细交链孢菌诱导下不同品种枣抗病基因的筛选

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分类号：S763.15学校代码：10712UDC：632研究生学号：2015050840密级：公开2018届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文细交链孢菌诱导下不同品种枣抗病基因的筛选学科专业森林保护研究方向森林病理学研究生焦小利指导教师宋晓斌完成时间2018年5月中国陕西杨凌 Classificationcode:S763.15Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2015050840Confidentialitylevel:PublicThesisforMaster’sDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018TRANSCRIPTOMECHARACTERIZATIONBASEDONRNASEQUENCINGINDIFFERENTVARIETIESJUJUBELINESINFETCEDBYALTERNARIAALTERNATAMajor:ForestProtectionResearchfield:ForestPathologyNameofPostgraduate:JIAOXiaoliAdviser:SongXiaobinDateofsubmission:May,2018YanglingShaanxiChina 细交链孢菌诱导下不同品种枣抗病基因的筛选摘要枣（ZiziphusjujubaMill.），是我国重要的干果树种，枣果实营养丰富尤其是维生素C含量高，入药还可润心肺、益气养容。对开拓枣制品的市场具有十分积极的作用。枣缩果病主要危害枣果，发病范围覆盖全国各个枣生产基地，严重影响枣果的产量和品质。目前，相关研究报道主要从生理生化和形态结构水平探讨枣对细交链孢菌的防御作用，而分子水平的研究鲜有报道。为了解枣果实在细交链孢菌（Alternaria.altrenata）诱导下的在转录组水平的变化，挖掘与枣缩果病抗性相关的重要基因的类别和功能。本试验以枣抗缩果病‘蜂蜜罐’、感缩果病‘七月鲜’及其清水处理对照材料，以细交链孢菌（A.altrenata）为诱导条件，分别采摘0.5d、1d、2d、3d、4d和5d的实验组与对照组样品材料，通过利用转录组测序技术及qPCR等技术从分子水平研究枣果实在细交链孢菌（A.altrenata）诱导下的应答机制，从分子手段研究植物关键基因的调控，为枣育种一定的分子理论基础。取得的主要结果如下：1.以枣抗缩果病‘蜂蜜罐’、感缩果病‘七月仙’及其清水处理对照材料，按照有参基因组的转录组测序流程及分析方法，样品分别获得了4.88×107、4.93×107、4.74×107、4.80×107Rawreads，对低质量数据进行过滤，可分别得到4.87×107、4.91×107、4.71×107、4.78×107高质量序列。其中分别有4.12×107、4.28×107、4.06×107、3.86×107条比对至枣基因组，有3.71×107、3.49×107、3.27×107、3.31×107条获得唯一比对。2.通过转录组测序并利用DESeq2软件进行差异基因分析，以FDR<0.05和∣≧log2FC2∣进行显著差异基因的筛选，发现样品‘蜂蜜罐’R1VSR2差异基因上调表达39个，基因下调表达8个。‘七月鲜’S1-VS-S2的基因上调表达1754个，基因下调表达603个。这些差异基因可能在植物受到病原菌侵染的过程中起着关键的调节作用。3.对显著差异表达的转录本进行GO功能的富集分析发现，‘蜂蜜罐’抗枣缩果病（R1vsR2）显著差异表达转录组中转录本被显著富集到9个terms，在‘七月鲜’感缩果病病（S1vsS2）转录组中显著差异表达的转录本被富集到31个terms。4.在A.altrenata侵染感病材料‘七月鲜’的代谢途径中分析发现，可以通过谷胱甘肽代谢，脂肪酸合成与代谢途径，类黄酮合成，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，JA信号，油菜素甾醇（BRs），水杨酸信号，乙烯，等途径中关键基因的表达调控来抵御病原菌的侵染。5.在A.altrenata侵染抗病材料‘蜂蜜罐’中的显著差异基因中包括扩展蛋白（expansin-A1）、GMP合酶（GMPsynthase)、紫色酸性磷酸酶(purpleacidphosphatase17)、 抗病蛋白RPM1(diseaseresistanceproteinRPM1)、葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运蛋白2（glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2)、氨基酸通透酶(Aminoacidpermease)、CCCH锌指结构域蛋白(zincfingerCCCHdomain-containingprotein18)、硫酸盐转运蛋白（sulfatetransporter3.3)等抗病基因。这些与抗枣缩果病相关的基因进行不同接种时间下实时荧光定量分析，结果发现在高抗病植株和感病植株中这13个基因随着接种时间的延长，其表达方式各不相同，这种不同可能导致了枣对缩果病抗病和感病的差异。关键词：枣缩果病；细交链孢菌；转录组测序；抗病相关基因差异表达 TRANSCRIPTOMECHARACTERIZATIONBASEDONRNASEQUENCINGINDIFFERENTVARIETIESJUJUBELINESINFETCEDBYALTERNARIAALTERNATAABSTRACTZiziphusjujubaMill.isanimportantdriedfruittreespeciesinChina.Thedevelopmentofthejujubeindustryhasaverypositiveeffectonfarmers'higheconomicincomeandthepromotionofagoodchangeintheecologicalenvironment.Jujubefruitdiseaseismainlyharmfultojujubefruit.Theincidencerangecoversalljujubeproductionbasesinthecountry,causingseriousimpactonjujubefruit.Theyieldandqualityareseriouslydamaged,causingseriousdamagetojujubeareasinChina.InordertounderstandthechangesinthetranscriptomelevelofjujubefruitsinducedbyA.altrenata,itispossibletoidentifythetype,number,andfunctionofimportantgenesrelatedtofruitshrinkageresistanceinjujubefruit.TheresponsemechanismunderinfectionbyA.altrenataisofgreatsignificance.Inthisstudy,jujubefruitanti-conefruit'Fengmiguan',senilefruitdisease'QiyueXian'anditswatertreatmentcontrolmaterials,andA.altrenatawereusedasinducingconditionsbyusingtranscriptomesequencingtechnology.AndqPCRandothertechniquesfromthemolecularlevelofthejujubefruitinresponsetoA.altrenatainducedresponsemechanism,themolecularmeanstostudytheregulationofplantkeygenesandjujubebreedingacertainmoleculartheoreticalbasis.Themainresultsobtainedareasfollows:1.Accordingtothegenomictranscriptomesequencingprocedureandanalyticalmethod,thesampleswereobtainedas4.88×107,usingthedateanti-conedisease'Honeycan',senilefruitdisease'Juyenxian'andtheirclearwatertreatmentcontrolmaterials.4.93×107,4.74×107,and4.80×107Rawreads.Filteringlow-qualitydatayieldshigh-qualitysequencesof4.87×107,4.91×107,4.71×107,and4.78×107,respectively.Amongthem,4.12×107,4.28×107,4.06×107,and3.86×107werecomparedtothejujubegenome,and3.71×107,3.49×107,3.27×107,and3.31×107wereuniquelymatched.2.ThroughtranscriptomesequencingandDESeq2softwarefordifferentialgeneanalysis,FDR<0.05and∣≧log2FC2∣wereusedtoscreensignificantdifferencesingenes.Theresultsshowedthat39geneswereup-regulatedinthehoneypotR1VS R2differentialgene,andthegenesweredown-regulated.8expressions.Thegenesof'JulyFresh'S1-VS-S2wereup-regulatedby1754andgenesdown-regulatedby603.Thesedifferentialgenesmayplayakeyregulatoryroleinplantinfectionbypathogenicbacteria.3.GOfunctionenrichmentanalysisofsignificantlydifferentiallyexpressedtranscriptsrevealedthatthe'HoneyCan'anti-diarrheadisease(R1vsR2)wassignificantlydifferentlyexpressedinthetranscriptomeandwassignificantlyenrichedinninetranscripts,SignificantlydifferentiallyexpressedtranscriptsintheS1vsS2transcriptomewereenrichedin31terms.4.AnalysisofmetabolicpathwaysinA.tenuissimainfectivesusceptiblematerial'JulyFresh'canbefoundthroughglutathionemetabolism,fattyacidsynthesisandmetabolicpathways,flavonoidsynthesis,cysteineandmethioninemetabolism,JASignals,Brassinosteroids(BRs),SalicylicAcidSignals,Ethylene,andotherkeygenesinthepathwayareregulatedtoprotectagainstinfectionbypathogenicbacteria.5.SignificantdifferentialgenesinA.tenuissimainfestationresistantmaterial'honeypot'includeexpansin-A1,GMPsynthase,aquaporinNIP3-1,transcriptionFactorMYB21,Purpleacidphosphatase17,RPM1,Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2,TranscriptionfactorbHLH30,Aminoacidpermease,ProteinNRT1/PTRfamily,CCCHzincfingerdomainprotein,Sulfatetransporter,Zinctransporterandotherresistancegenes.The13real-timefluorescencequantitativeanalysisofgenesrelatedtoanti-diarrheadiseaseatdifferentinoculationtimesrevealedthatthe13genesinhigh-resistantandsusceptibleplantsdidnotexpressasthetimeofinoculationprolonged.Inthesameway,thisdifferencemayhaveledtodifferencesinthediseaseresistanceandsusceptibilityofdates.KEYWORDS:Jujubefruitshrinkdisease;A.altrenata;transcriptomicanalysis;Thedifferenceexpressionofresistance-relatedgene 