石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究

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2012109057单位代码：10759石河子大学磧士考依铪弍石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究学位申请人夏小伟指导教师左维泽申请学位门类级别医学硕士学科、专业名称内科学研究方向病毒性肝炎的基础与临床研究所在学院医学院中国.新疆.石河子2015年5月 分类号：密级：无学号：2012109057单位代码：10759石河子大学硕士学位论文石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究学位申请人夏小伟指导教师左维泽申请学位门类级别医学硕士学科、专业名称内科学研究方向病毒性肝炎的基础与临床研究所在学院医学院中国·新疆·石河子2015年5月 TheInfectionandPartialNucleotideSequencingofHepatitisEVirusforPeopleinShiheziofXinjiangProvinceADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByXiaXiaowei(InternalMedicine)Supervisor:ZuoWeizeMay,2015 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名::師时间■年彡月/如使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名时间：年f月~日时间：沉年<月"曰 中文摘要目的新疆是戊型肝炎的高发区，在我国石河子地区HEV在人群中的流行情况的详细报告较少，我们希望通过本实验研究探讨戊型肝炎病毒在石河子地区的人群血清流行病学和分子流行病学的情况，以期对今后HEV的预防和进一步研究奠定良好的理论基础。方法用ELISA试剂盒检测人血清中的抗-HEV抗体，对部分血清、粪便标本进行HEVRNA检测，并对PCR阳性产物进行克隆测序，并进行部分基因序列分析。结果1.本次调查共检测3513人，总体抗体阳性率为26.10%，其中，男性1678人，抗体阳性率为25.98％，女性1835人，抗体阳性率为26.21％。城镇人口2417人，抗体阳性率为17.21％；乡村人口1096人，抗体阳性率为45.71％。不同年龄组人群抗体阳性率差异有显著性，且随着年龄的增长抗体阳性率呈增长趋势。不同职业人群中，农牧民的抗体感染率最高，为46.70%。不同民族人群阳性率差异有显著性。2.本研究为在同一急性戊型肝炎患者的血清和粪便中分别检测到3份HEVRNA阳性样本，序列分析显示石河子各株间氨基酸同源性在96.7%～100%,核苷酸同源性均在84.5%～93.8%。选取不同基因型ORF2的部分核苷酸与石河子地区3株HEV（Sh-H-r、Sh-H-f-1、Sh-H-f-2）进行比较分析，石河子地区3株均属基因IV型。结论石河子地区抗-HEV抗体阳性率为26.10%，具有较高的感染率。石河子地区3株HEV均属基因IV型。关键词戊型肝炎病毒；流行病学；基因型论文类型A(基础研究)I AbstractObjectiveXinjiangisthehighincidenceareaofHEinShiheziarea.TherearelessdetailedreportsaboutHEVinthecrowdprevalence,wehopethatthepassageofthisexperimentalstudyofHEVinShiheziinthecrowdepidemiologyandmolecularepidemiologyserum,thesituationwithaviewtothefutureHEVfurtherstudyandthepreventionlayagoodtheoreticalbasis.MethodByELISAfordetectionoftheanti-serum-HEVantibody,forsomeserumandstoolspecimensforHEVRNAdetection,andpositivePCRproductswereclonedandsequencedandpartialgenesequenceanalysis.Result1.Theoverallpositiverateofanti-HEVIgGwas26.10%inatotalof3513people.While,in1678maleand1835female,thepositiveratewas25.98%and26.21%.Theantibodypositiveratewas17.21%and45.71%inurbanpopulation2417peopleandruralpopulationof1096people.Thepositiverateofanti-HEVIgGincreasedwithage.Farmersandherdsmenantibodiesinfectionratethatwas46.70%washighest,indifferentoccupationalgroupsofpeople.Differentethnicpeoplehavesignificantpositivedifference.2.ThisstudyintheserumofpatientswithacuteHEV,fecesdetectedthreeHEVRNApositivesample,sequenceanalysisshowedthatthestrainsbetweenChangchunaminoacidhomologyof96.7%to100%,nucleotidehomologyare84.5%to93.8%,selectdifferentgenotypesORF2partofnucleotideandShihezithreehepatitisEviruses(Sh-H-r,Sh-H-f-1,andSh-H-f-2)conductedacomparativeanalysis,allofthreeShihezihepatitisEvirusesareTypeIV.ConclusionTheresultsofHEVantibodypositiveratewas26.10%inShihezi,withhigherinfectionrates.ShihezithreeHEVgenearetypeIV.KeyWordshepatitisEvirus；epidemiology；genotypeTypeofthesisA(Basicresearch)II 目录中文摘要...................................................................................................................I英文摘要..................................................................................................................II中英文缩略表...........................................................................................................V前言.........................................................................................................................1第一部分石河子地区戊型肝炎血清流行病学调查研究实验一的材料与方法................................................................................................3实验一的结果...........................................................................................................5实验二的材料与方法................................................................................................7实验二的结果...........................................................................................................8第二部分戊型肝炎病毒基因型研究材料与方法..............................................................................................................10结果..........................................................................................................................19讨论..........................................................................................................................21结论...........................................................................................................................23参考文献....................................................................................................................24综述...........................................................................................................................25致谢............................................................................................................................35作者简介.....................................................................................................................36导师评阅表.................................................................................................................37III 