吴茱萸碱抑制HDACs促进人白血病K562细胞凋亡的机制研究

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分类号：R733.7UDC：密级：重庆医科大学硕士学位论文吴茱萸碱抑制HDACs促进人白血病K562细胞凋论文题目亡的机制研究作者姓名袁龙指导教师姓名（职称、单位名称）陈地龙研究员重庆医科大学基础医学院李静副教授重庆医科大学基础医学院申请学位级别硕士学科、专业名称人体解剖与组织胚胎学论文答辩年月2016年5月2016年5月 目录符号说明..........................................................................................................................1中文摘要..........................................................................................................................2英文摘要..........................................................................................................................5论文正文：吴茱萸碱抑制HDACs促进人白血病K562细胞凋亡的机制研究.......9前言..........................................................................................................................9第一部分吴茱萸碱抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的实验研究........................111材料与方法.........................................................................................................112实验结果.............................................................................................................143讨论....................................................................................................................18小结........................................................................................................................20第一部分图片........................................................................................................21第二部分吴茱萸碱对K562细胞中HDACs的调控...............................................241材料与方法........................................................................................................242实验结果............................................................................................................263讨论....................................................................................................................29小结........................................................................................................................31第二部分图片........................................................................................................32全文总结........................................................................................................................34参考文献........................................................................................................................35文献综述：组蛋白去乙酰化酶抑制剂在白血病治疗中的应用................................40致谢........................................................................................................................48攻读硕士学位期间发表的论文....................................................................................49 