目录第一章文献综述....................................................................................................................11.1枣缩果病病研究现状..................................................................................................11.1.1枣缩果病病原种类............................................................................................11.1.2枣疯病的发病症状............................................................................................21.1.3枣缩果病的传播途径........................................................................................21.1.4枣缩果病的侵染时期........................................................................................21.1.5影响枣缩果病发生的主要因素........................................................................31.1.6枣缩果病防治措施.............................................................................................31.2枣缩果病的抗病性研究...............................................................................................41.2.1枣果实结构与抗病性关系.................................................................................41.2.2枣缩果病发病在生理水平的研究.....................................................................41.3植物与病原真菌互作的分子基础...............................................................................51.3.1次生代谢产物与病原菌侵染.............................................................................51.3.2植物信号转导与病原菌侵染.............................................................................61.4转录组学在植物与病原菌互作研究中的应用...........................................................61.4.1转录组的概念.....................................................................................................61.4.2转录组测序应用................................................................................................71.5本研究的目的意义.......................................................................................................7第二章细交链孢菌诱导下枣抗、感缩果病果实转录组测序分析....................................92.1材料与方法..................................................................................................................92.1.1接种和取样.........................................................................................................92.1.2主要仪器、试剂（盒）及耗材的处理.............................................................92.2总RNA的提取.........................................................................................................102.3总RNA质量检测.....................................................................................................112.4cDNA合成材料与方法.............................................................................................112.4.1末端修复..........................................................................................................112.4.2cDNA3ˊ末端加‘A’...........................................................................................112.4.3Adapter的连接.................................................................................................112.4.4连接产物的胶回收纯化...................................................................................112.4.5PCR反应及产物纯化.....................................................................................122.4.6上机测序...........................................................................................................12 2.4.7基因表达谱数据分析.......................................................................................122.5实时荧光定量PCR验证........................................................................................122.5.1RNA提取及cDNA合成.............................................................................122.5.2荧光定量分析..................................................................................................122.5.3数据处理与分析...............................................................................................14第三章结果与分析..............................................................................................................153.1RNA质量检测...........................................................................................................153.2转录组测序数据分析.................................................................................................163.2.1转录组测序质量评估.......................................................................................163.2.2病原菌接种后差异表达基因数量分析...........................................................163.2.3GO功能注释富集分析...................................................................................173.2.4差异表达基因的Pathway分析.....................................................................183.3‘七月鲜’中抗性相关代谢途径及基因分析...............................................................213.3.1植物激素信号转导通路...................................................................................213.3.2谷胱甘肽代谢途径相关基因...........................................................................223.3.3类黄酮生物合成及相关基因...........................................................................233.3.4脂肪酸合成途径及相关基因...........................................................................243.4‘蜂蜜罐’枣果实基因组中抗病基因组织表达特异性分析......................................253.4.1实时荧光定量的验证.......................................................................................263.4.2枣抗缩果病相关基因的qRealTime-PCR分析结果...................................263.5讨论............................................................................................................................30第四章结论......................................................................................................................334.1枣果实抗感缩果病转录组分析.................................................................................334.2通过转录组测序获得的差异基因............................................................................33参考文献..................................................................................................................................35致谢..................................................................................................................................39作者简介..................................................................................................................................40 第一章文献综述枣（ZiziphusjujubaMill.）是鼠李科（Rhamnaceae）枣属植物，是我国重要的干果树种，枣产业的发展在给农民带来高水平经济收入和促进生态环境的良好改变具有十分积极的作用(刘孟军，2009）种。枣树以其特产于我国、抗旱耐脊且枣果速丰、营养丰富尤其是维生素含量高、入药还可润心肺、益气养容等用途广泛的优点，在促进农民经济发展和改善生态环境方面居十分重要的地位。据近几年的数据统计显示，全国枣树栽培面积已达万，枣果年产量万吨以上，占世界的99%以上干果产量排名第一（李新岗2015）。