2抗纤维蛋白溶原酶两个与HEVORF3互作的蛋白质，并进一步采用免疫共沉淀、Westernblotting和pull-down技术进行了验证。Zhao等（Zhaoetal2013）分离并鉴定了国内第一株鸡源HEV(CaHEV)，并发现鸡HEV可以造成鸡的肝脾肿大，为了进一步分析鸡HEVORF3的抗原表位，9 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文该团队表达了CaHEV全长的ORF3蛋白以及5个截短的ORF3蛋白，并鉴定出三个抗原表位区域，这三个区域为(aa)1-28、55-74和75-88位，其中，aa75-88位为优势抗原表位集聚区，该研究结果为进一步开发鸡HEV检测试剂提供了理论基础。猪HEVORF3编码蛋白是重要的调节蛋白，可以改变转录因子的活性以及细胞质的信号通路，MicroRNAs是潜在的前转录调节因子，是近年来鉴定治疗戊型肝炎靶点的热点之一，为了阐明猪HEVORF3在宿主细胞中对miRNAs产生何种影响，Cheng等（Chengetal2013）在稳定的细胞系上观察了存在猪HEVORF3以及不存在猪HEVORF3的情形下miRNAs表达模式的区别，结果发现，在人293肾细胞上当表达HEVORF3时miR-221和miR-222明显下调，这一发现为今后进一步揭示miRNAs在HEV感染过程中具体发挥何种作用提供了新的研究策略。ORF4：最近，基因1型HEV又鉴定出一个新的编码框ORF4，该编码框位于HEV基因组的2835-3308位，与其它编码框不同的是ORF4编码框的翻译由位于HEV基因组序列第2701-2787位的内部核糖体进入位点（IRES）样序列介导，ORF4编码产物与其它病毒蛋白相互作用形成包括RNA聚合酶和解旋酶在内的蛋白复合体，ORF4编码产物诱导病毒RNA聚合酶的活性进而促进了病毒的复制，ORF4编码框能够在无细胞系统中成功表达，并且从HEV感染的患者体内检测到ORF4表达蛋白抗体的存在，但是，通过对其它基因型HEV基因组序列的分析并没有发现该编码框的存在。因此，尚需要进一步实验研究来阐明ORF4编码框的具体功能（Nanetal2016）。HEV的基因型及全球分布有关HEV的基因分型仍然没有统一的标准，目前，大部分报道主要依据HEVORF2和ORF1的部分核苷酸片段进行基因分型，而且所选择的具体核苷酸片段和片段大小都各不相同，因此，造成HEV的基因分型呈现多样化的局面（董庆鸣和庄辉2001）。采用HEV的全基因组序列进行基因分型是最准确的，但是，Zhai等（Zhaietal2006）报道采用HEV的部分片段进行基因分型与采用HEV全基因序列进行基因分型的结果完全一致，因此，可以采用特定的部分核苷酸片段进行基因分型来代替用戊型肝炎病毒的全基因序列进行基因分型。最初，HEV只分为亚洲-非洲基因型和墨西哥基因型两个基因型，后来从美国分离的US-1、US-2以及猪源分离株被划作新的基因型。2006年7月1日至5日，第十二届国际病毒性肝炎和肝病学研讨会在10 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究法国巴黎召开，在本次研讨会上Fahkhauser等根据HEVORF2、ORF3以及HEV全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性差异程度，确定以ORF2核苷酸序列差异程度不超过20%作为标准，同源性在20%之内划作同一基因型，同源性大于20%划作不同的基因型，依据该标准将从世界各地分离的HEV分为5个不同的基因型，各个基因型又可以划分为多个不同的基因亚型。基因I型：以缅甸HEV为代表分离株，分布在亚洲和非洲一些国家，主要有新疆株、埃及株、咋得株、巴基斯坦株、缅甸株、印度株等。基因I型HEV各分离株的核苷酸同源性均在90%以上，主要局限于人类，通常是暴发性的，该基因型可以分为(la、1b、1c、Id、le)5个基因亚型（Wangetal2001,Jameeletal2002,Vaidyaetal2002,Shresthaetal2004,Grandadametal2004,Nicandetal2005）。基因II型：基因II型HEV与其它基因型HEV的同源性差异较大，最初，基因II型HEV只在墨西哥有分离的报道，近年来，发现非洲国家苏丹、纳米比亚、尼日尼亚、埃及等也有该基因型HEV分离鉴定的报道（Huangetal1992,Buissonetal2000,Mailaetal2004）。基因II型HEV可以分为(2a、2b)两个基因亚型。基因Ⅲ型：基因ⅢHEV呈全球分布，在工业发达国家和发展中国家均有分离鉴定的报道，代表株为美国人源分离株US-1，US-2以及全球首株猪源HEV分离株，主要分布在欧洲、亚洲、美洲等国家，早前，希腊分离株和阿根廷分离株被认为是新的HEV分离株，通过核苷酸同源性比较发现，希腊分离株和阿根廷分离株HEV与基因Ⅲ型HEV具有很高的同源性，因此，后来把希腊分离株和阿根廷分离株划归为基因Ⅲ型HEV（Schlauderetal1998,Tokitaetal2003,Mansuyetal2004,Butietal2004,Ijazetal2005,Munnéetal2006,Daltonetal2007a,Daltonetal2007b,Herremansetal2007,DeSilvaetal2008）。基因Ⅲ型HEV进一步可以划分为3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、3h、3i、3j10个基因亚型。中国近年来也有基因Ⅲ型HEV分离鉴定的报道，并开展与之相关的反向遗传操作（Ningetal2008,Zhuetal2011,Sietal2014）。基因IV型：基因IV型HEV主要在东亚国家和地区以及印度流行，包括尼泊尔、印度、日本、越南、中国台湾和中国大陆地区，基因IV型HEV有4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h8个基因亚型（Wangetal2002,Hijikataetal2002,Yazakietal2003,Nishizawaetal2003,Wibawaetal2004）。基因V型：2001年Haqshenas等（Haqshenasetal2001）在研究室首次从美国11 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文患有肝脾肿大综合症（hepatitis-splenomegaly,HS）的鸡胆汁中分离到一株类HEV，Huang等（Huangetal2004）建议将该分离毒株命名为HEV基因V型。周恩明教授与该团队进行合作，对禽HEV的B淋巴细胞抗原表位进行了筛选研究，从禽HEV开放阅读框ORF2上筛选出两个抗原表位，实验证实这两个抗原表位为中和表位，具有抗原性，能够抵御禽HEV的感染。并且进一步证实禽源HEV的ORF2上存在以下特征性抗原表位：禽特异的抗原表位、禽-猪-人HEV交叉抗原表位、禽-人HEV交叉抗原表位。这一特征发现具有如下应用前景：虽然禽源HEV具有人禽共感染的可能性，但是，也可以开发以禽HEVORF2表达蛋白为检测抗原的免疫诊断试剂，用来区别人和禽HEV（周恩民等2009）。1997年杨德吉等（杨德吉等1997）首先证实HS综合症在我国鸡群中的存在，Zhao等（Zhaoetal2010）首次从国内患有HS综合症的鸡群中分离到鸡源HEV，并对其基因组进行了描述。近年来，多项研究证实与人类密切接触的猪、羊、牛等多种家畜亦可以感染HEV，并且新的变种不断从鼠（Johneetal2010）、野猪（Takahashietal2011）、雪貂（Rajetal2012）、蝙蝠（Drexleretal2012）和鳟鱼（Battsetal2011）等动物体内被分离鉴定，Smith等（Smithetal2013）对HEV基因型划分作了新的建议。以上HEV基因型划分的研究对于了解不同物种HEV的起源和进化，以及对不同物种戊型肝炎的防控具有重要意义。HEV的培养模型细胞培养模型随着HEV研究的不断深入，越来越多的HEV分离株被克隆测序，但是，缺乏合适有效的细胞培养模型一直是制约HEV致病机制等特性研究的瓶颈因素，在HEV体外培养方面国内外学者做了大量的尝试性研究。Huang等（Huangetal1995）将87AHEV分离株接种在人肺癌细胞A549上，观察接种单层细胞的细胞病变，同时，用ET1.1引物检测不同阶段培养上清中的HEV-RNA，结果发现，87AHEV分离株能够在A549细胞上有效复制。为了筛选HEV的敏感细胞以及合适的培养条件，Le等（Leetal2001）将患有急性戊型肝炎病人的粪便上清在恒河猴体内扩大繁殖，恒河猴的阳性粪便样品上清依次接种人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402和人宫颈癌Hela细胞，同时接种非人灵长类细胞-非洲绿猴肾细胞Vero细胞，通过细胞病变CPE(cytopathiceffect)、RT-PCR和免疫荧光法来测定适合HEV生长的敏感细胞。结果，接种后的第7-9dKMB17、A549、BEL740212 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究细胞出现细胞病变，第1次传代细胞（接种后的11-13d）发生细胞脱落，第10次传代细胞上可以检测到HEVRNA的存在，而Hela和Vero细胞上接种后的第2代到第14代既没有细胞病变，也检测不到HEVRNA。因此，实验条件下KMB17、A549、BEL7402是HEV的敏感细胞，而Hela和Vero细胞对HEV不敏感。Tam等（Tametal1996）用缅甸株HEV感染短尾猴，然后将感染HEV短尾猴的干细胞进行分离培养，在培养的过程中用高度特异的RT-PCR方法可以从培养的肝细胞中检测到HEVRNA的正链和负链，还可以从培养基中检测到HEVRNA的正链，通过高速离心将培养基中的病毒粒子进行了200倍的浓缩，浓缩后的病毒粒子与HEV抗血清作用后可以通过免疫电子显微镜观察到。Tanaka等（Tanakaetal2007）成功地建立了体外培养HEV的PLC/PRF/5肝癌细胞系，HEV子代病毒粒子能够在PLC/PRF/5肝癌细胞系上传代5次，病毒粒子在培养基中存在的时间以及滴度取决4于种子病毒接种的浓度滴度，当以6.4x10滴度接种6孔板上PLC/PRF/5单层细胞时，接种后的第14d可以从培养基中检测到子代病毒，第60d时病毒滴度达到559.1x10，当以8.6x10滴度接种6孔板上PLC/PRF/5单层细胞时，接种后的第12d7可以从培养基中检测到子代病毒，第60d时病毒滴度达到8.6x10，HEV在PLC/PRF/5单层细胞上的最适生长条件是56℃30min，当温度70℃时HEV不能在PLC/PRF/5单层细胞上生长，感染基因1、2、4型HEV病人恢复期的血清含有IgM抗体时可以中和基因3型HEV的生长，表明HEV具有广泛的交叉免疫活性，甚至感染HEV8-24年后的恢复期血清依然能够抑制HEV在PLC/PRF/5单层细胞上的生长，这表明HEV抗体在恢复期血清中能够存在较长的时间，并且能够中和HEV的活性。Divizia等（Diviziaetal1999）用人源和动物源细胞系培养HEV，结果，试验株SAR-55只能在PLC/PRF/5单层细胞上生长且没有任何细胞病变，同时，从埃及亚历山大大帝发热医院收集了患有急性戊型肝炎病人的粪便，将处理之后的粪便样品接种PLC/PRF/5细胞，接种1周后3份样品的血清IgM呈现阳性，1份样品HEVRNA呈阳性，PCR样品测序结果发现该分离株与缅甸株的同源性最高。基于反向遗传学的基本原理，Emerson等（Emersonetal2004）在体外用HEV感染性克隆的体外转录本转染灵长类动物的细胞培养物，结果，7种灵长类动物细胞可以有效支持HEV复制，感染细胞不能传代培养，用转染HEV体外转录本的PLC/PRF/5和Huh-7细胞裂解物接种恒河猴，恒河猴出现感染现象且能够产生HEV粒子，Emerson等进一步用构建了HEV的复制子，该复制子具有ORF2编码框，但是，用绿色荧光蛋白13 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文取代了ORF3编码框，结果，该复制子也能够在支持HEV全基因组复制的灵长类细胞上有效复制，分析表明，HEV5′的帽子结构是HEV保持感染性必需的。Emerson等（Emersonetal2005）对比了强毒株HEV和HAV的热稳定性能，将粪便悬液均加热到45-70℃，然后，将粪便处理物接种敏感细胞系以观察处理物中病毒的感染性，结果发现，HEV不及HAV对热稳定，但是，也很有可能在熟食中存在。兔源HEV近年已经从中国多个地区、美国以及法国分离到，但是，兔HEV的宿主范围、地理分布、潜在的动物传播能力以及在体外细胞培养的能力均没有详细的报道。Jirintai等（Jirintaietal2012）对我国内蒙古一家兔场的211只4个月龄大的兔子进行了HEV抗体以及HEVRNA检测，结果，121只兔子HEV抗体阳性，151只兔子HEVRNA阳性，174个HEV分离株ORF2的核苷酸差异达到了13.6%，与中国其它省市兔源HEV氨基酸的同源性在89.3%-95.9%，三个内蒙古代表株与国内其它兔源分离株全基因序列核苷酸的同源性为79.6%-96.7%。该研究从兔肝脏组织中分离到的HEV能够在人A549和PLC/PRF/5细胞系上生长，表明兔源HEV具有潜在的动物传播风险。灵长类培养模型灵长类动物与人类具有相似的遗传进化特性，灵长类动物感染HEV后与人类感染HEV具有相近的临床表现，因此，灵长类动物是研究HEV首选的实验动物模型。Arankalle等（Arankalleetal1995）用三株流行株和一株印度散发的HEV分离株感染先前感染HEV痊愈的恒河猴，通过血清转氨酶的水平、血清HEV抗体水平以及胆汁和粪便中HEVRNA含量的变化，确定HEV攻毒毒株是否能够再次感染恒河猴，以确定感染痊愈的恒河猴是否对攻毒毒株具有交叉保护作用，结果表明，痊愈的恒河猴能够产生对攻毒毒株的交叉保护作用。Ticehurst等（Ticehurstetal1992）建立了HEV的感染模型，用HEV接种枭猴和食蟹猴对比两种不同类型的动物模型产生HEV抗体和病毒粒子的区别，通过免疫电镜检测发现6只枭猴在接种HEV后的6个月均表现出血清学反应，但是，只有其中三只枭猴表现出肝炎症状，通过对两只枭猴肝脏组织的免疫荧光显微镜观察发现肝脏组织具有HEV相关的抗原，该枭猴急性期的胆汁和粪便中均有HEV存在，食蟹猴更适合HEV的繁殖，5只食蟹猴全部表现出肝炎症状，胆汁和粪便中均有较高水平的HEV抗原，因此，食蟹猴更适合应用于HEV的培养。Tsarev等（Tsarevetal1994）用HEVSAR-55分离株感染短尾猴，通过每周监测丙氨酸氨基转移酶和HEV抗体水平来反映有效的作用剂量，通过14 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究RT-PCR方法确定HEV接种物的感染滴度，结果表明，接种物的浓度越高短尾猴产生肝炎症状的效果越明显，接种物的剂量越低抗体阳转的潜伏期越长。猪培养模型Meng等（Mengetal1998）首次分离鉴定了猪HEV，并且尝试用猪HEV和人HEV分离株感染SPF猪，将自然感染HEV的猪血清通过静脉接种SPF猪，接种后的4-8周血清抗体阳转，没有接种的猪也被感染，接种后的2周可以从鼻腔分泌物和直肠内容物中检测到HEV，并且可以持续4-8周，接种后的4-6周出现病毒血症，病毒血症可以持续1-3周。接种血清的试验猪没有明显的临床症状和肝脏酶类显著5升高的现象。用人源Sar-55和Mex-14分离株，以感染猴的10接种剂量静脉接种SPF试验猪后，试验猪不被感染。Balayan等（Balayanetal1990）用患有HEV急性期病人的粪便提取物上清经静脉和口接种猪，结果表明，猪对HEV具有易感性，人源HEV具有跨物种感染的风险。Halbur等（Halburetal2001）用美国猪分离株和美国人US-2分离株静脉接种SPF试验猪后观察两个不同分离株各自产生的病理变化，结果表明，各试验猪均不表现明显的临床症状，血红素以及肝脏酶类也不明显升高，同时表现为肝脏以及肠系膜淋巴结肿大、肝细胞局灶性坏死、肝细胞浸润等特征，对照组试验猪肝脏损伤很轻微，接种猪源HEV的试验猪肝脏损伤相对较重，接种人源HEV的试验猪肝脏损伤最严重，所有接种HEV的试验猪均可以从粪便、肝脏组织和胆汁中检测出IgG和HEVRNA，显微病理变化表明人源HEVUS-2分离株接种试验猪之后产生的病理变化和肝脏损伤比猪源HEV导致的病理损伤更严重，因此，猪业从业者以及器官移植患者具有感染HEV的机率，猪源HEV具有跨物种感染人的风险。目前，HEV已经从多种动物中检出，兔HEV是近年分离的有别于基因3型HEV的新变种，为了确定鼠源以及兔源HEV是否具有跨物种感染的能力，Cossaboom等（Cossaboometal2012）将20头实验猪分成5个实验组，依次接种PBS、美国兔源HEV分离株、中国兔源HEV分离株和猪源HEV，结果表明，接种兔源HEV的试验组仅有一半试验猪表现出低水平的病毒血症并伴随有HEV排出，试验猪排出的HEV并且能进一步感染实验兔，接种兔源HEV的试验猪未被感染，试验结果初步表明兔源HEV与其它物种HEV具有抗原相关性。巴马小型猪体型较小，是一种比较经济的实验动物，Tang等（Tangetal2016）建立了巴马小型猪的HEV感染模型，巴马猪用基因3型和基因4型HEV接种后表现出了明显的临床症状，所有的试验猪均出现病毒血症并伴随有HEV排出，HEV抗体呈现阳性，部分试验猪15 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文表现为肝脏炎症，巴马猪可以用于HEV跨物种传播的实验动物模型。在欧洲，基因3型HEV主要在人、猪和野猪中传播，Thiry等（Thiryetal2016）观察了野猪源HEV对家猪的潜在感染性，将5头试验家猪中的3头通过静脉接种的方式接种野猪源HEV，另外2头接种HEV阴性的猪肝匀浆液，试验猪在接种后的第8d、9d、10d进行尸体剖解，并且检测血清、胆汁、肝脏、脾脏、十二指肠、空肠、结肠、肺脏、肝脏淋巴结和粪便中的HEVRNA，同时，将12只试验猪分成4个组，依次接种野猪源HEV、野猪源HEV的家猪传代株、家猪HEV分离株和家猪HEV阴性的肝脏匀浆液，并且检测血清、胆汁、肝脏、肝脏淋巴结和粪便中的HEVRNA，结果显示，大多数接种猪在接种后第15d呈现血清阳性，该研究表明野猪源HEV接种后早期出现多个脏器感染，同时说明，野猪源HEV可以通过粪口途径传播给家猪。兔培养模型兔源HEV和哺乳类动物基因1-4型HEV的基因组结构很相似，基因组序列的同源性为77%-79%。为了了解兔子是否可以作为人源HEV感染合适的动物模型，Ma等（Maetal2010）将42只SPF家兔随机分成7个试验组，依次接种两种不同剂量兔源HEV的传代病毒和基因1-4型HEV，接种后每周收集血清和粪便，检测收集血清的HEV抗原、HEVRNA、HEV抗体和丙氨酸氨基转移酶，粪便样品检测HEVRNA，屠宰后观察肝脏样品的组织病理学变化。