重庆医科大学硕士研究生学位论文符号说明英文缩写英文全称中文全称CCK-8Cellcountingkit-8细胞增殖毒性检测试剂盒CDKCyclindependentkinase细胞周期蛋白依赖激酶DMSODimethlysulfoxide二甲基亚砜EvoEvodiamine吴茱萸碱ECLEnhancedchemiluminescence增强型化学发光试剂盒ERKExtracellularsignal-regulatedkinase细胞外信号调节激酶FBSFetalbovineserum胎牛血清FCMFlowcytometry流式细胞术JNKc-junN-terminalkinasec-jun氨基末端激酶HATsHistoneacetyltransferases组蛋白乙酰化酶HDACsHistonedeacetylases组蛋白去乙酰化酶HDACihistonedeacetylaseinhibitor组蛋白去乙酰化酶抑制剂IC50Halfinhibitorycontentration半数抑制浓度MAPKMitogen-activatedproteinkinase丝裂原蛋白激活蛋白激酶KDKilodalton千道尔顿PVDFPolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯PIPropidiumiodide碘化丙啶PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液p38p38mitogen-activedproteinkinasep38丝裂原蛋白激活蛋白PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠1 重庆医科大学硕士研究生学位论文吴茱萸碱抑制HDACs促进人白血病K562细胞凋亡的机制研究摘要白血病是一种造血干细胞性克隆性疾病，近年来，白血病已经占据了我国肿瘤性疾病的第六位。白血病和其他肿瘤一样，具有异常分化、增殖不受限制和凋亡失常等特点。现在临床上有多种治疗方法，除了放射性治疗、化学性治疗，还有靶向性治疗、干细胞治疗等，但是目前的治疗方法都有各自的优缺点。近年来，传统中药以及其有效成分的抗肿瘤活性得到越来越多人的关注。吴茱萸碱（evodiamine,Evo）是从中药吴茱萸中提取出来的有效成分之一，具有降血压、降血糖、镇痛、减肥和抗肿瘤等多种生物学效应。研究报道显示，组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases,HDACs）的异常激活和表达与肿瘤的发生发展有着十分密切的关系，HDACs作为癌症治疗的靶点已经引起了众多科研人员的关注。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor,HDACi)作为新型的抗肿瘤药物，部分已经用于临床治疗。我们提出假设：Evo的抗肿瘤效应可能和HDACs有关联。本研究以人红白血病K562细胞作为实验对象，探讨Evo对K562基金项目：国家自然科学基金资助项目（NO.31271368）2 重庆医科大学硕士研究生学位论文细胞增殖和凋亡的影响，以及Evo对K562细胞的表观遗传修饰作用，为中药的临床应用提供实验依据。目的研究Evo对人红白血病K562细胞增殖与凋亡以及组蛋白乙酰化的影响，并探究在K562细胞中HDACs的改变与细胞凋亡的关系。方法体外培养人红白血病K562细胞株，分别加入Evo1，2，4，8，16µmol/L继续培养24，48和72h，CCK-8法检测Evo对K562细胞的增殖抑制作用；倒置显微镜下观察Evo对K562细胞生长的影响；流式细胞术检测Evo对K562细胞周期和凋亡的影响；化学比色法检测K562细胞内组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的活性；Westernblot检测K562细胞周期相关蛋白、凋亡执行蛋白、组蛋白去乙酰化酶以及其下游信号通路中主要蛋白分子的表达。结果1.CCK-8结果显示：吴茱萸碱对K562细胞的增殖具有十分明显的抑制作用；吴茱萸碱在1～16µmol/L浓度范围内，其抑制作用呈现浓度依赖性，并且随着时间的延长，吴茱萸碱的抑制作用逐渐增加（72h内）。2.倒置显微镜下可见对照组K562细胞生长状况良好，而加入吴茱萸碱诱导48h后，K562细胞的数量明显减少。3 重庆医科大学硕士研究生学位论文3.流式细胞术结果显示：吴茱萸碱可将K562细胞阻滞在G0/G1期；2、4、8μmol/L吴茱萸碱诱导K562细胞48h后，其凋亡率从空白对照组的（2.79±1.01）%分别增加至（11.47±1.05）%、（12.77±0.79）%和（18.58±1.37）%，差异具有明显统计学意义（P＜0.01）。4.化学比色法结果显示：吴茱萸碱可以降低K562细胞HDACs的活性，提高HATs的活性。