枣缩果病于20世纪70年代开始正式报道（韩金声1979），主要危害枣果实，在果实白熟期发病。缩果病发病范围广，在我国的山西、陕西、河南、河北等省份的枣种植区均有发生，经常造成毁灭性灾害，严重影响枣果的产量和品质（徐祥彬等2009；刘春国2011）。由于病原菌的侵染，在国内枣栽培区缩果病的病果率常达30%-80%，严重年份超过90%，甚至绝收，对我国枣区造成严重危害。枣缩果病已成为我国枣产业持续发展的重要制约因素（ZHANGCHetal.2011）。1.1枣缩果病病研究现状1.1.1枣缩果病病原种类20世纪70年代，国内开始有枣缩果病研究的报道（韩金声1979），而目前对于枣缩果病病原菌的鉴定始终没有统一定论。初期认为此病害为生理性病害，也有认为是一种欧文氏菌属细菌引起的病害（陈贻金等1989）。目前为止，共报道过的病原菌有6种真菌和2种细菌（张朝红等2008）。曲俭绪等（1992）报道枣缩果病的病原菌为D.gregaria。郑晓莲等（1995）的鉴定认为病原是盾壳霉菌ConiaothyriumolivaceumBon、细链隔孢菌AlternariatenuisNees．及群(聚)生小穴壳菌DothriorellagregariaSacc3种弱寄生菌和1种细菌，而这4种病原单独或混合接种都可产生典型的症状；康绍兰等（1998）提出枣缩果病由细交链孢菌A.altrenata、毁灭茎点霉菌P.destructive、梭壳孢菌Fusicoccumsp三种病原真菌单独或混合侵染引起；罗军等（2009）通过定期采集枣树并进行组织分离，明确了枣缩果病病原包含有细交链孢菌A.altrenata、梭壳孢菌Fusicoccumsp、细极链格孢(A.altrenata)、和橄榄色盾壳霉Coniaothyriumolivaceum；韩党悦（2012）利用组织分离、形态观察和分子鉴定等方法确定了分离比率较稳定的枣缩果病病原菌细交链孢菌A.alternata；王叶等（2013）明确了6株枣缩果病病原菌，即七叶树壳梭抱菌FusicoccumaesculiCord、头状茎点霉Phomaglomerata、细极链格孢菌Alternariatenuissima(Kunze)Wiltshire、细交链孢菌A．alternata、鸭梨链格孢A.R.G.Roberts。虽然各地区对枣缩果病病原的报道各不相同，但广泛认为枣缩果病是由以上单一病原或两种1 以上病原混合侵染而引起，并发现链格孢属的菌株可能是引起枣缩果病最普遍的病原真菌。1.1.2枣疯病的发病症状枣缩果病又名枣铁皮病、枣萎蔫果、枣黑腐病病等，枣缩果病主要危害枣果实，果实受病原菌侵染时，初发病时枣果实的生花蒂尖端逐渐变红、开始干缩，之后便不断地向中上部开始扩展，当变红及干缩区达到枣果实的1/3-1/2面积时，病果风吹即落，但也有部分病幼果实即使全部变红但也不脱落。发病过程一般是在病菌侵入正常果实3d后，先是在肩部或胴部形成淡黄色且边缘清晰而整体不规则的变色斑，从而果皮呈现边界不清的土黄色的水渍状，疏布针刺状圆形褐点，之后病斑逐渐开始扩大，因为糖分上升迅速，颜色逐渐开始由浅红色变深而呈现红褐色，最后病果呈现暗红色，果实失去光泽，受病原菌侵染的果实因开始慢慢失水而逐渐发软萎缩。果肉最初为浅土黄色的较小斑块，严重时大片斑块直到整个果肉开始变为黄褐色。组织呈海绵坏死状，味极苦，不能食用。果柄逐渐由褐色变为黑褐色，提前因形成离层而开始脱落。被侵害果实的症状通常有晕环、水渍、提前着色、萎缩、脱落5个阶段。但脱落期相差很大，前期病果多在水渍期，中期多在着色半红期，后期病果多在萎缩期末脱落，接近成熟期染病的枣果，病斑不明显，果皮提早变红，为紫红色，果肉灰黑色，呈软腐状，于成熟前脱落（周琳等2002；张朝红等2008）1.1.3枣缩果病的传播途径枣缩果病除风雨等天气作用和叶果间相互摩擦而形成的伤口个别传病外，主要是叶蝉、蝽蟓等由刺吸口器的害虫造成的伤口传病。凡是大面积防治害虫普遍比较好的枣区，枣缩果病发生较轻；而小面积治虫追肥的枣林，因为叶片颜色较绿，导致趋绿的害虫数量增加，提高了传染媒介途径，导致病情加重（陈贻金等1989）。曲俭绪等认为，病原菌是通过刺伤或灼伤等造成的伤口入侵的，多以机械刺伤最有利于传染病。此外，病原菌还可以从表皮直接入侵，但侵染过程与伤口侵入相比时间要长一些。以初始病状斑块进行组织分离时，往往不产生任何菌落，但却为病原菌进一步侵入提供了途径（曲俭绪等1992）。李志清认为病原菌可以通过伤口侵染途径也可以通过直接穿透无伤表皮进行侵染，但是发病的速度略有不同，伤口侵染途径要比侵染无伤表皮发病快(李志清等1997)。1.1.4枣缩果病的侵染时期枣缩果病的发生与枣果是的生长发育时期有密切关系，从枣树的花期开始,枣缩果病就开始侵染枣花、枣叶，枣果实的整个生长发育时期都可被侵染,但是枣叶、枣花上并不会表现出症状（郑晓莲等1998）。枣缩果病病原菌可在七月下旬(幼果期)侵入果实,在果实生长到近8月中旬(成熟期)才开始表现症状（康绍兰等1997）。罗学平等（2003）的研究表明,枣果实没有成熟时表现为真菌侵染,果实发育至成熟时主要受细菌危害。另2 外，在连绵的阴雨天气或夜雨昼晴的天气是最容易发生病害的（杨自民等2002）。1.1.5影响枣缩果病发生的主要因素1.1.4.1气候刘元荣等（1988）根据多年的田间观察和调查发现，积温和枣果实发育到成熟前，降雨量多少对发病爆发期出现的早晚有很大影响，积温高，降雨量多，则发病的爆发期就会提前。李志清等（1997）认为，七、八月份田间枣缩果病的发病率与持续阴雨天气的天数和降雨量的大小呈正相关，七、八月份持续阴雨天多、降雨量多，则枣缩果病发病重；阴雨天少，降雨量小，则发病轻。杨昌变（2005）则认为，在八月中旬，在枣果实受到侵染的初期如果遇到连绵的阴雨天或遇到晴雨高湿交替的、连续大雾和交替高温的天气，就会造成发病暴发成灾的现象，尤其是在枣果实白熟期到成熟期之间，下雨后几田内枣果实发病情况就会加重很多。1.1.4.2不同品种刘元荣等（1998）根据多年的田间观察和调查报道，以灰枣、木枣、和灵枣感病最重，六月鲜和八月炸、九月青、齐头白、马牙枣和鸡心枣的抗病性较强。陈谟林等（1996）经田间调查得，灰枣、灵枣、木枣、扁核酸、婆枣发病率较高，而鸡心枣、齐头白、牙枣、九月青有明显的抗病性。杨自民等（2002）观察指出，梨枣、壶瓶枣发病较重，而赞皇大枣、鸡心枣、骏枣等发病较轻。张朝红等在枣缩果病病害发生盛期对不同品种枣进行了田间缩果病抗性调查，参照康绍兰等的病害严重度分级标准，发现金丝小枣、蜂蜜罐、圃铃、长红、冬枣等为高抗品种，姜枣、壶瓶枣为高感品种（康绍兰等1997）；薛晓妮（2012）经过田间缩果病抗性调查及参照曲晓晨（2007），张峰等（2008）病果的病害严重度分级标准计算分析得七月鲜发病率较高，而峰蜜罐有明显的抗病性。1.1.4.3枣果成熟度枣缩果病的发生情况与枣果实的生长生育时期密切相关。一般在枣果实的果梗处变红逐渐变到着色期（即果实有1/3变红区），果肉的糖含量在18％以上，pH值5.5-6.0，气温23-26℃时，是枣缩果病的发病爆发期。枣果实在绿果期时，枣缩果病发病率低于逐渐变红期时枣果实的发病率，并且多年生枝条上的枣果实发病重于l到2年生枝上的枣果。在枣果实的白熟期，枣缩果病病果的Vc和酚含量降低速度快于健果，过氧化物酶活性迅速下降的速度低于健康果实（张朝红等2008）。1.1.6枣缩果病防治措施枣缩果病发生后会带来严重的经济损失，近年来在枣缩果病的防治措施上也开展了较多的研究工作（宋韬亮等2013）。枣缩果病的防治主要有选育和栽培抗病品种；彻底地清除病害果，集中烧毁深埋；加强枣园土壤管理，在枣果变色转红期保持土壤湿润，预防或减少裂果的发生；做好合理修剪的工作，使树冠通风并合理地透光性；还有做好药剂防治工作。（贾亚丁等2008；崔胜兵等2009）。药剂防治主要是在枣的不同发育3 阶段喷洒不同的药剂，比如在枣果实转红变色前后喷施“枣果防裂防烂剂”，预防裂果并恶意降低裂果的产生；而在枣果实转红变色期的发病前后喷洒DT杀菌剂500倍液或特谱唑粉剂3000倍液以及链霉素；在多雨天气，可喷洒M-45可湿性粉剂600~800倍液。另外也要制定合理的综合治理措施进行科学建园，合理间作合理增施有机肥和磷钾肥，合理理施用氮肥和硼、钙等微量元素，以增强树势，全面提升枣树自身的抗病能力（宋宏伟等1999；李京涛等2004）。1.2枣缩果病的抗病性研究1.2.1枣果实结构与抗病性关系周仲铭等经过对的植物结构研究发现，果实表面的角质层可以阻止病原物孢子在果实表面的停留进而起到抵抗病原菌侵入的作用（周仲铭等2006），作为植物自我保护的第一道屏障在植物生长发育过程中起重要保护作用。许勇等发现寄主表面的气孔或皮孔是病原菌侵入的重要途径，气孔的形状、大小、密度、行为和发育程度均与病害的发生发展存在一定的相关性（许勇等2000）。宗兆锋等发现植物细胞的胞间层、初生壁和次生壁通过累积木质素等形成一层屏障，可以限制一些侵染力弱的病原真菌对植物的胁迫(宗兆锋等2006)。田昕通过不同的抗性枣品种果实，切片利用显微镜观察计算其气孔角质层厚度、密度、果肉结构和表皮厚度等发现枣抗病品种的角质层厚度显著高于感病品种，可以推出，角质层厚度与品种抗病性之间存在正相关性。而气孔与表皮厚度则与枣的品种有关，不具有普遍性，有待进一步研究(田昕2012)。1.2.2枣缩果病发病在生理水平的研究植物含有的分泌物、酶抑制物、抗菌物质、营养物等物质在受到外界胁迫起到被动抗病的作用。另外植物在受到病原物胁迫时，还会主动产生植物保卫素、防御性酶系等抗菌物质，积极防御病原物的侵害（许志刚等2006）。王丽丽等通过测量Vc和糖含量表明，枣缩果病的发生与枣果实的生理变化有紧密关系。枣果实的还原糖和可溶性糖含量在七月中旬到八月上旬较低，而Vc含量处于上升阶段且含量较高，病原菌这时候可能已经侵染枣果，但仍不发病。八月中旬之后枣果开始着色趋于成熟，在可溶性糖和还原糖的含量迅速增加，而Vc含量降低时，枣果开始发病，说明糖含量高是促进植物感病性的一个很重要的因素，而Vc含量是反映细胞活力的高低的重要指标。所以，枣果的生理变化可能为枣缩果病的发生提供条件。王丽丽通过发病区和不发病区枣果内总酚含量的测定，表明枣缩果发病初期和盛期病果中的酚类物质含量均显著高于健果，田昕等通过比较三地不同抗性品种的总酚含量变化发现，果实总酚含量与品种抗病性呈正相关，且在八月下旬至九月上旬缩果病发病盛期，抗病品种枣果总酚含量显著高于感病品种，表明酚类物质可能也参与了枣果实对病原菌侵染的应激反应和防御机制的建立。刘慧娟等通过对不同地区不同枣品种在发病期的酶活性测定发现，SOD与PAL的活性大4 小与品种抗性呈正相关，并且枣抗病品种的活性上升提前于感病品种，而POD的活性与品种抗性负相关，并且感病品种枣果接种病原菌后，酶活性变化较抗病品病性呈正相关，且在八月下旬到九月上旬缩果病发病盛期，抗病品种枣果总酚含量显著高于感病品种。通过测量不同抗性品种枣果中脯氨酸含量变化发现，果实脯氨酸含量与品种抗病性呈一定程度的负相关（王丽丽等2011；田昕等2012；刘慧娟2007）。1.3植物与病原真菌互作的分子基础在植物的生长发育过程中，由于遭受到各种病原物例如细菌、真菌、和病毒等的侵染，使植物无法正常的生长发育，从而在外部特征及生理上表现出病理特征，这就表明植物已经发生了病害。自然界中，植物在生长发育过程中与病原菌相互影响、相互作用，协同进化，逐渐形成了一系列自身的免疫系统和复杂的防御反应机制，以抵御病原菌的进一步侵染（Bolleretal.2009;Jonesetal.2006;Zipfeletal.2008）。植物对病原菌的防御反应形式多样，主要表现在两个方面：一方面是植物先天形成的防卫反应（pre-formeddefense），植物本身的抵御病原菌侵染的物理结构屏障和生物化学抑菌物质，物理结构例如细胞壁的角质、木质素、蜡质和特殊气孔结构等，生化物质如植保素、毒性脂肪酸、酚类化合物以及影响病原物细胞透性的蛋白质、核糖体失活蛋白、病程相关蛋白等都具有抗病功能；它们共同构成植物抵御病原菌侵染的防御屏障。另一方面是诱导抗性，植物在受到病原菌的侵染时由抗病基因介导的抗病反应，其作用机制主要是通过植物体内的抗病基因与病原物相对应的无毒基因相互识别，激活植物体内的抗病信号而抵抗病原菌的侵染。诱导的防卫反应包括系统获得抗性（Systemacquiredresistance,SAR）和过敏反应（Hypersensitiveresponse,HR）（Caillotetal.2012）。如能系统认识植物寄主与病原菌相互作用过程中所产生的一系列防御反应、信号转导以及抗性相关基因等的差异表达情况，将有利于深入探究植物与病原菌互作的分子基础，进一步了解植物宿主响应病原菌侵染的抗性机制，为植物防御病害提供科学依据。另外，对抗性相关基因进行深入挖掘鉴定，可为植物抗病分子育种奠定基础。1.3.1次生代谢产物与病原菌侵染植物利用次级代谢途径而产生的物质可以称为次生代谢产物(secondarymetabolites)，植物次生代谢产物，是由植物次生代谢产生的多种多样的小分子有机化合物，这些次生物质种类较多，功能各不相同，在植物抗病反应中，次生代谢产物可以作为生化壁垒抵御病原物侵染，还可以作为信号物质参与植物的抗病反应(ZhaoQetal.2011;LunaEetal.2011)。在与植物抵御对病原菌侵染有关的次生代谢产物中，植物保卫素是较为重要的一类物质。植物保卫素是在植物受到病原菌感染后而被诱发产生的，植物保卫素可分为类黄酮和类萜两大类，其中类黄酮的生物合成途径在植物体内广泛存在,并可以产生极丰富的次生代谢产物,统称为类黄酮化合物。许多研究已表明类黄酮化合5 物具有多种生物活性,除具有抗菌等作用外,在抗氧化等方面也有显著效果，类黄酮化合物还是大多数氧自由基的清除剂,因此能够提高过氧化物歧化酶(SOD)的活力。类黄酮化合物在病原菌侵染植物过程中的信号传导过程中也发挥着重要的作用（KoesREetal.1996）。在次生代谢产物中类胡萝卜素也是植物生长发育所必不可少的。它可保护叶绿素免受强光导致的光氧化破坏,同时它又是光合天线和反应中心复合体不可缺少的结构成分,有些类胡萝卜素还是ABA合成的前体(Winkel-ShirleyBetal.2001)，在植物激素信号转导过程起重要作用。1.3.2植物信号转导与病原菌侵染促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在真核生物普遍存在并能在植物细胞中对各类生长因子进行应答反应，当植物受到外界胁迫时，能将外界的信号传递给细胞核，通过调节特异基因的表达使植物作出相应的生理反应，研究表明MAPK信号途径在调节植物的生长发育以及抵御外界侵染等方面发挥重要的作用。