英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称AmpAmpicillin氨苄青霉素bpBasepair碱基对cDNAComplementaryDNA互补DNADNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸DNaseDeoxyribonuclease脱氧核糖核酸酶dNTPDeoxyNTP脱氧核苷三磷酸DTTDithiothreitol二巯基苏糖醇E.coliEscherichiacoli大肠杆菌EBEthediumbromide溴化乙锭EDTAEthylenediaminetetraaceticacid二乙胺四乙酸ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验HAVHepatitisAvirus甲型肝炎病毒HBVHepatitisBvirus乙型肝炎病毒HCVHepatitisCvirus丙型肝炎病毒HEVHepatitisEvirus戊型肝炎病毒HGVHepatitisGvirus庚型肝炎病毒HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IFAIndirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光分析KanaKanamycin卡那霉素KbKilobase千碱基kDaKilodalton千道尔顿TETris-EDTAbufferTris-EDTA缓冲液UTRUntranslatedregion非翻译区NSPnon-structureprotein非结构蛋白ODOpticaldensity吸光度OPDOrtho-phenylene-diamine邻苯二胺ORFOpenreadingframe开放阅读框架PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应RT-PCRReversetranscriptionPCR逆转录-聚合酶链式反应poly（C）polycytosinetract胞嘧啶富集区V 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究前言戊型肝炎（HepatitisE,HE）是由戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus,HEV）引起的一种经粪-口途径传播的严重危害人类健康的急性自限性病毒性肝炎。据不完全统计，全球目前已有23亿人口感染了HEV[1-2]，所以说HE已成为全球关注的公共卫生问题。在急性肝炎病例中，尤其是在亚、非等发展中国家，HEV感染可居首位。随着对HEV感染宿主研究的开展,已在多种动物中检测到抗HEV抗体或病毒RNA,同时，还发现，吃生的或未煮熟的肉制品和奶制品是导致HEV感染病例发生的一个重要原因，它已被证实，是一个新兴的人畜共患传染病[3-9]HEV属于戊型肝炎病毒科（Hepeviridafamily）戊型肝炎病毒属(Hepevirusgenus)，形状呈球形，无包膜，大小约为27-34nm，20面体，表面不规则，为单股正链的RNA病毒。该病毒活性不稳定，对一般的化学试剂敏感，在-70℃～8℃之间保存易降解。HEV全基因组长约为7.5kb；其基因组结构为5’NCR-NS-S-NCR-Poly(A)3’；其中5’NCR含有27nt,3’NCR含有48nt,全基因组含有三个相互重叠的开放阅读框架(openreadingframe,ORF)[10-11]。其中ORF2是HEV的主要结构基因编码区，编码着病毒衣壳蛋白。通过分析pORF2aa序列，其结果显示具有典型的病毒衣壳蛋白特性，并且带有明显的序列样信号片段同时包含有潜在的切割位点(PA/PPP)。根据研究结果显示[12]，HEV仅有一个血清型，但基因型却远远不止一个，目前，HEV的基因分型多采用的是ORF2基因或基因片段，学术界多数认为HEV有5个基因型。其中，基因Ⅰ型是缅甸类似株基因型（也称亚洲基因型），以缅甸株为代表，又包括中国的北京、新疆、杭州和深圳等地区分离出HEV病毒株、吉尔吉斯坦株、印度株、巴基斯坦株及非洲株；基因Ⅱ型是墨西哥基因型，此型仅仅为墨西哥株；基因Ⅲ型是美国基因型，包括人的HEVUS-1和US-2以及猪的HEV病毒株；基因Ⅳ型是中国基因型，包括从广州分离得到的两株HEVG-9和G-20，及从辽宁、河北、厦门和台湾等地区的急性散发性戊型肝炎患者的血清或粪便标本中分离得到的HEV变异株；基因Ⅴ型目前仅发现于禽类，可引起鸡的大肝脾病，也可越种感染猪、火鸡等。其中，基因Ⅰ型和Ⅱ型仅发现于人类，Ⅲ型和Ⅳ型在人与动物间均有发现，为人兽共患[2]。对于HE的临床诊断，主要依靠流行病学、临床表现以及实验室检查来综合判断。流行病学主要考虑是否接触有急性病毒毒性肝炎患者或者到过HE高发地区等；传播途径是否有不解饮食或生食肉、奶等；易感人群，人群普遍易感。该病最常见于卫生条件较差的偏远地区,通常可通过被污染的水和食物引起HE的爆发或流行。HE的临床表现与甲型肝炎相似,多起病急骤,常可伴有发热、畏寒、食欲减退、乏力、恶心、肝脾肿大以及肝功异常等，一般很少见慢性病例，但黄疽型病肝炎和重症肝炎的比例较高,病死率高于其他类型的病毒性肝炎。目前，实验室检查主要凭借肝功能检查、病毒抗原或抗体检测以及对病毒RNA的检测。HEV的抗原检测，主要使用患者恢复期的血清作为抗体，来检测急性期患者的粪便及胆汁中病毒的抗原，通过免疫电镜观察符合率接近100%；1 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究HEV的抗体检测，检测方法包括有酶联免疫、WesternBlot等，这些方法在日常工作和研究中均有应用。目前，HEV抗原、抗体检测试剂盒的研发工作已取得了明显的成效，当前，用于临床上检测血清抗HEV抗体的试剂盒多是围绕ORF2或ORF3而设计。国内外很多商家生产了一整套用于检测IgG、IgM、血清总抗体，以及检测抗原的试剂盒，其特异性和灵敏性都比较好[2,13]。另外，利用RT-PCR技术、免疫荧光等方法，可以检测肝组织、血清以及粪便标本中的HEV-RNA。HE主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的一些发展中国家，但在美国、英国、法国以及日本等发达国家中，散发病例在一年四季中也常有发生。在我国，各省、市、自治区均有HE病例的发生，其中新疆、内蒙、河北、山东、辽宁、吉林和北京等地曾发生过HE的暴发或流行。根据卫生部全国法定传染病疫情报告分析来看，自2003年以来，我国HE的发病情况呈现一种上升的态势；2009年共报告HE病例20275例，较2008年同期增加了8.89%,其中死亡24例。同时，HE在急性病毒性肝炎病例中所占的比例已从2003年的8.85%上升为2009年的31.62%[14]。1986～1988年在新疆的南疆地区发生了当时世界上规模最大的一次HE大流行，持续时间长达20多个月，发病人数为119280例，死亡近千人，其流行规模震惊世界[2,14]。此后，新疆地区的HEV研究倍受关注。2011年，钟崇芳等[15]对大流行后的新疆和田地区人群进行了血清流行病学调查，结果显示HEV-IgG阳性率为34.98%；虽然，这一结果与内地的HEV-IgG阳性率相似，但是在11岁和21岁以下年龄组中HEV-IgG阳性率分别为20.49%和54.17%，明显高于内地报道的2.5%和7.4%，证明在该地区中儿童与青少年的HEV的隐性感染仍然是很严重的问题。该年龄段群体属于1989年之后出生的新一代，他们的抗体阳性水平较高，反应了新感染者的比例仍然在增加。同时，他们的研究显示在不同民族人群中，HEV-IgG阳性率无差异，与1986-1989年大流行中维吾尔族人群的感染率高于汉族人群有明显不同。其研究结果提示：当前新疆地区的HEV感染已经发生了变化。又根据新疆维吾尔族自治区传染病网络直报系统中的HE发病数据，2010、2011、2012年，新疆维吾尔族自治区HEV人群发病率分别为0.91/10万、1.15/10万、1.32/10万，表现出了明显的上升趋势。本课题选取新疆维吾尔自治区石河子地区为研究现场,一方面对辖区范围内不同人群和动物群HEV感染状况的调查，分析抗HEV-IgG抗体在不同宿主间的感染；另一方面,本课题采用巢式RT一PCR方法对石河子市急性散发性HE患者的血清和粪便中的HEV-RNA进行检测,通过对分离株的序列分析,来明确石河子地区流行的HEV基因型,了解本地区感染的HEV基因型分布及其流行趋势,为HE的防治提供科学依据。所以说，为进一步了解新疆范围内HEV感染的情况，开展此次研究就十分有必要。2 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究第一部分石河子地区戊型肝炎血清流行病学调查研究实验一人群戊型肝炎病毒血清流行病学研究材料与方法（Materials&Methods）1.1调查对象采用分层随机抽样方法将石河子地区按行政区划分为市区、石河子镇、下野地、安集海和莫索湾5个片区，在每个片区随机抽取2～3个乡(村)或社区，按照人口系数以家庭为单位随机抽取居住6个月以上，年龄在1～59岁的居民为调查对象。