结果，接种兔源HEV的试验组出现感染现象，粪便中有病毒排出，产生病毒血症和肝炎症状，血清中HEV抗原水平较高，病变严重程度与接种病毒的剂量有关，其中，分离株GDC54-18产生的病变最严重。接种基因4型HEV的试验组，只有两只出现感染现象，接种基因1型HEV的试验组没有表现出感染现象，该研究结果提示家兔只适合做为兔源HEV的动物模型而不适合做人源HEV的动物感染模型。HEV239疫苗近期在中国获批生产，对于一般人群和孕妇该疫苗具有对基因1型和基因4型HEV良好的保护作用，由于HEV具有人兽共患的特性，是否该获批疫苗也能有效保护其它动物不受人源HEV的感染，Liu等（Liuetal2014）将12只SPF家兔随机分成两个试验组，第一组试验兔肌肉接种HEV239疫苗，第二组接种PBS，初次免疫后的第七周，免疫家兔通过静脉注射的方式用猪HEV或者兔HEV攻毒，攻毒后连续10周内观察攻毒兔子血清丙氨酸转氨酶的水平、病毒血症持续的时间、粪便HEV排出以及HEV抗体变化，结果显示，所有HEV239疫苗免疫的家兔均产生了较高水平的HEV抗体，攻毒后未出现感染现象，而接种PBS的试验组攻毒后均出现了肝炎症状、病毒血症、16 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究病毒排泄以及肝脏酶类水平升高的现象，该结果虽然提示目前获批生产的HEV239疫苗能够保护家兔免受同源和异源HEV感染，但是，该研究中对试验兔子的免疫策略参照了对人的免疫策略，如果对兔子大范围开展免疫成本是很昂贵的，为了削减对兔子大范围开展免疫的成本，Zhang等（Zhangetal2015）制定了三套免疫方案并筛选出了最优的免疫方案，结果表明，HEV239疫苗分两次以10μg的剂量免疫家兔产生的免疫效果最佳。有关HEV对怀孕女性和怀孕母畜的危害，不同文献有不同的报道，为了明确HEV对妊娠过程产生的影响，Xia等（Xiaetal2015）建立了怀孕家兔的HEV感染模型，分别用兔源HEV分离株接种6只怀孕家兔和6只未怀孕的家兔，三只怀孕家兔和一只未怀孕的家兔不接种HEV作为对照，结果，2只接种HEV的怀孕家兔出现了流产现象，3只接种HEV的怀孕家兔因出现严重的肝脏坏死而死亡，而且，胎盘中因HEV复制而出现垂直传播的现象，该研究结果表明，HEV感染对妊娠期的女性和母畜能够产生较严重的后果。Han等（Hanetal2014）通过建立SPF兔子的感染模型以研究HEV的致病机制，将8只SPF家兔随机分为两个试验组，一个试验组接种同源的兔源HEV分离株CHN-BJ-rb14，另一个试验组接种异源的猪源HEV分离株CHN-XJ-SW13，结果，3只接种兔源HEV分离株的试验兔出现感染症状，表现为间歇性病毒血症、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶不稳定以及持续性排毒，同时，出现慢性肝炎和肝脏不同程度纤维化，肝脏、大脑、胃、十二指肠以及肾脏中均可以检测到HEV抗原以及HEVRNA的存在。尽管3只接种猪源HEV分离株CHN-XJ-SW13的试验兔子也出现感染现象，但是，病毒血症和排毒时间较接种兔源HEV的实验组要短，肝脏的生物酶类也没有明显的升高。该研究结果表明家兔可以用做兔源HEV的感染动物模型，兔源HEV对家兔可以导致更严重的肝炎病理变化。Mao等（Maoetal2014）观察了HEV在感染家兔中的组织定位分布，结果发现多种组织脏器有HEV分布，特别是小肠部分的淋巴组织HEV分布较多。啮齿类动物培养模型鼠源HEV近年来国内外均有分离鉴定的报道，王艳坤等（王艳坤等2011）建立了长爪沙鼠的感染模型，用HEV患者的粪便上清通过腹腔接种长爪沙鼠，结果长爪沙鼠成功地被感染。贡嘎等（贡嘎等2102）发现SD大鼠是4型HEV的易感宿主。由于缺乏稳定有效的实验动物模型，HEV增殖等一系列生物学特性的研究受到了限制，HE的治疗同样也受到制约，Debing等（Debingetal2016）通过建立无胸17 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文腺的裸鼠动物模型，确定该动物模型能够有效增殖鼠源分离株LA-B350，Debing进一步构建了鼠源分离株LA-B350的感染性克隆pLA-B350和复制子pLA-B350/luc，有趣的是，鼠源HEV对a-干扰素、利巴韦林和霉酚酸的敏感性较基因3型HEV要差，但是，通过构建联合病毒发现利巴韦林也能够有效抑制无胸腺的裸鼠对LA-B350的增殖，该动物模型的建立对今后研究HEV的抗病毒策略提供了思路。Yang等（Yangetal2015）建立了蒙古沙鼠的感染模型，用猪源HEV感染蒙古沙鼠后天冬氨酸转移酶、丙氨酸转氨酶和总胆红素明显升高，接种后的第21d血清中可以检测到HEVIgG，接种后的第7d肝脏中可以检测到HEVRNA，28d达到峰值，接种组试验鼠病毒性肝脏损伤明显，通过免疫组化手段可以从肝脏中检测到HEV抗原，Western-blot检测表明HEVORF3抗原在肝脏中有表达，该研究结果表明蒙古沙鼠可以做为猪源HEV的感染模型。为了明确不同基因型HEV跨物种感染的特性，Li等（Lietal2013）建立了威斯塔裸鼠的感染模型，分别用基因1、3、4型HEV和鼠源HEV通过静脉注射的途径感染不同分组的威斯塔鼠，采用RT-PCR和ELISA方法检测粪便和血清样品中的HEVRNA和HEV抗体，结果，接种基因1、3、4型HEV的试验组没有检测到HEVRNA和HEV抗体，血清样本也没有谷丙转氨酶升高的现象，而接种鼠源HEV的试验组HEVRNA和HEV抗体均呈现阳性，该研究结果表明威斯塔鼠对鼠源HEV比较易感，而对基因1、3、4型HEV并不易感。Huang等（Huangetal2009）建立了Balb/c裸鼠的感染模型，将猪源HEV同时通过口腔和静脉注射的途径感染Balb/c裸鼠，结果Balb/c裸鼠成功地被感染，感染裸鼠的肝脏、脾脏、肾脏、空肠和结肠均有HEV抗原和HEVRNA表达，肝脏和脾脏的组织病理学病变明显，肝脏的谷草转氨酶、碱性磷酸酶和HEVIgG的水平明显增加，Balb/c裸鼠对猪源HEV相对易感，可以用做HEV致病机制研究的实验动物。1.2.3不同物种戊型肝炎病毒的研究史人源HEV戊型肝炎病毒最初的研究起因于印度一家研究所对肝炎患者的血清学检测，该研究所对疑似甲肝患者的血清进行抗体检测时没有检测到对应的甲肝抗体，因此，研究者便推断有经肠道传播的新的病毒性肝炎。继而Balayan等科学家于1983年从前苏联一名患者的粪便中也观察到类似病毒的存在，曾经一度戊型肝炎病毒被认为是杯状病毒科的成员。1990年第一株人源HEV被成功克隆并测序（Tametal1991），18 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究直到2004年第8次国际病毒分类委员会(TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)上，该分离病毒被初步列为戊型肝炎病毒科(FamilyHepeviridae)，戊型肝炎病毒属(GenusHepevirus)，该分离病毒为本科属下唯一的成员，戊型肝炎病毒最终在第12届国际病毒性肝炎和肝病研讨会上进行了规范的分类划分。猪源HEV猪是主要的存储宿主和放大器之一，Balayan等曾用亚洲株人源HEV感染圈养猪，圈养家猪经口腔以及静脉接种HEV后出现急性肝炎症状，一周之后粪便中可以检测到HEVRNA并且可以持续三周，该研究结果证实圈养家猪对人源HEV具有易感性，但是，后续的研究证实Balayan等建立的猪感染模型中所用的HEV并非人源HEV而是猪源HEV（Luetal2004）。Meng等（Mengetal1997）首次分离鉴定了猪源HEV，并证实美国猪源HEV分离株与当地人源HEV分离株的抗体具有交叉反应的特性，ORF2编码框氨基酸的同源性为90%-92%，ORF3编码框核苷酸和氨基酸的同源性依次为83%-85%和77%-82%，Meng进一步证实猪源HEV可以跨物种感染非人灵长类动物，人源HEV接种试验猪后部分毒株表现出感染性，这一实验间接提示猪源HEV具有跨物种感染人的风险，Meng等对猪源HEV的研究揭开了动物源性HEV研究的新篇章（Mengetal1998）。禽源HEVPayne等（Payneetal1999）首次报道了澳大利亚鸡肝脾肿大的疾病，并将单克隆抗体技术和RT-PCR技术引入对鸡肝脾肿大疾病病原(bigliverandspleendiseasevirus，BLSV)的分析，通过分析发现鸡肝脾肿大病原在扩增区域处523bp的核苷酸与人源HEV解螺旋酶基因核苷酸序列的同源性为62%。Haqshenas等从北美肝脾肿大的鸡群中分离到一株未知的病毒，通过对该未知病毒的遗传学分析发现该病毒与HEV的基因组结构极其相似，核苷酸序列具有高度同源性，为了将该病毒与人源和猪源HEV相区别，将该病毒暂时定名为禽HEV，进一步电子显微镜观察发现该分离病毒为直径约30-35nm的没有囊膜的病毒粒子，基因组长约4kb，包括三个完整的开放阅读框，解螺旋酶基因是禽HEV和其它HEV之间最保守的基因，氨基酸的同源性为58%-61%，核苷酸的同源性为57%-60%，序列比对分析显示北美肝脾肿大鸡群HEV与澳大利亚鸡肝脾肿大疾病病原核苷酸序列的同源性为80%。Huang等（Huangetal2002）对加利福尼亚州、美国科罗拉多州、康涅狄格州、弗吉尼亚州和威斯康辛州不同年龄和不同品种的鸡群进行了系统的血清流行病学调查，结果发19 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文现禽HEV在调查地区广泛流行。Sun等（Sunetal2004a,Sunetal2004b）进一步对美国鸡源HEV进行了分子病毒学研究，并且首次证实鸡源HEV可以跨物种感染火鸡。Moon等（Moonetal2016）从韩国患有肝脏破裂、脾脏肿大和腹部脂肪沉积的种肉鸡中分离到基因2型鸡HEV，该分离株与美国和西班牙鸡HEV分离株在遗传进化上处于同一分支，韩国鸡源HEV基因1型和基因2型分离株的鉴定有助于对全球禽源HEV分布的再认识。在国内，周恩明教授研究团队分离并鉴定了国内第一株鸡源HEV(CaHEV)，并建立了快速、特异、重复性较好的实时定量RT-PCR检测方法，该方法能够从血清、肝脏、脾脏和粪便样品中检测禽HEVRNA，检测效果比常规RT-PCR方法准确性高（Zhaoetal2015）。进一步阐明鸡源HEV存在与人源HEV和猪源HEV共同的抗原表位，这一研究结果提示禽HEV具有跨物种感染人的潜在性（Wangetal2014,Wangetal2015）。为了研究禽源HEV的感染性及致病机制，Park等（Parketal2015）采用反向遗传学技术构建了韩国基因1型禽源HEV的感染性克隆，并且证实禽源HEV开放阅读框ORF1中高度变异的区域对于调节病毒的感染性和致病性具有重要的作用。鹿源HEV一些间接证据表明戊型肝炎可以在人和鹿之间跨物种传播，Tei等（Teietal2003,Teietal2004）对临床感染戊型肝炎的病例做了研究，发现研究对象曾在6-7周之前有生吃鹿肉的生活史，进一步研究表明，患病病人的HEVRNA和当初食用鹿肉中HEVRNA的核苷酸序列完全一致，这一结果不仅直接支持戊型肝炎是人兽共患病的理论，而且说明戊型肝炎可以跨物种从鹿感染人。为了进一步阐明生吃鹿肉感染戊型肝炎的危险性，Tei等对日本西部地区45名曾有生吃鹿肉的志愿者和该地区从未接触鹿肉的志愿者从年龄和性别两个层面分析感染戊型肝炎的差异，结果表明生吃鹿肉是造成感染戊型肝炎的危险因素。Boadella等（Boadellaetal2010）首次对西班牙赤鹿感染戊型肝炎的状况进行了流行病学调查，结果发现调查鹿群的抗体阳性率为10.4%，HEVRNA阳性率为13.6%。Choi等（Choietal2013）从韩国南部地区一名4岁患有急性肝炎症状的病人血清中分离到基因4型HEV，流行病学追溯调查表明该病人也有食用生鹿肉的生活史。Di等（Dietal2017）对意大利251头赤鹿感染戊型肝炎的状况进行了调查研究，结果发现，意大利赤鹿流行的戊型肝炎病毒为基因3型。在西欧，本土戊型肝炎感染的病例很大程度上与接触当地家养和野生的动物有关，为了研究鹿传染戊型肝炎的潜在性，Neumann等（Neumannetal2016）20 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究对德国2011-2012年间北部森林地区的赤鹿和2012-2013年间南部森林地区的麅鹿，以及2000-2001年间德国国家公园的赤鹿、麅鹿和扁角鹿进行了系统的流行病学调查，结果表明，所调查的三个品系鹿种均有不同程度的HEV感染。Weger等（Wegeretal2017）对加拿大白尾鹿、长耳鹿和北美洲驯鹿三个不同的品系鹿进行了流行病学调查，结果表明，当地鹿群依然存在戊型肝炎流行的情况。Zhang等（Zhangetal2015）对我国内蒙古、吉林和黑龙江省2012-2013年梅花鹿感染HEV的情况进行了系统的流行病学调查研究，并从性别、地域和时间分布等因素进行了对比研究，结果表明，调查省市鹿群均有HEV感染的状况，这是国内鹿感染戊型肝炎比较系统的研究报道。啮齿类HEV啮齿类动物也存在HEV感染的状况，Kabrane-Lazizi等（Kabrane-Lazizietal1999）对美国马里兰、夏威夷和路易斯安那的239份鼠血清进行了HEV抗体检测，结果，抗体阳性率依次为77%、90%和44%，来自城市和乡村的血清样本均有阳性的，随着检测鼠的年龄增加抗体阳性率也逐渐增加，自此，HEV的传播方式和易感动物引起了美国当地研究部门的高度关注。Favorov等（Favorovetal2000）对美国啮齿类动物感染戊型肝炎的状况进行了相对比较系统的报道，采用EIA方法对15个属26个种的806份血清进行了HEV抗体检测，结果表明鼠类的感染率最高，采自城市的血清样品阳性率要高于乡村的阳性率。为了进一步研究HEV的分子生物学特性，Jirintai等（Jirintaietal2014）建立了鼠源HEV的细胞培养模型，将印度尼西亚野鼠的肝脏混悬液接种到人的肝癌细胞上，结果发现，鼠源HEV能够在PLC/PRF/5、HuH-7和HepG2上进行有效地复制，该发现为进一步揭示HEV的致病机制、阐明病毒复制和研究病毒的蛋白功能奠定了理论基础。Li等（Lietal2015）将HEV分离株R63/DEU/2009的全基因组序列克隆在T7启动子的下游，体外转录后通过肝内注射途径接种裸大鼠，结果，血清和粪便HEVRNA呈现阳性，将阳性的粪便悬液通过静脉注射的途径接种裸鼠和威斯塔鼠，裸鼠的血清和粪便悬液均呈现HEVRNA阳性，该研究成功地构建了HEV的感染性克隆，并且证实裸鼠可以有效地用做HEV复制的实验动物模型。Lack等（Lacketal2012）对美国以及其它国家的446只老鼠肝脏组织进行了HEVRNA的半巢式PCR检测，结果发现美国鼠类流行的HEV属于基因3型。为了研究啮齿类动物在HEV传播中的作用，Kanai等（Kanaietal2012）对猪源HEV流行地区的56只老鼠内脏器官进行了HEVRNA检21 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文测，血清样本进行了HEV抗体检测，HEVRNA阳性的样本用A549细胞进行病毒分离，结果表明，检测地区的鼠类中流行的HEV同样属于基因3型，其中，肝脏和脾脏中病毒RNA的检出率较高，鼠源HEV可以用A549细胞进行分离培养。Purcell等（Purcelletal2011）从美国洛杉矶的鼠中分离到两株鼠源HEV，分离株可以感染SD大鼠，感染强度相对较高，但是，感染持续的时间不久，病毒血症较感染裸鼠严重，分离毒株的核苷酸序列与德国鼠源株具有较高的同源性，分离毒株不能感染非人灵长类，说明本分离毒株不具有跨物种感染人的潜在性。兔源HEV兔源HEV是近年来鉴定的HEV新变种，Zhao等（Zhaoetal2009）首次克隆并测序了国内兔源HEV，对于两株兔源HEV遗传演化分析表明，其与基因1,2,3,4型HEV以及鸡源HEV的同源性依次为74%,73%,78%-79%,74%-75%和46%-47%，该研究为HEV的基因分型提供了新的信息，并且提示哺乳类动物存在新的HEV变种。兔源HEV与已经报道分离的其它哺乳类动物和禽类HEV具有遗传相关性，但是，又是区别于哺乳类动物的HEV新变种，为了了解兔源HEV的传播方式以及兔源HEV的遗传演化特征，Geng等（Gengetal2011）对采自中国境内10个地区不同品种的1094份兔血清样本进行了HEV抗体、HEV抗原以及HEVRNA检测，结果表明，抗体阳性率为15.4%，其中，武汉地区的阳性率最高，遗传进化分析表明所有分离株与已知的兔源HEV分离株处于同一分支，而与基因1-4型HEV不在同一分支。Cossaboom等（Cossaboometal2012）最近鉴定发现美国兔源分离株HEV不属于基因3型HEV，并首次表达纯化了分离毒株的衣壳蛋白，结果发现兔源分离株HEV的衣壳蛋白可以和鼠、禽、猪以及人的HEV发生血清学交叉反应。为了了解兔源HEV分离株的潜在传播性以及致病机制，Liu等（Liuetal2013）用中国兔源分离株HEV实验感染了猴子，结果发现接种HEV的猴子表现出了典型的肝炎症状，譬如：病毒血症、肝脏相关酶类升高以及粪便持续排毒现象，全基因组测序发现兔源HEV在实验猴传代的子代病毒与原病毒的同源性为99.8%，该研究表明兔源HEV可以在猴子成功培养传代。为了了解兔源HEV的流行趋势以及兔源HEV的分子特征，Izopet等（Izopetetal2012）对法国2009年的200份胆汁样品和2007-2010年间的205份肝脏样品进行了HEVRNA检测，结果表明阳性率依次为7%和23%，与基因1-4型HEV的同源性为72.2%-78.2%，该研究也表明欧洲地区HEV的动物宿主也有逐步扩大的趋势，兔源HEV具有人兽共患的潜在性。Cossaboom等22 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究（Cossaboometal2012）分离鉴定了第一株美国兔源HEV的全基因组序列，遗传进化分析表明美国兔源HEV分离株不属于基因3型HEV，其中，ORF1的X结构域有90个核苷酸的插入，该插入序列可能与HEV的物种趋向性有关。猫鼬HEVLi等（Lietal2006）对日本冲绳地区的84份猫鼬血清进行了HEV抗体和HEVRNA检测，结果84份检测样品中7份样品HEV抗体阳性，所有样品HEVRNA呈现阴性。Nakamura等（Nakamuraetal2006）对日本冲绳的100猫鼬进行了流行病学调查，结果，21只猫鼬HEV抗体阳性，其中，1只猫鼬HEVRNA呈现阳性，对该阳性猫鼬的HEV全基因组进行了克隆测序，结果表明，猫鼬分离株属于基因3型HEV的新亚型，进一步分析发现，该分离毒株与当地猪源HEV分离株具有核苷酸序列的高度同源性，因此，研究结果提示HEV有可能在猪与猫鼬之间相互传播。