MAPK还参与了激素信号的传导过程，在植物体信号传导中也发挥着重要的作用。植物在生长发育过程中会受到各类生物胁迫和非生物胁迫，植物的内源激素在植物生物胁迫和非生物胁迫中起着重要的作用。研究认为，植物激素水杨酸(SalicylicAcid，SA)、茉莉酸(JasmonicAcid，JA)和乙烯(Ethylene，ET)是植物抗病信号转导途径中的重要调控因子（PieterseCMJetal.2009）。此外，植物激素脱落酸(AbscisicAcid，ABA)、生长素(Auxin)、赤霉素(Gibberellin，GA)、细胞分裂素(Cytokinine，CK)和油菜素内酯素(Brassinosteroid，BR)，也被报道参与调控植物对病原菌的抗性(Ueguchi-TanakaMetal.2007;StevenHetal.2008)。植物根据入侵的病原菌类型和营养方式激活相应激素信号调控的抗病途径，然而这些激素调控的信号途径在植物生长发育和抗病等多种生理活动中并不是完全独立存在的，在很多情况下它们相互作用、彼此关联。这些激素信号途径之间的交叉互作使植物可以更有效地抵御各种类型的病原菌侵染。1.4转录组学在植物与病原菌互作研究中的应用1.4.1转录组的概念近年来，随着基因组研究技术的不断发展，转录组学、蛋白质组学和基因组学等组学逐渐在植物研究中被广泛应用，其中转录组学又是应用最为广泛的，而且转录组学在基因组研究中率先发展起来(LockhartandWinzeler.2000)，转录组（RNA-seq）是指特定的组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和，它包括mRNA和非编码RNA（non-codingRNA，ncRNA）（Costaetal.2010）。转录组测序技术不仅可以研究细胞功能和表型，还可以研究基因结构、基因表达以及基因功能(张春兰等，2012)。近些年，DNA高通量测序技术的不断发展和大规模的平行测序(Massiveparallelsequencing,MPS)技术的相继出现，改变了转录组测序的方式，出现了“RNA测6 序技术(RNA-seq)”(YassourMetal.2010)。RNA-seq也被称作转录组测序技术，是利用高通量测序技术全方位测定mRNA、sRNA以及ncRNA的序列的有效方法，能够全方位快速地获得所要研究的样本几乎所有的转录本，从而展现它们的表达水平及可以获得生物体某一个部分、某一个阶段或某类环境下的基因表达信息。与传统的杂交技术相比，RNA-Seq技术不需要预先设计探针，可在单核苷酸水平种更为检测任意物种的全部转录信息，以高通量、易操作、可定量、低成本等优势逐渐成为基因组和转录组研究的新技术，广泛应用于差异基因检测、新基因识别及基因功能分析等方面。1.4.2转录组测序应用转录组测序技术发展给大多种植物的研究提供了巨大的信息，为研究基因的表达、功能提供了强大的支持，可以在转录本结构的发现、基因的表达水平、新基因的发现等方面有更多应用。Sara等利用高通量转录组测序技术对葡萄果实发育过程的转录组进行了研究，通过对所得数据进行分析，发现了MYB转录因子家族的28个新基因和53个谷胧甘肤转移酶(Glutathionetransferase)家族的新基因，还发现了385个基因具有可变剪接,并鉴定出85870个SNP(LiRetal.2009)；戴忠仁等以耐冷型黄瓜自交系和冷敏型黄瓜自交系为材料，通过转录组测序，通过差异基因比对获得耐冷型黄瓜自交系表达基因3353个、下调表达基因1629个，冷敏型黄瓜自交系的上调表达基因886个、下调表达基因262个。材料耐冷型黄瓜自交系发现了1300个新转录本，材料冷敏型黄瓜自交发现了1264个新转录本，从实验材料获得了可变剪接，材料耐冷型黄瓜自交系的可变剪接数为43716个、材料冷敏型黄瓜自交系为38223个。通过一致性序列与参考序列的比较，从而找到SNPs，材料耐冷型黄瓜自交系为36539、冷敏型黄瓜自交系为32967(戴忠仁等2015）。1.5本研究的目的意义枣产业发展的迅速在促进农民经济发展和改善生态环境方面具有重大作用，但由于枣缩果病的发生后，造成枣果脱落及坏死，严重影响了枣果的产量和品质，对我国枣区的生产造成严重的危害，对该病害的防治刻不容缓。随着枣树基因组测序的完成，为系统、深入的挖掘枣树功能基因，为揭示优良性状的分子机制提供了重要的基因资源，在参考基因组的基础上进行转录组测序，可以更精准、高效的研究组织特异表达、不同胁迫下差异表达基因的动态规律（费元等2015；Huangetal.2016）。本试验以白熟期枣抗缩果病‘蜂蜜罐’、感缩果病‘七月鲜’果实及其清水处理的果实对照材料，以细交链孢菌（A.altrenata）侵染枣果0.5d、1d、2d、3d、4d和5d为诱导条件，采集实验组及对照组样品分子水平研究条件，利用转录组测序技术进行分析，掌握枣果实响应细交链孢菌（A.altrenata）侵染下的代谢通路及相关抗性基因，挖掘该基因表达和调控模式，为后续相关抗病基因的克隆和枣抗缩果病的防治和抗病品种选育提供理论参考依据。7 第二章细交链孢菌诱导下枣抗、感缩果病果实转录组测序分析2.1材料与方法本研究所采用的枣品种为‘蜂蜜罐’，‘七月鲜’白熟期枣果实，采自陕西省清涧红枣试验站，细交链孢菌为ZS091生理小种，来源于河南省林业科学院。2.1.1接种和取样将供试菌种于PDA培养基上培养7天后，用吐温80溶解病原菌孢子，并用无菌水稀释，经血球计数板计数后，配成浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液。当枣果进入白熟期时，选用长势相似的健康蜂蜜罐枣作为试验材料。用75%的酒精冲洗干净后用无菌水冲洗3遍，最后将配好的孢子悬浮液摇匀，均匀地喷洒在枣果表面作为实验组（Tester）。同时以健康枣果喷洒无菌水作为对照组（Driver）。接种后小心地套上硫酸纸袋，并在袋中放入浸水的无菌棉保湿。分别于0.5d、1d、2d、3d和4d采集实验组及对照组样品，每个样品3个重复（每个重复5个枣果），采自3株植株。将采集的枣果用冰盒迅速带回实验室，带皮削成薄片，并用锡纸包好后立即投入液氮中冷冻，置于-80℃冰箱中保存备用。2.1.2主要仪器、试剂（盒）及耗材的处理2.1.2.1主要仪器本实验中用到的仪器见表2-1。表2-1主要仪器型号及来源Table2-1Maininstrumentstypeandsourse仪器名称来源型号InstrumentNameSourceType琼脂糖凝胶电泳仪北京六一生物科技有限公司DYY-III紫外凝胶成像分析仪北京六一生物科技有限公司BIOIMAGINGSystemGeneGENIUS核酸蛋白检测仪Eppendorf艾本德中国有限公司Eppendorf超纯水机默克化工技术(上海)有限公司Milli-Q高压灭菌锅上海天呈科技有限公司HIRAYAMAHV-50超净工作台赛默飞世尔中国有限公司Heraguard™ECO制冰机上海净信有限公司XB-40小型高速冷冻离心机Eppendorf艾本德中国有限公司EppendorfCentrifuge5415D掌上离心机上海化科实验器材有限公司D1008漩涡振荡器上海略申仪器设备有限公司Vortex-Genie2微波炉广东格兰仕集团有限公司P7021TP-6微量移液器赛默飞世尔中国有限公司/8 仪器名称来源型号InstrumentNameSourceType4℃冷藏柜美的集团MS-DCL1000E4D-80℃冰箱北京爱立斯生物科技有限公司BDF86V158PCR仪美国ABI公司ABI2720智能型光照培养箱南京恒裕仪器设备制造有限公GZP-250CFX荧光定量仪司IQ5美国BIO-RAD公司2.1.2.2主要试剂本研究中所用试剂及来源见表2-2。表2-2主要试剂及来源Table2-2Listofmainreagentsandthesource试剂名称来源ReagentnameSourceTaKaRaMiniBESTPlantRNAExtraction宝生物工程(大连)有限公司（TaKaRa）Kit试剂盒；引物上海生工公司无水乙醇西陇化工股份有限公司吐温80西陇化工股份有限公司2.2总RNA的提取在枣果实研磨成细粉末状时，要不断向其中加入液氮，以保持RNA活性，避免RNA降解。采用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit试剂盒提取叶片样品总RNA，注意进行去多糖多酚和去基因组DNA步骤：（1）将研磨成粉末状的样品（50-100mg）加入到含有450μlBufferRL（使用前请确认已加入50×DTTSolution）的1.5ml灭菌离心管中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀，12,000rpm，4℃离心5min。（2）将上清液小心吸取到新的1.5ml灭菌离心管中。（3）加入2步骤中的上清液或混合液1/2体积的无水乙醇（此时可能会出现沉淀），使用移液枪将溶液混合均匀。（4）立即将混合液（含沉淀）全部转入到RNA离心柱中（含收集管）。（如果混合液的体积大于600μl，请分批加入，每次加入的体积不要大于600μl。）12,000rpm，离心1min，弃滤液。（5）将500μl的BufferRWA加入至RNA离心柱中，12,000rpm离心30s，弃滤液。（6）将600μl的BufferRWB加入至RNA离心柱中，12,000rpm离心30s，弃滤液。注：请确认BufferRWB中已经加入了指定体积的100%乙醇。（7）DNaseI消化：9 ①DNaseI反应液的配制：取5μl10×DNaseIBuffer，4μlRecombinantDNaseI（RNasefree,5U/μl），41μlRNasefreedH2O到新的1.5ml已灭菌离心管中，混合均匀。②向RNA离心柱膜中央加入50μlDNaseI反应液，室温静置15min。③向RNA离心柱膜中央加入350μl的BufferRWB，12,000rpm离心30s，弃滤液。（8）重复操作步骤5，将RNA离心柱重新安置于收集管上，12,000rpm离心2min。（9）将RNA离心柱安置于1.5ml的新的已灭菌离心管上，在RNA离心柱膜中央处加入50-200μl的RNaseFreedH2O或0.1%DEPC处理水，室温静置5min后12,000rpm离心2min洗脱RNA。2.3总RNA质量检测使用1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度及污染程度、Nanodrop2000检测RNA纯度、Qubit2.0对RNA浓度进行精确定量、Agilent2100精确检测RNA的完整性。2.4cDNA合成材料与方法检测合格的RNA样品，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，将得到的mRNA在PCR仪上按相应程序合成第一链cDNA。将第一链cDNA与反转录第二链反应体系混合，适温反应一段时间来合成第二链，反应结束后，用试剂盒对二链合成产物进行纯化，对其进行末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPureXPbeads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终cDNA文库。2.4.1末端修复配置末端修复复合酶反应体系，在Thermomixer中适温反应一段时间进行末端修复，修复产物用试剂盒进行纯化回收。2.4.2cDNA3ˊ末端加‘A’在聚合酶体系的作用下，使上一步得到的修复产物在3ˊ末端加上‘A’碱基，为下一步接头连接作准备。加‘A’产物用试剂盒进行纯化回收。2.4.3Adapter的连接配置连接酶反应体系，在Thermomixer中适温反应一段时间使Adapter和加‘A’产物连接。连接Adapter后的产物用试剂盒进行纯化回收。2.4.4连接产物的胶回收纯化制备琼脂糖凝胶，对上一步的连接产物进行电泳。完成切胶后将剩下的胶块在凝胶成像系统中拍照并储存图片。确定没有问题后方可将所剩凝胶胶块丢弃至垃圾桶中。切下的胶块用试剂盒进行纯化回收。10 2.4.5PCR反应及产物纯化配置PCR反应体系对上一步的切胶回收产物进行扩增。反应结束后对PCR反应产物进行电泳，切胶，并用试剂盒进行纯化回收，回收产物溶于适量Elutionbuffer中，打印好标签贴在离心管管壁上，至此文库制备完成。2.4.6上机测序库检及上机测序将构建好的cDNA文库用Qubit2.0进行初步定量并稀释文库值1ng/μL，使用Agilent2100对cDNA文库insertsize检测，符合需求后，用qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量（有效浓度>2nM），以保证文库质量。库检合格后，将不用文库按照有效浓度及目标表下机数据量的需求pooling后，利用IlluminaHiSeqTM2500测序平台进行PE125测序分析。测序工作由金唯智（中国）生物科技有限公司完成。2.4.7基因表达谱数据分析由IIIuminaHiSeqTM2000测序所得的数据称为rawreads或rawdata，随后要对rawreads进行质控(QC)，以确定测序数据是否适用于后续分析。质控后，经过滤得到高质量cleanreads，利用Hisat2(v2.0.1)平台构建unigene文库（Haasetal.，2013）、与枣基因组数据（Liuetal.,2014）比对后，采用DESeq（Andersetal.,2012）方法消除生物学变异后进行差异表达分析，对差异基因筛选的标准一般为:FDR≦0.05，差异表达倍数|log2Ratio|≥2。采用RPKM（ReadsPerKilobasesperMillionreads）（Mortazavietal.，2008）的方法对测序数据标准化。可进行基因表达、基因结构优化、可变剪接、新转录本预测及注释、SNV检测等一系列后续分析，并对所有差异表达基因与GO数据库（http://www.geneontology.org/）和KEGG数据库（http://www.kegg.jp/kegg/）进行对比，分别进行GeneOntology(GO)功能分析和KEGGPathway富集分析。