5.Westernblot结果显示：吴茱萸碱可以提高K562细胞中组蛋白H3的乙酰化水平。吴茱萸碱作用K562细胞后，Bcl-2、CDK4、CyclinD1、HDAC1-3、HDAC6、JNK、p-ERK蛋白的表达下调，Bax、Caspase-3（激活型）、p21、p16、p-p38、p38、p-JNK蛋白的表达上调，而ERK蛋白表达无明显变化（P>0.05）。结论1.吴茱萸碱可以明显抑制K562细胞的生长与增殖，且其抑制作用呈时间和浓度依赖性。2.吴茱萸碱可以通过调控周期相关蛋白的表达，将K562细胞阻滞在G0/G1期。3.吴茱萸碱能诱导K562细胞组蛋白乙酰化水平的提高，并通过激活HDACs下游信号通路来影响细胞的增殖和凋亡。关键词：吴茱萸碱，K562细胞，凋亡，组蛋白去乙酰化酶，组蛋白去乙酰化酶抑制剂4 重庆医科大学硕士研究生学位论文MECHANISMOFEVODIAMINEINDUCESAPOPTOSISTHROUGHTHEINHIBITIONOFHISTONEDEACETYLASESINHUMANERYTHROLEUKEMIAK562CELLSABSTRACTLeukemiaisamalignantclonaldisorderofthehematopoieticstemcells,whichrankedthesixthplaceofvarietiestumorsinChina.Justasothertumors,leukemiaischaracterizedbyuncontrolledproliferationofhematopoieticcells,maturationblockedandtheunnormalprocessofapoptosis.Currently,therearevariousmethodsforthetreatmentofleukemia,suchasradiationtherapy,chemotherapy,targetedtherapy,immunotherapy,andstemcellstransplantation.However,thereareadvantagesanddisadvantagesincurrenttreatmentmethods.Inrecentyears,traditionalChinesemedicineaswellasitsactiveingredientwhichhavebeenintheanti-tumoractivityofgrowingconcern.Evodiamine(Evo)whichextractingfromEvodiamedicinehasmanyfunctions,suchasanti-hypertension,hypoglycemic,analgesia,slimming,anti-tumorandsoon.Researchreportsindicatedthathistonedeacetylases(HDACs)hada5 重庆医科大学硕士研究生学位论文verycloserelationshipwiththedevelopmentoftumoraswellastheoccurrenceofabnormalactivationofexpression.ManyresearchersbelievedthatHDACswasatargetforthecancertherapy.Histonedeacetylaseinhibitors(HDACi)wereregardedasanovelanti-cancerdrugsandhadbeenusedinclinicaltreatment.Weassumethattheanti-tumoreffectofEvomaybeassociatedwithHDACs.Inthisstudy,humanleukemiaK562cellswereusedasexperimentalsubjectstoinvestigatetheeffectofEvoonproliferationapoptosisandepigeneticmodificationinK562cells,expectlytoprovideexperimentalevidencefortheclinicalapplicationoftraditionalChinesemedicine.ObjectiveToinvestigatetheeffectsofEvoontheproliferationinhibition,apoptosis,epigeneticmodificationofhumanerthroleukemiacelllineK562andtoexploretheeffectsofEvoonhistoneacetylationofK562cellsfromtheaspectsofepigeneticmodificationandtheregulatorymechanisms.MethodsEvo(1，2，4，8，16µmol/L)inducedhumanleukemiaK562cellsline24h,48h,and72hrespectivelyinvitro.TheactivityofK562cellswasdetectedbyCCK-8assay;thegrowthofK562cellswasobservedby6 