共调查3513人。1.2标本采集按照流行病学调查要求。采用入户调查方法，统一调查问卷，对确定的调查个体进行现场流行病学调查，同时由专业人员对目标人群采集静脉血2ml，统一编号，分离血清于－20℃冰柜中冷冻保存待检。1.3试剂与仪器1）戊型肝炎病毒IgG抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）：北京万泰生物药业有限公司产品；2）蒸馏水：自制；3）酶标仪：德国；4）洗板机：德国；5）恒温培养箱：上海医疗仪器厂；6）台式振荡器：国产HZ881K台式振荡器；7）低温冰箱：日本三洋产MDF-382E型；8）离心机：德国ThermoScientific；9）10ul、100ul、200ul微量移液器：德国Eppendorf产品；10）一次性10ul、100ul、200ul枪头、离心管、炮弹管：上海生物工程公司产品。1.4检测方法1.4.1检验原理：采用间接法酶联免疫吸附试验原理。微孔条上预包被的基因重组HEV抗原，可与3 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究样品中抗HEV抗体结合，洗板后加入酶标试剂进行二次温育。当样品中存在HEV-IgG抗体时，将形成“包被抗原-抗体-酶标抗体”复合物。复合物上连接的HRP催化显色剂反应，生成蓝色产物，终止反应后变为黄色。若样品中无HEV-IgG抗体时，不显色。1.4.2检验方法：1）配液：20倍稀释浓缩洗涤液，可使用蒸馏水或去离子水；2）编号：按微孔板顺序编号标本，每次试验设阴、阳及空白对照，其中阴性对照2孔，阳性对照1孔和空白对照1孔；3）稀释：将100ul标本稀释液加入到每孔中，空白孔不加；4）加样：再依次加入待检标本或阴阳对照各10ul，振荡器上振荡10秒混匀（空白对照孔不加）；5）温育：封板膜封严后放置温育箱内，37℃温育30分钟；6）洗涤：轻轻揭开封板膜，向反应孔内加入200ul洗涤液洗涤5次，最后一次洗涤后，扣干反应孔内的洗涤液；7）加酶：依次加入100ul酶标试剂，空白孔不加；8）温育：方法同5；9）洗涤：方法同6；10）显色：依次加入A、B显色剂液各1滴，振荡器振荡10秒混匀，室温下避光显色15分钟；11）测定：依次加入终止液1滴，振荡器振荡10秒混匀，在反应结束10分钟内测定结果。酶标仪的波长设定在450nm处；调零空白孔后测定各孔A值。1.4.3参考范围：1）正常的阴性对照范围：一般情况下，阴性对照孔的A值≤0.1（若有1孔阴性对照孔的A值大于0.1应放弃该孔，若有两孔或两孔以上的阴性对照孔A都大于0.1，应重复实验）。2）正常的阳性对照范围：一般情况下，阳性对照孔的A值≥0.8。1.4.4检验结果的解释：1）计算临界值：临界值=0阴性对照孔A值的平均值+16。（若阴性对照孔A值都小于0.03，按0.03计算）。2）判断阳性：样品的A值≥临界值，判定为HEV-IgG抗体反应阳性。3）判断阴性：样品的A值<临界值，判定为HEV-IgG抗体反应阴性。1.5统计学处理采用Epidata3.2数据库软件对所有检测数据进行双盲录入，运用SPSS17.0软件进行数据分析，采用描述性统计分析，组间比较采用X2检验，P＜0.05，认为差异有统计学意义。4 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究结果（Results）2.1戊肝IgG抗体检出情况被调查的3513名居民，戊肝IgG抗体阳性数为917例，阳性率为26.10％；其中男性检测数1678例，阳性数435例，阳性率为25.98％；女性检测数1835例，阳性数481例，阳性率为26.21％；两组阳性率差异无统计学意义（X2=0.0386，P＞0.05；表1）。表1不同性别戊肝IgG抗体阳性率分布情况性别检测数阳性数阳性率(%)男167843525.98女183548126.21合计351391726.102.2不同年龄组戊肝IgG抗体阳性率分布情况将3513名1～59岁居民分成6个年龄组段，人群HEV-IgG抗体阳性水平在各个年龄组间分别为8.19%、13.22%、21.74%、34.65%、42.73%、48.05%，平均抗体阳性率为26.10%。不同年龄组间阳性率差异有统计学意义(X2=397.13，P＜0.05；表2）。表2不同年龄组戊肝IgG抗体阳性率分布情况年龄段检测数阳性数阳性率(%)1～781618.1910～6058013.2220～48310521.7430～68123634.6540～57824742.4350～38518548.05合计351391726.102.3不同职业人群戊肝IgG抗体阳性率分布情况3513名被调查者人群中HEV-IgG抗体阳性水平在各个职业间分别为3.60%、10.32%、46.70%、36.65%、35.56%、22.14%、44.13%、36.53%，平均抗体阳性率为26.10%。在不同职业组间戊肝IgG抗体阳性率差异有统计学意义(X2=408.41，P＜0.05；表3)。5 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究表3不同职业人群戊肝IgG抗体阳性率分布情况职业检测数阳性数阳性率(%)散居儿童278103.60学生121112510.32农牧民80337546.70工人41215136.65干部451635.36医护人员3848522.14个体从业2139444.13其他1676136.53合计351391726.102.4不同居住环境人群戊肝IgG抗体阳性率分布情况3513名被调查居民居住地环境不同，人群HEV-IgG抗体阳性水平在各个地域间分别为17.21%、45.71%，平均抗体阳性率为26.10%。各地域人群戊肝IgG抗体阳性率之间的差异有统计学意义(X2=317.53，P＜0.05；表4)。表4不同居住环境人群戊肝IgG抗体阳性率分布情况居住地检测数阳性数阳性率(%)城镇241741617.21乡村109650145.71合计351391726.102.5不同民族人群戊肝IgG抗体阳性率分布情况3513名被调查者依据本地区民族特点可分为四组，人群HEV-IgG抗体阳性水平在各个民族间分别为29.35%、20.31%、18.96%、18.27%，平均抗体阳性率为26.10%。各民族组间人群戊肝IgG抗体阳性率差异有统计学意义(X2=39.50，P＜0.05；表5)。表5不同民族人群戊肝IgG抗体阳性率分布情况民族检测数阳性数阳性率(%)汉族235469129.35维吾尔族57611720.31哈萨克族4799018.97其他1041918.27合计351391726.106 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究实验二动物群戊型肝炎病毒血清流行病学研究材料与方法（Materials&Methods）1.1标本来源在石河子地区采集羊血样品93份；在玛纳斯县的乐土驿镇、包家店镇、北五贫镇、兰州湾镇、旱卡子滩哈萨克族乡、玛纳斯镇、塔西河哈萨克族乡等7个乡（或镇）随机抽取的200份牛血清样本；在石河子地区采集鼠类样品161份。1.2ELISA诊断试剂盒双抗原夹心ELISA试剂盒为北京万泰生物药业公司产品。1.3主要器材同试验一。1.4方法同试验一。1.5结果判定同试验一。1.6统计学分析同试验一。7 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究结果（Results）2.1不同羊群间戊肝IgG抗体阳性率分布情况石河子地区羊群间HEV-IgG抗体阳性水平在各羊场分别为33.33%、37.50%、20.83%、4.76%，平均阳性率为27.31%。各羊场之间戊肝IgG抗体阳性率差异无统计学意义（X2=7.75，P＞0.05；表6）表6石河子地区的羊群HEV-IgG抗体检测结果地区检测数阳性数阳性率(%)石河子羊群124833.33羊群224937.50羊群324520.83羊场12114.76合计932327.312.2不同牛群间戊肝IgG抗体阳性率分布情况玛纳斯牛群间HEV-IgG抗体阳性水平在各乡镇分别为0.00%、0.00%、0.00%、3.33%、5.00%、0.00%、0.00%，平均阳性率为1.50%。各乡镇之间牛的戊肝IgG抗体阳性率差异无统计学意义（X2=5.98，P＞0.05；表7）。表7不同牛群间戊肝IgG抗体阳性率分布情况来源检测数阳性数阳性率(%)玛纳斯镇1300乐土驿镇3000包家店镇3900北五岔镇3013.33兰州湾镇4025.00旱卡子滩哈萨克族乡4000塔西河哈萨克族乡800合计20031.502.3不同地区间老鼠戊肝IgG抗体阳性率分布情况老鼠的HEV-IgG抗体阳性水平在石河子各地区间分别为25.00%、0.00%、13.64%、0.00%、33.33%、0.00%、18.18%，平均阳性率为18.01%。各地区间老鼠的戊肝IgG抗体阳性率差异无统计学意义（X2=8.95，P＞0.05；表8）。8 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究表8161份石河子地区老鼠血清阳性率统计结果（1）血清来源检测数阳性数阳性率(%)150团良五连与149团交界处641625.00133团15连800149团17连44613.64149团54公里处1300121团7连9333.33136团100150团良四连22418.18合计1612918.012.4不同鼠种间戊肝IgG抗体阳性率分布情况石河子地区老鼠的HEV-IgG抗体阳性水平在不同鼠种间分别为25.68%、0.00%、0.00%、17.65%，平均阳性率为18.01%。各鼠种间戊肝IgG抗体阳性率差异无统计学意义（X2=5.62，P＞0.05；表9）。表9161份石河子地区老鼠血清阳性率统计结果（2）老鼠种类检测数阳性数阳性率(%)子午沙鼠741925.68柽柳沙鼠100林姬鼠100大沙鼠851017.65合计1612918.012.5不同动物间戊肝IgG抗体阳性率分布情况石河子地区范围内各种动物的HEV-IgG抗体阳性水平在不同动物间分别为27.31%、1.50%、18.01%，平均阳性率为12.12%。各动物间戊肝IgG抗体阳性率差异有统计学意义（X2=135.72，P＜0.05；表10）。