2.5实时荧光定量PCR验证2.5.1RNA提及取cDNA合成枣果实总RNA采用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit试剂盒提取，反转录合成cDNA总量为200ng，所用试剂盒为TaKaRaPrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime），具体操作步骤参照说明书指导进行。2.5.2荧光定量分析基于SYBR法对差异表达基因进行qRT-PCR验证，所用内参基因为ACT1基因（ZhangCetal.，2016）。所用引物信息见表2-3，由上海生工公司合成。PCR反应体系10μL：SYBRPremixExTaqⅡ5.0μL，正反引物各0.4μL，DNA模板1.0μL，水3.2μL。反应条件为：95℃30s，95℃5s，58℃30min，72℃30s，共40个循环。11 表2-3引物信息Table2-3Primerinformation基因ID登录号基因名称引物序列(5'-3')扩增效决定系数GeneIDaccessionGenenamePrimersequences率R2E(%)Zj.jz107428959Expansin-A1F：TCCTCTTCTCCCGCATGGTA96%0.990R：CGCTGGAGGCTGGTGTAATCZj.jz107419914Gibberellin-2-betadiF：ATCAACGGCAGGTCGCATT95%0.990oxygenase8R：GACCCACCATTTCACAAGGC95%0.996Zj.jz107429464TranscriptionfactorF：CAGTGTTTGTCAGTTTGCTTGG99%0.988MYB21R:AGACTTTTCTTGATGCGGTTCGGTZj.jz107420088AminoacidF：TCTACCCCAAGGCTGCTCAT101%0.998permeaseR:TGGCACTCTTGTTGTTCCCTCZj.jz107417234TranscriptionfactorF：CCTTCTAATTCATCGTCCTG98%0.998bHLH30-likeR:GCACATTTTGATACCCTTCGZj.jz107413980ProteinNRT1/PTRF：TGTGAGACAGAAGCGGCATG101%0.998FAMILY5.1R：TTCAAGTTCCAGATTGCTCCACZj.jz107420411Glucose-6-phosphatF：CCTTTTGCGAGTTAATACCG106%0.996e/phosphateR：TGATAGCAGATGGCTTTGTCtranslocator2Zj.jz107426176AquaporinNIP3-1F：TTGGCTGGTTTATTGGTCTGTT99%0.992ZincfingerCCCHR：TTCTGATGATTCCCGTTCGCZj.jz107432190domain-containingF：TCTTAGCCAGGTCCTTTTGGTGTAT96%0.996protein18R：CCTTCATCTCCTCCCACTTCAZj.jz107429308SulfatetransporterF：GTCTCTCACACTGGAAGCAAGCAAT108%0.9913.3R：CATACACCAAAAGGACCTGGCTAAGZj.jz107433466Zinctransporter1F：CGGGAAGACCATTGATACGG102%0.990R：AGTCTGGTTCAAAGCAGGAGCZj.jz107434596DiseaseresistanceF：TTTGCAGCAGGTCATCGT97%0.994proteinRPM1R：TGAGTTGTATTTGGTGGGCZj.jz107419438PurpleacidF：CCTTTTGCGAGTTAATACCG100%0.988phosphatase17R：TGATAGCAGATGGCTTTGTC12 表2-4PCR反应体系（25μl）Table2-4SystemofPCRreaction（25μl，TaKaRa）试剂体积ReagentVolumeSYBRPremixExTaqⅡ12.5μlF1.0μlR1.0μlcDNA2.0μlddH2O8.5μl2.5.3数据处理与分析用SPSS20.0对数据进行单因素方差分析（ANOVA），采用LSD和Duncan’s方法进行两两比较，显著性分析p<0.05，并使用OriginPro8.0软件制图。13 第三章结果与分析3.1RNA质量检测使用离心柱试剂盒法提取RNA后，取1.5ul使用ThermoScientificNanoDrop分光光度计对其浓度260/280进行检测，检测后用1%琼脂糖凝胶电泳检测枣果实总RNA的完整性。检测样品在冰上融化离心后混匀，取lμL样品稀释，70℃变性2min后，进行Agilent2100检测。检测样品浓度，片段大小，RIN和28S:18S比值。从图3-1分析结果显示样本RNA完整性较好，所有样品RIN值大于8，rRNARatio(28s/18s)都大于1，RNA浓度都大于100ng·μl-1，因此个样品总质量满足建库及测序要求。R1R2RNAArea:294.2RNAArea:332.5RNAConcentration:164ng/ulRNAConcentration:187ng/ulrRNARatio:2.5rRNARatio:2.5RNAIntegrityNumber(RIN):8.70(B.02.08)RNAIntegrityNumber(RIN):8.5(B.02.08)S1S2RNAArea:281.2RNAArea:182.8RNAConcentration:158ng/ulRNAConcentration:110ug/ulrRNARatio:2.1rRNARatio:2.8RNAIntegrityNumber(RIN):8.9(B.02.08)RNAIntegrityNumber(RIN):9.7(B.02.08)图3-1基于Agilent2100所获得的总RNA检测图Fig.3-1Agilent2100examinationoftotalRNA注：R1，为‘蜂蜜罐’不同接种时间RNA等量混合；R2，为‘蜂蜜罐’清水对照；S1为‘七月鲜’不同接种时间RNA等量混合；S2为‘七月鲜’清水对照Note:1:R1isRNAequivalentmixturewithdifferentinfectedtimesofhighresistantlines；R2isthecontrolofhighresistantlines；S1isRNAequivalentmixturewithdifferentinfectedtimesofhighsusceptivelines；S2isthecontrolofhighsusceptivelines;14 3.2转录组测序数据分析3.2.1转录组测序质评估量本研究中的4个样品测序分别获得了4.88×107、4.93×107、4.74×107、4.80×107Rawreads，对低质量数据进行过滤，去除污染及接头序列后可分别得到4.87×107、4.91×107、4.71×107、4.78×107高质量序列。其中分别有4.12×107、4.28×107、4.06×107、3.86×107条比对至枣基因组（Liuetal.2014），有3.71×107、3.49×107、3.27×107、3.31×107条获得唯一比对。测序分析中，一般认为Q≧20的碱基具备可靠的质量，Q20范围为97.08-97.35%符合Q20大于80%的要求，GC含量平均约为44.79%。样品的皮尔逊相关系数的平方(R2)均大于0.9，表明在不同重复材料之间的重复性较好，可以用于后续生物信息学分析。表3-1转录组测序数据统计StatisticsofTranscriptomesequencingdataQ20SamplenameTotalmappedCleanreadsUniquemappedreadsGC（%）（%）R148676507412489863716748897.0844.52R249136789427205903489946397.3544.62S147090715405849643266404497.3044.89S247752767385958393315169097.2045.11注：Q20为Cleanreads质量值≥20的碱基所占的百分比。Note：Q20meanspercentageofqualityvaluesofbasesinvolvedcleanreadsisequalorgreaterthan20.3.2.2病原菌接种后差异表达基因数量分析基因功能注释结果表明，A.altrenata接种‘蜂蜜罐’、‘七月鲜’后差异表达的基因数分别为47和2357，其中上调表达基因数分别为39和1754个，而下调表达则分别为8和603个。图3-2差异表达基因统计Fig.3-2Thestatisticsofdifferentialexpressiongene15 3.2.3GO功能注释富集分析通过对差异表达基因的GO功能注释分析发现，差异基因主要富集在生物学过程（Biologicalprocess）和分子功能（Molecularfunction）两大类别（见图3-3），分别在‘蜂蜜罐’和‘七月鲜中’包含14个和16个功能分类。以CorrectedP-value≤0.05为阈值，定义A.altrenata接种‘蜂蜜罐’果实后差异表达基因显著富集的GO-term，并进行GO功能分析（图3-3），结果表明，‘蜂蜜罐’在接种A.altrenata后，枣果实生物学过程的差异表达基因显著富集在5条GO-term中，包括定位（localization)、单一生物过程（single-organismprocess）、刺激反应（responsetostimulus）、代谢过程（metabolicprocess）、细胞过程（cellularprocess）。细胞组分中的差异表达基因显著富集在5条GO-term中，包括细胞部件（cellpart）、膜部件（membranepart）、膜（membrane）、细胞器（organelle）、细胞器部件（organellepart）等。而在分子功能中的差异表达基因显著富集在4条GO-term中，包括连接（binding）、转运活性(transporteractivity)、催化活性（catalyticactivity）结构分子活性(structuralmoleculeactivity)等。对A.altrenata接种‘七月鲜’果实差异表达基因进行GO功能分析，结果如图（3-3）表示，生物学过程的差异表达基因显著富集在12条GO-term中，主要包括代谢过程（metabolicprocess）、细胞过程（cellularprocess）、定位（localization)、单一生物过程（single-organismprocess）、刺激反应（responsetostimulus）、生物调节（biologicalregulation）等，与侵染‘蜂蜜罐’不同的是，生物学过程主要富集的是代谢过程（metabolicprocess），富集了133基因；细胞组分中的差异表达基因显著富集在8条GO-term中，包括细胞部件（cellpart）、膜部件（membranepart）、细胞器（organelle）、膜（membrane）、细胞器部件（organellepart）等。与侵染‘蜂蜜罐’相比，细胞组分中同样主要富集在细胞部件（cellpart），共富集了48条；而在分子功能中的差异表达基因显著富集在11条GO-term中，包括催化活性（catalyticactivity）、连接（binding）、转运活性(transporteractivity)、电子载体活性(electroncarrier)、信号转导活性（signaltransduceractivity）等，与侵染‘蜂蜜罐’相比，主要富集的是催化活性（catalyticactivity），共富集了182基因。16 R1VSR2差异表达基因GO功能显著性分析S1VSS2差异表达基因GO功能显著性分析图3-3显著差异基因GO分类统计图Fig.3.3GOclassificationofassembledtranscripts.3.2.4差异表达基因的Pathway分析在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，通过Pathway显著性富集能确17 定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）是有关Pathway的主要公共数据库(Kanehisa,2008）。Pathway显著性富集分析以KEGGPathway为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的Pathway。表3-7表明，A.altrenata接种‘七月仙’后的差异表达基因有745个富集在32条Pathway中，选取差异基因中与枣果实响应病原菌侵染相关的Pathway有植物激素信号转导（Planthormonesignaltransduction）、谷胱甘肽代谢（Glutathionemetabolism）、半胱氨酸和蛋氨酸代谢(Cysteineandmethioninemetabolism)、类黄酮生物合成（Flavonoidbiosynthesis）、类胡萝卜素生物合成（Carotenoidbiosynthesis）、脂肪酸代谢（Fattyacidmetabolism）、脂肪酸生物合成(Fattyacidbiosynthesis)、α-亚麻酸代谢（alpha-Linolenicacidmetabolism）等。A.altrenata侵染‘蜂蜜罐’果实中差异基因共匹对了13个，Pvalue≤0.05的代谢通路有13个。包括光合作用（Photosynthesis-antennaproteins），植物激素信号转导（Planthormonesignaltransduction），磷酸戊糖途径（Pentosephosphatepathway），糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis），二萜生物合成（Diterpenoidbiosynthesis）等如表3-3。