重庆医科大学硕士研究生学位论文opticalmicroscopic;thechangesofcellcycledistributionandapoptosiswereexaminedbyflowcytometry;chemicalcolorimetryassaywasusedtoexaminetheactivityofhistonemodificationenzymesinK562;thechangesofhistoneacetylationlevel,expressionsofhistonedeacetylaseproteinandthekeyenzymesonsignalingpathway,whichisassociatedwithHDACs,wereexaminedbywesternblotanalysis.Results1.EvocouldeffectivelyinhibittheproliferationofK562cells,whichexhibitsadose-dependentmannerattherangeof1~16μmol/L.Besides,withtheextensionoftime,theinhibitionofEvoweregraduallyincreased(within72h).2.Morphologicalobservationunderinvertedmicroscope:ThegrowthofK562cellswasgoodinthecontrolgroup,butthenumberofK562cellsweresignificantlyreducedafterinducedbyEvo(2,4,8μmol/L).3.TheresultsofflowcytometryindicatedthatEvocouldarrestK562cellsinG0/G1phase.TheapoptosisrateofK562cellswere(11.47±1.05)%,(12.77±0.79)%and(18.58±1.37)%afterinducedby2,4,8μmol/LEvo,whichshowedstatisticallysignificantdifference(P＜0.01)comparedwiththecontrolgroup(2.79±1.0)%.4.ChemicalcolorimetryassayshowedthatEvocouldreducetheactivityofHDACsinK562cellsandimproveHATs’activity.7 重庆医科大学硕士研究生学位论文5.WesternblotassayindicactedthatEvocouldenhancetheacetylationlevelsofhistoneH3inK562cells.TheexpressionsofBcl-2,CyclinD1,CDK4,HDAC1-3,HDAC6,JNKandp-ERKproteinsweredecreasedinadose-dependentmannerafterinducedbyEvo.However,theexpressionsofBax,Caspase-3(activationtype),p21,p16,p-p38,p38andp-JNKproteinswereincreased.But,theexpressionofERKproteinhadnosignificantdifference(P>0.05).Conclusion1.EvodiaminecouldeffectivelyinhibittheGrowthandproliferationofK562cellsinadose-andtime-dependentmannerinvitro.2.EvodiaminecouldinducecellcyclearrestinG0/G1phasethroughregulatingtheexpressionofcyclinproteins.3.EvodiaminecouldincreasethelevelsofhistoneacetylationandactivateHDACs,andthroughactivatingtheHDACs’downstreamsignalingpathwaystoinfluencetheproliferationandapoptosisofK562cells.Keywords:K562cells,evodiamine,apoptosis,histonedeacetylase,histonedeacetylaseinhibitors8 重庆医科大学硕士研究生学位论文吴茱萸碱抑制HDACs促进人白血病K562细胞凋亡的机制研究前言吴茱萸碱（evodiamine,Evo）是从吴茱萸中提取出的生物碱之一，具有降血[1]压、降血糖、镇痛、减肥和抗肿瘤等多种生物学作用。大量研究证实，Evo具有广泛且较强的抗肿瘤活性，包括阻滞周期、诱导分化和凋亡等等，而且Evo抗[2]肿瘤作用涉及到多条信号通路的参与和激活。已有文献报道，Evo可以明显抑制人宫颈癌HeLa、人前列腺癌pc-3、人黑色素瘤A375-S2、LNCaP等细胞系的[3-7]生长和诱导细胞凋亡。那么，Evo对白血病细胞的作用又如何呢？目前国内外的报道还比较少。[8]表观遗传学是由Waddington在1942年提出的概念，后经HolidayR等人不断的补充完善，提出系统性论断，即表观遗传学是指在生物体基因型未改变的情[9]况下基因表型发生变化，并且改变了的基因表型还可以稳定遗传。表观遗传学的内容首先是调控基因选择性转录，包括组蛋白共价修饰、组蛋白甲基化、染色体重塑等；其次是基因转录后的调控，包括基因组的miRNA、非编码RNA以及内含子等。