时隔6年之后，Nidaira等（Nidairaetal2012）再次对日本冲绳地区猫鼬感染HEV的情况进行了流行病学调查，结果表明，209份检测样品中6份样品HEVRNA阳性，遗传进化分析表明分离毒株属于基因3型HEV，并且分为A、B两个亚群，其中，B亚群与之前报道的HEV具有核苷酸序列的高度同源性。其它动物HEV除了上述动物宿主已被证实感染HEV之外，猫（Okamotoetal2004）、狗（Liangetal2014）、鸽子、绵羊、山羊、牛、驴以及马（Zhangetal2008）等多种动物也有HEV感染的报道，作为一种新型的人兽共患病，尚需要进一步加大流行病学检测的宿主范围。1.2.4HE的流行病学国内外流行概况目前，亚洲地区已有12个国家有戊型肝炎暴发的历史，包括印度尼西亚（Jenningsetal1994,Corwinetal1995,Sedyaningsih-Mamahitetal2002）、缅甸（Uchidaetal1993）、越南（Corwinetal1996）、日本（Nakanoetal2006）、中国（Ayeetal1992）、孟加拉国（Harun-Or-Rashidetal2013,Gurleyetal2014）、巴基斯坦（Iqbaletal1989,Tsarevetal1992,Bryanetal1994,Rabetal1997,Bryanetal2002,Siddiquietal2005）、尼泊尔（Claysonetal1998）、伊拉克（Al-Nasrawietal2010）、乌兹别克斯坦（Sharapovetal2009）、土库曼斯坦（Albetkovaetal2007）和印度（Sreenivasan23 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文etal1978,Khuroo1980,Sreenivasanetal1984,Rayetal1991,Naiketal1992,Skidmoreetal1992,Arankalleetal1994,Singhetal1995,Banerjeeetal2005,Singhetal2006,Dasetal2007,Sargunaetal2007,Balietal2008,Sailajaetal2009,Martoliaetal2009,Swainetal2010,KhurooandKhuroo2010,Chauhanetal2010,Viveketal2010,Viswanathan2013,Majumdaretal2013,Awsathietal2014,Tambeetal2015）(Fig.5)。图5.戊型肝炎暴发流行全球分布（苏丹和南苏丹视为同一个国家）Fig.5TheGlobalHEVoutbreakdistribution(Note:SudanandSouthSudanareregardedasonecountry)在亚洲，戊型肝炎首次确认暴发于印度，在这期间发现疑似病例约29000例，此后，戊型肝炎在印度再次流行，其中，1990年12月至1991年4月，规模最大的一次暴发流行发生于印度的坎普尔，期间，大约有79000例疑似病例的报道，患病率达3.76%。巴基斯坦曾经有4次戊型肝炎暴发的报道，首次暴发发生于1987年3月至4月，最大一次水源性传播暴发发生于伊斯兰堡地区，感染人数达3827人。孟加拉国有两次暴发流行的报道，自伊拉克战争之后，中东地区的戊型肝炎曾于2005在伊拉克暴发。亚洲中部地区最大一次戊型肝炎暴发发生于土库曼斯坦，此次暴发共计报道16000例可疑病例。在中国，规模最大的戊型肝炎暴发于1986年9月至1988年4月发生在新疆南部地区，共计发病119280例，死亡707例，是迄今为止世界上规模最大的一次流行。非洲地区14个国家有戊型肝炎暴发的报道，包括埃及（Shataetal2012）、肯尼24 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究亚（Mastetal1994,Ahmedetal2013）、苏丹和南苏丹（McCarthyetal1994,Guthmannetal2006,Bocciaetal2006,Rayisetal2013,Thomsonetal2013）、中非共和国（Escribàetal2008,Goumbaetal2010,Goumbaetal2011）、乌干达（Teshaleetal2010,Teshaleetal2010,Howardetal2010,Cummingsetal2014,Gerbietal2015）、乍得（Anonim2004）、吉布提共和国（Coursagetetal1998）、阿尔及利亚（Grandadametal2004）、纳米比亚（Isaäcsonetal2000）、摩洛哥（Benjellounetal1997）、索马里（Bileetal1994）、埃塞俄比亚（Tsegaetal1991）、南非（Robsonetal1992）和喀麦隆（Mauriceetal2013）(Fig.2)。在非洲，首次规模较大的暴发流行于索马里，本次流行导致140个村庄全部感染，确诊病例达11000例。在最近十年，非洲地区由于战乱和冲突的发生导致难民不断迁移，其中，肯尼亚、南苏丹和苏丹地区曾有数百万人感染戊型肝炎。欧洲和美洲仅有少数几次暴发流行的报道，在欧洲，英国一艘环球远航船只在结束远航之后，可能由于接触鱼贝类的原因，曾有船员暴发基因3型戊型肝炎的报道，其中，789名船员HEVIgM呈现阳性（Saidetal2009），意大利曾经有戊型肝炎小规模暴发的报道，5例确诊病例全部为基因4型戊型肝炎（Garbugliaetal2013）。在美洲，戊型肝炎首次于1986年暴发于墨西哥，有超过200例病例的报道（Velázquezetal1990），自此之后，墨西哥再无戊型肝炎暴发的报道。古巴曾经有两次戊型肝炎暴发的报道（Villalbaetal2008）。流行特征戊型肝炎全年均可发生，流行特征与HEV的基因型密切相关，流行的基因型分布呈现一定的地域特性，HEVORF2和ORF1是基因型分布研究的主要依据，根据HEV的全球分布，基因1型和基因2型HEV主要在亚洲和非洲地区暴发流行，基因3型和基因4型主要在欧洲地区小规模流行，在亚洲，基因1型HEV较基因2型流行更广泛，而且，几次大规模暴发流行均由基因1型HEV导致，譬如，1986-1988年暴发于中国新疆南部地区的大流行就是由基因1型HEV所致(Fig.6)。戊型肝炎的时间以及年龄分布也呈现出一定的规律性，基因1型和基因2型HEV主要发生于冬春季节，以洪水和雨季较多，感染人群以15-40岁的青壮年为主，其中，亚洲、非洲和美洲等发展中国家主要由水源污染所致，基因3型和基因4型HEV以散发为主，全年均发，感染人群以40岁以上的中老年人为主（文心田等2011）。25 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文图6.戊型肝炎暴发流行的基因型分布（苏丹和南苏丹视为同一个国家）Fig.6HEVgenotypedistributionresponsiblefortheoutbreaks(Note:SudanandSouthSudanareregardedasonecountry)传染源研究表明，戊型肝炎在人与人之间是传播的，其中，临床感染患者和亚临床感染患者均具有传染性。前已述及，人以及非人灵长类动物、猪、禽、鹿、啮齿类动物、兔、猫鼬、野猪、马、狗、猫、牛、驴等动物在HE的流行中具有直接或者潜在的传播作用。传染途径粪-口途径传播粪-口传播途径是戊型肝炎最常见的感染途径，其中，肠道传播是主要途径，因此，1989年9月，在日本东京召开的国际肝病学学术会议之前曾经一度把戊型肝炎称为肠道传播的非甲非乙型肝炎。经口途径的传播主要包括水源污染和食物污染，主要是由于含有HEV的粪便污染地表或者地下水源导致饮用水源污染，水源性污染的粪口传播途径主要发生在热带和亚热带地区。世界上首次因为水源性污染的粪口传播暴发于印度的新德里（Viswanathan2013），南索马里亚曾经一度因为河水污染导致戊型肝炎急性暴发，其中，三个村庄的村民全部患病，97.6%的患病病人出现黄疸现象（Mushahwaretal1993）。中国新疆南疆地区曾经出现的人源戊型肝炎急性暴发流行也是因为水源持续污染所致，由此可见，水源污染导致的戊型肝炎流行往往具有大规模急性暴发的特点，因此，防止水源污染是预防戊型肝炎流行的首要因素。血液传播26 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究静脉注射比粪口传播的途径更直接，静脉输血是感染戊型肝炎的最直接途径，为了研究戊型肝炎的肠外传播途径，Khuroo等（Khurooetal2004）对145名输血病人和250名健康人群进行了回顾性调查研究，结果表明，输血传播是戊型肝炎传播最危险的因素，频繁的输血传播增加了对献血政策的再思考，特别是戊型肝炎的流行地区，更应该注意防止输血感染。Gotanda等（Gotandaetal2007）对日本红十字血液中心丙氨酸氨基转移酶升高的6700份血清进行了HEVRNA,IgG,IgM和IgA检测，结果表明，大约3%具有戊型肝炎亚临床感染的现象。Xia（Xiaetal2004）等用10ml戊型肝炎病毒血症的血浆通过静脉注射罗猴，并通过病毒学技术、免疫学技术、生物化学技术，结合组织病理学技术确定接种罗猴出现急性戊型肝炎感染的症状，该研究进一步警示，戊型肝炎流行地区的输血途径增加了感染戊型肝炎的风险。Parsa等（Parsaetal2016）对伊朗2014年1月至3月专门为战争供血组织捐赠的700份血清样品进行了HEVIgG和IgM以及HEVRNA检测，结果，7.1%的血清样品HEV抗体阳性，其中，7份血清HEVRNA阳性，对阳性样品的测序结果表明分离病毒属于基因1型HEV，为了降低血液传播戊型肝炎的风险，血液管理部门应当对志愿者捐赠的血液进行彻底筛查。母婴垂直传播研究表明，孕妇感染HEV后可通过垂直传播的方式感染婴儿，Khuroo等（Khurooetal1995）对妊娠期第3个月感染HEV8名孕妇的婴儿进行了持续观察，其中，一名婴儿出生之后就有黄疸并伴有转氨酶升高的现象，四名婴儿出现无黄疸型肝炎，一名婴儿出生之后因出现低血糖于24h之内死亡，一名婴儿出现大面积肝脏坏死，其中，五名婴儿的出生血液和脊髓中可检测到HEVRNA的存在，六名婴儿可以确诊HEV感染，该研究表明孕妇感染HEV可以导致婴儿感染并增加围产期的发病率和死亡率。为了研究HEV对怀孕的影响，Xia等（Xiaetal2015）建立了怀孕兔子的HEV感染模型，并比较研究了HEV对怀孕和未怀孕兔子的影响，采用RT-PCR方法检测HEVRNA，ELISA方法检测HEV抗体，采用免疫组化和组织病理学技术检测HEV抗原，结果表明，感染HEV的怀孕母兔表现出严重的肝脏损伤，HEV在胎盘中复制导致垂直传播发生。Troxler等（Troxleretal2014）对曾经有禽HEV流行的种鸡群持续进行了HEV监测，结果发现HEV在调查鸡群持续存在并呈现亚临床循环式感染，HEV在鸡群中可以垂直感染。食源性传播27 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文食源性传播可以导致戊型肝炎的小范围流行和散发病例出现。Matsuda等（Matsudaetal2003）报道曾经有因吃未经过烹饪的猪肝而发生戊型肝炎感染的事件是戊型肝炎食源性传播的有效证据，Yazaki等（Yazakietal2003）对日本北海道10名感染急性戊型肝炎的患者进行了调查，结果发现，9名患者在疾病出现的2-8周之前曾有食用烤猪肝和未经烹饪生猪肝的经历，进一步流行病学追溯调查发现，该肉品销售店出售的猪肝有HEV污染的情况。其中，1株猪肝HEV分离株的部分核苷酸序列与1名86岁患者HEV分离株HE-JA18具有100%同源性，该研究结果表明未经烹饪的猪肝具有传播戊型肝炎的可能性。Miyashita等（Miyashitaetal2012）发现污染HEV的猪脏器甚至猪肉均可将戊型肝炎传播给消费者。易感动物及高危人群研究表明，各年龄段人群均为HEV的易感人群，且HEVIgG抗体随年龄增大有明显增加的趋势，孕妇和婴儿相对较易感，孕妇感染HEV后死亡率较高，而且在妊娠期的三个月尤其易患戊型肝炎（Huangetal2015,Renouetal2014），但是，其致病机理尚不清楚。Cheng等（Chengetal2013）对2003-2012年间中山大学第三附属医院的294名患者进行了调查，结果发现慢性乙型肝炎肝硬化能够加重感染戊型肝炎的临床症状。除此之外，与家畜有密切接触的职业人群感染HEV的风险较高。1.2.5HE的临床症状及免疫损伤感染戊型肝炎后肝脏组织病理学主要表现为毛细胆管内胆汁淤积、典型的门脉区炎症、淋巴细胞出现坏死性炎症以及细胞浸润现象，恢复期肝细胞坏死消退，部分肝细胞水样变性。戊型肝炎病毒感染后的表现分为临床型和亚临床型，亚临床型戊型肝炎可能不发病，而仅仅引发感染机体的免疫反应过程而最终产生HEV抗体，亚临床型儿童比较多见，成人临床型较多见，可分为急性黄疸型、急性无黄疸型、淤胆型和重型型。急性黄疸型戊型肝炎急性黄疸型戊型肝炎发病较急，并伴有发热、咳嗽、头痛等上呼吸道症状，进而出现食欲下降、恶心、腹泻等消化道症状，患病病人的肝脏肿大，尿液颜色逐渐加深，部分病人脾脏肿大，急性黄疸型可以持续2-4周。急性无黄疸型戊型肝炎其临床症状和体征表现较急性黄疸型戊型肝炎要轻，病人一般不表现明显的临28 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究床症状，呈现亚临床经过。淤胆型戊型肝炎临床症状和甲型肝炎基本相似，但是，患病率要较甲型肝炎高。重型型戊型肝炎多见于孕妇和慢性乙型肝炎感染者，尤其是妊娠晚期的孕妇可以导致早产或者流产，孕妇死亡率可以达到20%，产后大出血；慢性乙型肝炎患者合并感染HEV后可以使得肝脏病情加重，恢复期的黄疸不易消退，可以并发胆管炎、胆囊炎等病症。1.2.6HE的检测方法免疫电子显微镜技术（IEM）急性期戊型肝炎患者的粪便和胆汁标本中存在HEV颗粒，但是，由于HEV的排毒时间很短，加之HEV在环境中不稳定，完整的HEV颗粒相对较少，免疫电镜技术的灵敏性和重复性较差，因此，免疫电镜技术无法在临床检测中广泛使用。免疫荧光技术（IFA）基于抗原抗体特异性反应的原理，戊型肝炎病毒感染期间，动物肝细胞中有戊型肝炎病毒特异性抗原表达，利用荧光素标记的HEV特异性抗体可以检测肝细胞中特异的HEV抗原。分为直接荧光技术法和间接荧光技术法，直接荧光技术法是利用荧光素标记的HEV特异性抗体直接与待检标本中的HEV特异性抗原反应从而达到检测戊型肝炎病毒的目的，间接荧光技术法是利用HEV抗体阻断荧光素标记的HEV抗体与待检标本中HEV抗原反应而达到检测戊型肝炎病毒的目的。免疫印迹(WB)免疫印迹技术目前没有商品化的试剂出售，而且检测时间较长，因此，主要用于实验室检测，是利用基因工程表达的HEV特异的重组蛋白来检测血清中HEV的特异性抗体。酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验是目前国内外检测戊型肝炎最常用的方法，可以利用体外表达的各种重组蛋白检测血清中HEV的特异性抗体，目前，商品化生产用于HEV抗体检测的抗原主要有合成肽抗原和基因工程表达的抗原，在国外，第1代HEVELISA试剂盒是基于墨西哥株和缅甸株的表达抗原进行包被生产而成，该试剂盒由美国29 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文Grenelabs公司生产，在国内，北京万泰生物药业股份有限公司利用基因工程表达产物研发出针对检测戊型肝炎的系列试剂盒，并在临床检测中得到了广泛的应用。RT-nPCR检测技术RT-nPCR具有高度敏感性和特异性，可以广泛用于血清、组织、粪便和其它标本中HEVRNA检测，该技术利用简并引物检测出了不同基因型的HEV，实际应用中要注意样品的新鲜性，避免RNA降解的情况，同时，要避免操作过程的交叉污染。荧光定量PCR技术荧光定量PCR检测技术的特异性、灵敏性和精确性均较传统的PCR技术要高，而且可以用于HEV的基因分型，是今后HEV检测的发展方向。1.2.7HE的疫苗研究由于没有有效的细胞培养模型，因此，无法研制HEV的弱毒苗和灭活苗，开发基因工程疫苗和核酸疫苗是戊型肝炎防控的根本手段。原核细胞表达策略大肠杆菌表达系统具有技术成熟和培养成本低的优点，Xia等（Xiaetal2016）利用基因工程表达策略将HEV的保护性抗原与轮状病毒和星状病毒的刺突蛋白抗原在大肠杆菌表达系统中进行了融合表达，并将该融合表达疫苗与三种病原各自表达成分的混合疫苗进行了小鼠免疫实验，结果表明，融合表达疫苗产生HEV抗体的效果较混合疫苗好。Li等（Lietal2015）利用大肠杆菌表达系统将基因1型HEVpORF2aa368-606进行表达，研发出HEV239疫苗，并从生物物理学、生物化学和免疫化学的角度评价了该疫苗的质量，结果表明，HEV239疫苗具有相对较高的免疫功效，该疫苗目前已经进入三期临床试验阶段，并进一步观察了该疫苗的安全性和免疫效果。Behloul等（Behlouletal2015）将不同基因型HEVORF2编码框的452-617位氨基酸进行了表达，并预测了表达产物p166s的晶体结构，表达产物p166s用于间接ELISA检测HEVIgM和IgG抗体，结果表明，483-533位氨基酸具有潜在的抗原性，其中，488,489,512,533,483和530位氨基酸发挥了主要作用。Li等（Lietal2015）利用大肠杆菌表达系统表达了HEV的衣壳蛋白VLP，并且通过大规模的临床试验进一步观察了表达产物的抗原性和免疫原性，结果表明，该抗原位点具有很好的抗原性，在此基础之上，该团队研发出了第一个商业化的HEV疫苗。真核细胞表达策略30 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究真核表达系统的再修饰功能使得表达产物具有生物学活性，Baechlein等（Baechleinetal2013）利用利什曼原虫建立了HEV新的表达系统，将猪HEV分离株的ORF2截短蛋白定向克隆到包含部分利什曼原虫基因组的质粒中，该表达质粒可以通过C端组氨酸标签进一步对表达的ORF2蛋白进行纯化，该表达蛋白用于ELISA进行血清学分析具有很好的免疫反应活性。Chen等（Chenetal2014）将HEVORF3基因通过RT-PCR扩增后定向克隆到pDsRed-Monomer-N1哺乳动物表达载体的多克隆位点，将构建的重组质粒转染BHK-21细胞，结果表明，该表达系统可以成功表达HEVORF3蛋白。Farshadpour等（Farshadpouretal2015）通过人工合成的方式构建了包含HEVORF2和截断ORF2的tPAsp-PADRE表达元件，分别将构建的表达元件亚克隆至pVAX1表达载体中，并在真核细胞中进行表达，结果表明，构建的表达元件均可以在真核表达系统中进行表达，该表达元件可以做为新的HEV候选疫苗。