表3-3代谢通路Tab.3-3MetabolicpathwayDEGswithpathwayPathwayIDPathwayPvalueannotation(466)S1VSS2ko00941Flavonoidbiosynthesis12(1.79%)4.62E-06ko05164InfluenzaA35(7.51%)6.00E-04ko01200Carbonmetabolism35(7.51%)1.75E-03Drugmetabolism-cytochromeko0098212(2.58%)9.41E-05P450ko00592alpha-Linolenicacidmetabolism13(2.79%)7.90E-05ko05145Toxoplasmosis45(9.66%)1.50E-04ko05204Chemicalcarcinogenesis10(2.15%)3.14E-04Biosynthesisofsaturatedfattyko010408(1.72%)3.03E-04acidsSynthesisanddegradationofko000724(0.86%)2.64E-04ketonebodiesCysteineandmethionineko0027016(3.43%)1.55E-03metabolismTropane,piperidineandpyridineko009608(1.72%)1.68E-04alkaloidbiosynthesisToll-likereceptorsignalingko0462045(9.66%)1.64E-05pathway18 DEGswithpathwayPathwayIDPathwayPvalueannotation(466)D-GlutamineandD-glutamateko004712(0.43%)1.74E-03metabolismko04016MAPKsignalingpathway-plant27(5.79%)2.44E-09Chagasdisease(Americanko0514244(9.44%)4.90E-05trypanosomiasis)Taurineandhypotaurineko004305(1.07%)5.70E-04metabolismko00052Galactosemetabolism15(3.22%)1.65E-03ko00480Glutathionemetabolism15(3.22%)2.33E-03Metabolismofxenobioticsbyko0098011(2.36%)1.09E-04cytochromeP450ko05162Measles45(9.66%)4.66E-05Planthormonesignalko0407533(7.08%)1.47E-04transductionNeomycin,kanamycinandko005243(0.64%)3.26E-03gentamicinbiosynthesisko05133Pertussis46(9.87%)1.04E-05ko05152Tuberculosis47(10.09%)2.89E-04ko00906Carotenoidbiosynthesis8(1.72%)2.40E-03ko01212Fattyacidmetabolism16(3.43%)4.22E-05Carbonfixationpathwaysinko007208(1.72%)2.28E-04prokaryotesko04624TollandImdsignalingpathway44(9.44%)3.05E-05ko04064NF-kappaBsignalingpathway44(9.44%)2.59E-05ko04722Neurotrophinsignalingpathway46(9.87%)1.14E-04ko05140Leishmaniasis44(9.44%)1.57E-05ko00061Fattyacidbiosynthesis11(2.36%)3.22E-04R1VSR2ko01200Carbonmetabolism1(14.29%)3.93E-02ko04142Lysosome1(14.29%)5.54E-03ko00904Diterpenoidbiosynthesis1(14.29%)4.01E-04ko00920Sulfurmetabolism2(28.57%)1.53E-05ko00010Glycolysis/Gluconeogenesis1(14.29%)9.46E-03Photosynthesis-antennako001961(14.29%)1.56E-04proteinsko03015mRNAsurveillancepathway1(14.29%)9.05E-03ko04380Osteoclastdifferentiation1(14.29%)8.42E-0419 DEGswithpathwayPathwayIDPathwayPvalueannotation(466)ko00030Pentosephosphatepathway1(14.29%)2.47E-03ko00740Riboflavinmetabolism1(14.29%)1.38E-04ko00230Purinemetabolism1(14.29%)1.02E-02ko05323Rheumatoidarthritis1(14.29%)7.57E-043.3‘七月鲜’中抗性相关代谢途径及基因分析3.3.1植物激素信号转导通路图3-4‘七月鲜’中显著差异基因参与的植物激素信号传导代谢通道Fig.3-4Phytohormonessignalingpathwayinvolvedindifferentialgenesin'QiYueXian'3.3.1.1SA、JA/ET介导的抗病信号途径研究显示（图3-4），‘七月仙’受A.altrenata侵染后，有1个基因（上调1.6倍）参与下游调控NPR1的表达，表明SA信号途径参与了‘七月仙’对A.altrenata的响应。‘七月仙’受A.altrenata侵染后，调控ProteinTIFY10A相关基因有2个（分别上调2.3、2.2倍），JA信号途径中关键基因的表达变化，表明JA信号途径在A.altrenata侵染‘蜂蜜罐’的过程中起着重要的作用。乙烯是植物激素的植物生长调节物质之一，在植物抵御生物与非生物胁迫等方面发挥重要作用。图3-9分析发现，在A.altrenata侵染下，‘七月仙’乙烯信号通路的多个20 基因表达发生变化，包括2个调控CTR1(ConstitutiveTripleResponse1）基因（1个上调2.5倍，一个下调2.3倍），2个EIN3（Ethyleneinsensitive3）基因（分别上调2.9、2.8倍），3个ETR1（Ethylenereceptor1）基因（分别上调4.4、2.9、1.6），2个ERF（Ethyleneresponsefactor）基因（分别上调3.0、2.5倍）。在A.altrenata诱导下，‘七月鲜’枣果实中乙烯途径多个基因表达发生变化，这暗示了乙烯信号途径参与了枣果实对细交链孢菌A.altrenata的响应过程。3.3.1.2BRs介导的抗病信号途径油菜素甾醇（BRs）具有多种生理效应，可以促进植物细胞的伸长和分裂，增强植物在逆境胁迫时的耐受性(陈全助2013）。A.altrenata侵染枣果实后，油菜素甾醇（BRs）信号途径中相关基因表达发生变化，分析发现，1个调控BSK1基因（上调1.8倍），1个BAK1基因（上调2.2倍）,1个TCH4基因（上调2.5倍），一个CYCD3基因（下调4.7倍）。BSK1与BAK1均是BRI1受体高度相关激酶家族成员，与BRI1相互作用，将植物BRs信号由胞外向胞内转导，在调控植物生长发育和抗病之间的平衡过程中起到重要作用(AlbrechtCetal.2012)。在细交链孢菌A.altrenata诱导下，‘七月鲜’枣果实中BRs途径多个基因表达发生变化，这暗示了BRs信号途径参与了枣果实对细交链孢菌A.altrenata的响应过程。3.3.1.3PYR/PYL及Auxins介导的抗病信号途径在植物的生长和发育过程中，生长素(auxin，IAA)起着重要的调节作用。生长素的作用表现在多个方面，最主要的是分子水平的作用，大多数作用过程都是由生长素调控的基因表达来起始或介导。A.altrenata侵染枣果实后，生长信号途径中相关基因表达发生变化，分析发现，2个调控Aux/IAA的基因（分别上调2.6、1.6倍），2个调控GH3的基因（分别上调2.0、1.9倍），2个调控SAUR的基因（一个上调1.7、一个下调2.8倍），它们均是生长素早期响应基因。在A.altrenata侵染下，‘七月鲜’脱落酸信号通路的多个基因表达发生变化，包括1个调控PYR/PYL(PyrabatinRiesistance/PyrabatinRiesistance)的基因（上调1.4倍），5个调控PP2C（Proteinphosphatase，2C）的基因（分别上调2.7、2.0、2.5、1.8、2.6倍），2个调控SnRK2（Serine/threonine-proteinkinaseSRK2I）的基因（上调2.7倍，下调2.4倍），1个调控ABF（ethyleneresponsefactor）的基因（上调1.6倍）。另外A.altrenata侵染枣果实下，在MAPKsignalingpathway信号转导途径中还发现2个WRKY33基因（分别上调2.0、2.4倍），3个呼吸爆发氧化酶(RespiratoryBurstOxidaseHomolog,RBOH)的基因（1个上调2.3、2个均下调2.0倍）。3.3.2谷胱甘肽代谢途径相关基因谷胱甘肽(glutathione,GSH)广泛存在于植物体内，在植物抵御环境胁迫是起重要作用。同时，谷胱甘肽还在组织抗氧化特性维持和对氧化还原敏感的信号传导的调节中发挥关键性作用，谷胱甘肽还是植物体内最有效的活性氧清洁剂之一，能够有效清除植物21 自身代谢和环境胁迫时产生的过氧化物（EdwardsRetal.2000）。相关研究认为，植物体内GSH水平含量与其对环境胁迫的忍耐性相关，当植物受到环境胁迫时，加谷胱甘肽的合成量增加，从而提高自身抗性。研究发现（图3-12），在A.altrenata的侵染下，枣果实中谷胱甘肽代谢相关基因表达发生了变化，包括调控10个调控谷胱甘肽s-转移酶（GST）的相关基因（1.9、1.8、2.6、2.3、2.5、1.7、2.7、2.6、2.1、1.6）及1个调控抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbateperoxidase,APX）的基因（上调3.5倍），一个调控亚精胺合成酶（Spermidinesynthase2,SPDS）的基因（上调表达1.8倍），一个调控葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶（glucose-6-phosphate1-dehydrogenase,GDH）的基因（下调2.2倍），一个调控核糖核苷二磷酸还原酶大亚基(ribonucleoside-diphosphatereductaselargesubunit,RRM1)的基因(下调1.6倍）。图3-6‘七月鲜’中显著差异基因参与的谷胱甘肽代谢途径Fig.3-6Glutathionemetabolicpathwayinvolvedinthesignificantdifferenceofgenesin‘QiYueXian’3.3.3类黄酮生物合成及相关基因类黄酮是一类重要的次生代谢产物，其生物合成途径在植物体内普遍存在，具有清除植物体内代谢产生的各类活性氧自由基，增强过氧化物歧化酶（SOD）的活性等功能，在植物微生物信号转导、植物抵御外界胁迫等方面起重要的作用，是三大植保素之一。研究发现，在A.altrenata的侵染下，枣果实中类黄酮生物合成相关基因表达发生了变化，包括1个调控柚皮素3-双加氧酶（Naringenin,2-oxoglutarate3-dioxygenase,ODD）的基因22 （上调2.6倍），3个调控CHS（Chalconesynthase)的基因（分别上调3.0、2.6、3.5倍），1个调控CHI（Chalconeisomerase）的基因（上调5.6倍），2个FLS(Flavonolsynthase)（分别上调5.9、2.3倍），2个LDOX(Leucoanthocyanidindioxygenase)（分别上调1.9、1.7倍），1个DFR（Dihydroflavonolreductase）（上调2.2倍），1个肉桂酸-4-羟基化酶（Trans-cinnamate4-monooxygenase,C4H）（上调2.1倍），一个咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(CaffeoylCoAO-methyltransferase,CCoAOMT)(上调2.0倍）。图3-7‘七月鲜’中显著差异基因参与的类黄酮生物合成途径Fig.3-7TheSignificantlyDifferentGenesParticipateintheFlavonoidBiosynthesisPathwayin‘QiYueXian’3.3.4脂肪酸合成途径及相关基因脂肪酸是细胞生物膜脂的主要成分，在植物体内广泛存在。脂肪酸在植物抵御外界胁迫时发挥重要作用。另外，一些脂肪酸还作为信号分子参与植物激素乙烯、生长素等的信号转导过程，在植物防御信号路径中的起主动作用。研究发在在A.altrenata的侵染下，枣果实中脂肪酸合成途径相关基因表达发生了变化，包括1个β-酮脂酰-酰基载体蛋白还原酶(β-ketoacyl-ACPreductase,FabG)基因(上调1.5倍），1个硬酯酰载体蛋白脱氢酶1（StearoyI-ACFdesaturase,Fab1)基因(下调1.4倍），3个（长链脂酰CoA合成酶(Long-chainacyl-CoAsynthetase,ACSL）基因（分别下调2.4、2.0、1.6倍），2个乙酰-乙酰载体蛋白硫脂酶(Acetyl-fattyacylcarrierproteinthioesterase,FATB)基因(分别上调2.7、2.4倍），3个酰基-酰基载体蛋白去饱和酶(Plastidacyl-ACPdesaturase,FAB2)基因(分别上调2.3、2.0、1.7倍）。