染色体具有遗传性，其基本结构单位是核小体，核小体之间以DNA（长约40～60bp）连接，并与组蛋白H1结合，每个核小体是由一个八聚体的组蛋白以及缠绕其上1.75圈的DNA（长约146bp）组成，八聚体中的组蛋白由两分子的H2A-H2B二聚体、两分子的H3和两分子的H4构成，八聚体的三维结构为球状结构，该结构中有组蛋白亚基的游离氨基酸，称之为组蛋白尾巴。组蛋白尾巴上的残基存在多种共价修饰，不同的共价修饰形成各不相同的信号，类似于密码，各自或共同调控相关蛋白的功能，从而影响基因的表达。有学者把这种生物学调控过程称为“组蛋白密码”学说。简而言之，“组蛋白密码”就是通过共价修饰细胞9 重庆医科大学硕士研究生学位论文[11-12]内的组蛋白，然后调控基因的表达。组蛋白乙酰化是一个可逆的动力学过程，由组蛋白乙酰化酶（histoneacetyltransferases,HATs）和组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases,HDACs)共同协调完成的，HATs和HDACs的动态平衡保证了组蛋白乙酰化的进行，两种酶修饰[13]的部位一般位于组蛋白N端保守的赖氨酸残基上。HATs调控组蛋白的乙酰化，其作用是促使DNA与组蛋白八聚体的紧密缠绕结构解开，导致核小体结构松弛，利于转录因子和DNA特异的调控转录因子相互结合，促进基因转录；而HDACs调控组蛋白的去乙酰化，使组蛋白乙酰化水平降低，结果导致DNA与组蛋白八[14-15]聚体的紧密缠绕更加紧密，抑制基因转录的发生。研究证实，在许多肿瘤中[16-17]已经发现HDACs的过表达。目前观点认为，HATs和HDACs之间的平衡对细胞功能的调控和细胞生长有十分重要的作用，因此HATs和HDACs可能成为包[18]括肿瘤在内的许多疾病的有效治疗靶点。Evo能否对肿瘤细胞的乙酰化修饰产生影响，其抗肿瘤效应与HDACs有无关联呢?目前尚未见报道。本研究以人红白血病K562细胞为实验对象，探讨Evo对K562细胞增殖和凋亡的影响，以及从表观遗传修饰方面研究Evo对白血病细胞的药理作用机理，为Evo的临床用药提供实验依据。10 重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分吴茱萸碱抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的实验研究1材料与方法1.1实验材料1.1.1细胞株人白血病K562细胞株由本校检验系相赠，本实验室储存。培养液使用含10%FBS的RPMI1640完全培养液，培养条件是37℃，5%CO2饱和湿度，一般3天换液一次。1.1.2实验药品取10mg吴茱萸碱（南京泽朗药科技有限公司，纯度=98%）在329.6μlDMSO中充分溶解配制成原液（浓度=100mmol/L），﹣20℃保存。使用时用RPMI1640（含10%FBS）完全培养液稀释成实验要求浓度。1.1.3实验试剂CellCountingKit-8(CCK-8)江苏碧云天生物公司RPMI1640培养基美国Gibco公司SDS-PAGE凝胶配制试剂盒江苏碧云天生物公司5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液江苏碧云天生物公司ECL显色剂、PVDF膜美国Millipore公司胎牛血清（FBS）美国HyClone公司AnnexinV-PI双标凋亡检测试剂盒南京凯基生物公司BCA蛋白浓度测定试剂盒江苏碧云天生物公司甘氨酸、Trisbase、SDS美国Genview公司11 重庆医科大学硕士研究生学位论文兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗体美国Epitomics公司鼠抗人β-actin单克隆抗体江苏碧云天生物公司辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H＋L)江苏碧云天生物公司兔抗人Caspase-3（激活型）多克隆抗体江苏碧云天生物公司辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H＋L)江苏碧云天生物公司1.1.4仪器CO2恒温细胞培养箱美国ThermoForma公司4℃低温高速离心机美国Sigma公司倒置显微镜（HFX-ⅡA)日本Nikcon公司超净工作台苏州第二设备厂制冰机宁波格兰特制冷设备有限公司Westernblot电泳仪美国BIORAD公司纯水仪美国Millipore公司酶标仪（550型）美国BIORAD公司-80℃低温冰箱日本SANYO公司高压消毒锅莱伯泰科有限公司1.2方法1.2.1CCK-8法检测Evo对K562细胞增殖的影响将处于对数生长期的K562细胞种植于96孔板，每孔总体积为200μl，细胞8密度为1×10/L。实验分组：本底对照组，只加入RPMI1640培养液，不加入DMSO和Evo；空白对照（Control）组：加入最大剂量为0.1%的DMSO；药物组：Evo终浓度为(1、2、4、8、16)μmol/L；每组设置5个复孔。37℃、5%CO2饱和湿度下培养12、24、48h后，各组每孔均加入CCK-8工作液（10μl），震荡混匀后12 重庆医科大学硕士研究生学位论文继续培养，2h后用酶标仪（工作波长为450nm）测量吸光度(A)值。并用A值计算出各时间点的半数抑制浓度(halfinhibitoryconcentration,IC50)。