表10不同动物间戊肝IgG抗体阳性率结果动物类别检测数阳性数阳性率(%)羊932327.31牛20031.50老鼠1612918.01合计4545512.129 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究第二部分基因分型材料和方法（Materials&Methods）1材料1.1标本来源从石河子大学医学院第一附属医院感染科收集急性戊肝病人的血清和粪便标本，其中依据2000年西安会议修订的诊断标准来确定急性戊肝的诊断。血清和粪便标本经处理后冻存于-70℃冰箱中备用。1.2菌种和克隆载体菌种为大肠杆菌JM109，由军事医学科学院病毒实验室提供。克隆载体Pmd18-T由宝生物工程(大连)有限公司生产。1.3主要的酶和其他试剂1）超纯RNA提取试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司；2）PCR产物胶回收试剂盒：北京全式金生物技术有限公司；3）TRIZOL：美国MD；4）TaqDNA聚合酶、AMV反转录酶：Promega公司产品；5）dNTP：中科开瑞公司；6）Rnasin：华美公司；7）限制性核酸内切酶EcoRI和PstI：Fermentas公司生产；8）CW0500高纯度质粒小提试剂盒：北京康为世纪生物科技有限公司；9）氯仿、异丙醇分析纯：天津市第一化学试剂厂生产；10）6×Loadingbuffer：Takara宝生物工程(大连)有限公司；11）氨苄青霉素：石药集团生产；1.4主要溶液的配制：1)10×TBEBuffer(pH8.3)组份浓度:890mMTris-硼酸，20mMEDTA配制量:1L配制方法:①称量下列试剂，置于lL烧杯中；Tris108gNa2EDTA·2H2O7.44g硼酸55g②向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；10 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究③加去离子水将溶液定容至lL后，室温保存。2)溴乙锭(10mg/ml)组份浓度:10mg/ml溴乙锭配制量:100ml配制方法:①称量1g溴乙锭，加入到100ml容器中；②加入去离子水100ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭；③将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存；④溴乙锭的工作浓度为0.5g/ml。注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。3）Agarose凝胶配制方法：①配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5×TBE或1×TAE)；②根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中；③加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%)；注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。④在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。小心摇动锥形瓶。使琼脂糖充分均匀熔化。此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化。必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。熔化琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全熔化，否则，会造成电泳图像模糊不清；⑤使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度0.5µg/ml)。并充分混匀；注：溴乙锭是一种致癌物质。使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好手套。⑥将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3～5分钟之间；⑦在室温下使胶凝固(大约30分钟～1小时)，然后放置于电泳槽中进行电泳。注：凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。4）LB液体培养基组份浓度：1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)，0.5%(W/V)YeastExtract(酵母提取物)，1%(W/V)NaCl配制量：1L配制方法：①称取下列试剂，置于lL烧杯中；11 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g②加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；③滴加5NNaOH(约0.2m1)，调节pH值至7.0；④加去离子水将培养基定容至1L；⑤高温高压灭菌后，4℃保存。5）LB固体培养基组份浓度：1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)，0.5%(W/V)YeastExtract(酵母提取物)，1%(W/V)NaCl，1.5%(W/V)琼脂粉配制量：1L配制方法：①称取下列试剂，置于lL烧杯中；Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g②加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；③滴加5NNaOH(约0.2m1)，调节pH值至7.0；④加去离子水将培养基定容至1L，加入琼脂粉15g；⑤高温高压灭菌后，4℃保存。6)LB/Amp培养基组份浓度:1%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)YeastExtract1%(W/V)NaCl0.1mg/mlAmpicillin配制量:1L配制方法:①称取下列试剂，置于lL烧杯中；Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g②加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；③滴加5NNaOH(约0.2mL)。调节pH值至7.0；④加去离子水将培养基定容至1L；12 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究⑤高温高压灭菌后，冷却至室温；⑥加入1mlAmpicillin(100mg/ml)后均匀混合,4℃保存。1.5主要实验仪器1）超净工作台：江苏苏净集团安泰公司生产SW-C1-IFD型；2）低温高速离心机：SIGMA公司生产949412-16型；3）恒温培养箱：上海医疗仪器厂；4）温控培养摇床：武汉科学仪器厂；5）凝胶成像扫描仪：BIO-RAD公司生产GEL-DOC2000型；6）电泳槽：上海医疗仪器厂；7）PCR循环仪：Hybrid公司生产；8）紫外分光光度仪：上海康华生化仪器制造厂生产，ZF型；9）台式振荡器：国产HZ881K型；10）电子天平（万分之一克）：MonoBloc公司生产AB204-E型；11）调温水浴箱：上海医疗仪器厂；12）大孔梳齿：北京六一厂；13）高压蒸汽灭菌器：日本三洋公司生产ML-S-3020型；14）4℃、-20℃、-80℃冰箱：海尔公司生产；15）漩涡混合器：太仓市科教器材厂生产WH861型；16）雪花制冰机：美国GRANT-FM100型；17）2.5ul、10ul、100ul、200ul、1000ul微量移液器：德国；18）一次性1ul、10ul、200ul、1000ul枪头、PCR反应管、1.5ml离心管：上海生物工程公司生产；19）去离子制水机：美国Millipore公司生产；20）微波炉：中国格力21）核酸检测仪：PharmaciaBiotech公司生产22）酸度计：Beckrman公司生产。2方法2.1引物设计合成引物依据GenBank中注册的HEV各基因型的保守区序列,参照文献[35]设计一套简并引物,以M1、M2为内引物，M3、M4为外引物。该引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。M1:5’-GTC(T)ATGC(T)TGCATACATGGCT-3’(6010-6031)；M2:5’-AGCCGACGAAATC(T)AATTCTGTC-3’(6336-6358)；M3:5’-AAC(T)TATG(C)CAGTACCGGGTTG-3’(5725-5746)；M4:5’-CCCTTATCCTGCT(G)AGCATTCTC-3’(6433-6455)。2.2HEV-RNA的提取13 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究按照超纯RNA提取试剂盒使用说明操作:①血清250μl加1mlRLT缓冲液，用移液器反复吸吹数次，将标本充分裂解。常温下静置10分钟，保证能完全裂解蛋白核酸复合物；②加入200μl氯仿剧烈振荡15秒，室温放置2分钟；③室温下，12000rpm离心10分钟，标本被分为上层无色水相、中间层和红色有机相三层，所需要的RNA主要存在上层水相中，自备一个新的无RNase离心管，将上层水相转移到其中；④加入等体积的无RNase水配置的70%乙醇在得到的水相溶液中，轻轻上下颠倒混匀；⑤转移上一步骤所得的全部溶液到已装入2ml收集管（CollectionTube）的吸附柱（SpinColumnRM）内。可根据溶液多少分多次转移。10000rpm离心30秒，丢弃收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；⑥加RW1缓冲液700ul到吸附柱内，10000rpm离心30秒，丢弃收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；⑦加已经加入无水乙醇的RW2缓冲液500ul到吸附柱内，10000rpm离心30秒，丢弃收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；⑧重复方法⑦；⑨10000rpm离心3分钟，丢弃收集管中废液。