DNA疫苗DNA免疫是近年来HEV疫苗研发的新方向，Yang等（Yangetal2010）将基因4型HEV中国分离株的中和表位HEV-p179分别与人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽序列tPA和三个串联的鼠补体成份C3d进行融合，并用融合的DNA对小鼠进行免疫，通过分析发现用tPA-p179-C3d3DNA疫苗免疫小鼠产生抗体的水平显著高于用p179和tPA-p179DNA疫苗免疫的水平，tPA-p179-C3d3DNA疫苗的成功研发克服了常规HEVDNA疫苗免疫活性水平不高的不足。Deshmukh等（Deshmukhetal2007）采用基因枪技术将编码HEV囊膜蛋白的ORF2基因序列免疫小鼠能够产生特异显著的体液和细胞免疫反应，将ORF2编码区的中和表位NE采用基因枪技术免疫小鼠同样可以刺激小鼠产生HEV相应的免疫反应。Hong等（Hongetal2005）将HEV部分结构蛋白编码基因ORF2和全长的ORF3基因嵌合克隆到真核表达载体pcDNA3，用该嵌合表达质粒pcHEV23做为DNA疫苗采用静脉注射的途径接种BALB/c小鼠，结果，所有免疫小鼠在2-3次接种后均产生HEVIgG，并出现特异的T淋巴细胞增殖，该研究结果提示将HEVORF2和ORF3嵌合表达的DNA疫苗能够诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。31 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文1.2.8HE的预防与控制预防HEV的感染应当从传染病流行的三个环节入手，首要工作是切实改善流行地区的卫生，切断传染病流行的传染途径，尤其要保持饮用水源的卫生，避免饮用不洁净的水；其次，相关部门要加大对传染源的监测，尤其要加大对食源性传染源的监测，杜绝摄入未经烹饪的动物源性食品，特别是动物内脏；针对易感人畜积极研发广谱有效的疫苗是根本手段，目前，厦门大学夏宁邵团队研发的HEV239疫苗是临床应用前景比较乐观的疫苗之一，该疫苗在16-65岁的受试人群中经过3次免疫接种后取得了100%的免疫保护效果，并于2012年在我国进行商业化生产，是否HEV239疫苗能够在其它国家推广应用，以及是否能够抵抗其它基因型HEV的感染尚需进一步的实验验证。1.3问题与展望戊型肝炎做为一种新型的人兽共患病，不同地区分离株的基因型以及生物学特性往往有所差别，对于HEV分子生物学的研究存在诸多需要解决的问题：首先，虽然血清学已经证实多种畜种曾有感染HEV的病史，但是，尚需要从分子生物学和病原学的水平进一步确证；其次，目前，市售试剂对戊型肝炎检测所采用的抗原有所差别，临床检测中可能存在漏检或误检的情况，不论在发展中国家还是在发达国家戊型肝炎的宿主动物不断被发现，但是，HEV在生态环境中的分布规律、流行规律等流行病学特征仍缺乏系统的研究，这些尚未系统解决的问题或许将成为HE大流行的重大隐患；再次，为了彻底从源头上理清HEV的遗传进化关系、HEV的致病机理、HEV跨物种传播的机制以及不同物种HEV分离株的生物学特性，急需建立一套稳定有效的HEV体外培养系统。32 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究1.4本研究目的和意义戊型肝炎的危害逐年增加，根据世界卫生组织的统计报道，全球每年感染戊型肝炎的人数大约有2000万，其中，约有330万人表现出戊型肝炎症状，5.66万人死于戊型肝炎（Reinetal2012）。新疆是我国人源戊型肝炎的高发地区，新疆南疆地区曾经发生人类历史上规模最大的一次暴发流行，为了了解目前当地不同人群戊型肝炎感染的状况，以及戊型肝炎对当地公共卫生的影响程度，本研究对新疆南疆地区公共场所从业人员进行了系统的血清流行病学调查，从而为当地人源戊型肝炎的防控提供理论参考。随着研究的不断深入戊型肝炎的宿主范围不断在扩大，目前已有多种动物感染戊型肝炎的报道。因此，系统开展不同动物宿主之间戊型肝炎感染状况的调查，摸清戊型肝炎在不同宿主间的流行规律和流行特点，有助于对戊型肝炎人兽共患的风险点进行评估。新疆南疆地区经济水平相对落后，畜牧业养殖的机械化程度普遍较低，当地信仰伊斯兰教为主的穆斯林居民占60%以上，奶牛、绵羊和禽类是当地居民主要的肉食动物，也是当地与人们生活密切接触的主要畜种，为了了解戊型肝炎在当地主要经济动物中的流行状况和流行特点，本研究对当地奶牛、绵羊和鸡等主要畜种进行了系统的血清流行病学调查。根据世界范围内不同检测毒株核苷酸序列的差异性将不同物种来源的戊型肝炎病毒分为四个主要的基因型。在新疆，最初从南疆和田地区维吾尔族患者体内检测到基因1型戊型肝炎病毒，之后，新疆境内流行的戊型肝炎病毒毒株出现基因1型到基因4型的转变，且基因4型戊型肝炎病毒成为取代基因1型的优势基因型，是否新疆南疆也存在基因3型戊型肝炎病毒的流行，尚未见有文献报道。为了了解目前新疆南疆戊型肝炎病毒的进化地位，并进一步掌握当地戊型肝炎的流行状况，本研究系统开展了新疆南疆地区戊型肝炎的分子流行病学调查。33 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文第2章新疆南疆地区不同人群戊型肝炎病毒抗体和抗原检测2.1前言戊型肝炎是研究起步较晚的病毒性肝炎之一，该疾病可以通过未经检测的捐献血液、染疫动物的脏器，以及受到污染的饮用水等多种途径传播。在亚洲，中国是戊型肝炎的高发地区，2011年，厦门万泰注册并获批了一种预防戊型肝炎的基因工程重组亚单位疫苗，2015年，世界卫生组织免疫战略咨询专家组发布了一份关于戊肝的立场文件，并于2016年5月首次通过了“2016-2021年全球卫生部门病毒性肝炎战略”的讨论，尽管世界卫生组织不建议将该疫苗纳入国家计划免疫的范畴，但是，依然建议各国主管部门要根据当地戊型肝炎的流行情况做出合理使用的决定。戊型肝炎在不同的国家和地区流行状况有所区别，散发流行往往发生在欧美等经济发展水平较高和环境卫生较整洁的国家和地区，发展中卫生状况较差的国家戊型肝炎往往呈暴发流行。新疆是中国乃至世界病毒性肝炎流行的高发地区，新疆南疆曾经出现我国历史上戊型肝炎规模最大的一次暴发流行，其中，位于南疆最边缘的和田与喀什地区是此次肝炎流行的重灾区。近年来，在国家各部门和新疆维吾尔自治区政府的大力支持下，尤其是国家各领域对口援疆政策的贯彻落实，使得新疆南疆地区的医疗、教育和环境卫生等民生问题得到了明显的改善。为了进一步了解目前南疆当地人源戊型肝炎的流行状况，本研究对新疆南疆地区不同职业人群开展了戊型肝炎感染的血清流行病学调查。2.2材料与方法2.2.1样品来源2014年11月至2016年12月，在新疆全民体检的时间段，从新疆南疆阿克苏、喀什、和田以及库尔勒地区的市民当中随机采集血清2980份，其中男性1459份，女性1521份，维吾尔族1652份，汉族1328份，采集血清均有性别和年龄记录。从业人员血清包括餐饮服务人员160份，超市服务人员220份，家畜及肉品销售人员85份，屠宰场工人32份，其他人员2483份。采用分离胶采血管进行血清采集，采血后立即轻轻倒转采血的分离胶试管2-3次使得标本充分混匀，大约30min后标本34 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究充分凝固，然后在3500-4000r/min的条件下离心10min，分离血清置-20℃保存待检。2.2.2主要试剂戊型肝炎病毒IgG抗体（HEV-IgG）检测试剂盒（批号：EG20161104）、戊型肝炎病毒IgM抗体(HEV-IgM)检测试剂盒（批号：EM20161106）和戊型肝炎病毒抗原（HEV-Ag）检测试剂盒（批号：EV20161124）均由北京万泰生物药业股份有限公司生产。2.2.3主要仪器采用北京普朗新技术有限公司生产的DNM-9602型酶标分析仪进行读数。2.2.4HEV-IgG抗体检测本试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验原理，微孔板上预包被基因重组的HEV抗原，预包被的抗原可以与检测样品中的HEV抗体结合，洗板后加入酶标试剂进行二次孵育，如果样品中含有HEV-IgG抗体存在时，将形成“包被抗原-HEVIgG抗体-酶标记抗体”复合物，复合物上连接的HRP催化显色剂反应，生成蓝色产物，终止反应后变成黄色，如果样品中不含有HEV-IgG抗体存在时，没有颜色变化。操作步骤：①配液将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水做20倍稀释。②编号将待检测的样品按照微孔板提供的编号依次编号，每块反应板设置阴性对照孔3个，阳性对照孔2个和空白对照孔1个。③稀释除空白孔之外，每孔加入样品稀释液100μL。④加样除空白孔之外，每孔加入待检测的样品或阴阳性对照10μL，轻轻震荡混匀。⑤温育用封板膜将反应板封板后置37℃的培养箱30min。⑥洗涤撕掉封板膜，将反应板孔内的液体甩干，用稀释好的洗涤液洗涤5遍，每次洗涤完均在滤纸上将余液拍干，最后一次尽量拍干。⑦加酶在各孔中均加入酶标试剂100μL。⑧重复步骤⑤和⑥。35 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文⑨显色每孔加入显色液A和显色液B各50μL，轻轻混匀，用封板模将反应板封板后置37℃的培养箱避光反应15min。⑩测定每孔均加入终止液50μL，轻轻混匀，设定酶标仪的双波长为450nm/630nm，测定各孔的OD值。结果判定：阴性对照孔的OD值≦0.1，阳性对照孔的OD值≧0.8，临界值（CO）=阴性对照孔的OD均值+0.16，待检测样品OD值≧临界值（CO）的为抗体阳性，反之为阴性。2.2.5HEV-IgM抗体检测本试剂盒采用捕获法酶联免疫吸附试验原理，反应板上预包被抗-人IgM（抗μ链），加入待检测标本进行温育，标本中的IgM抗体被捕获，洗板后不与抗-人IgM结合的物质会被洗掉，加入酶标试剂进行再次温育。如果检测样品中含有HEV-IgM抗体时，将会形成“包被抗-人IgM+HEV-IgM抗体+酶标记抗原”复合物，再次洗板后加入显色剂，酶标记抗原上的HRP催化显色剂反应，生成蓝色产物，终止反应后变为黄色，如果待检测样品中不含有HEV-IgM抗体则不会发生颜色变化。操作步骤：①配液将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水做20倍稀释。②编号将待检测的样品按照微孔板提供的编号依次编号，每块反应板设置阴性对照孔3个，阳性对照孔2个和空白对照孔1个。③稀释每孔加入样品稀释液100μL，除空白孔之外。④加样分别在相应的孔中加入待检测的样品或阴阳性对照10μL，轻轻震荡混匀。⑤温育将反应板用封板膜封闭后置37℃的培养箱30min。⑥洗涤撕掉封板膜，将孔内的液体甩干，用洗涤液洗涤5遍，每次洗涤完均在滤纸上将余液拍干，最后一次尽量拍干。⑦加酶在各孔中均加入酶标试剂100μL。⑧重复步骤⑤和⑥。⑨显色每孔加入显色液A和显色液B各50μL，轻轻混匀，用封板模将反应板封板后置37℃的培养箱避光反应15min。⑩测定每孔均加入终止液50μL，轻轻混匀，设定酶标仪的双波长为450nm/36 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究630nm，测定各孔的OD值。结果判定：阴性对照孔的OD值≦0.1，阳性对照孔的OD值≧0.8，临界值（CO）=阴性对照孔的OD均值+0.26，待检测样品OD值≧临界值（CO）的为抗体阳性，反之为阴性。2.2.6HEV-Ag检测反应板上预先包被HEV抗体，包被的抗体可以与待检测样品中的HEV抗原特异性结合，加入HRP标记的HEV抗体后，形成复合物“包被抗体-HEVAg-酶标记抗体”，标记物HRP使显色剂生成蓝色产物，加入终止液后变为黄色，如果待检测样品中不含有HEVAg则不发生颜色变化。操作步骤：①配液将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水做20倍稀释。②编号将待检测的样品按照微孔板提供的编号依次编号，每块反应板设置阴性对照孔3个，阳性对照孔2个和空白对照孔1个。③加样分别在相应的孔中加入待检测的样品或阴阳性对照100μL，轻轻震荡混匀。④温育将反应板用封板膜封闭后置37℃的培养箱30min。⑤洗涤撕掉封板膜，将孔内的液体甩干，用洗涤液洗涤5遍，每次洗涤完均在滤纸上将余液拍干，最后一次尽量拍干。⑥加酶在各孔中均加入酶标试剂100μL。⑦重复步骤④和⑤。⑧显色每孔加入显色液A和显色液B各50μL，轻轻混匀，用封板模将反应板封板后置37℃的培养箱避光反应15min。⑨测定每孔均加入终止液50μL，轻轻混匀，设定酶标仪的双波长为450nm/630nm，测定各孔的OD值。结果判定：阴性对照孔的OD值≦0.1，阳性对照孔的OD值≧0.8，临界值（CO）=阴性对照孔的OD均值+0.12，待检测样品OD值≧临界值（CO）的为Ag阳性，反之为阴性。37 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文2.2.7统计学分析采用Excell软件建立数据库，采用SPSS17.0软件进行统计学分析。2.3结果与分析2.3.1不同年龄人群HEV-IgG检测结果将采集的血清样品按照不同年龄大小进行分组，比较各分组之间的感染情况，2结果表明，不同分组之间抗HEV-IgG阳性率差异具有统计学意义（=98.627,df=6，P=0.000），其中，10-29岁的人群较低，30-59岁的人群最高，见表2-1。表2-1不同年龄人群抗HEV-IgG检测结果Tab2-1.Detectionresultsofanti-HEVIgGantibodyofpopulationwithdifferentages年龄男性女性总数（岁）检测数阳性数阳性率%检测数阳性数阳性率%检测数阳性数阳性率%10—24052.0825093.6490142.8620—230125.22318247.55548366.5730—1982814.142503514.004486314.0640—2203214.552654416.604857615.6750—2405221.671882714.364287918.4660—1952613.3314553.45340319.1270—13675.1510543.81241114.562.3.2不同地域人群HEV-IgG检测结果将收集的试验样品按照地域来源不同进行分组，实验共检测血清2980份，检出阳性血清310份，阳性率达10.40%，各采样点调查对象均有HEV的感染（或既往感染），新疆南疆四个行政区采样点之间抗HEV-IgG阳性率差异具有统计学意义2（=34.838,df=3,P=0.000），其中，和田采样点的阳性率明显高于其它各采样点，见表2-2。38 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究表2-2不同地域人群HEV-IgG检测结果Tab2-2.Detectionresultsofanti-HEVIgGantibodyofpopulationwithdifferentareas检测数阳性数阳性率(%)总阳检测总阳性地域男女男女男女性数总数率(%)库尔勒34035028198.245.43476906.81阿克苏45052140398.897.49799718.14喀什370390504813.5112.319876012.89和田299260444214.7216.158655915.38合计1459152116214811.109.73310298010.402.3.3不同族别人群HEV-IgG检测结果对1652份维吾尔族受试对象和1328份汉族受试对象的样本进行HEV-IgG检测，ELISA结果表明，维吾尔族男性的阳性率略高于维吾尔族女性的阳性率，二者之间的阳性率差异不显著（P=0.824﹥0.05），汉族男性受试对象的阳性率也高于汉族女性受试对象的阳性率，二者之间的阳性率差异也不显著（P=0.164﹥0.05），但是，维吾尔族受试对象的总阳性率远高于汉族受试对象的总阳性率，两个不同检测民族之间的抗体阳性率差异极显著(p=0.000﹤0.01)，见表2-3。表2-3不同族别人群HEV-IgG检测结果Tab2-3.Detectionresultsofanti-HEVIgGantibodyofpopulationwithdifferentraces检测数阳性数阳性率(%)总阳检测总阳性族别男女男女男女性数总数率(%)维吾尔族8508021089912.7112.34207165212.53汉族60971954498.876.8210313287.76合计1459152116214811.109.73310298010.402.3.4不同职业人群HEV-IgG检测结果将所有采集的血清样品按照受试对象所从事工作的不同进行实验分组，比较不同职业受试对象之间的感染情况，2980名受试对象中，各分组之间抗HEV-IgG差异2具有统计学意义（=42.498,df=4,P=0.000）。其中，10份屠宰场工人血清样品抗39 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文-HEVIgG呈阳性，阳性率为31.25%，14份职业性接触家畜受试对象的血清样品抗-HEVIgG呈现阳性，阳性率为16.47%，这两个分组之间阳性率差异不显著（P=0.079﹥0.05）。超市服务相关人群的抗-HEVIgG阳性率为3.18%，餐饮服务相关人群的抗-HEVIgG阳性率为2.50%，二者之间的阳性率差异也不显著（P=0.696﹥0.05），见表2-4。表2-4不同职业人群HEV-IgG检测结果Tab2-4.Detectionresultsofanti-HEVIgGantibodyofpopulationwithdifferentoccupations职业检测数阳性数阳性率（%）餐饮从业相关人群16042.50超市从业相关人群22073.18家畜及肉品接触人群851416.47屠宰场工人321031.25其他人群248327511.08合计298031010.402.3.5不同年龄人群HEV-IgM检测结果按照HEV-IgG检测的年龄分组，平行进行HEV-IgM检测，ELISA结果表明，HEV-IgM阳性的样品仅在30-39岁和40-49岁的年龄段有分布，阳性率依次为1.12%和0.41%，二者的阳性率差异不显著（P=0.214﹥0.05），结果见表2-5。