公式为：抑制率=(A空白对照组－A实验组)/（A空白对照组－A本底对照组）×100%。1.2.2镜下观察Evo对K562细胞生长情况将处于对数生长期的K562细胞种植于六孔板，每孔总体积为3ml，细胞密8度为1×10/L。实验分组：空白对照（Control）组，加入最大剂量为0.1%的DMSO；药物组：终浓度为8μmol/L的Evo。培养条件为37℃，5%CO2饱和湿度下培养48h。在倒置显微镜下观看细胞生长情况。1.2.3FCM检测Evo对细胞周期和早期凋亡的影响将处于对数生长期的K562细胞种植于六孔板，每孔总体积为3ml，细胞密8度为1×10/L。实验分组：空白对照（Control）组：加入终浓度为0.1%的DMSO；药物组：药物Evo的终浓度为2、4、8μmol/L。条件为37℃，5%CO2饱和湿度下环境培养。48h后收集细胞，进行预处理：预冷PBS(pH7.2，0.01mol/L)洗涤2次，然后加入预冷75％酒精，4℃冰箱静置12h。检测前离心去掉酒精，加入AnnexinV-FITC和碘化丙啶(propidiumiodide，PI)，4℃环境处理30min，然后用流式细胞仪检测细胞周期和细胞早期凋亡。实验重复3次。1.2.4Westernblot检测Evo对K562细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3（激活型）、CyclinD1、CDK4、p16和p21蛋白表达的影响将处于对数生长期的K562细胞种植于六孔板，每孔总体积为3ml，细胞密8度为1×10/L。实验分组：空白对照（Control）组：加入终浓度为0.1%的DMSO；药物组：药物Evo的终浓度为2、4、8μmol/L。条件为37℃，5%CO2饱和湿度下环境培养。48h后收集细胞，预冷PBS(pH7.2，0.01mol/L)漂洗细胞2次，然后提取细胞全蛋白，全蛋白浓度使用BCA法进行检测。每组取50μg蛋白样品进行SDS-PAGE（120g/L）电泳，然后电转至PVDF膜，PVDF膜在封液室温封闭2h。封闭完后分别加入稀释度为1∶1500的Bcl-2、Bax和β-actin抗体，1∶1000稀释的Caspase-3（激活型）、CDK4、p16、CyclinD1和p21，4℃冰箱中静置孵13 重庆医科大学硕士研究生学位论文育12h；用TBST漂洗去掉PVDF膜上的抗体之后，加入稀释度为1∶3000的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔（或抗小鼠）IgG(H+L)，室温孵育2h，之后用TBST洗净，然后用ECL显色剂化学发光显色，图像分析软件QuantityOne分析个目的条带的吸光度值，β-actin作为内参对照。实验重复3次。1.2.5统计学方法SPSS22.0（SPSS公司，美国）用于统计学分析，使用单因素方差分析方法，结果使用x±s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有明显统计学意义。2实验结果2.1吴茱萸碱可以有效抑制K562细胞增殖给予不同Evo（1、2、4、8和16μmol/L）作用K562细胞24h、48h和72h后，K562细胞增殖受到抑制，且呈剂量和时间依赖性。与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图1-1。Evo作用K562细胞24、48和72h的IC50分别为（12.03±0.85）μmol/L、（7.09±0.11）μmol/L和（6.47±0.05）μmol/L。后续试验将8μmol/L的Evo做为加药诱导K562细胞的阈值。浓度为8μmol/L的Evo作用K562细胞24、48和72h后，K562细胞的增殖抑制率分别为（12.69±0.01）μmol/L、（53.30±0.02）μmol/L和（68.92±0.01）μmol/L。14 重庆医科大学硕士研究生学位论文注：n=5;与空白对照组比较：**P<0.01。Note:n=5;**P<0.01vsThecontrolgroup.图1-1Evo对K562细胞的增殖抑制作用。Figure1-1EffectofevodiamineonproliferationofK562cells.2.2镜下观察吴茱萸碱对K562细胞生长形态的影响浓度为8μmol/L的Evo作用K562细胞48h后，在倒置显微镜下观察，空白对照组K562细胞生长状况良好，细胞胞膜透亮，体积较大，随培养天数的增加，细胞数目增多，密集；加药组K562细胞数目明显减少，胞膜透亮性变差，提示浓度为8μmol/L的Evo对K562细胞有十分明显的增殖抑制作用，见附图1-1。2.3吴茱萸碱阻滞K562细胞周期在G0/G1期不同浓度Evo（2、4、8）μmol/L作用K562细胞48h后，使用FCM检测细胞周期，结果显示经Evo作用后K562细胞的G0/G1期比例增加，G2/M期和S期的细胞比例则明显下降，且增加和下降的趋势呈浓度依赖性。G0/G1期细胞比15 重庆医科大学硕士研究生学位论文例由空白对照组的（19.80±1.52）%分别增加至（39.37±1.15）%、（54.25±1.62）%和（67.77±1.43）%，差异具有明显统计学意义（P＜0.01），见表1-1，附图1-2。