常温下，将吸附柱放置10分钟，使其彻底晾干；⑩将吸附柱放置于一个新的1.5ml的无RNase离心管（CollectionTube）中，加50ul无RNase水到吸附柱的中间部位，常温放置2分钟，10000rpm离心2分钟，收集RNA溶液，-80℃保存RNA，防止降解。2.3逆转录(RT)在无RNA酶的离心管中依次加入：RNA模板10ulM41uldNTP2ul5×RTBuffer4ul混匀后70℃水浴箱温育5分钟，然后迅速冰浴；再依次加入:Rnasin1μl(25Unit)反转录酶（AMV）2μL(200Unit)混匀后42℃水浴箱温浴1小时，再95℃温浴5分钟，用以灭活反转录酶（AMV），最后-20℃冰浴30分钟；最后取4ul产物用于PCR,剩余-20℃储存备用。14 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究2.4PCR扩增1）第一轮反应体系：cDNA4ulM30.2ulM40.2ulMix10ulH2O5.6ul反应体积20ul反应条件：95℃预变性5分钟94℃变性1分钟53℃退火30秒30个循环72℃延伸40秒最后72℃终延伸10分钟。2）第二轮反应体系：第一轮PCR产物4ulM10.2ulM20.2ulMix10ulH2O5.6ul反应体积20ul反应条件：95℃预变性5分钟94℃变性1分钟53℃退火30秒30个循环72℃延伸40秒最后72℃终延伸10分钟。循环结束后，用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，观察扩增结果。2.5PCR产物的琼脂糖凝胶电泳1）配制1%琼脂糖凝胶：取250ml三角瓶，加入100mlTBE缓冲液，称取1g琼脂糖加入缓冲液中，微波炉中加热3～5分钟至完全溶解，加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭(EB)。在模具中插入梳齿，将冷却的凝胶倒入模具。凝胶厚度3～5mm，避免产生气泡。2）取10ulPCR产物与上样缓冲液混匀后加入加样孔，以10×TBE为缓冲液，100伏恒压，电泳30分钟，使DNA向阳极移动。电泳结束后，关闭电源，取出琼脂糖凝胶，放置于观察结果，以出现348bp条带的PCR产物为阳性样品。15 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究2.6PCR扩增产物的纯化使用小量胶回收试剂盒将回收的PCR产物进行纯化,严格按照操作按试剂盒说明书进行：①凝胶成像扫描仪下，切下包含目的条带的琼脂糖凝胶胶块，放入1.5ml的离心管中，按操作说明书加入300ul溶胶液,置50℃水浴箱中温浴10分钟,每2分钟颠倒混匀一次,使琼脂糖块完全溶化；②加入150ul异丙醇,轻轻混匀,50℃水浴箱温浴l分钟后，再次混匀；③将溶化后的琼脂糖液转移到已经套上收集管的吸附柱内，12O00rpm离心30秒,丢弃收集管中的废液,将吸附柱放回集管中；④向吸附柱中加入500ul洗涤液，1200Orpm离心1分钟,丢弃收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中；⑤再次向吸附柱中加入500ul洗涤液，室温放置l分钟,12000rpm离心30秒,丢弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2分钟；⑥将吸附柱放入一个新的离心管（1.5ml）中,室温静置5分钟，彻底晾干，向吸附柱的中央加入50u1洗脱液,室温静置l分钟后,1200Orpm离心l分钟,收集DNA溶液，将1.5ml离心管(DNA)于-20℃储存。2.7连接连接反应体系：Pmd18-TVector0.5ulLigationSolutionI5ul纯化PCR产物3ul水1.5ul总体积10ul16℃连接过夜。2.8转化1）大肠杆菌JM109感受态细胞的制备①用无菌接种环刮取-70℃冻存的大肠杆菌JM109,接种于新配制的不含Amp的LB平板上,37℃温箱培养12～16小时；②从长有宿主菌的LB平板中，用无菌牙签挑取单个菌落,接种到3ml不含Amp的LB液体培养基的试管中,于37℃,22Orpm振荡培养6～8小时；③培养完成后,将lml上述菌液倒入300m1不含Amp的LB液体培养基中,37℃,22Orpm,振摇培养2～3小时；④在无菌条件下，将菌液在冰上预冷30分钟,每5分钟轻轻摇晃一次,使细菌均匀冷却,随后将上述菌液分装到30Oml预冷的离心管中，4℃、3000rpm离心10分钟收集菌体；⑤弃上清,离心管中加入10ml预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，使悬浮沉淀，冰浴3016 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究分钟，4℃、5000rpm离心5分钟，收集菌体；⑥弃上清,往离心管中加入用2ml预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,使沉淀悬浮，冰浴1小时；⑦分装感受态细胞于预冷的1.5ml的离心管中,每管100ul，-80℃储存备用。2）连接产物转化感受态细胞①从-80℃的冰箱中取出冻存的感受态细胞,握于手中解冻,4℃静置10分钟，取40ul的感受态细胞加入到预冷的无菌的1.5ml离心管中，再取5ul连接产物加入其中，轻轻吹打混匀，冰浴30分钟；②42℃热休克2分钟，快速冰浴冷却5分钟；③加入300ul不含Amp的液体LB培养基，37℃、150rpm振摇培养50分钟；④取200ul转化液涂于含Amp的固体LB培养基上，37℃恒温培养箱中正向放置20分钟，然后倒置培养10～14小时，出现转化菌落；⑤取单个菌落接种到含有Amp的液体LB培养基（3ml）中，37℃、220rpm振摇培养12～16小时，所得菌液于-70℃冰箱储存备用。2.9重组质粒的酶切鉴定1）重组质粒的提取，严格按照说明书操作：①取1.5ml过夜培养的菌液于微量离心管中，12000rpm离心1分钟，尽量吸弃上清液；②向留有菌体沉淀的离心管中加入250ulBufferP1（请先检查是否已加入RNaseA），使用漩涡振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀；注意：如果菌块未彻底混匀，将回影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。③向离心管中加入250ulBufferP2，温和的上下颠倒混匀4-6次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液变得清亮粘稠；注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免造成基因组DNA污染，此步骤所用时间应不超过5分钟，避免质粒受到破坏。④向离心管中加入350ulBufferN3，立即温和地上下颠倒混匀4-6次，充分混匀，此时应出现白色絮状沉淀。13000rpm离心10分钟；注意：BufferN3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。⑤将步骤4中所得到的上清液转移到已装入收集管的吸附柱（SpinColumnCM）中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；⑥向吸附柱中加入500ulBufferPB，13000rpm离心45秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；⑦向吸附柱中加入750ulBufferPW（请先检查是否已加入无水乙醇），13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液；⑧将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温5分钟，以彻底晾干；17 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究⑨将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位加入200ulBufferEB，室温放置4分钟，13000rpm离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃冰箱中保存。2）重组质粒的酶切和PCR鉴定①提取的质粒用EcoRI和PstI双酶切鉴定。反应体系：10×HBuffer1ulEcoRI0.5u1PstI0.5u1质粒4u1水4ul总体积10u1反应条件：水浴箱内37℃水浴12～14小时，终止反应加上样缓冲液。②PCR鉴定反应条件：94℃预变性4分钟94℃变性45秒55℃退火45秒扩增30个循环72℃延伸45秒最后一个循环后72℃终延伸10分钟。2.10阳性重组质粒测序及系统进化分析将阳性重组质粒送往宝生物工程(大连)有限公司，由其完成测序及系统进化分析工作。石河子分离株（标本来自于同一患者）名称:Sh-H-r(石河子HE病人血清分离HEV)、Sh-H-f-1(石河子HE病人粪便分离HEV-1)、Sh-H-f-2（石河子HE病人粪便分离HEV-2)。18 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究结果（Results）1HEVRNA的检测使用1%的琼脂糖凝胶，对巢式RT-PCR扩增得到的产物，进行电泳检测，（图1），得到扩增后大小为348bp的目的条带。图1PCR产物凝胶电泳分析1．MarkerDL2000;2,3,4PCR产物（348bp）2序列分析结果本研究在石河子地区分离得到的3株人源戊型肝炎病毒部分序列的长度为348bp，在全基因中的位置为6010～6360bp，位于ORF2内，编码了118个氨基酸。