表2-5不同年龄人群抗HEV-IgM检测结果Tab2-5.Detectionresultsofanti-HEVIgMantibodyofpopulationwithdifferentages年龄男性女性总数（岁）检测数阳性数阳性率%检测数阳性数阳性率%检测数阳性数阳性率%10—24000250004900020—23000318005480030—19852.532500044851.1240—2200026520.7548520.4150—24000188004280060—19500145003400070—13600105002410040 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究2.3.6不同地域人群HEV-IgM检测结果按照HEV-IgG检测的地域分组，平行进行HEV-IgM检测，结果表明，阿克苏、喀什以及和田各有少量阳性样品分布，依次为0.10%、0.39%和0.54%，HEV-IgM阳2性率的地域差异无统计学意义（=2.485,df=2,P=0.289）。但是，HEV-IgM总阳性率（0.23%）较HEV-IgG总阳性率（10.40%）明显下降，差异极显著(p=0.000﹤0.01)，结果见表2-6。表2-6不同地域人群HEV-IgM检测结果Tab2-6.Detectionresultsofanti-HEVIgMantibodyofpopulationwithdifferentareas检测数阳性数阳性率(%)总阳检测总阳性地域男女男女男女性数总数率(%)库尔勒340350000006900阿克苏450521100.22019710.10喀什370390300.81037600.39和田299260120.330.7735590.54合计14591521520.340.13729800.232.3.7不同族别人群HEV-IgM检测结果按照HEV-IgG检测的族别分组，对1652份维吾尔族受试对象和1328份汉族受试对象平行进行HEV-IgM检测，结果表明，维吾尔族受试对象的IgM阳性率高于汉族受试对象的阳性率，但是，不同族别之间IgM阳性率差异不显著(p=0.107﹥0.05)，见表2-7。表2-7不同族别人群HEV-IgM检测结果Tab2-7.Detectionresultsofanti-HEVIgMantibodyofpopulationwithdifferentraces检测数阳性数阳性率(%)总阳检测总阳性族别男女男女男女性数总数率(%)维吾尔族850802420.470.25616520.36汉族609719100.160113280.01合计14591521520.340.13729800.2341 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文2.3.8不同职业人群HEV-IgM检测结果按照HEV-IgG检测的职业分组，平行进行HEV-IgM检测，结果表明，餐饮从业相关人群和超市从业相关人群未见有HEV-IgM阳性样品分布，屠宰场屠夫的HEV-IgM阳性率相对较高，显著高于其他人群和家畜及肉品接触人群的阳性率，2HEV-IgM阳性率的职业差异性有统计学意义（=196.797,df=2,P=0.000），结果见表2-8。表2-8不同职业人群HEV-IgM检测结果Tab2-8.Detectionresultsofanti-HEVIgMantibodyofpopulationwithdifferentoccupations职业检测数阳性数阳性率（%）餐饮从业相关人群16000超市从业相关人群22000家畜及肉品接触人群8522.35屠宰场工人32412.50其他人群248310.04合计298070.232.3.9不同年龄人群HEV-Ag检测结果按照HEV-IgG检测的年龄分组，平行进行HEV-Ag检测，结果表明，HEV-Ag也仅在30-39岁和40-49岁的年龄段有2例阳性样品分布，阳性率差异不显著（P=0.955﹥0.05），结果见表2-9。42 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究表2-9不同年龄人群HEV-Ag检测结果Tab2-9.DetectionresultsofHEVAgofpopulationwithdifferentages年龄男性女性总数（岁）检测数阳性数阳性率%检测数阳性数阳性率%检测数阳性数阳性率%10—24000250004900020—23000318005480030—19810.512500044810.2240—22010.452650048510.2150—24000188004280060—19500145003400070—1360010500241002.3.10不同地域人群HEV-Ag检测结果按照HEV-IgG检测行政地域的试验分组，对各个试验分组的血清样品平行进行HEV-Ag检测。结果表明，HEV-Ag仅仅在喀什地区有2份阳性样品分布，其它地域均未检测到HEV-Ag阳性的样品，结果见表2-10。表2-10不同地域人群HEV-Ag检测结果Tab2-10.DetectionresultsofHEVAgofpopulationwithdifferentareas检测数阳性数阳性率(%)总阳检测总阳性地域男女男女男女性数总数率(%)库尔勒340350000006900阿克苏450521000009710喀什370390200.54027600.26和田299260000005590合计14591521200.140229800.072.3.11不同族别人群HEV-Ag检测结果按照HEV-IgG检测的族别分组，对1652份维吾尔族受试对象和1328份汉族受试对象平行进行HEV-Ag检测，结果表明，仅有2名维吾尔族男性受试对象HEV-Ag43 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文呈现阳性，见表2-11。表2-11不同族别人群HEV-Ag检测结果Tab2-11.DetectionresultsofHEVAgofpopulationwithdifferentraces检测数阳性数阳性率(%)总阳检测总阳性族别男女男女男女性数总数率(%)维吾尔族850802200.240216520.12汉族6097190000013280合计14591521200.140229800.072.3.12不同职业人群HEV-Ag检测结果按照HEV-IgG检测的职业分组，对所有受试对象的采集样品平行进行HEV-Ag检测，结果表明，仅在屠宰场工人采集的血样中检测到2份阳性样品，其它人群的检测样本中均未筛选到HEV-Ag阳性的样品，结果见表2-12。表2-12不同职业人群HEV-Ag检测结果Tab2-12.DetectionresultsofHEVAgofpopulationwithdifferentoccupations职业检测数阳性数阳性率（%）餐饮从业相关人群16000超市从业相关人群22000家畜及肉品接触人群8500屠宰场工人3220.625其他人群248300合计298020.072.4讨论国家卫生计生委的法定传染病疫情统计数据显示，近年来，中国境内戊型肝炎是仅次于乙型肝炎的病毒性肝炎之一，且具有人兽共患的特性，感染戊型肝炎后患者往往表现出黄疸症状，其临床症状和甲型肝炎的症状极其相似，一般情况下戊型肝炎在青壮年人群比较多发，但是，青壮年感染戊型肝炎的临床症状及其危害远不及对怀孕妇女的危害。目前，对于戊型肝炎的防控既没有比较有效的药物，也没有从国家层面纳入计划免疫范畴的有效疫苗，因此，对于戊型肝炎的预防比较可行的办法依然是加强对日常生活中传染源的管控，研究表明，戊型肝炎的生活传染源主44 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究要包括感染HEV的多种家畜及其内脏器官、戊型肝炎临床感染者以及戊型肝炎的亚临床感染者。戊型肝炎可以通过多种方式传播，经粪-口感染是戊型肝炎典型的传播方式，其中，污染的水源和染疫动物的动物性食品是最主要的污染源，新疆南疆地区曾经因饮用水源污染而导致了戊型肝炎的暴发流行；动物实验表明，静脉输血也可以导致戊型肝炎的传播，中国学者从HEVIgM阳性的捐赠血浆中分离到HEV，并将该血浆通过静脉注射的方式输入恒河猴，结果发现，恒河猴表现出典型的急性肝炎症状，且恒河猴静脉血清的HEVIgM和HEV-IgG均呈阳性，静脉试验输血感染恒河猴的研究表明血液及血液制品具有传播戊型肝炎的可能性；人-畜之间的跨物种感染是戊型肝炎传播的潜在方式，到目前为止，已从多种非人灵长类、猪、牛、羊、啮齿类和鸡等动物体内检测到HEV抗体和HEVRNA的存在，表明戊型肝炎是一种人兽共患传染病，日本学者对Hokkaido地区暴发的急性戊型肝炎研究表明未经烹饪的猪肝可以将HEV传播给人，Meng的研究团队对中国大陆境内部分地区的猪群接触者进行了戊肝感染状况的调查，结果发现所有调查对象的戊型肝炎抗体全部呈阳性，该期调查表明猪群接触者具有戊型肝炎高感染的风险。长期以来，受经济发展和人文社会因素的影响，新疆南疆地区的自然环境状况相对恶劣，水源以及饮食卫生条件普遍较差，特别是喀什与和田一带的偏远村庄，百姓对健康和疾病预防的知识十分贫乏，加之不良的生活和饮食卫生习惯，导致南疆地区是新疆戊型肝炎感染的重灾区。本研究主要从受试对象的年龄、采集样品的地域分布、受试对象的性别和族别，以及所从事的职业五个方面开展了分析研究。从研究结果HEV-IgG检测的性别差异来看，由于男性是当地家庭的主要劳动力，男性居民是家庭经济收入的主要来源，戊型肝炎在维吾尔族和汉族男性的感染率均高于女性的感染率，估计这与男性因频繁应酬各种活动的就餐习惯有很大的关系，当然，不同性别之间是否具有戊型肝炎易感性的差异也有待于进一步试验研究；从年龄分组的感染性差异来看，随着年龄的增长男性受试对象和女性受试对象的HEV-IgG抗体阳性率均呈显逐渐增加的趋势，30-60岁年龄组段的人群较其他各年龄分组人群有相对较高的感染率，分析其原因，该年龄组段人群社会活动相对比较频繁，因反复外出就餐而增加了接触戊型肝炎传染源的机率，因此具有相对较高的感染率；从不同职业分组的感染情况来看，不同职业分组的受试对象戊型肝炎感染差异较大，其中，屠宰场工人因长期反复接触屠宰家畜的血液、粪便和肠衣等戊型肝炎病毒分布含量较高的传染源，因此，与从事其它行业工作的人员相比较，该类45 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文人群的感染率相对较高，与家畜有密切接触的家畜及肉品销售人群的阳性率次之，虽然本研究无法进一步追溯该组受试对象曾经接触动物的种类以及接触的周期，但是，从该受试人群高检出率的结果不能排除HEV跨物种感染的推测；从戊型肝炎流行的地域差别来看，四个检测地区的受试对象均有不同程度的流行，但是，新疆最南端喀什与和田地区受试对象的HEV-IgG抗体阳性率较库尔勒和阿克苏地区的受试对象要高，其中，和田地区的阳性率最高，喀什地区的次之，分析其原因可能受以下因素的影响：首先，从戊型肝炎的流行历史来看，尽管整个南疆地区戊型肝炎流行普遍，但是，新疆几期规模较大的戊型肝炎暴发流行均主要集中在和田与喀什一带，庄辉教授研究团队曾从和田地区和田村的维吾尔族患者粪便中分离到新疆第一株人源戊型肝炎病毒，虽然时隔多年，但是，当地人群血清中可以长时间保持HEVIgG的存在，同时，可能存在HEV在当地人群再循环的可能，其次，新疆是我国维吾尔族自治区，绝大多数的维吾尔族民众主要分布在南疆地区，而喀什与和田地区又是维吾尔族的集聚区，长期以来，受当地宗教文化以及多方面因素的影响，当地环境卫生普遍较差，民众疫病防控的意识与理念相对薄弱，这一状况使得戊型肝炎在当地长期滋生并流行，再次，喀什与和田地区位于新疆地区的最南缘，该地区境内分布有红其拉甫、吐尔尕特和伊尔克什坦等6个一类国家对外开放的口岸，近年来，特别是喀什地区设立经济特区之后，新疆地区乃至国内东部省市以新疆南疆边界口岸为中转，逐步加强与中亚各国之间在原产品加工、货物贸易、旅游开发、畜禽养殖以及畜产品交易等多个领域的互动，当地人流与物流来往日趋频繁，虽然，经济特区的设立使得当地民众经济与生活的状况逐步得到了改善，但是，环境与卫生多年恶化的状况无法在短时间内得到快速弥补，尤其百姓对疫病防控认识的教育更需要漫长的时间，上述多种因素的影响使得戊型肝炎在喀什与和田一带依然保持相对较高的阳性率；从戊型肝炎流行的族别差异来看，维吾尔族和汉族检测样本均呈现一定程度的HEVIgG阳性率，但是，维吾尔族检测样本的阳性率显著高于汉族检测样本的阳性率，这可能主要与不同民族的饮食习惯和生活习俗有关，在新疆，牛羊肉在当地民众的饮食结构中占主要的成分，不管是维吾尔族民众还是汉族民众均常年消费该类肉及肉制品，但是，维吾尔族民众更青睐肉品的原味，烤羊肉几乎是维吾尔族民众的用餐必备，青睐肉品原味的嗜好很难保证将肉品完全烹饪熟，除此之外，抓饭是维吾尔民众的特色食品之一，也备受当地各民族欢迎，但是，受民族传统文化的影响，维吾尔族民众在用餐过程中保持了原原本本的手抓用餐方式，46 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究而且，家族成员一起共同用餐，这一过程可能是加速戊型肝炎在维吾尔族民众之间快速传播的主要原因。本调查研究过程中，同时对所有受试对象按照年龄、性别、地域、族别和职业进行HEVIgM和HEVAg的辅助性检测，分析HEVIgM和HEVAg的检测结果，由于戊型肝炎患者通过粪便排毒以及病毒血症持续的时间很短暂，且IgM仅仅在疾病感染的早期出现，因此，HEVIgM和HEVAg的检出概率极低。本研究中，从年龄和地域的检出情况来看，尽管阳性样品也主要集中在30-60岁的年龄段，阳性样品的检出地域也主要分布在喀什与和田地区，但是，由于检出HEVIgM和HEVAg阳性的样品较少，因此，本研究从HEVIgM和HEVAg的检出情况无法反映目前当地戊型肝炎流行的年龄和地域分布；但是，从职业间HEVIgM和HEVAg的分布情况来看，除了在普通人群当中检出1份HEVIgM阳性样品之外，其它阳性的HEVIgM样品均来自屠宰工人和与家畜及肉品有密切接触的职业人群，说明与家畜以及动物性食品有密切接触的人群是戊型肝炎感染的高危人群；从HEVIgM和HEVAg检出的族别分布来看，维吾尔族民众具有相对较高的阳性率，但是，是否维吾尔族民众对戊型肝炎具有更高的易感性有待于进一步深入研究。本研究在新疆南疆地区全民体检阶段随机采集部分血样开展了上述研究，研究对象覆盖南疆四个行政区域的分布居民，采用统计学方法从研究对象的职业、研究对象的族别与年龄大小，以及采集样本的地域分布等多个方面进行研究，研究结果能够体现戊型肝炎在南疆当地近年的流行概况。另外，本次调查中部分来自餐饮和超市从业人员的检测样本也呈现HEVIgG阳性，而HEVIgM和HEVAg呈现阴性，由于新疆南疆地区尚没有开展戊型肝炎的免疫接种，这一结果说明该类研究人群也有戊型肝炎既往感染的经历，因此，要从从业人员的个人健康等多个层面把好食品安全的卫生关。47 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文第3章新疆南疆地区主要经济动物戊型肝炎病毒抗体和抗原检测3.1前言戊型肝炎病毒可以导致急性病毒性肝炎，在发展中国家往往呈现暴发或者散发流行，在欧美等发达国家也有散发流行的报道。自第一株动物源戊型肝炎病毒于1997年从美国猪群中分离鉴定以来，多种其它畜种的血清和组织中也相继检测到戊型肝炎抗体和病毒RNA的存在，并进一步提出戊型肝炎是重要的人兽共患病，戊型肝炎现已成为发展中国家乃至全球共同关心的影响公共卫生的主要疾病之一。研究表明，戊型肝炎染疫动物具有跨物种散播病原的风险，其中，猪、牛和羊是与人类密切接触的家养动物，该类染疫动物及其脏器很有可能将HEV传播给消费者，从而成为影响公共卫生最主要的隐患之一。新疆是中国戊型肝炎的高发地区，曾经有多起戊型肝炎流行的报道，其中，南疆是我国人源戊型肝炎流行最主要的地区，鉴于戊型肝炎人兽共患的潜在隐患，以及新疆南疆辖区有戊型肝炎大暴发流行的历史，密切关注戊型肝炎在南疆当地畜群中发生发展的趋势对于该病的合理防控具有重要的卫生及经济学意义。本章节对新疆南疆地区牛羊等主要经济动物目前流行戊型肝炎的情况进行了研究。3.2材料与方法3.2.1样品来源2013年11月至2016年12月，在新疆南疆地区动物疾控中心开展重大动物疫病普检期间，从新疆南疆库尔勒、阿克苏、喀什以及和田地区采集绵羊血清2700份、猪血清1660份（3月龄以上猪血清1000份，3月龄以下猪血清660份）、牛血清1110份、天山马鹿血清410份、鸡血清1800份、犬血清160份。用10mL的医用注射器（鸡用5mL注射器）采集全血，将注射器倒置过夜让血清自然析出，分离血清置-20℃保存待检。48 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究3.2.2主要试剂戊型肝炎病毒总抗体(HEV-Ab)诊断试剂盒（批号：ES20160804）和戊型肝炎病毒抗原（HEV-Ag）检测试剂盒（批号：EV20161124）均由北京万泰生物药业股份有限公司生产。3.2.3主要仪器用北京普朗新技术有限公司生产的DNM-9602型酶标分析仪进行读数。3.2.4HEV-Ab抗体检测本试剂盒实验原理采用两步夹心ELISA方法检测血清或血浆样品中戊型肝炎病毒(HEV)抗体，反应板上预包被的高纯度基因表达戊型肝炎病毒抗原，能够与待检测样品中的抗戊型肝炎抗体反应，洗板后加入HRP标记的戊型肝炎病毒抗原，反应结束后用TMB底物显色。通过加入TMB底物显色后的颜色变化，结合吸光度(OD值)的读数来判定样品中HEV-Ab抗体的存在与否。操作步骤：①配液将浓缩洗涤液在使用前用蒸馏水或去离子水做20倍稀释。②编号依据反应板提供的微孔编号，将待检测的样品对应进行编号，每块反应板设置3个阴性对照孔，2个阳性对照孔；③稀释将所有孔内加入样品稀释液50μL；④加样将待检测的样品或阴阳性对照加入对应的反应孔内，50μL/孔，轻轻震荡混匀；⑤温育将加样后的反应板用封板膜贴封，置37℃培养箱温育30min；⑥洗涤撕掉封板膜，甩干反应板内的所有液体，用20倍稀释的洗涤液将反应板充分洗涤5遍，最后一次在滤纸上将余液拍干；⑦加酶在所有孔内均加入酶标试剂100μL；⑧重复步骤⑤和⑥；⑨显色所有反应孔内均加入显色液A和显色液B各50μL，充分混匀，封板后置37℃培养箱避光显色反应15min；⑩测定所有反应孔内均加入终止液50μL，轻轻混匀终止反应，在450nm/63049 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文nm双波长条件下测定各孔的OD值；结果判定：阴性对照孔OD值≤0.1，阳性对照孔OD值≥0.8；临界值＝阴性对照孔OD均值NC+0.12；样品OD值≥临界值者，为HEV抗体阳性；样品OD值＜临界值者，为HEV抗体阴性。3.2.5HEV-Ag检测操作步骤：同第二章。3.2.6统计学分析建立Excell数据库，采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。3.3结果与分析3.3.1猪戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果猪血清样品主要来自阿克苏地区8县1市，从ELISA检测结果来看，血清HEV-Ab总抗体阳性率为53.25%（884/1660），南疆阿克苏境内各县市猪群均存在不同程度的感染情况，其中，乌什县（42.00%）的感染情况相对较低，阿瓦提县（65.77%）的感染情况相对较高，血清HEV-Ag阳性率相对较低，为1.57%，其中，依然是阿瓦提县的阳性率最高，见表3-1；对采集的血样按照猪群养殖的月龄不同，整理其检测结果，分析表明，HEV-Ab抗体在3月龄以上猪群（56.00%）的阳性率高于3月龄以下猪群（49.09%）的阳性率(P=0.006﹤0.01)，但是，3月龄以下猪群的HEV-Ag阳性率（2.58%）相对较高(P=0.007﹤0.01)，见表3-2。