表1-1Evo对K562细胞周期的影响Table1-1TheeffectofEvooncellcycleofK562cellsEvo(µmol/L)G0/G1(%)G2/M(%)S(%)019.80±1.5217.41±4.1262.71±2.60239.37±1.15**3.88±1.10**56.75±1.48*454.25±1.62**3.64±3.09**42.10±1.47**867.77±1.43**2.34±1.79**29.87±0.82**注：n=3;与空白对照组相比较，*P＜0.05，**P<0.01。Note:n=3;*P＜0.05,**P<0.01vsThecontrolgroup.2.4Evo诱导K562细胞早期凋亡不同浓度Evo（2、4、8）μmol/L作用K562细胞48h后，使用FCM检测细胞早期凋亡，结果显示K562细胞的早期凋亡率随着Evo浓度的增加而逐渐增高，分别为（11.47±1.05）%、（12.77±0.79）%和（18.58±1.37）%，与空白对照组（2.79±1.01）%比较，差异具有明显统计学意义（P＜0.01），见图1-2，附图1-3。注：n=3；与空白对照组相比较，**P<0.01。Note:n=3;**P<0.01vsThecontrolgroup.图1-2Evo对K562细胞周期的影响。Figure1-2EffectofevodiamineoneqaarlyapoptosisofK562cells.16 重庆医科大学硕士研究生学位论文2.5Evo对K562细胞中周期相关蛋白CyclinD1、CDK4、p16和p21的影响WesternBlot结果显示，不同浓度Evo（2、4、8）μmol/L作用K562细胞48h后，p16和p21蛋白的表达上调；CyclinD1和CDK4的表达下调，使用β-actin作为内参对照，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1-3，附图1-4。注：n=3;与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。Note:n=3;*P<0.05,**P<0.01vsThecontrolgroup.图1-3CDK4、CyclinD1、p16和p21蛋白的表达。Figure1-3CDK4,CyclinD1,p16andp21proteinexpression.2.6Evo对K562细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3（激活型）蛋白表达量的影响WesternBlot结果显示，不同浓度Evo（2、4、8μmol/L）作用K562细胞48h后，凋亡促进蛋白Bax和caspase-3（激活型）的表达上调；凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达下调，与空白对照组相比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1-4，附图1-5。17 重庆医科大学硕士研究生学位论文注：n=3;与空白对照组比较：**P<0.01。Note:n=3;**P<0.01vsThecontrolgroup.图1-4Bcl-2、Bax和Cleavedcaspase-3蛋白的表达。Figure1-4Bcl-2、BaxandCleavedcaspase-3proteinexpression.3讨论吴茱萸是一种传统中药，首先记载于《神农本草经》。吴茱萸碱是从吴茱萸中提取的有效成分，具有多种生物学效应。其中吴茱萸碱的抗肿瘤作用在近年来得到越来越多的人的关注，其抗肿瘤作用在肺癌，黑色素瘤，结直肠癌，前列腺癌[4,19-22]乳腺癌，以及人白血病细胞Raji、U937和Jurkat细胞中均已被证实。吴茱萸碱可以从多个方面发挥抗肿瘤作用，首先，吴茱萸碱可以抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡和分化，其次，还可以抑制肿瘤细胞的迁移。3.1吴茱萸碱抑制K562细胞的增殖实验结果显示，Evo能够有效抑制K562细胞增殖，并在一定浓度（1~16µmol/L）和时间（≤72h）内呈剂量和时间依赖性(见图1-1)。同时，光学显微镜下可见，8µmol/LEvo作用K562细胞48h之后，K562细胞数量明显减少，见附图1-1。18 重庆医科大学硕士研究生学位论文FCM结果显示，Evo可以干扰K562细胞的细胞周期，并阻滞K562细胞周期在G0/G1期。细胞周期异常是肿瘤的重要特征之一。正常的细胞周期需要多种因子共同调节，其中周期蛋白与周期蛋白依赖性激酶扮演着重要的角色，两者的相互结合产生的蛋白激酶是推动细胞周期进行的重要动力。CyclinD1与CDK4结合的复合体是G0/G1期向S期推进的主要动力，而p21作为细胞周期依赖性蛋白激酶的抑制剂，可与CyclinD1/CDK4复合物特异性结合，抑制其活性，阻滞[23]G0/G1期向S期推进。p16蛋白是有p16基因的编码产物，p16蛋白作为CDK4的抑制因子，阻碍CDK4和CyclinD1相互结合，CyclinD1/CDK4复合物的减少[24-26]阻滞细胞周期从G0/G1期向S期推进。在本实验研究中，WesternBlot结果显示，Evo可以下调CyclinD1和CDK4蛋白，上调p21和p16蛋白，见图1-3，附图1-4。综上，Evo可能是诱导周期相关蛋白的表达异常，引起细胞周期阻滞，进而影响K562细胞的增殖。3.2吴茱萸碱诱导K562细胞的凋亡细胞凋亡（apoptosis）是在众多因素的控制下发生的形态和生理生化特征变化的一种自然死亡行为，是一种程序性死亡方式，是细胞的一种生理性死亡过程，细胞在一定生理和病理条件下，发生凋亡，结束生命。