序列测定分析如下：19 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究3核苷酸及氨基酸同源性石河子各株间氨基酸同源性在96.7%～100%,核苷酸同源性均在84.5%～93.8%,通过分析石河子3株HEV：Sh-H-r(石河子HE病人血清分离HEV)、Sh-H-f-1(石河子HE病人粪便分离HEV-1)、Sh-H-f-2(石河子HE病人粪便离HEV-2)均属基因IV型。20 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究讨论（Discussion）人体在感染戊型肝炎病毒之后，典型的感染经过常表现为：最早在2周左右可在粪便出现病毒,随后在血液中出现病毒，一般4周左右才可出现明显的临床症状，紧接着可在标本中测出IgM或IgG抗体，但随着病情的发展，IgM抗体水平逐渐下降，而IgG抗体水平可出现升高并可持续多年。本次调查针对以上因素，主要检测IgG抗体水平，结果表明，3513名石河子居民戊肝IgG抗体阳性率为26.10%，低于钟崇芳[15]等人在新疆和田地区调查的人群戊肝IgG抗体阳性率34.98%，其原因可能为和田地区曾在80年代发生过戊肝爆发流行，且戊肝IgG抗体又是既往感染的一个重要标志。男性和女性戊肝IgG抗体阳性率差异无统计学意义,分别为25.98%和26.21%,与其他研究男性高于女性[16,17]，以及王祥英[8]等研究女性高于男性都有所不同，其原因主要可能是地域风俗差异造成，在本地区男女外出工作的机会平等，故而感染几率相当有关。石河子居民随着年龄的增长，戊肝IgG抗体阳性率递增，感染率越高，这与其他地区[18,19]的研究一致。不同职业人群戊肝IgG抗体阳性率差别很大，最高为农牧民和个体从业人员，分别为46.70%和44.13%，农牧民和个体［20］从业人员为石河子市居民中戊肝感染的重点人群，这与刘小桂等的调查结果相吻合，其原因可能是农牧民、个体从业人员的生活的卫生环境条件较差，多有不良的卫生习惯以及在生活中经常会接触到猪、羊等家禽以及其粪便有关;工人、其他公共场所服务人员和干部职员的阳性率也很高，达到36.65%、36、53%和35.56%，可能与这部分人群在外就餐机会较多，接触到不洁食物的几率高有关，另外，干部阳性率高，也可能是由于样本量太少的原因，有待需要进一步证实。此次调查证实居住环境不同，戊肝IgG抗体阳性率不同，分别为城镇17.21%、乡村45.71%；这与戊肝感染和职业有关相吻合。本研究结果显示在不同民族人群中，戊肝IgG抗体阳性率差异有统计学意义，这与钟崇芳[15]等人在新疆和田研究结果不同，分析原因可能为本地区民族分布不同有关，在石河子地区主要以汉族居民为主，且肉质品消费以猪为主，这与猪在戊肝流行过程中为主要宿主[21]相一致，进一步为说明戊肝为经消化道接触传播的人畜共患传染病提供依据。戊肝已被世界卫生组织认为是发展中国家的一个重要的公共卫生问题。戊肝病人发病后IgG基本保持在一个较稳定的水平，约33%的病人在发病后10年体内仍有IgG抗体，提示抗戊肝IgG可长期存在[22]，因此，单纯戊肝IgG阳性，只能说明既往感染或急性感染的恢复后期，故戊肝IgG可作为戊肝流行病学调查的指标。本次戊肝血清流行病学调查发现，人群中戊肝IgG流行率随着年龄的增长而增高，差异有统计学意义，而与性别无关，与居住地类型、职业和民族有关。所以石河子市戊型肝炎的流行情况不容低估，应进一步加强对戊型肝炎的监测力度，制定预防控制措施，防止戊型肝炎的爆发流行。作为一种新发现的人兽共患病，戊型肝炎病毒的感染，在动物群体中流行也普遍存21 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究在。已经发现多种非人灵长类（黑猩猩、短尾猴、恒河猴、枭猴、小绢猴、非洲绿猴等）、家猪、野猪、鹿、猫鼬、啮齿类、狗、猫、绵羊、山羊、牛、驴、鸡、贝类等动物可以自然或人工感染戊型肝炎病毒[4,5,23-28]。已经证实人群的发病或感染与感染了戊型肝炎病毒的动物有着密切的关系。我国的研究人员，对国内常见的家畜、宠物和老鼠等多种动物都进行了戊型肝炎病毒感染的流行病学研究，结果都提示有不同程度的感染[8,9,13,29,30,31]。葛胜祥等[32]检测了我国多个省、市、自治区的上百个猪场的几千头头普通商品成年猪的血清，显示HEV阳性率高达83.4%，每个猪场的商品猪中均HEV感染的现象，虽然阳性率在不同地区、省份有所差别，但最低也有68.0%，半数感染率在90.0%以上。王佑春等[29]对北京、河南、河北、浙江、广东和大观山收集的猪血清进行HEV抗体检测，结果抗体阳性率分别为92.8%，85.2%，80.0%，87.5%，77.7%和73.7%，各地区抗体阳性率无明显的差异，平均阳性率为83.6%。表明在我国商品猪中HEV的感染比较普遍。王灵岚等[9]研究发现黄胸鼠、褐家鼠、家犬、乳牛、猪、山羊的感染率分别为：10.24%，6.47%，38.78%，23.33%，71.31%，86.21%。表明除了家畜外，多种野生动物可以感染HEV。这与本次调查的动物间感染情况都有相似之处。在新疆地区动物戊型肝炎病毒感染研究中，马勋、武军元、曲立春等发现新疆地区猪感染阳性率高达61.84%(503/813)，绵羊HEV阳性率为28.8%(142/490)，牛HEV阳性率为5.78%(39/675)[31,32]。本次调查，动物间感染率低于以上结果，可能主要是因为样本量较少的缘故，希望在以后的研究中增大样本量，进一步证实。同时，胡广东、王永霞、马勋等[13,33,34]分别从牛、羊、猪体内检测到了HEV-RNA，经过序列比对和遗传进化分析，证实新疆地区三种家畜来源的HEV均属于基因Ⅳ型。本次研究通过分子水平，测得的来源于同一患者血清和粪便的HEV也属于基因Ⅳ型。其他研究证实[36-39]HEV具有一定的地域性分布特点，同一地区的HEV在核酸和氨基酸水平上的表现，通常是人和猪的HEV同源性较高，基本上属于同一基因型,但同源性与其他地区HEV分离株相比比较低。另外，实验研究证实猪等动物对各型人HEV敏感，猪HEV也可跨种系感染非人灵长类[40-42]，再次提示戊型肝炎是一种人畜共患传染病。22 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究结论（Conclusion）1.3513份各类人群的血清检测抗-HEV抗体，其结果是石河子地区抗-HEV抗体阳性率为26.10%，具有较高的感染率。2.石河子市人群中抗-HEVIgG感染率与居住地类型、年龄、职业和民族有关，而与性别无关。石河子地区戊型肝炎病毒感染率随着年龄增加而增加，尤以年龄段超过50岁的人群感染较多。3.动物间抗-HEVIgG感染率存在不同的感染。3石河子地区人感染戊型肝炎病毒株属于基因IV型。23 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究参考文献[1]WorldHealthOrganization.Viralhepatitis.October28,2010,datelastaccessed.Availablefrom:URL:http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/A62/A62_22-en.pdf.[2]夏宁邵,张军,李少伟等.戊型病毒性肝炎研究进展[J].厦门大学学报(自然科学版),2011,50(2):431-436.[3]PriyankaShukla,HanhT.Nguyen,UdanaTorian,etal.Cross-speciesinfectionsofculturedcellsbyhepatitisEvirusanddiscoveryofaninfectiousvirus-hostrecombinant[J].PNAS,2011,108(6):2438-2443.[4]MasajiN,KazuakiT.HepatitisEvirusinfectioninwildmongoosesofOkinawa,Japan:demonstrationofanti-HEVantibodiesandafull-genomenucleotidesequence[J].HepatolRes,2006,34:137-140.[5]ShuchinT,NaotoK,TakahashiK,etal.ZoonotictransmissionofhepatitisEvirusfromdeertohumanbeings[J].Lancet,2003,362:371-373.[6]KazuakiT,NaotoK,NatsumiA,etal.Completeornear-completenucleotidesequencesofhepatitisEvirusgenomerecoveredfromawildboar,adeer,andfourpatientswhoatethedeer[J].Virology,2004,330:501-505.[7]SaadMD,HusseinHA,BashandyMM,etal.Hepati-tisEvirusinfectioninworkhorsesinEgypt[J].InfectGenetEvol,2007,7(3):368-373.[8]朱建福,郑英杰,王法弟,等.禽类养殖职业人群戊型肝炎病毒感染状况及其危险因素研究[J].中国人兽共患病学报,2006,22(5):483-484.[9]王灵岚,陈亮,何似,等.福建省六种哺乳动物戊型肝炎病毒感染调查[J].中国人兽共患病杂志.2006,22(2):188,131.[10]王佑春,张华远,李河民,等.戊型肝炎病毒Ⅳ型全基因序列分析[J].中华微生物和免疫学志,2001,21(2):210-213.[11]何水珍,郑子峥,吴婷,等.戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究[J].病毒学报,2006,22(6):426-430.[12]TamAW,SmithMM,GuerraME,etal.HepatitisEvirus(HEV):molecularcloningandsequencingofthefull-lengthviralgenome[J].Virology,1991,185(1):120–131.[13]马勋,陆承平,孟继鸿.新疆地区猪戊型肝炎血清流行病学调查[J].中国病毒学,2004,19(3):285-287.[14]付红伟,朱永红,庄辉.我国戊型肝炎流行病学研究进展[J].中国病毒病杂志,2011,1(1):67-70.