50 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究表3-1阿克苏地区猪血清样品戊型肝炎病毒抗原和抗体检测结果Tab3-1.DetectionresultsofswineHEV-AgandHEV-AbofdifferentcountysinAksuregionHEV-AbHEV-Ag样品来源检测总数阳性数阳性率（%）阳性数阳性率（%）阿克苏市20011658.0042.00温宿1808245.5621.11新和1207562.5010.83阿瓦提26017165.7783.08拜城1608955.6331.88库车40018446.0061.50乌什1004242.0000沙雅904550.0000柯坪1508053.3321.33合计166088453.25261.57表3-2不同年龄猪戊型肝炎病毒抗原和抗体检测结果Tab3-2.DetectionresultsofswineHEV-AgandHEV-AbwithdifferentagesHEV-AbHEV-Ag年龄检测总数阳性数阳性率（%）阳性数阳性率（%）≧3个月100056056.0090.90﹤3个月66032449.09172.58合计166088453.25261.573.3.2牛戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果牛血清样品也主要采自阿克苏地区境内的8县1市，从ELISA检测结果来看，相对猪的感染情况牛的感染率较低，牛群中戊型肝炎病毒Ab阳性率只有7.03%(78/1110)，其中，拜城县的HEV-Ab抗体阳性率最低，为4.00%，阿瓦提县牛群的HEV-Ab抗体阳性率相对较高，达12.50%；牛血清样品中未检测到HEV-Ag，见表3-3；将1110份检测血清按照年龄分为2岁以下、2-4岁和4岁以上三个年龄组，整51 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文理分析其检测数据，结果表明，HEV-Ab阳性率差异在不同年龄组间有统计学意义2（=43.106,df=2,P=0.000），见表3-4。表3-3阿克苏地区牛血清样品戊型肝炎病毒抗原和抗体检测结果Tab3-3.DetectionresultsofcowHEV-AgandHEV-AbofdifferentcountysinAksuregionHEV-AbHEV-Ag来源检测总数阳性数阳性率（%）阳性数阳性率（%）阿克苏市15085.3300阿瓦提2002512.5000新和6058.3300温宿12086.6700柯坪140107.1400沙雅8056.2500库车250124.8000乌什3525.7100拜城7534.0000合计1110787.0300表3-4不同年龄奶牛戊型肝炎病毒抗原和抗体检测结果Tab3-4.DetectionresultsofcowHEV-AgandHEV-AbwithdifferentagesHEV-AbHEV-Ag年龄检测总数阳性数阳性率（%）阳性数阳性率（%）≤216063.75002-4780405.1300＞41703218.8200合计1110787.03003.3.3马鹿戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果马鹿血清主要采自南疆地区人工驯化的规模化养殖场，血清样本的ELISA检测结果表明，当地驯化养殖鹿群也存在戊型肝炎病毒的感染，且具有相对较高的感染52 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究2率（32.4%），四个调查鹿群之间戊型肝炎Ab阳性率差异有统计学意义（=16.469,df=3,P=0.001），其中，集约化养殖鹿群的Ab阳性率高于散养鹿群的阳性率，鹿群样本中未检测到HEV-Ag，见表3-5；将410份血清样本分为﹤2岁、2-4岁和﹥4岁三个年龄组，分析不同年龄鹿群的检测数据，结果表明，2-4岁鹿群戊型肝炎Ab阳性率（43.8%）高于2岁以下鹿群的Ab阳性率（9.33%），且不同分组年龄鹿群之间2感染戊型肝炎的Ab阳性率差异有统计学意义（=166.041,df=2,P=0.000），见表3-6。表3-5马鹿血清样品戊型肝炎病毒抗原和抗体检测结果Tab3-5.DetectionresultsofcervuselaphuslinnaeasHEV-AgandHEV-AbHEV-AbHEV-Ag来源检测总数阳性数阳性率（%）阳性数阳性率（%）鹿场a2006532.5000鹿场b1004646.0000鹿场c952021.100散养群d15213.300合计41013332.400表3-6不同年龄鹿戊型肝炎病毒抗原和抗体检测结果Tab3-6.DetectionresultsofcervuselaphuslinnaeasHEV-AgandHEV-AbwithdifferentagesHEV-AbHEV-Ag年龄检测总数阳性数阳性率（%）阳性数阳性率（%）﹤27579.33002-42109243.8000﹥41253427.2000合计41013332.40003.3.4鸡戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果对采集的鸡血清样本进行检测，ELISA结果表明鸡戊型肝炎的感染率普遍较低，没有检测到HEV-Ag呈显阳性的样本，1800份检测样本的Ab总阳性率只有1.56%，53 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文分析结果表明，鸡源戊型肝炎病毒Ab阳性率差异在南疆四个采集地区之间不具有2统计学意义（=0.458,df=3,P=0.928），见表3-7。表3-7鸡血清样品戊型肝炎病毒抗原和抗体检测结果Tab3-7.DetectionresultsofavianHEV-AgandHEV-AbHEV-AbHEV-Ag来源检测总数阳性数阳性率（%）阳性数阳性率（%）喀什35061.71%00阿克苏60091.50%00和田45081.78%00库尔勒40051.25%00合计1800281.56%003.3.5犬戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果犬血清样本全部采自南疆当地的宠物诊所，血清样本的检测结果表明，不同来源血清样本的Ab阳性率差异极显著(P=0.001﹤0.01)，农村饲养犬的阳性率（25.46%）高于城市家养犬的阳性率为（6.67%），见表3-8；对采集的犬血清样本按照犬只年龄大小进行分组，统计分析表明，不同组犬之间戊型肝炎Ab阳性率差异无统计学2意义（=3.207,df=2,P=0.201），见表3-9；五个品种分组之间Ab阳性率差异无统2计学意义（=9.425,df=4,P=0.051），见表3-10；将采集的血清样本按照犬只性别进行分组，统计分析表明，不同性别组犬之间Ab阳性率差异极显著(P=0.007﹤0.01)，见表3-11。表3-8血清来源及抗原和抗体检测结果Tab3-8.SourceofbloodserumandresultofdogsHEV-AgandHEV-AbHEV-AbHEV-Ag样品来源检测总数阳性数阳性率(%)00农村饲养犬551425.4600城市家养犬10576.6700合计Total1602113.130054 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究表3-9不同年龄犬抗原和抗体检测结果Tab3-9.comparisonofdogHEV-AgandHEV-AbprevalencebyagesHEV-AbHEV-Ag年龄(岁)检测总数阳性数阳性率(%)00＜23725.41002-5951616.8400＞528310.7100合计1602113.1300表3-10不同品种犬抗原和抗体检测结果Tab3-10.comparisonofdogHEV-AgandHEV-AbprevalencebybreedsHEV-AbHEV-Ag品种检测总数阳性数阳性率(%)阳性数阳性率(%)贵宾犬35925.7100金毛猎犬4636.5200京巴犬3837.9000牧羊犬800.0000其它品种33618.1800合计1602113.1300表3-11不同性别犬抗原和抗体检测结果Tab3-11.comparisonofdogHEV-AgandHEV-AbprevalencebygendersHEV-AbHEV-Ag性别检测总数阳性数阳性率(%)阳性数阳性率(%)雄性861719.7700雌性7445.4100合计1602113.13003.3.6绵羊戊型肝炎病毒感染的ELISA检测结果绵羊血清采自南疆当地四个辖区，对采集的绵羊血清进行Ab血清学检测，55 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文ELISA结果显示，各采样点绵羊均有戊型肝炎病毒感染，对不同地域来源绵羊血清的检测结果进行统计学分析，结果表明，南疆辖区四个采样点的绵羊血清Ab阳性2率差异具有统计学意义（=46.113,df=3,P=0.000），其中，喀什地区的HEV-Ab阳性率（37.65%）与库尔勒地区的HEV-Ab阳性率（21.67%）差异极显著(P=0.000﹤0.01)，见表3-12。表3-12绵羊血清样品戊型肝炎病毒抗原和抗体检测结果Tab3-12.DetectionresultsofsheepHEV-AgandHEV-AbHEV-AbHEV-Ag来源检测总数阳性数阳性率（%）阳性数阳性率（%）库尔勒3006521.6700阿克苏110027925.3600喀什85032037.6500和田45014632.4400合计270081030.00003.4讨论病毒性肝炎是由甲、乙、丙、丁、戊等多种病原体引起的以肝脏损伤为主的病毒性传染病，不同类型的病毒性肝炎均以肝脏病变、功能异常、传播途径多样和传染性较强为主要特征，患病病人伴有疲乏无力，食欲减退等表现，部分患者伴有黄疸症状发生。戊型肝炎是新发现的流行范围较广的人兽共患病毒性肝炎之一，婴幼儿大多为隐性感染，感染戊型肝炎后往往不表现特征性症状，成年人往往表现为急性起病的特征性感染。目前已经明确戊型肝炎和甲型肝炎均是因为摄入受污染的食物或水源而造成，但是，戊型肝炎患者的黄疸疫情较甲肝患者更为严重，近年来，戊型肝炎在我们国家的流行更趋频繁，据国家卫生计生委统计，2016年全国戊型肝炎的发病人数（27922）已经超过了甲型肝炎的发病人数（21285）。在新疆，有必要了解当地动物戊型肝炎的感染以及带毒情况，以便进一步深入研究戊型肝炎在当地不同动物群体中的分布以及与人源戊型肝炎流行规律的关系。为此，本研究对新疆南疆地区牛、羊、猪和鸡等主要经济动物感染戊型肝炎的情况进行了系统的流行病学调查。56 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究新疆南疆地区养猪业主要集中在阿克苏境内，特别是阿克苏地区的库车、拜城和温宿一带，本研究对阿克苏地区8县1市猪群采集的所有样本进行了HEV-Ab和HEV-Ag检测，结果表明，调查各县猪群均有戊型肝炎病毒感染，该区境内猪群HEV-Ab总抗体阳性率为53.25%(884/1660)。葛胜祥等（葛胜祥等2013）对国内其它20个省市的商品猪感染戊型肝炎病毒的情况进行了系统的流行病学调查，结果发现，虽然不同调查省市感染率有所差别，但是，总体感染率相对较高，感染率最低的省市也达到68%，大部分调查省市的感染率在90%以上。本研究调查猪群的感染率显著低于葛胜祥等先前的报道，分析其原因，尽管新疆曾有人源戊型肝炎大暴发流行的历史，但是，新疆是信仰伊斯兰教为主的维吾尔族集聚区，养猪业毕竟不是当地的经济支柱产业，影响戊型肝炎在猪群中循环流行的因素相对较少，因此，当地猪群戊型肝炎的感染率较东部其它省市的感染率相对要低。但是，对该地区样品检测结果的整理分析发现，阿克苏境内不同年龄猪群戊型肝炎病毒感染依然存在3月龄以上猪群的感染率高于3月龄以下猪群感染率的情况，这一结果与国内其它报道相一致，估计这是3月龄以下猪群受母源抗体保护的结果，母源抗体在3月龄以后滴度明显下降，故3月龄以上猪群的感染率相对增加。养牛业在南疆当地的畜牧业生产中占有相当大的比重，目前，仅新疆兵团肉牛存栏数就达22.4万头，奶牛存栏数达20.0万头，年出栏肉牛27.2万头，兵团牛业养殖的优势生产区主要集中在南疆地区的一、二、三师。近年来，自治区和兵团逐步调整产业结构，大力发展养殖业，疆内外奶牛跨境交易的活动日趋频繁，部分地区还陆续从国外引进品质优良的种牛及牛肉制品，这种跨境交易的活动逐步增加了传染病远距离传播的机会。本研究中牛血清样品也主要采自牛业养殖比较集中的阿克苏地区，检测结果表明，相对于当地猪群戊型肝炎的感染情况，采样当地牛群戊型肝炎的Ab阳性率相对较低，但是，分析结果发现猪群戊型肝炎和牛群戊型肝炎的HEV-Ab抗体阳性率均以阿瓦提县最高，而且这一结果与武军元等（武军元等2010）曾经对该地域境内羊源戊肝调查的结果相一致，是否戊型肝炎在阿克苏地区阿瓦提境内各畜种之间循环流行很有必要开展进一步的深入调查。本研究对不同年龄牛群戊型肝炎的流调分析发现，牛群戊型肝炎的HEV-Ab抗体阳性率也呈现明显的年龄相关性，年龄越大阳性率越高，估计这与年龄越大通过饮水、饲草和环境等各种途径接触戊型肝炎病毒造成感染的可能性越大有关。鹿及鹿产品也具有跨物种传播戊型肝炎的潜在性，日本学者曾经从生鲜鹿肉和57 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文食用该生鲜鹿肉的患者体内检测到核酸序列高度相似的HEVRNA，食用鹿肉感染戊型肝炎的证据直接表明鹿源戊型肝炎病毒可以跨物种感染人。在新疆，规模化马鹿的驯化养殖历史已久，新疆马鹿养殖主要集中在南疆库尔勒地区境内的10个团场，近年来，随着市场需求的增加马鹿养殖的数量也在急速增加，马鹿养殖逐渐成为库尔勒地区当地畜牧业发展的支柱产业，但是，随着马鹿养殖数量的增加以及养殖方式的转变，马鹿疫病防控方面的弊端也日渐显露。为了了解戊型肝炎在当地境内鹿群中流行的状况，本研究分别选择当地不同养殖方式的几个鹿群进行调查，结果表明，不同养殖方式的马鹿均有戊型肝炎感染，且感染率相对较高，其中，集约化养殖鹿群的感染率显著高于散养鹿群的感染率，但是，在鹿群感染的年龄差异性分析中，2-4岁鹿群的HEV-Ab抗体阳性率高于2岁以下以及4岁以上鹿群的HEV-Ab抗体阳性率，不存在年龄越大感染率越高的现象，估计这与采集样品的数量多少有关。马鹿产鹿茸、鹿胎、鹿血等多种人体相关的营养成分，因此，在尚不明确戊型肝炎病毒感染鹿群机制的情况下，应当加强对鹿群的饲养管理、引种检疫和疫病防控等多个环节的监控，以阻断戊型肝炎在鹿群中的循环传播。禽源戊型肝炎病毒因基因组序列与人和猪的戊型肝炎病毒序列仅有50%的同源性，已被划为一个独立的基因型，在戊型肝炎的系统进化分析中往往作为参考毒株。在国内，Zhao等（Zhaoetal2010）首次从山东省部分鸡场中分离到禽源戊型肝炎病毒，并对该分离毒株的基因组特征进行了描述，分析发现，尽管禽源病毒有别于其它物种来源的戊肝病毒，但是，在抗原性上依然存在一定的相关性，鸡源戊型肝炎病毒和哺乳动物戊型肝炎病毒在外壳蛋白上具有相同的抗原表位，这种结构组成上的共同之处对鸡源戊型肝炎病毒是否能够感染其它物种提出了新的研究方向。在新疆，禽是仅次于牛羊养殖的又一经济动物，当地各少数民族对禽类产品消费量巨大，本研究对采自新疆南疆阿克苏、库尔勒、喀什以及和田地区的1800份鸡血清检测发现鸡戊型肝炎的感染率普遍较低。对于禽类戊型肝炎传播流行的研究相对较少，因此，需要深入对比研究禽源病毒和哺乳类动物戊肝病毒的一系列特征，以进一步揭示其致病机制、传播途径和跨物种传播等特性。近年来，随着人们生活水平的逐步提高和工作节奏的日益加快，宠物养殖特别是宠物犬的养殖数量逐年上升，各种犬类与人们的接触也日渐密切。研究表明，犬类亦可以感染戊型肝炎，而且犬类感染戊型肝炎后往往呈现亚临床症状，感染的家犬可以通过环境接触将病毒散播在人们的日常生活空间，因此，感染的犬只很有可58 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究能是戊型肝炎循环最重要的潜在传染源。本研究对从兽医宠物门诊收集的160份犬血清进行血清学检测发现调查当地的犬类也存在戊型肝炎的感染，当地各种犬类也具有不同程度的感染情况，犬类HEV-Ab抗体阳性率达到了13.13%，养殖方式不同流行情况也有所差异，其中，农村里面散养犬类的Ab阳性率（25.46%）明显较市区里面家庭宠物犬类的Ab阳性率（6.67%）要高，估计不同养殖方式的犬类感染状况的差异与其所处的养殖环境有关，农村里面卫生状况较差，存在多种家畜和家禽混养的情况，而且，农村里面的犬类几乎全部处于散养状态，这种养殖方式使得戊型肝炎在混养的各种畜禽之间能够保持长时间的循环，散养犬接触戊型肝炎传染源的机会更多，而城市里面的家庭宠物犬所处的环境卫生状况较好，因此，阳性率相对较低；戊型肝炎在2岁以下的犬类中阳性率较低，而在2岁以上的犬类中阳性率相对较高，估计这是犬类养殖的时间越长接触戊型肝炎病原的机会越多，造成感染的可能性越大；在调查的几个品种犬之间，除了金毛猎犬和金巴犬之外，其它几个品种犬对戊型肝炎的感染都表现出了品种之间的差异性，本研究中品种之间易感性的差异可能与样本数量的多少有关；在犬类感染的性别差异分析中，不同性别犬类也表现出感染状况的差异性，这一现象是否与不同性别犬的生活习性和生理特性有关，尚需要进一步的深入研究。对采集的绵羊血清进行血清学检测发现，新疆南疆各行政区的绵羊均存在戊型肝炎病毒感染，且表现出感染情况的地区差异性，其中，以新疆南部边缘维吾尔族民众集聚的和田与喀什地区阳性率相对较高。本次研究对绵羊感染的流行病学调查没有按照品种和年龄等因素进行进一步的深入分析，但是，检测样本的HEV-Ab抗体阳性率与武军元等（武军元等2009）曾经对该地区绵羊戊型肝炎感染的流调结果基本接近，说明绵羊是当地仅次于猪的相对易感物种。本研究对猪、牛、羊等主要经济动物进行抗HEV-Ab检测的过程中，同时进行HEV-Ag辅助性检测，仅有26份猪源血清样本呈现HEV-Ag阳性，其它调查畜种的检测样品HEV-Ag均呈现阴性，分析其原因可能是戊型肝炎在感染畜种体内的病毒血症很短，血清样本中已很少有戊型肝炎病毒颗粒存在。59 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文第4章新疆南疆地区戊型肝炎分子流行病学调查4.1前言在几种病毒性肝炎之中，戊型肝炎病毒在自然条件下宿主范围相对较广，其人兽共患的特性已经被广泛地得到证实，新的动物宿主和传染源也不断在发现，目前，从病原核酸水平得到证实的动物宿主并不是很多，而且，迄今为止，对于病原描述比较详尽的戊型肝炎病毒只有人源HEV、鸡源HEV和猪源HEV。