23 图3-8‘七月鲜’中显著差异基因参与的脂肪酸合成途径Fig.3-8Fattyacidsynthesispathwayinvolvedinthesignificantdifferenceofgenesin‘QiYueXian’3.4‘蜂蜜罐’枣果实基因组中抗病基因组织表达特异性分析我们从抗病材料‘蜂蜜罐’中的差异基因中筛选抗病相关基因，包括扩展蛋白（expansin-A1）、GMP合酶（GMPsynthase)、水通道蛋白（AquaporinNIP3-1）、转录因子MYB21（TranscriptionfactorMYB21）、紫色酸性磷酸酶(Purpleacidphosphatase17)、抗病蛋白RPM1(DiseaseresistanceproteinRPM1)、葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运蛋白2（Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2)、转录因子bHLH30（TranscriptionfactorbHLH30）、氨基酸通透酶(Aminoacidpermease)、蛋白质NRT1/PTRprotein家族(NRT1/PTRFAMILY）、CCCH锌指结构域蛋白(ZincfingerCCCHdomain-containingprotein18)、硫酸盐转运蛋白（Sulfatetransporter3.3)、锌转运蛋白（Zinctransporter1），其中GMP合酶（GMPsynthase)，转录因子bHLH30（TranscriptionfactorbHLH30），葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运蛋白2（Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2)，紫色酸性磷酸酶(Purpleacidphosphatase17)，CCCH锌指结构域蛋白（ZincfingerCCCHdomain-containingprotein18)，锌转运蛋白（Zinctransporter1）在样品‘七月鲜’中也同时上调表达。采用实时荧光定量RT-PCR对枣果实的这些抗病进行下一步的验证，发掘参与抗病反应的时间及在抗病和感病材料中的差异表达情况。24 3.4.1实时荧光定量的验证通过相对实时荧光定量检测其表达分析如图（3-9）所示，总的来看，选取的13个基因实时荧光定量检测结果和Illumina测序结果趋势总体上一致，但两者之间的差异基因表达倍数存在偏差，原因可能是Illumina测序技术较Q-PCR分析的灵敏度高(HoenPAetaj.2008)，由此认为Illumina测序结果比较可靠。图3-9Illumina测序结果qRT-PCR分析验证Fig.3-9ThereliabilitydemonstrationofthedifferentialexpressedgeneusingqRT-PCR3.4.2枣抗缩果病相关基因的qRealTime-PCR分析结果为了进一步研究和验证‘蜂蜜罐’枣果实中差异表达的相关抗病基因在接种A.altrenata的0-5d之间具体变化情况，我们挑选出13个与抗病相关差异表达的基因（GMPsynthase、TranscriptionfactorMYB21、Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2、Expansin-A1、Purpleacidphosphatase17、TranscriptionfactorbHLH30、Aminoacidpermease、ZincfingerCCCHdomain-containingprotein、Zinctransporter1、Sulfatetransporter、DiseaseresistanceproteinRPM1、AquaporinNIP3-1、ProteinNRT1/PTRFAMILY5.1），通过相对实时荧光定量分析在时间上的表达模式。如图3-10所示，GMPsynthase、Expansin-A1、Sulfatetransporter、DiseaseresistanceproteinRPM1、ZincfingerCCCHdomain-containingprotein基因在不同接种时间下表达量均先上调然后在下调，且均在抗缩果病病株系表达量高于感病株系；25 RRSaD1.61.6aaa1.41.4ab1.2a1.2b1.01.0e0.8c0.8cdb0.6de0.6bcedbcRelativeexpression0.4dede0.4bbRelativeexpression0.2edcc0.2c0.00.012345671234567ARDSR1.4aS2.0a1.21.81.61.0a1.40.81.21.00.6b0.8ca0.40.6bbRelativeexpressiondcdcRelativeexpressionbcbbcded0.4bcb0.2eecee0.2ccccc0.00.012345671234567JHRS2.5a2.0ba1.5ca1.0ccbddRelativeexpression0.5eeff0.01234567K图3-10不同接种时间下抗病相关基因在抗、感缩果病枣果实中的qRT-PCR分析Fig.3-11qRT-PCRanalysisofdisease-realatedgenesondifferenttimeafterinoculationinresistantandsuspectivejujube（1:0h;2:0.5d;3:1d;4:2d;5:3d;6:4d;7:5;A:GMPsynthaseB:transcriptionfactorMYB21;D:expansin-A1;G:Aminoacidpermease;H:zincfingerCCCHdomain-containingprotein;;K:diseaseresistanceproteinRPM1;TranscriptionfactorMYB21在0-1d时，在抗病株系中的表达量高于感病株系，并在第3d时表达量达到峰值，而在感病植株中到第4d时表达量达到最高；26 RSa1.6a1.41.2b1.00.8cb0.6cdddRelativeexpressiondcd0.40.2ee0.01234567B图3-11不同接种时间下TranscriptionfactorMYB21在抗、感缩果病枣果实中的qRT-PCR分析Fig.3-11qRT-PCRanalysisofTranscriptionfactorMYB21ondifferenttimeafterinoculationinresistantandsuspectivejujube在感病植株中Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2的表达量先上升后下降，在第2d是达到峰值；Purpleacidphosphatase17的表达量在第3d达到最高且之后表达量均高于抗病植株；RR1.6SaSa2.4a1.42.2b2.0b1.21.8b1.01.6c1.40.8ac1.2ccb1.00.6cbc0.8bdRelativeexpression0.4ddd0.6ccRelativeexpressioncddd0.4ede0.2e0.2e0.00.012345671234567CE图3-12不同接种时间下抗病相关基因在抗、感缩果病枣果实中的qRT-PCR分析Fig.3-12qRT-PCRanalysisofdisease-realatedgenesondifferenttimeafterinoculationinresistantandsuspectivejujube(C:Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2;E:Purpleacidphosphatase17)27 TranscriptionfactorbHLH30、ProteinNRT1/PTRFAMILY5.1随着时间的延伸表达量逐渐升高，TranscriptionfactorbHLH30、ProteinNRT1/PTRFAMILY5.1在感病植株中则呈先上升后下降的趋势;RR4.0S2.5Saa3.5a2.0b3.0cd2.5ab1.5b2.0bccc1.51.0ce1.0dcdcdedRelativeexpressioncdRelativeexpression0.50.5dfeedef0.00.012345671234567FM图3-13不同接种时间下抗病相关基因在抗、感缩果病枣果实中的qRT-PCR分析Fig.3-13qRT-PCRanalysisofdisease-realatedgenesondifferenttimeafterinoculationinresistantandsuspectivejujube(F:transcriptionfactorbHLH30;M:proteinNRT1/PTRFAMILY5.1)RR5.0S1.6Saa4.51.4aaa4.01.23.51.03.02.50.82.0bbab0.6bbababab1.5abccdcdc0.4ccRelativeexpression1.0cRelativeexpressioncccdcd0.50.20.00.012345671234567GIRS1.8aa1.6bb1.41.21.0cccd0.8decdd0.6eeRelativeexpression0.40.2ff0.01234567L图3-14不同接种时间下个抗病相关基因在抗、感缩果病枣果实中的qRT-PCR分析Fig.3-14qRT-PCRanalysisof13disease-realatedgenesondifferenttimeafterinoculationinresistantandsuspectivejujube（G:Aminoacidpermease;I:zinctransporter1;J:sulfatetransporter;L:aquaporinNIP3-1;）28 3.5讨论在‘蜂蜜罐’显著差异基因中，硫酸盐转运蛋白（sulfatetransporter3.3），GAM合成酶（GMPsynthase），扩展蛋白（Expansin-A1），氨基酸通透酶（Aminoacidpermease），CCCH锌指结构域蛋白（ZincfingerCCCHdomain-containingprotein18），抗病蛋白（DiseaseresistanceproteinRPM1），蛋白质NRT1/PTR家族（ProteinNRT1/PTRFAMILY5.1）基因表达上调，而在‘七月鲜’中下调表达，而其他基因比如钙结合蛋白(calcium-bindingprotein)，叶绿素a-b结合蛋（Chlorophylla-bbindingprotein）赤霉素2-β-双加氧酶（Gibberellin2-beta-dioxygenase8）等基因在‘蜂蜜罐’中明显表达上调，在‘七月鲜’的差异表达基因中未出现，说明细交链孢菌诱导下这些基因参与了枣对病原菌的防御反应，并且在抗病株系中表现突出。转录因子MYB21（transcriptionfactorMYB21），葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运蛋白（Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2），紫色酸性磷酸酶17（Purpleacidphosphatase17），锌转运蛋白1（Zinctransporter1），水通道蛋白NIP3-1(AquaporinNIP3-1)等基因在两个品种均表达上调，说明这些基因参与了细交链孢菌诱导下枣果实的应答机制。而实时荧光定量结果显示，抗病品种和感并株系筛选的13个基因随着接种时间的延长，其表达方式各不相同，这种不同可能导致了枣果对缩果病抗病和感病的差异，表达量的不同说明它们很可能参与了枣果对缩果病的防御机制。以扩展蛋白为例，植物遭受病原菌侵染时,其细胞壁结构发生变化以阻止或限制病原菌侵染及传播(徐筱等2010)。果实对病原菌的敏感性随着成熟程度而逐渐增加，成熟果实防御病原菌的能力相对于未成熟的果实较弱。在果实成熟过程中，细胞壁多聚糖网络结构的重新排列会影响植物对病原菌的感应。扩展蛋白作为细胞壁松弛剂也参与了植物对生物胁迫的响应过程，通过调控扩展蛋白基因的表达进行抗病的过程，不依赖传统的水杨酸和茉莉酸的信号传导途径而起作用，可能会提高植物抵抗病原菌的能力（Cantuetal.2009）。植物激素是植物体自身产生的一类有机物质，在植物抗病反应中，起着重要的调控作用。生长素类(Auxins)、赤霉素类(Gibberenllins，GA)、细胞分裂素类(Cytokinins，CK)、乙烯(Ethylene)、脱落酸(Abscisicacid，ABA)、油菜素甾醇类(Brassinosteroids，BRs)被公认为植物的六大类内源激素。此外，近年来相关研究表明，茉莉酸(Jasmonicacid，JAS)、水杨酸类(Salicylates，SA)等也是诱导植物产生防御反应的主要信号分子(VlotAC,2009)。水杨酸(salicylicacid,SA)是植物体内的一类内源酚类化合物，参与植物多种代谢调控过程，是植物防御病原菌侵染过程中的重要参与者，受到侵染的植物，SA水平升高从而诱导产生过敏性反应（Hypersensitiveresponse，HR）及系统获得性抗性（Systemicacquiredresistance，SAR）（DurnerJetal.1997）。SA介导的抗病信号转导途径受多个29 基因的调控，NPR1是SAR信号转导途径中作用于SA下游的关键性基因，NPR1通过与转录因子TGA互作来激活一系列SAR基因的表达，最终使植物产生抗病性（MouZetal.2003）。研究表明，NPR1基因在植物抗病性获得过程中参与不同抗病途径，不仅在SA介导的SAR，而且在JA介导的ISR产生中起重要调控作用，茉莉酸(Jasmonicacid，JA)是广泛存在植物体内的信号分子，是调节植物的生长发育的重要化合物，在植物受到病原菌侵染时，JAs生物合成相关基因上调表达，从而介导植物的防御反应。