[15]钟崇芳，李俊红，胡志明，等.新疆和田地区人群血清抗HEV水平调查[J].传染病信24 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石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究文献综述戊型肝炎病毒感染的研究进展摘要戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，主要引起急性自限性肝炎，该病毒不仅可以感染人，而且有多种动物可以作为其自然宿主。文章从病原学、流行病学、诊断与治疗、预防几个方面对其进行了综述。关键词戊型肝炎病毒病原学流行病学预防戊型肝炎（HepatitisE,HE）是由戊型肝炎病毒（HepatitisEvirus,HEV）引起的一种严重危害健康经粪-口途径传播的急性自限性肝炎。该病毒主要经肠道传播，常引起爆发或流行。临床症状类似甲型肝炎（甲肝），但临床表现比甲肝严重，并可出现肝内胆汁淤积甚至发展为慢性肝炎[1]，主要发生在青壮年，男性高于女性[2,3]。最早关于HE的记录是1955～1956年印度新德里发生的一次水源性传播的肝炎大流行[4]。1989年Reyes等应用分子技术得到了本病毒的基因克隆。在东京国际会议上正式将这一类型的肝炎及病毒命名为戊型肝炎(HE)和戊型肝炎病毒(HEV)。由于HE是通过粪一口途径传播，因此主要在卫生条件较差的地区流行，包括亚洲、非洲和南美洲等发展中国家，我国也属于高发区。据WHO在2011年估计，全球每年新发HE约3400万例，其中死亡30万例，并可导致5200个孕妇流产[5]。1986～1989年在中国新疆南部地区曾暴发世界上规模最大的HE流行,发病119280例，死亡707例[6]，其中414名为孕妇。1997年Meng等[7]在美国分离得到首株猪的HEV核酸分离株，并发现与美国人源的HEV分离株具有高度同源性，使人们产生一种HE可能是人畜共患病的猜想。近年来大量研究表明HE是一种人兽共患疾病，猪是HEV的最主要动物宿主和人类HE的主要传染源。最近研究显示，在欧洲和亚太等发达地区，无疫区旅行史的本土HE病例时有发现，并偶有小范围的HE暴发的报道。随着人们对HEV认识的日益深入，其重要性越来越突出。现就HEV研究进展做如下综述。1病原学特点HEV是正二十面体，无囊膜的球形颗粒，直径27～34nm的单股正链RNA病毒，表面带有刺突(spikes)和缺刻(indentation)，全基因组长约7.2kb。当前，根据国际核酸序列数据库提供，大约有1600个HEV基因序列,而且HEV基因序列的数量还在不断增加[8]。HEV全基因组含有3个非连续及部分重叠的开放读码框（openreadingframe,ORF），分别为ORF1、ORF2和ORF3，编码所有结构性或非结构性的蛋白[9]。其中ORF1基因长约5kb，是ORF中结构最大的，它在RNA合成酶的参与下编码非结构蛋白(pORF1)。ORF2为HEV的主要结构基因编码区，编码病毒衣壳蛋白，衣壳外表面是病毒优势中和表位的聚集区，也是宿主识别的关键区域。ORF3编码一个小分子的功能蛋白,该蛋白能够参与组成细胞内膜结构，特别是细胞骨架，能促进肝细胞外周免疫抑制环境的形成，参与介导细胞内MAPK/ERK的转导通路，在病毒感染早期可促进细胞增殖、27 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究分化，进而逃避细胞凋亡机制。因为在血清和粪便中HEV的滴度低，HEV细胞培养没有稳定可靠的结果，所以关于HEV的理化特性甚少。一般认为，HEV在-70～8℃中不稳定，对高盐、氯仿、氯化铯敏感，但在液氮中极为稳定。4℃下保存易降解，反复冻融易导致病毒活性下降。在碱性环境中较稳定，有镁和锰离子存在时能保持病毒完整，用56℃加热1小时或71℃加热10分钟均不能破坏HEV的抗原反应性。用71℃水浴加热20分钟，大火炒（191℃）5分钟或沸水煮5分钟可彻底灭活病毒[10]。目前，各国学者根据克隆株核酸、氨基酸的同源性及遗传性将已经发现的与人类疾病发生有关的HEV病毒株分为4个主要基因型：HEV-1、HEV-2、HEV-3和HEV-4，代表株分别为缅甸株、墨西哥株、美国株和中国台湾株[11]。各基因型又分为许多亚型。不同基因型和亚型在HEV的流行病学研究中都具有非常重要的意义，传播途径的多样性和疾病的严重程度受基因型的影响[12]。HEV-1和HEV-2的自然宿主目前仅见于人类（人源型），而HEV-3和HEV-4的自然宿主还包括猪及多种野生哺乳动物（人畜共患型）[10]。同一地区分离得到的人与猪的HEV同源性高度接近，甚至同一亚型内，两者之间同源性可达95%～100%[13]。迄今已知的暴发性的HEV感染主要仅与HEV-1或HEV-2有关，与粪-口传播直接相关。而HEV-3或HEV-4主要引起急性散发性HE，偶尔引起食源性小暴发。HEV-3主要在动物之间传播，人感染HEV-3主要是因为物种间的传播[14]。目前在我国仅发现HEV-1、HEV-3和HEV-4[15]三种，其中HEV-1只感染人类，HEV-3仅在上海地区的猪场中发现[16]，HEV-4在人和猪中普遍存在[17]。目前，在我国HEV-4感染占据主导地位[18]。2流行病学特点2.1流行情况HE在全球范围内均有发病，迄今为止世界上已有50余次HE的暴发或流行[19]。其暴发或流行主要集中在亚洲和非洲的一些发展中国家，特别是在贫穷落后、卫生条件较差的一些国家和地区[20]。在欧美等发达国家仅出现散发病例，尚无大规模暴发和流行的报道，且病例多出现在外来移居者或旅行者。但近10年来，欧美等发达国家出现大量无疫区旅行史的本土病例，并发现多种与HEV感染相关的并发症及肝外症状，且在世界各地的驯养和野生的动物身上不断发现天然感染的HEV[21]。目前，全球HE流行可分为2种明显的不同模式，分别与人源型HE和人畜共患型HE的流行有关[22-24]。我国各地区均有散发性HE存在，但分布不平衡。最近的调查显示，中国普通人群抗-HEVIgG阳性率大约20.0%～40.0%，高于以往的调查，且流行病学特征与1992年的调查结果相似[25]。2.2传染源HEV-1和HEV-2的传染源为潜伏期末期或急性期早期的HE患者和亚临床感染者；HEV-3和HEV-4除了感染人体外还可感染其他多种动物宿主，其主要传染源为猪和HE患者。其中，猪是HEV重要的自然宿主和传染源，这与其极高的感染率和与人群的密切接触程度有关。28 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究2.3传播途径目前已知的HEV传播途径包括消化道传播、血液传播、垂直传播和密切接触传播。消化道传播最常见，饮用被HEV污染的水或食用被HEV污染的食物而导致感染；血液传播，近年有报道HEV可通过血液传播[26],而且在献血员中的感染率很高；垂直传播也有报道，有报道称[27]，在阿根廷垂直传播导致患儿感染率在33.3%~50.0%之间；密切接触传播，有HE病人的家庭成员的HEV阳性率比无HE病人的家庭成员要高。在各种传播途径中，通过污染的水源传播是过去最常见的传播途径，但随着各地区环境卫生条件的改善，近年来水源性传播的报道逐渐减少，而以散发性HE多见。2.4易感人群人群对HEV普遍易感，各年龄段均可感染，幼年时感染多为亚临床型，成年人感染多为临床型。密切接触的从业人员(包括畜牧养殖人员和餐饮业人员)、野外工作者、军人、疫区务工或商务旅行者和大学生等人群由于有更多接触病原体的机会而具有较高的HEV感染风险。人体感染HEV后可产生保护性抗体并持续20年以上。具有HEV抗体的人群再次感染HEV的风险降低，且感染后绝大多数为隐性感染或仅出现轻微症状，预后良好[28]。我国近年来发病人群以男性为主，且发病率男性高于女性，以中、老年者居多，儿童及青少年少见；孕妇也有较高的感染率和病死率，其重型肝炎的发生率明显高于正常人群[29]。2.5人畜共患型HEHE是一种以粪-口传播为主的人畜共患病[30]，1990年Balayan等[31]成功的将HEV感染猪，并猜想猪可能在HEV的传播中起着重要作用，这也是最早关于HEV动物宿主的推测。近年来，许多国家的学者在对家猪养殖场员工检测时发现，其HEV的感染率明显高于其他人群，如Galiana等[32]对家猪养殖工作者调查显示，该人群HEV感染率为18.6%，显著高于对照人群，进一步为猪是HEV动物宿主这一推测提供了有力证据。猪HEV分为HEV-3和HEV-4，其与人HEV-3和HEV-4的核酸序列具有高度的同源性，并在许多国家中被证实。研究结果表明，同一个地区可以存在２种或２种以上的基因型，也发现同一种基因型可以分布在不同地域[33]。人畜共患型HE分布于世界各地，主要表现为散发及食源性小暴发，尚未见大规模暴发的报道。在西方，HEV-3感染导致的戊肝已成为最常见的急性肝炎。在欧美的研究结果显示，有大部分被诊断为药物性肝炎的患者为HEV感染[34]。在日本和中国台湾地区，HEV-3和HEV-4感染均有发生。消化道传播是人畜共患型HE的主要传播途径，人畜共患型HEV感染多为隐性，小于5%的感染者会出现临床症状，通常为持续4～6周的自限性疾病[35]。与人源型HE主要发生在青壮年明显不同，人畜共患型常见于中老年。越来越多的证据显示HE是一种人兽共患疾病，猪是HEV的最主要动物宿主和人类HE的重要传染源[36]。3临床特征根据国内流行病学调查，HE潜伏期为2～10周，平均40天[37]，大部分呈自限性，29 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究临床表现与其他急性病毒性肝炎相似。成人感染多表现为临床型，儿童为亚临床型。HE主要分为3个临床类型[38]：急性黄疸型、急性无黄疸型和重型戊型肝炎。在HE高流行区，常见的表现是急性黄疸型肝炎，与其他类型的急性病毒性肝炎无明显差异。整个病程分为两个阶段:初期表现为发热、恶心、纳差、厌食、呕吐、腹痛、肌肉痛等，并持续数天；黄疸发作期时前驱症状基本消失。HE为自限性疾病，病程数周，体检可见黄疸、肝脾肿大。部分患者会出现延迟性胆汁淤积，表现为皮肤瘙痒，预后较好。在HE流行区无症状或隐性HEV感染也常见。较多的研究发现，HEV感染也会引起多种严重并发症，包括慢加急性肝病、肝外征候和慢性肝炎，预后则较差；妊娠是HE患者发生肝衰竭的危险因素，且病死率高；垂直传播所致的婴儿HEV感染可发展为黄疸型肝炎，无黄疸型肝炎或高胆红素血症，早产，低体温以及低血糖均较常见，病死率可高达50%[39]。