在亚洲和非洲等卫生状况较差的发展中国家戊型肝炎已成为重要的公共卫生问题，戊型肝炎表现为亚临床感染或自限性经过，人类感染戊型肝炎后很难与其它几种病毒性肝炎在临床症状上加以区别，尤其在动物往往不表现任何临床症状，因此，携带戊型肝炎病毒的动物可以通过不同的途径直接或者间接地将病毒传播给人类。早前，粪口传播的方式一直被认为是人类感染戊型肝炎最主要的传播途径，但是，随着猪、野猪、鹿等多种戊型肝炎易感动物的发现，以及食物源性戊型肝炎传播途径的揭示，人们不得不再次密切监控戊型肝炎在人类以及不同畜种之间流行传播的趋势。在新疆，本前期研究已发现多个畜种均可感染戊型肝炎病毒，但是，尚需要进一步明确不同基因型戊型肝炎病毒在当地人畜之间的流行趋势。4.2材料与方法4.2.1样品来源2013年9月至2016年12月，从新疆南疆阿克苏地区多浪牛羊屠宰中心采集绵羊粪便2400份、胆汁400份、肝脏300份；从新疆农一师阿拉尔市大地屠宰场采集猪粪便100份；第2章试验筛选出HEV-IgM阳性的人血清样本7份，HEV-Ag阳性的人血清样本2份；第3章试验筛选出HEV-Ag阳性的猪血清样本26份。4.2.2主要试剂HighPureViralRNAKit(Cat.No.11858882001)购自Roche公司、PrimeScript™IIFirst-strandcDNASynthesisKit(Cat.No:6210A)购自宝生物工程(大连)有限公司、HiPureGelPureDNAKits(Cat.No.D2111-02)购自Magen公司、pGEM-TEasyVector60 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究购自Promega公司、Trans2KDNAMarkers，TransTaq-TDNAPolymerase购自北京全式金生物技术有限公司、TIANprepMiniPlasmidKit(Cat.No.DP103)购自天根生化科技有限公司、TRIZOL购自Invitrogen公司。4.2.3主要仪器高速冷冻离心机德国Eppendorf公司梯度PCR仪德国Eppendorf公司全自动凝胶成像分析系统美国Bio-Rad公司恒温水浴锅北京六一仪器高压灭菌锅上海博讯实业有限公司-80℃立体冰箱中国海尔公司电泳仪北京六一仪器BCN-1360生物洁净工作台哈尔滨东联电子技术开发有限公司恒温摇床上海科学仪器厂FastPrep-24SamplePreparationSystem北京北方同正生物技术发展有限公司4.2.4引物设计与合成根据GenBank公布的戊型肝炎病毒各基因型ORF2的保守区序列，参照文献（Wuetal2015），利用Primerpremier5.0软件设计一套套式PCR引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列见表4-1。表4-1戊型肝炎病毒ORF2区引物Tab4-1.TheprimerstargetingHEVORF2region引物名称引物序列(5′-3′)P1AATGGWGTTGGYGAGGTCP2WGARAGCCAAAGCACATCP3TGTTTAATCTTGCTGATACGP4TGYTGGTTRTCRTAATCCTG4.2.5样品处理采集的粪便样品用PBS(0.01mol，pH7.2-7.4)缓冲液制成10%的悬液，室温放61 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文置30min，反复冻融3次，4℃4000r/min离心20min，收集的粪便上清液置-80℃保存备用。采集的胆汁样品用双抗做1:10的稀释，反复冻融3次，4℃4000r/min离心20min，收集的胆汁上清液置-80℃保存备用。采集的肝脏样品取10-20mg放入含有磁珠的2mL匀浆管中，加入1.5mL的PBS，用匀浆机进行研磨，研磨的样品于4℃12000r/min离心15min，收集的肝脏上清液置-80℃保存备用。4.2.6粪便及胆汁样品HEV总RNA的提取以下所有枪头、离心管等材料均已去除RNA酶，具体操作步骤如下：⑪取900μLTRIzol加到1.5mL的Eppendorf管中；⑫加400μL收集的粪便上清（或者胆汁上清）于含有900μLTRIzol的Eppendorf管中，手摇混匀（颠倒十次），于室温放置10min；⑬加200μL氯仿于上述Eppendorf管中，平放涡旋15s，后置冰上10min；⑭12000r/min4℃离心15min；⑮吸取700μL上清离心液加入到新的1.5mL的Eppendorf管中（此步用枪头沿液面边吸边下移，切勿吸到中间的蛋白层）；⑯加入等体积异丙醇（700μL），手摇混匀，室温静置10min；⑰12000r/min室温离心10min；⑱吸弃上清，后加入900μL无水乙醇，300μLRnasefreeH2O（或直接加入1200μL75%酒精），用枪头轻轻混匀；⑲7500r/min室温离心5min；⑳吸弃上清，7500r/min室温离心5s；⑴尽量吸弃余液，后开盖置超净台风干5min；⑵加入10-15μLRnasefreeH2O溶解RNA；4.2.7肝脏样品HEV总RNA的提取按照HighPureViralRNAKit说明书逐步操作。62 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究4.2.8HEVRNART-nPCR检测HEVRNA第一链cDNA的合成取制备的RNA5μL，用PrimeScript™IIFirst-strandcDNASynthesisKit按照如下反应体系和条件进行变性及反转录：变性总量变性组份变性量P21μLdNTPsMixture(10mmoleach)1μL10μLRNAfreeddH2O3μLRNA5μL65℃5min变性后立即冰浴反转录总量反转录组份反转录量5×primerscriptⅡbuffer4μLRNaseinhibitor(40U/ul)0.5μL20μLprimerscriptⅡRNase(200U/ul)1μLRNasefreeH2O4.5μL上述变性液10μL42℃60min72℃15min5℃5min63 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文HEVRNA套式PCR检测取第一链cDNA(或第一轮产物)，按照如下反应体系和条件检测HEVRNA：总量组份量cDNA(或第一轮产物)2μL10×TransTaq-Tbuffer2.5μL2.5mMdNTPs1μL25μLTransTaq-TDNAPolymerase(5U/ul)0.5μLP1(P3)1μLP2(P4)1μLddH2Oupto25μL94℃预变性5min94℃30s35个循环55℃30s72℃30s最后一个循环结束后，72℃延伸10min。4.2.9PCR产物的纯化回收采用Axygen的HiPureGelPureDNAKits回收试剂盒回收PCR产物，具体步骤如下：⑪将PCR产物电泳分离，在紫外灯下快速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，将凝胶置2ml的离心管中；⑫按照大约每100mg凝胶量加入100μL体积计算，加入等体积BufferGDP，50-55℃水浴溶解7-10min，其间颠倒两次，使得凝胶完全融化；⑬将HiPureDNAColumn套在2mL收集管中，将融化的凝胶转移至HiPureDNAColumn柱中，静置2min，10000r/min室温离心1min（若融化的凝胶过多，可以将离心后收集管中的凝胶倒弃后重复该步骤）；⑭倒弃滤液，把HiPureDNAColumn柱放入收集管中，加入300μLBufferGDP，静置1min后10000r/min室温离心1min；⑮倒弃滤液，把柱子放入收集管中，加入600μLBufferDW2（已经用无水乙醇64 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究稀释），10000r/min室温离心1min；⑯重复步骤⑮；⑰倒弃滤液，把柱子放入收集管中，12000r/min室温离心2min；⑱把HiPureDNAColumn套在1.5mL离心管中，37℃开盖放置5min；⑲在HiPureDNAColumn柱膜中央加入30-35μL灭菌水，置室温2min后12000r/min离心1min；⑳将离心管中收集的液体再次加入HiPureDNAColumn柱膜中央，12000r/min离心1min，以增加DNA的回收率；⑴取3-5μL回收的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检查回收质量，余液-20℃保存，以备连接用。4.2.10回收产物的T/A连接按照如下的反应体系和反应条件，将PCR回收产物与pGEM-TEasyVector进行过夜连接：组份量2×RapidligationBuffer5μLpGEM-TEasyVector1μLT4DNAligase1μL回收产物3μL4℃连接过夜。4.2.11连接产物的转化DH5a感受态细胞的制备⑪将保存的DH5a菌种划线接种LB固体培养基，于37℃条件下培养18h左右；⑫挑取LB固体培养基上的单菌落，接种到5mLLB液体培养基中，于37℃条件下继续振荡培养10-12h左右；⑬将振荡培养的菌液按照1:50的比例接种到100mLLB液体培养基中，于37℃250r/min的条件下继续振荡培养2h左右，直至OD600=0.4-0.6左右；⑭在无菌条件下将培养液全部转入50mL灭菌的试管中，置冰上10min，400065 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文r/min4℃10min；（以下所有操作步骤均需无菌操作，且在冰上进行）⑮倒弃去上清，将离心管置冰上，用10mL预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液轻轻重悬沉淀，置冰上20min；⑯4000r/min4℃10min；⑰倒弃去上清，将离心管倒置lmin，使得培养液流尽；⑱加入预冷的4mL0.05mol/L的CaCl2溶液（含有15%甘油），轻轻重选菌体沉淀，置冰上3-5min，即做成DH5a感受态细胞悬液；⑲将感受态细胞液分装，100μL/管，-80℃保存备用。连接产物转化DH5a感受态细胞⑪从-80℃冰箱中取出分装好的DH5a感受态细胞，置冰上使其逐步融化；⑫无菌条件下将连接产物全部加入分装DH5a感受态细胞的离心管中，用枪头轻轻混匀；⑬40-42℃条件下（不高于42℃）在水浴锅中热激90s，迅速冰浴2min；⑭无菌条件下在离心管中加入500μLLB液体培养基（不含有抗生素），37℃250r/min条件下振荡培养45min；⑮5500r/min离心5min，吸弃上清400μL，将余液轻轻混匀；⑯取150μL培养物涂布含有对应抗生素的LB固体培养基平皿，37℃倒置过夜培养；4.2.12重组质粒的PCR鉴定重组质粒的小量提取在细菌瓶中加入5mLLB液体培养基（培养基中按照1/1000的比例加入Amp抗生素），从培养过夜的平皿上挑取可疑的转化菌落置细菌瓶中继续摇菌8-10h，采用TIANprepMiniPlasmidKit质粒小提试剂盒提取质粒，具体步骤如下：⑪将吸附柱CP3放在收集管中，于吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min离心1min，倒弃离心液，将吸附柱放入收集管；⑫取5mL培养菌液，用1.5mL离心管反复离心收集，每次12000r/min离心1min，最后一次用枪头尽量吸弃上清；⑬在离心管中加入250μLP1溶液，用枪头将沉淀菌体彻底混匀；⑭在离心管中加入250μLP2裂解液，静置2min后轻轻地上下翻转10次使得66 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究菌体充分裂解，此时菌液变得澄清透明；⑮向离心管中加入350μLP1溶液，加入后立即轻轻地上下翻转10次使得溶液充分混匀，此时会出现白色沉淀；⑯12000r/min离心15min；⑰将离心后的上清转移到吸附柱CP3中（尽量不要吸上蛋白沉淀），静置5min后12000r/min离心1min；⑱将收集管中的滤液再次回加到吸附柱CP3中，静置2min后12000r/min离心1min；⑲倒弃滤液，于吸附柱CP3中加入600μLPW漂洗液，12000r/min离心1min；⑳倒弃滤液，将吸附柱CP3放回收集管，重复步骤⑲；⑴倒弃滤液，将吸附柱CP3放回收集管，12000r/min离心2min；⑵将吸附柱CP3放入另一个1.5mL离心管，55℃开盖放置5min；⑶于吸附柱CP3膜中间部位加入30μL灭菌水，室温静置2min，12000r/min离心2min；⑷将滤液重新加回到吸附柱CP3膜中间部位，室温静置1min，12000r/min离心2min，滤液即为提取的质粒溶液。质粒的PCR鉴定提取的质粒按照如下反应条件和体系进行PCR鉴定：总量组份量质粒溶液0.5μL10×TransTaq-Tbuffer2.5μL2.5mMdNTPs1μL25μLTransTaq-TDNAPolymerase(5U/ul)0.5μLP31μLP41μLddH2Oupto25μL94℃预变性5min。67 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文94℃30s35个循环55℃30s72℃30s最后一个循环结束后，72℃延伸10min。4.2.13序列测定与系统进化分析选择PCR鉴定为阳性的重组质粒送北京擎科武汉测序部进行序列测定，将测序正确的序列提交到NCBI数据库。应用序列分析软件DNAStar，将扩增到的HEVRNA序列与GenBank中公布的基因Ⅰ-Ⅳ型HEV的46株代表毒株（表4-2）进行同源性比较，用MEGA5软件的neighbour-joining方法构建系统进化树，分析其遗传进化关系。表4-2同源性分析的参考毒株Tab4-2.ThereferencestrainsofphylogenetictreeGenotype/CodeforreferenceGenBankCountryHostSubtypestrainsaccessionNo．Out-groupAvianHEVEF206691USAAvianNewclusterGDC46FJ906896.1ChinarabbitNewclusterch-bj-n1GU937805.1ChinarabbitNewclusterGDC9FJ906895.1Chinarabbit1aB1(Bur-82)M73218.1burmaHuman1aI2[Mad-93]X99441.1India(Madras)Human1aTK15/92AF051830.1Nepalmonkey1aAbb-2BAF185822.1PakistanHuman1bC1(CHT-88)D11092.1China(xinjiang)Human(uighur)1bC2(K52-87)L25595.1China(xinjiang)Human(constructed)1bC3(CHT-87)L08816.1China(xinjiang)Human(uighur)1bC4(Uigh179)D11093.1China(xinjiang)Human(uighur)1bChinaHebeiM94177.1China(Hebei)Human1bP1(Sar-55)M80581.1Pakistan(Sargoda)Macaca1chev037X98292.1IndianHuman1eT3AY204877.1ChadHuman2amexicanstrainM74506.1mexicanHuman3aHE-JA10AB089824.1Japan(Tokyo)Human3aJKN-SapAB074918.2Japan:SapporoHuman3aHEV-US1AF060668.1USHuman3aHEV-US2AF060669.1USHuman3bSAAS-JDY5FJ527832.2China(Shanghai)Swine68 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究3bswJ570AB073912.1Japan(Tochigi)Pig3bJBOAR1-Hyo04AB189070.1Japan(Hyogo)Boar3bJRA1AP003430.1Japan(Tokyo)Human3jArkellAY115488.1Canada(Ontario)Swine4aJKO-ChiSai98CAB197673.1China(Xian)Human4aJYI-ChiSai01CAB197674.1China(Shanghai)Human4aswGX32EU366959.1ChinaSwine4aCHN-XJ-SW33GU119960.2China(xinjiang)Swine4bswGX40EU676172.2China(Guangxi)Swine4cHE-JA1AB097812.1Japan(Hokkaido)Human4cHE-JK4AB099347.1Japan(Tochigi)Human4cswJ13-1AB097811.1Japan(Hokkaido)Swine4dswCH25AY594199.1China(xinjiang)pig4dswCH189FJ610232.1China(Gansu)Swine4dhb-3GU361892.1China(hubei)Swine4dbjsw1GU206559.1China(Beijing)Swine4dT1AJ272108.1China(Beijing)Human4eIND-SW-00-01AY723745.1IndiaSwine4fHE-JA2AB220974.1Japan(Hokkaido)Human4gCCC220AB108537.1China(Changchun)Human4hCHN-XJ-SW13GU119961.3China(xinjiang)Swine4iSH-SW-zs1EF570133.1China(shanghai)Swine4iEChZ20HM439284.1China(eastern)Human4iswCH31DQ450072.1China(eastern)Swine4.3结果与分析4.3.1新疆南疆地区HEVRNA检测结果本研究从新疆南疆地区共检测3235份样品，其中，绵羊粪便2400份、绵羊胆汁400份、绵羊肝脏300份，猪粪便样品100份，人血清样品9份（由第二章试验筛选），猪血清样品26份（由第三章试验筛选）。检测出HEVRNA阳性肝脏和粪便样品共计15份，检出率为0.46%，扩增产物在226bp处有一目的条带，见表4-3，图4-1。