TIFY基因在茉莉酸（JA）信号传导途径，植物生长发育和病原体应答中发挥重要作用（ZhuDetal.2014）。ETR1是乙烯受体家族的一种，具有组氨酸激酶活性。CTR1是在乙烯信号转导通路中起负调控作用的因子（张存立等2012）。EIN3是植物所特有的核蛋白，在细胞核内的乙烯信号转导的下游起关键作用，是乙烯反应的正调节因子（ChaoQet.al.1997）。TCH4是一类木葡聚糖内糖基转移酶（xyloglucanendotransglycosylase，XET），通过催化木葡聚糖分子的水解与重连而介导植物细胞壁的松弛和重建，研究表明，XET能够响应多种外界环境的刺激（陆旺金等2004）。Aux/IAA是一个转录抑制因子，包含4个保守结构域。生长素浓度较低时，游离的Aux/IAA与生长素响应因子(auxinresponsefactor,ARF)形成异源二聚体，抑制生长素响应基因的表达；当生长素浓度升高时，生长素就会与生长素受体转运抑制因子1(transportinhibitorresponse1/auxin-bindingF-boxprotein,TIR1/AFB)蛋白结合，引起Aux/IAA泛素化而被降解，释放出ARF，从而促进生长素响应基因的表达(OkushimaYetal.2005；KalluriUCetal.2007)。GH3基因家族编码一类酰酸酰胺合成酶，能促使氨基酸与IAA、茉莉酸(jasmonicacid,JA)和水杨酸(salicylicacid,SA)结合，改变它们在细胞内的生物活性形式的浓度，从而调控植物的生长、发育和防御反应(ParkJEetal.2007)。SAUR基因家族是植物特有的，是生长素响应因子中最大的一个家族，能够在生长素诱导的早期做出响应(YangTetal.2000)。PYR/PYL/RCAR分布于细胞质和核内，是ABA的受体蛋白。PYR/PYL/RCAR处于ABA信号通路的上游，具有识别ABA信号和启动信号转导原初过程的功能(张大鹏，2011）。PP2C是一类重要的丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶，PP2C类蛋白磷酸酶具有独特的结构模式：在蛋白质的N端或C端的催化区域有11个保守的结构亚区（BorkPetai.1996），而这些保守的区域与细胞内的信号转导有关。大量研究表明，PP2C是ABA信号转导途径中关键的负性调节因子(PullenKEetal.2004)。SnRK是广泛存在于植物体内的一类丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)类蛋白激酶，分为SnRK1、SnRK2和SnRK33个亚家族，其中SnRK2是植物体特有的一类Ser/Thr类蛋白激酶，并且SnRK2-AREB/ABF调控通路被认为在植物通过ABA响应非生物胁迫中起到至关重要的作用（FujitaYetal.2009）。ABA参与调控植物生长发育的各个阶段，是植物中最为重要的激素之一。作为“逆境激素”，ABA在植物应对各种环境胁迫过程中也发挥着30 关键作用。研究表明PYR/PYL/RCAR能特异结合ABA，并可正向调节ABA信号传导途径，引起植物体内ABA的生理响应。WRKY33还可参与植物抵御真菌的反应，WRKY33突变体增加了对真菌的敏感性并降低了茉莉酸调控的植物防卫蛋白基因(Plantdefensin,PDF1.2)表达，而高表达WRKY33则提高了植株的真菌抗病能力(ZhengZetal.2006)。在谷胱甘肽合成途径中，GST是一类多变的蛋白质家族，是GSH代谢途径最重要的酶之一，在维持植物代谢、参与信号传导等方面起着重要作用(EdwardsRetal.2000；WagnerUetal.2002)，而且GST表达的增强已经被认为是植物对胁迫响应的重要标志之一（EdwardsRetal.2000）。在类黄酮合成途径中，查尔酮异构酶（Chalconeisomerase,CHI）催化查尔酮形成柚皮素，作为重要的代谢产物进入下游合成途径，形成各种黄酮类化合物。查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS）是类黄酮合成途径早期的关键酶，CHS基因的特殊结构及功能基团，影响黄酮，异黄酮等的合成，从而影响植物的生理过程，在植物防御外界胁迫，生长素的运输等方面起重要作用；黄酮醇合成酶（Flavonolsynthase,FLS）是类黄酮合成途径的直接调控酶，是类黄酮合成代谢途径的关键基因。黄酮醇还原酶(Dihydroflavonolreductase,DFR)是在类黄酮合成途径较后阶段的关键酶。31 第四章结论本研究通过利用转录组测序技术研究抗感品种‘蜂蜜罐’、‘七月仙’在细交链孢菌侵染后及其清水处理对照间的转录组差异，经序列组装和基因注释，获得了大量的差异表达Unigene序列及其生物学通路从转录组水平总体研究枣抗病机制，同时发现与枣缩果病抗性相关的重要基因及生物学通路，这对于抗病相关基因的分离及利用基因工程技术对枣果实进行遗传改良具有重要意义。测序结果极大丰富了枣转录组数据资源，方便进一步探讨枣抗病的分子机理，是筛选和克隆抗病基因等后续研究的基础工作。4.1枣果实抗感缩果病转录组分析利用IIIuminaHiSeqTM2000双端测序，进行Denovo组装和数据分析方法，R1、R2、S1、S2这4个样本中分别获得了50676507、51136789、49090715和49752767条原始数据，利用Cutadapt（version1.9.1）软件对低质量数据进行过滤及去除污染和接头序列，分别筛选出48676507、49136789、47090715及47752767条高质量序列。4.2通过转录组测序获得的差异基因（1）通过转录组测序并利用DESeq2软件进行差异基因分析，以FDR<0.05和∣≧log2FC2∣进行显著差异基因的筛选，发现样品R1VSR2差异基上调表达基因39个，下调表达基因8个。S1-VS-S2的上调表达基因1754个，下调表达基因603个。这些差异基因在植物受到病原菌侵染的过程中起着关键的调节作用。（2）对显著差异表达的转录本进行GO功能的富集分析发现，‘蜂蜜罐’抗枣缩果病（R1vsR2）显著差异表达转录组中转录本被显著富集到9个terms，其中在biologicalprocess最富集的是localization，Cellularcomponent中最富集的是cellpar，而在molecularfunction中的差异表达基因最富集在binding。在‘七月仙’感缩果病病（S1vsS2）转录组中显著差异表达的转录本被富集到31个terms，其中biologicalprocess最富集的是metabolicprocess，Cellularcomponent中最富集的是cellpar，在molecularfunction中的显著差异表达基因最富集在catalyticactivity。（3）在A.altrenata侵染‘七月仙’的代谢途径中分析发现，可以通过谷胱甘肽代谢，脂肪酸合成与代谢途径，类黄酮合成，半胱氨酸和蛋氨酸代谢，JA信号，油菜素甾醇（BRs），水杨酸信号，乙烯，等途径中关键基因的表达调控来抵御病原菌的侵染。（4）在A.altrenata侵染抗病材料‘蜂蜜罐’中的显著差异基因中包括扩展蛋白（expansin-A1）、GMP合酶（GMPsynthase)、水通道蛋白（AquaporinNIP3-1）、转录32 因子MYB21（TranscriptionfactorMYB21）、紫色酸性磷酸酶(Purpleacidphosphatase17)、抗病蛋白RPM1(diseaseresistanceproteinRPM1)、葡萄糖-6-磷酸/磷酸转运蛋白2（Glucose-6-phosphate/phosphatetranslocator2)、转录因子bHLH30（TranscriptionfactorbHLH30）、氨基酸通透酶(Aminoacidpermease)、CCCH锌指结构域蛋白(ZincfingerCCCHdomain-containingprotein18)、硫酸盐转运蛋白（Sulfatetransporter3.3)、锌转运蛋白（Zinctransporter1）等抗病基因。这些与抗枣缩果病相关的基因进行不同接种时间下实时荧光定量分析，结果发现在高抗病植株和感病植株中这13个基因随着接种时间的延长，其表达方式各不相同，这种不同可能导致了枣对缩果病抗病和感病的差异。33 参考文献陈谟林，马元忠，李占林.1996.枣缩果病发病过程及流行规律.河南科技，(4):11-12陈贻金，陈谟林，朱林元.1989.枣缩果病及其防治技术研究.林业科技通讯，(8):1-5崔胜兵.2009.枣缩果病防治技术.河北林业，(3):25-25陈全助.2013.福建桉树焦枯病菌鉴定及其诱导下桉树转录组和蛋白组学研究.[博士学位论文].福州:福建农林大学戴忠仁.2015.黄瓜耐冷生理变化规律及相关基因转录组测序和表达分析.[博士学位论文].黑龙江：东北农业大学费元，韩雪，余红，庞基良.2015.大岩桐花萼和幼叶转录组研究.园艺学报，12：2519-2525韩党悦.2012.枣缩果病初侵染病原及防治研究.[硕士学位论文].保定:河北农业大学韩金声.1979.北方果树病害及其防治.天津:天津科学技术出版社贾亚丁，胡春哲，柴东岩.2008.枣缩果病防治新观点.河北林业，(3):71-71康绍兰，邸垫平，李兴红，彭士珙，毛永民，周俊义.1998.枣铁皮病病原鉴定.植物病理学报，44(02):70-76康绍兰，李兴红，邸垫平.1997.枣铁皮病发病规律的研究.河北农业大学学报，20:15-19李京涛，陈素珍，王海臣.2004.枣缩果病的防治药效对比试验.河北林业科技，(4):10李新岗.2015.中国枣产业.北京：中国林业出版社李志清，常聚普，乔趁峰.1997.枣黑腐病发病规律研究.果树科学，14(4):252-256刘春国，洪亮，雷祖禄，林丽飞，江茜，周萍.2011.红河地区枣树主要病害种类调查.宁夏农林科技，5（7）:32-33刘惠娟，刘随存，刘贤谦.2007.枣缩果病与果实生理指标关系的研究.山西林业科技，(1):19-21刘孟军.2009.汪民中国枣种质资源.北京:中国林业出版社，12:23刘元荣，朱林元，姜昆.1988.枣树新病害缩果病防治研究.河南农业科学，(10):19-22.陆旺金，中野隆平，久保康隆.2004.香蕉果实XETcDNA的克隆及其在成熟软化的果实果皮和果肉中的表达分析.植物学报(英文版)，46(3):355-362路文静.2011.植物生理学.北京:中国林业出版社罗军，贺伟，况红玲.2009.枣果实病害侵染与发病时期的研究.生态科学，28(2):158-163罗学平.2003.枣缩果病防治试验初报.落叶果树，(6):51-52曲俭绪，沈瑞祥，李志清，常聚普.1992.枣黑腐病病原研究.森林病虫通讯，11(02):1-4曲晓晨.2007.太谷枣区枣缩果危害及发病规律调查.山西林业，(3):38-39宋宏伟，宋小菊，刘俊磊.1999.12种杀菌剂防治枣缩果病田间药效试验报告.河南林业科技，19(3):9-11宋韬亮，王文江，刘孟军.2013.枣缩果病研究进展.全国干果生产、科研进展学术研讨会田昕.2012.不同枣树品种果实结构和酶活性与缩果病抗性关系分析.[硕士学位论文].北京：北京林业大学王丽丽.2011.枣缩果病的病害生理研究.[硕士学位论文].河北：河北农业大学王叶.2013.枣果实病原真菌的鉴定及链格孢属病原真菌多样性研究.[硕士学位论文].河南：河南农业大学34 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致谢站在人生十字路口，即将毕业，告别学生时代。三年的时光，给人以知识和智慧，也让人收获经历与成熟。我从迷茫焦躁，开始变得坚定从容。三年的研究生阶段是我重要的人生经历。遇见的人，经历的事，做过的报告，写下的论文，读过的书，等等等等，都让我收获满囊。在这里，我不仅学到了安身立命的技能，也塑造了人生观、世界观和价值观。非常庆幸能够接触到这么多卓越的大师、前辈和同龄者，身在其中，高山仰止，越是感觉自己学识太浅，要走的路还很长。在此，特别感谢我的老师、家人、朋友们的关心和帮助，向你们说声：谢谢！我谨在毕业论文完成之际，衷心感谢我的导师宋晓斌研究员，宋老师为人和蔼，无论在学术上还是生活上，导师严谨的治学态度、宽容大度的育人方式和执着精到的方方面面，为我树立了一辈子学习的典范。他的谆谆教诲，激励着学生不断思索、行动和表达，其独特的人格魅力影响着我和我身边的每一个人，我很荣幸能成为老师的学生，蒙受老师的教诲。在此，我谨向尊敬的宋老师致以深深的敬意！同时感谢黄建老师在课题的选题、研究思路的确定以及论文的撰写方面给提供的帮助，感谢司机师傅张俊在采样过程中给予的帮助。感谢杨慧欣师姐在我的实验过程中给予精心的指导，在最初的实验设计方面给了我很大的帮助，友善热情，有问必答，让我在科研路上能够顺利前行。感谢李天凤与我探讨论文中的诸多细节，与之讨论，常让我自惭形秽。有些时候不得不承认，有些人比你更聪明，也更努力。感谢杨静在采样的时候给与我的帮助和鼓励。感谢室友在生活中带来的欢乐，和谐愉快的氛围让三年的硕士生涯轻松而又短暂，由时间铸就的友谊也愈发宝贵，愿一生健康幸福。当然，最重要的还要感谢我的父母和亲人。他们一直默默的站在背后，含辛茹苦，给我以精神和经济上的支持，好让我能心无旁骛的完成学业。学生生涯的终结，它不仅仅是一个结束，也是责任的开始。愿父母身体健康，万事顺心。还要感谢这些年来生命中遇到的那些人和经历那些事，正是这些故事让我成长、成熟。即将工作，学术钻研之路就此中止，曾一度质疑铺在眼前的就是一条平凡之路了。“逝者如斯夫，不舍昼夜”。成长亦复如是，不断的和自己告别，和过去告别，和时间告别。相会是缘，同行是乐，共事是福。愿追求“卓越”之心不被世俗琐事所消磨，愿"梦想"不因时间而褪色。再见，三年的时光。再见，我的学生生涯。然后，去经历更大的世界。38 作者简介焦小利，女，汉族，河南焦作人，出生于1992年2月。2010年考入河南农业大学质植物保护学院。2014年获得农学学位；2015年考入西北农林科技大学森林保护专业，师从宋晓斌研究员，从事枣病害综合研究治理工作。在读期间发表的论文：焦小利,杨卉芯,宋晓斌.应用抑制性差减杂交技术研究枣缩果病病程相关基因[J].果树学报,2017(12):1520-1526.39