在HE的低流行区的表现包括黄疸型肝炎、无黄疸以及无症状的转氨酶升高，多在血清检测结果出来后才考虑HE。低流行区的HE多见于年龄较大的男性，多有肝病或饮酒史，无特异性症状。HE也有些不常见的临床表现，如急性胰腺炎、溶血、格林巴利综合征、血小板减少、脑膜脑炎、自身免疫现象、假性脑瘤、颅神经麻痹双侧椎体综合征等[40-41]。这些不典型患者的诊断多依赖于HEV-IgM的检测。HE严重程度的决定因素尚不清楚。人类HE的发生考虑与病毒滴度有关[42]。孕妇的病情往往较重且病死率高，可能与孕妇体内雌激素水平以及孕妇免疫状态有关[43]。4诊断和治疗HE的诊断依据流行病史、临床表现、血清学以及病原学的结果。因HE没有特异的临床表现，特别是患者无明显的HE流行病学史，所以在诊断中需注意鉴别诊断。虽然转氨酶检测灵敏度高，但其非特异性指标，仅提示肝功能损害；因此除了转氨酶的升高外，仍需HE的特异性检测：抗HEVIgM阳性或抗HEVIgG由阴性转阳性(或滴度明显升高>4倍)或HEVRNA检测阳性[44]。一般情况下这3项指标中的任何一项阳性都可作为HEV急性感染的临床诊断依据，如同时有2项指标阳性则可确诊。HE多表现为自限性，尚无特异性的治疗药物及方法。因此无须治疗或仅采取适当的对症支持治疗。对出现严重症状的HE患者，无论是否合并慢性肝病，均可考虑使用抗病毒药物进行治疗。对于合并慢性肝病的患者，可能出现由HEV感染导致的肝衰竭时，如有需要可进行肝移植。对于孕妇的治疗尚缺乏相关的资料。5预防与大多数粪-口传播的传染病一样，通过安全饮水、加强人畜排泄物的消毒处理、卫生宣教等是最重要的公共预防措施。在HE爆发期间，水源氯消毒和饮用水煮沸能有效预防HEV感染。散发性的HE确切来源常难以确认，目前尚未发现主要的单一危险因素，而是多种HEV感染途径并存，且在大多数情况下传播过程尚不完全清楚，因此制定针对性的防30 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究控策略十分困难。但是，加强饮食从业人员的健康体检，加强畜牧养殖人员的管理、加强人畜排泄物处理，严格执行生熟食分开等措施通常被认为可降低HE感染风险。疫苗接种是个体防护的最有效和最直接的方法[45]。HE疫苗已于2012年在我国上市[46]。从公共卫生的角度，有必要加强对饮食行业从业人员、畜牧养殖人员、无偿献血者进行疫苗接种。从个体防护角度，将前往HE高流行地区的务工人员、旅行者、维和部队官兵以及准备怀孕的妇女、已有慢性损伤人群和中老年人等也有必要进行疫苗接种。6小结由于HE是一种长期被忽视的重要的病毒性肝炎，及对HEV缺乏合适的细胞模型及动物模型，对其完整的的研究较少，因此其发病机制尚不完全清楚。在HEVRNA的检测方面，全世界并没有很好的标准，有研究显示，在全世界10个国家的20个实验室内，检测HEVRNA的灵敏度相差100～1000倍[47]。目前，在我国的临床实践中，HE诊断率与实际感染率严重不符。有研究显示[48]，近10年来卫生部门疫情监测数据中报告的HE病例和我国市场上HE诊断试剂盒使用量的增长密切相关，而目前国内HE诊断试剂盒的销量仅为甲肝试剂盒的1/5，提示仍有大量的HE病例被漏诊。在过去10年里，随着研究的不断深入和诊断技术的进步，国内外对HE和HEV的理解和认识发生了重大变化，这将更有助于降低HEV的感染率，提高人们的生活质量。参考文献［1］Rodriguez-FriasF.,JardiR.,ButiM［.HepatitisE:Molecularvirology,epidemiologyandpathogenesis.］［J］.EnfermInfeccMicrobiolClin.2012［2］VivekR.,NihalL.,IlliayarajaJ.etal.InvestigationofanepidemicofHepatitisEinNelloreinsouthIndia［J］.TropMedIntHealth.2010，15（11）：1333-1339［3］TakahashiM.,TamuraK.,HoshinoY.etal.AnationwidesurveyofhepatitisEvirusinfectioninthegeneralpopulationofJapan［J］.JMedVirol.2010，82（2）：271-281［4］WongD.C.,PurcellR.H.,SreenivasanM.A.etal.EpidemicandendemichepatitisinIndia:evidenceforanon-A,non-Bhepatitisvirusaetiology［J］.Lancet.1980，2（8200）：876-879[5]WHO.ViralhepatitisintheWHOsouth-eastAsiaregion［M］.India:regionalofficeforsouth-eastAsia,2011.[6]WangXC,LiuXM,TanCZ,etal.Epidemicnon-A,non-BhepatitisinXinjiang.Clinicalandpathologicobsevrations.JMedChin1990,103(11):890-8.[7]MengXJ,PurcellRH,HalburPG,etal.AnovelrirusinswineiscloselyrelatedtothehumanhepatitisEvines.ProcNstlAcadSciUSA,1997,94(1):9860-9865.[8]Shin-IT,TanakaY,TatenoY,etal.Developmentandpublicreleaseofacomprehensivehepatitisvirusdatabase[J].HepatolRes,2008,38(3):234-243.31 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石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究致谢光阴荏苒，时光如同白驹过隙，三年的研究生学习生涯即将结束，回首三年时光的点点滴滴，一切都历历在目，并且深切感受到这段人生经历的宝贵。同时，我要感谢在研究生学习期间给予我指导、帮助、支持的各位老师、同学及家人。首先我要衷心的感谢我的导师左维泽副教授，感谢她在研究生学习期间对我学业上的严格教导，以及在生活中对我无微不至的关心。本课题是在导师左维泽副教授的悉心指导下完成的。从论文选题、设计到论文的撰写以及修改，无不凝聚着导师的心血和汗水值此毕业之际谨向恩师致以诚挚的感谢和敬意!由衷感谢恩师在科研、临床实践中给予我的指导和教诲，感谢恩师在生活中给予我的关怀和鼓励!三年来，在导师的悉心教导下，我在全面认识问题、分析问题和处理问题等方面都取得了巨大进步。导师渊博的知识、严谨的治学态度、正直的人格以及对患者的仁爱之心是我一生学习的榜样。导师的严谨、认真、务实、创新的科研态度以及独特的人格魅力早已深深沁入我的身心。我衷心的感谢导师对我的谆谆教导，教会我做人的道理，以及在生活上给予我的帮助，使我能顺利完成学业。这将成为我宝贵的生命财富。在此，我要对她表示最崇高的敬意和最诚挚的感谢！同时，我也要衷心感谢石河子大学医学院第一附属医院感染性疾病科刘佩芝教授、季榕医师、买力坎木医师、詹爱琴医师、姚寿敏医师、朱庆峰医师、陈雪莉医师、居马百克医师、程丽医师、陈光海医师、高伊萍护士长及感染性疾病科的全体护士在联系标本、收集标本过程中给予的大力支持和帮助，感谢科室全体老师三年来在临床工作中给予我的指导和帮助!感谢石河子大学动科院的屈勇刚老师，感谢他在实验检测中所给予的指导和帮助。感谢石河子疾病预防控制中心的姚明琴老师在联系标本、收集标本过程中给予的大力支持和帮助。感谢2012级帮助过我的同学，与他们携手一起度过的日子将是我最美好的回忆。感谢提供样本的患者和健康志愿者！最后感谢我的家人多年来对我学业、生活的鼓励和支持和关心！35 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究作者简介夏小伟，男性，汉族，籍贯安徽，1981年7月生于安徽省寿县，2006年6月毕业于石河子大学医学院临床医学系，获医学学士学位，同年到石河子疾病预防控制中心工作，2012年9月于石河子大学医学院攻读医学硕士学位，专业为内科学，研究方向是病毒性肝炎的基础与临床研究。在研期间发表的文章1、夏小伟,左维泽,屈勇刚.石河子市戊型肝炎感染状况流行特征分析.石河子大学学报,录用待编.2、夏小伟,左维泽.戊型肝炎病毒感染的研究进展.中华传染病杂志,录用待编36 石河子地区戊型肝炎病毒感染的基因型研究石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表研究生姓名夏小伟学制三年病毒性肝炎的基础与专业内科学研究方向临床研究学术评语:戊型肝炎是一种经粪-口途径传播的急性传染病，主要流行于亚洲、非洲等发展中国家和地区，散发病例分布世界各地。在我国的很多地区都有戊型肝炎感染的报道，全国戊型肝炎感染率在7%～15%之间。遍及25个省，5个自治区和3个直辖市，感染率随年龄增加而增加，20岁左右达感染高峰，发病者主要为青壮年，主要临床表现是肝炎病毒引起黄疸、急性肝坏死等。一般呈良性经过，但孕妇感染情况较重，死亡率高达10%～20%，是一种全国普遍流行、危害比较严重的疾病。戊型肝炎病毒为单股正链RNA病毒，基因结构较为复杂，因此其诊断手段主要是利用RT-PCR检测病毒RNA，或采用间接酶联吸附分析（ELISA）方法检测血清中的抗体。本课题选取新疆维吾尔自治区石河子地区为研究现场,一方面对辖区范围内不同人群和动物群HEV感染状况的调查，分析抗HEV-IgG抗体在不同宿主间的感染；另一方面，本课题采用巢式RT-PCR方法对石河子市急性散发性HE患者的血清和粪便中的HEV-RNA进行检测，通过对分离株的序列分析,来明确石河子地区流行的HEV基因型，了解本地区感染的HEV基因型分布及其流行趋势,为HE的防治提供科学依据。该论文从课题设计、观察对象的收集与选择、实验过程到实验数据的统计、分析、论文撰写整个科研过程中思路清晰、研究目标明确、实验方法合理、数据真实，对数据的统计分析方法正确，取得了较为理想的实验结果，达到了科研立题的预期，具有一定的创新性和临床应用价值。指导教师签字:年月日37