69 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文表4-3戊型肝炎病毒RNA检测结果Tab4-3.ThedetectionresultsofHEVRNA样品检测总数阳性数阳性率（%）绵羊粪便240000绵羊胆汁40000绵羊肝脏30041.33猪粪便1001111HEV-IgM阳性人血清700HEV-Ag阳性人血清200HEV-Ag阳性猪血清2600合计3235150.46123456720001000750500250226bp1007654321图4-1部分样品RT-nPCR检测结果Fig.4-1RT-nPCRresultofpartialsamples泳道1-2：部分猪样品检测结果泳道3-4：部分羊样品检测结果泳道5：阳性对照泳道6：阴性对照泳道7：Maker4.3.2戊型肝炎病毒检测序列的核苷酸同源性比较根据阳性样品的编号，将本研究从绵羊肝脏组织中鉴定的4个羊源戊型肝炎病毒检测序列依次命名为：XJNJSLhev25、XJNJSLhev27、XJNJSLhev28和70 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究XJNJSLhev30，将其核苷酸序列提交NCBI数据库，获得GenBank登陆号：KP294330-KP294333；将本研究从阿拉尔市大地屠宰场猪粪便中鉴定的11个猪源戊型肝炎病毒检测序列依次命名为：XJNJSSHEV6、XJNJSSHEV13、XJNJSSHEV22、XJNJSSHEV23、XJNJSSHEV30、XJNJSSHEV32、XJNJSSHEV56、XJNJSSHEV67、XJNJSSHEV86、XJNJSSHEV88和XJNJSSHEV93，将猪源戊型肝炎病毒核苷酸序列提交NCBI数据库，获得GenBank登陆号为：MF434534-MF434542。本研究中15个检测序列核苷酸相互之间的同源性为97.4%-100%，与Ⅰ-Ⅳ型参考株之间的同源性依次为：81.6%-86.3%、84.2%-85.3%、80.0%-85.8%和84.2%-97.9%，见表4-4。表4-4戊型肝炎病毒ORF2部分核苷酸序列同源性比较(%)Tab4-4.Pairwisesequenceidentitiesbetweentheisolatedsequencesandcorrespondingsequencesofreferencestrainsofthefourgenotypes(%)基因型基因Ⅰ型基因Ⅱ型基因Ⅲ型基因Ⅳ型粪便分离肝脏分离（分离株数）（12）（1）（12）（20）株（11）株（4）肝脏分离株（4）81.6-85.384.2-85.382.1-85.384.7-97.997.4-99.197.8-100粪便分离株（11）81.6-86.384.2-85.380.0-85.884.2-96.899.1-100基因Ⅳ型（20）80.5-88.483.7-86.878.9-86.886.3-100基因Ⅲ型（12）80.5-91.180.0-86.880.5-100基因Ⅱ型（1）83.7-87.9100.0基因Ⅰ型（12）88.9-100注：括号里面的数字表示各基因型参考毒株和分离序列的数量Note:Numbersinparenthesesrepresentnumberofreferencesequencesandisolatedsequences.4.3.3戊型肝炎病毒检测序列的系统进化分析采用MEGA5软件的neighbour-joining法，以本研究186bp（不含引物序列）的核苷酸片段和各参考基因型毒株对应位置处的核苷酸片段绘制系统发育进化树，分析其遗传演化关系。本研究的15个肝脏和粪便检测序列集聚形成一个分支，与中国人源戊型肝炎病毒代表株T1（AJ272108）和新疆猪源戊型肝炎病毒代表株（AY594199）处于同一分支，属于4d亚型，见图4-2。71 XJNJSSHEV86.seqXJNJSLhev25.seq华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文XJNJSSHEV22.seqXJNJSSHEV30.seqXJNJSSHEV13.seqXJNJSSHEV6.seqXJNJSSHEV32.seqXJNJSSHEV67.seqXJNJSSHEV88.seqXJNJSSHEV56.seq4dXJNJSSHEV93.seqXJNJSSHEV23.seqXJNJSLhev28.seqXJNJSLhev30.seqXJNJSLhev27.seqGU361892.1.seqGU206559.1.seqAJ272108.1.seqGenotype4FJ610232.1.seqAY594199.1.seqAB099347.1.seqAB097811.1.seq4cAB097812.1.seqAB220974.1.seq4fGU119961.3.seq4hAY723745.1.seq4eDQ450072.1.seqHM439284.1.seq4iEF570133.1.seqAB108537.1.seq4gEU676172.2.seq4bAB197674.1.seqEU366959.1.seq4aAB197673.1.seqGU119960.2.seqM74506.1.seqGenotype2FJ906896.1.seqGU937805.1.seqNewclusterFJ906895.1.seqAB073912.1.seqFJ527832.2.seq3bAB189070.1.seqGenotype3AP003430.1.seqAY115488.1.seq3jAF060669.1.seqAF060668.1.seq3aAB074918.2.seqAB089824.1.seqAY204877.1.seq1eM73218.1.seqX99441.1.seq1aAF051830.1.seqAF185822.1.seq1cX98292.1.seqGenotype1D11092.1.seqM80581.1.seqD11093.1.seq1bL25595.1.seqL08816.1.seqM94177.1.seqEF206691.seq0.1图4-1基于ORF2部分186bp的系统进化树Fig.4-1Phylogenetictreebasedona186bppartialnucleotidesequencesofORF2注：▲代表羊源检测序列●代表猪源检测序列Note:SheepStrainswereindicatedwithsymbol▲SwineStrainswereindicatedwithsymbol●72 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究4.4讨论戊型肝炎的散发病例近年来在国内外均有逐步增加的趋势，在没有疫苗可供选择进行预防的条件下，病毒唑等一些广谱的抗病毒药物可用于病毒性传染病的治疗，在急性戊型肝炎的防治中病毒唑也表现出积极有效的作用。但是，近年来，戊型肝炎新的动物宿主又不断被发现，犬、鹿、禽、啮齿类等动物在HEV的流行中具有直接或者潜在的传播作用，牛、羊等大家畜对HEV多呈现亚临床感染，因不易引起人们的注意而更有机会将HEV传播给人的潜在风险。戊型肝炎病毒经肝细胞繁殖后随胆汁进入肠道，最终经粪便排出，通过直接或间接的途径造成其他人和家畜感染，从而形成戊型肝炎流行的循环圈。报道证实，在亚洲，我国是戊型肝炎的高发地区，几乎全国各省市均有戊型肝炎发病病例的出现，并有多起暴发流行的报道，因此，密切关注并深入研究戊型肝炎在流行地区人和家畜之间的动态分布，有利于对该疾病的发展趋势进行正确的判断，并进行及时有效的合理控制。在发生大暴发的时隔数年之后，戊型肝炎在新疆当地特别是在南疆人畜之间的流行状况并不清楚，因此，有必要对新疆南疆地区人畜戊型肝炎流行情况进行系统的分子流行病学调查。本研究前期对新疆南疆地区不同人群和牛羊等主要经济动物的抗原抗体检测时发现，检测对象均有戊型肝炎抗体的存在，其中，猪群戊型肝炎抗体阳性率较高，HEV-Ab达到了53.25%，检测人群的HEV-IgG阳性率也达到了10.40%。虽然，我国研发的世界首个人用戊型肝炎疫苗在临床试验中表现出积极有效的作用，并于2012年获批上市，但是，该疫苗目前尚未被新疆南疆地区纳入计划免疫接种的范围，因此，当地人群和牛羊等动物体内存在戊型肝炎病毒抗体应该是自然感染的结果。戊型肝炎病毒的ORF2编码框相对保守，因此，对于戊型肝炎病毒核酸水平的检测大多采用针对该编码框的套式PCR，在检测样品的选择上，因戊型肝炎病毒在肝细胞中增殖后，要经过胆汁和肠道这一途径，最终随粪便排出，所以，肝脏、胆汁和粪便中应该分布有大量的病毒，病毒血症期患病机体的血液中也有一定量的病毒存在，因此，在病原核酸的检测时应该主要选择粪便、胆汁和肝脏。但是，本研究采用针对ORF2的套式PCR对新疆南疆3235份样品的检测发现，仅有4份绵羊肝脏和11份猪粪便样品的HEVRNA呈现阳性，检出概率极低，而且，在绵羊肝脏样品的实际检测过程中，即使在同一份阳性肝脏样品上分别切取不同的部位，按照相同73 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文的方法进行处理后扩增选取部位的HEVRNA，也会出现同一份肝脏样品上有些位点HEVRNA呈阳性，而有些位点呈阴性的情况，这说明HEV感染肝脏具有“局灶性”特征，这种情况的存在也增加了本方案原拟扩增绵羊HEV全基因组序列的风险。HEVRNA低检出率的原因可能是：首先，戊型肝炎导致的病毒血症很短，患者排毒的时间也很短，估计这是HEVRNA低检出率的主要原因，其次，新疆南疆近年戊型肝炎的流行处于下降趋势，人和动物抗体阳性可能是既往感染的结果。戊型肝炎病毒虽然只有一个血清型，但是，可以分为四个典型的基因型，各型病毒具有相对严格的流行地域分布，在非洲和亚洲部分地区主要分布Ⅰ型病毒，当地流行的戊型肝炎主要是由水源污染问题导致的大流行，墨西哥等地区主要分布Ⅱ型病毒，这两型病毒主要通过水源和粪口途径感染人类；Ⅲ型和Ⅳ型病毒可以感染包括人在内的多种哺乳类动物，但是，往往呈现散发流行。其中，我国以基因Ⅰ型和基因Ⅳ型比较多见，近年，上海地区的猪群中又分离到基因Ⅲ型戊型肝炎病毒，江苏省的部分地区也发现人源基因Ⅲ型戊型肝炎病例，周恩民教授的研究团队首次从我国部分地区的鸡群中又检测到禽源戊肝病毒。本研究从新疆南疆地区的采样中仅检测到15株戊型肝炎病毒，15个南疆检测序列之间的同源性为97.4%-100%，与Ⅰ-Ⅲ型病毒的同源性依次为：81.6%-85.3%、84.2%-85.3%和80.0%-85.8%，与Ⅳ型病毒的同源性为84.2%-97.9%。本研究的15个检测序列在系统进化分析时集聚形成一个分支，与国内Ⅳ型病毒的人源检测株T1（AJ272108）、北京猪源检测株bjsw1（GU206559）、湖北猪源检测株hb-3（GU361892）、甘肃猪源检测株swCH189（FJ610232）和新疆猪源检测株swCH25（AY594199）处于同一分支，同属4d亚型，没有从新疆南疆地区检测到Ⅲ型病毒。本调查结果提示当地猪源和羊源病毒高度相似，且与人源戊型肝炎病毒具有跨物种传播的潜在性，这一结论不但进一步从基因水平上佐证了戊型肝炎是重要的人兽共患传染病，同时提示4d亚型病毒很有可能在当地人、猪和羊之间保持循环感染。74 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究第5章结论戊型肝炎呈现全球流行的趋势，据报道，全球每年大概有2000万人感染戊型肝炎病毒，其中，330万人发病而表现出戊型肝炎典型的临床症状，每年约有5.66万人死于戊型肝炎。为此，2016年7月28日的世界肝炎日，世界卫生组织进一步呼吁各层面要“了解肝炎，立刻行动”，通过采取积极行动以控制并减少因戊型肝炎导致的发病和死亡。戊型肝炎在新疆南疆曾经暴发流行，研究戊型肝炎在当地的流行现状是疫病防控和公共卫生安全首要解决的问题。本论文对新疆南疆地区人畜戊型肝炎的流行现状进行了分子流行病学研究，主要成果如下：1.对新疆南疆地区人源戊型肝炎进行了系统的流行病学调查，发现30-60岁中青年人群是戊型肝炎的高发人群；戊肝流行具有明显的职业倾向性，其中，与家畜有密切接触从业人群的感染率显著高于其它从业人群的感染率；戊肝流行具有地域差异性，喀什与和田地区的感染率相对较高；南疆当地戊型肝炎的流行具有性别和族别差异性，其中，以维吾尔族男性感染率相对较高。2.新疆南疆地区主要经济动物均存在戊型肝炎病毒感染，从检测样本的流行情况来看，各畜种的感染率：猪（53.25%）＞鹿（32.4%）＞羊（30.00%）＞犬（13.13%）＞牛（7.03%）＞鸡（1.56%）。3.首次从绵羊肝脏中检测到戊型肝炎病毒RNA，为戊型肝炎的食源性传播提供了证据。4.新疆南疆人畜间流行基因Ⅳ型戊型肝炎病毒，属于4d亚型，目前尚无基因Ⅲ型病毒在当地流行；4d亚型戊型肝炎病毒很有可能在新疆南疆当地的人、猪和羊之间保持循环感染。75 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华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文258.WuJ,SiF,JiangC,LiT,JinM.MoleculardetectionofhepatitisEvirusinsheepfromsouthernXinjiang,China.Virusgenes,2015,50(3):410-417．102 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究附录个人资料姓名：武军元性别：男籍贯：甘肃出生年月：1980年11月专业：预防兽医学导师：金梅林教育背景2013年9月－2017年12月于华中农业大学攻读博士学位；2003年9月－2006年6月于石河子大学攻读硕士学位；1999年9月－2003年6月于石河子大学攻读学士学位。研究生阶段发表论文：1．JunyuanWu,FushengSi,ChunyuJiang,TaoLi,MeilinJin.MoleculardetectionofhepatitisEvirusinsheepfromsouthernXinjiang,China.VirusGenes,2015,50:410-417．(IF:1.837)2．武军元，侯向萍．新疆地区公共场所从业人员戊型肝炎病毒感染血清学调查分析．吉林大学学报(医学版)，2016，42（4）：827-829．3．武军元，侯向萍．新疆南疆地区不同职业人群戊型肝炎病毒感染状况调查及影响因素．实用医学杂志，2016，32（14）：2402-2404．4．武军元，康强，白正辉．新疆天山马鹿戊型肝炎病毒血清流行病学调查．黑龙江畜牧兽医，2015，06（下）：131-133．5．武军元．新疆阿克苏地区猪戊型肝炎血清流行病学调查．黑龙江畜牧兽医，2016，(04下)：115-116．6．武军元．新疆南疆地区犬戊型肝炎病毒的血清学调查．贵州农业科学，2016，44(2)：100-102．研究生阶段获奖情况：1.获新疆维吾尔自治区第十四届自然科学优秀学术论文三等奖。103 华中农业大学2017届博士研究生学位（毕业）论文致谢时光荏苒，值本论文完稿之际，我在华中农业大学的求学生涯即将画上一个圆满的句号。回想在工作十年之后再次来到美丽的狮子山下圆我的博士梦想，不禁感慨不已！首先，要感谢我的恩师金梅林教授，很清楚记得2012年给金老师发的第一份电子邮件，当时我提出想从遥远的边疆来金老师的实验室学习分子生物学操作技术，没想到金老师很爽快地答应了我的请求。一年之后，当我再次提出想继续我的博士生涯时，金老师依然不嫌愚钝，并携我走上科研的道路。在华农求学的四年时间里，金老师不但在科研的思路与试验的开展方面给予手把手的指导，生活中更是言传身教，年近六旬的女性科学家前辈了，一年四季，不分白天黑夜，依然能和学生们保持相同的研究步调，让我切实感受到什么是一名合格的研究工作者应该具备的科学态度和科学精神，这种精神无疑是我研究生涯中追求的可贵目标。值此论文付梓之际，谨向导师金梅林教授致以最诚挚的感谢！感谢陈焕春院士领衔的研究队伍为我们搭建了一流的学习环境和研究平台，在这里，几乎每周都有机会享受国内外业界专家为我们带来的学术大餐，这种难得的学习机会使我深刻感受到边疆高校和内地高校之间的区别，也使我再次眷恋培养我的华中农业大学！感谢农业微生物国家重点实验室的曹胜波教授、周锐教授、肖少波教授、郭爱珍教授、何启盖教授、吴斌教授、曹罡教授、赵凌教授、彭贵青教授、张安定教授和周红波教授在科研思路上的启导，特别感谢刘正飞教授对我手把手的指导！感谢实验室的师弟师妹们：涂加钢、邹威、王荡和曾松林在我第一次来实验室学习时给予了很多操作技术上的指导；孙欣、刘亮、康超、张俊勤、郭克磊和张世硕，我们一起入校，相互交流，彼此帮助，共同度过了我们最难忘的博士生活；同时还要感谢胡勇、邹忠、赵宗正、朱记平、李永涛、刘成、张强、赵联忠、林显、刘小坤、王雅、张文婷、许仲旻、钱伟和王盛羽等博士；刘志刚、王平安、杨静、周丽姗、黄慧敏、张雪、雷二铭、杨宇洁和黄开松等硕士，我们朝夕相处，彼此交流，有机会在一起学习是我们的缘分！感谢实验室的科研助管孙小美女士和科前公司的李冉、李淑云、杨影、石健、杭尧和马婷婷等同事，他们的付出为实验室每位同学研究工作的顺利开展提供了充104 新疆南疆地区人畜感染戊型肝炎流行病学研究分的后勤保障！感谢西北农林科技大学的周恩民教授、赵钦副教授、上海市农业科学院畜牧兽医研究所的李震研究员、司伏生副研究员和石河子大学的马勋教授、胡广东副教授，他们在研究过程中给我提出了很多合理的建议并给予指导！感谢华中农业大学动物医学学院和塔里木大学动物科学学院的行政领导，他们积极响应并贯彻落实教育部对口支援新疆少数民族地区高校政策的举措，使得我在工作十年之后再次获得了求学的机会！感谢新疆生产建设兵团阿拉尔市人民医院检验科侯向萍主任、新疆生产建设兵团第三师人民医院检验科龚天美主任、新疆阿克苏地区动物疾控中心检验科康强科长、新疆库车县动物疾控中心黄忠武主任、新疆阿瓦提县动物改良站姚礼文站长、新疆生产建设兵团第一师动物疾控中心龚磊科员、新疆生产建设兵团第二师33团动物疾控中心张生帅科员、新疆生产建设兵团第三师50团动物疾控中心单俊娟科员在采样过程中的协调与帮助！感谢塔里木大学信息工程学院统计学专业李春娥老师在数据分析过程中的指导与帮助，感谢塔里木大学动物医学系的同事们，我在外出求学阶段他们分担了繁重的教学任务！感谢我的家人，特别感谢我的妻子宋小英女士，在我外出求学阶段她不仅要完成自己的教学工作，还要扛起照顾年迈公公婆婆和两个孩子的任务，以及里里外外的家务，对妻子默默的付出深表歉意！最后，再次向所有关心我和帮助过我的领导、老师、同事和同学致以我最诚挚的谢意！武军元二零一七年十二月于狮子山下105 华中农业大＃ＩＨＨＥ｜博士学位论文ＰｈＤＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ
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