人体中多种疾病都可能与[27-28]细胞凋亡有关联，例如免疫性疾病、神经性疾病、肿瘤等等。所以，以促凋亡为主要作用的抗肿瘤药物是目前研究的热点。本实验采用流式细胞术检测K562细胞的凋亡率，结果显示，Evo诱导K562细胞48h后，随着浓度的增加，K562细胞的凋亡率逐渐增加，在Evo浓度为8μmol时凋亡率达到（18.58±1.37）%，见表1-1和附图1-2。结果提示，Evo可以诱导K562细胞发生凋亡，进一步阻滞肿瘤发生恶化。Bcl-2家族基因广泛分布于各种动物中，目前，已经发现的Bcl-2同源基因有[28]20多种。Bcl-2蛋白家族分为两大类：一类是抗凋亡蛋白,主要包括Bcl-2,Bcl-xL，Bcl-w,Mcl-1,A1/bfl-1,Boo,Ced-9,mbc1-x,bhrf1,lmw5-h13和Nr-13等；另一类是促凋亡蛋白，包括Bax、Bak、Bok、Bcl-x(s)、bik、Bid、Bad、hrk和Egl-1等。抗凋亡基因Bcl-2位于18号染色体21区，共有239个氨基酸残基，Bcl-2蛋白定位于线粒体外膜，主要是通过调控线粒体的功能和细胞色素C的释放发挥抗19 重庆医科大学硕士研究生学位论文[29-30]凋亡的作用。促凋亡基因Bax定位于19q13.3～q13.4区，多以非活性单体形式分布于细胞质，接收凋亡信号激活后，移位至线粒体外膜，发挥其促凋亡的作[31]用，Bax还可以阻止其他抗凋亡基因发挥抗凋亡的作用。Bax和Bcl-2之间量的相对多少决定着Bax/Bax的同二聚体和Bcl-2/Bax的异二聚体的比值，当Bcl-2过度表达时，同二聚体Bax/Bax解离，异二聚体Bcl-2/Bax生成增多，发挥抗凋[32-34]亡作用；当Bax过表达时，生成大量同二聚体Bax/Bax，启动细胞凋亡。Caspase全称是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteinase)，存在于细胞质中，研究表明，Caspase蛋白家族对细胞凋亡有着十分重要的意义。根据功能和结构的不同，可以将Caspase蛋白家族分成三大类：（1）凋亡执行因子，其作用是作用于特异性底物然后导致凋亡的发生，主要包括Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7等；（2）凋亡启动因子，其作用是在其他蛋白的辅助下，活化并激活下游相关Caspase，主要包括Caspase-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等；（3）炎症介导因子，其作用是介导炎症反应，并辅助死亡受体介导细胞发生凋亡，主要包括Caspase-l、Caspase-4、Caspase-5和[35]Caspase-11等。Caspase级联反应中Caspase-3是下游最关键的凋亡执行者，Caspase-3的激活依赖cyt-c的释放，异二聚体Bcl-2/Bax可以通过线粒体途径介导cyt-c等物质释[36]放，激活Caspase-3，诱导细胞发生凋亡。本实验研究中，WesternBlot结果显示，Evo可以下调Bcl-2和上调Bax,同时，Caspase-3（激活型）蛋白被激活（见图1-4，附图1-5），提示Evo可能是通过激活Caspase-3诱导K562细胞发生凋亡。但是，细胞凋亡是一个发生机制极为复杂的过程，除上所叙述的可能机制外，还有其他可能的机制需要进一步研究和发现。小结吴茱萸碱在1~16µmol/L范围内可以有效抑制K562细胞增殖，并可通过下调CyclinD1和CDK4蛋白，上调p21和p16蛋白将K562细胞周期阻滞在G0/G1期；通过调节Bcl-2/Bax比例激活下游Caspase-3，最终导致K562细胞发生凋亡。20 重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分图片注：A：空白对照组(0.1%DMSO),B：8µmol/LEvo。Note:A:Thecontrolgroup(0.1%DMSO),B:8µmol/LEvo.附图1-1Evo对K562细胞生长的影响。Supple.figure1-1EffectofevodiamineongrowthofK562cells.注：n=3；A：空白对照组(0.1%DMSO),B：2µmol/LEvo,C：4µmol/LEvo,D：8µmol/LEvo。Note:n=3;A:Thecontrolgroup(0.1%DMSO),B:2µmol/LEvo,C:4µmol/LEvo,D:8µmol/LEvo.附图1-2Evo对K562细胞周期的影响。Supple.figure1-2EffectofevodiamineoncellcycleofK562cells.21 重庆医科大学硕士研究生学位论文注：n=3;A：空白对照组(0.1%DMSO),B：2µmol/LEvo,C：4µmol/LEvo,D：8µmol/LEvo。Note:n=3;A:Thecontrolgroup(0.1%DMSO);B:2µmol/LEvo;C:4µmol/LEvo;D:8µmol/LEvo.附图1-3Evo对K562细胞周期的影响。Supple.figure1-3EffectofevodiamineoncellcycleofK562cells.附图1-4CDK4、CyclinD1、p16和p21蛋白的表达。Supple.figure1-4CDK4,CyclinD1,p16andp21proteinexpression.22 重庆医科大学硕士研究生学位论文附图1-5Bcl-2、Bax和Cleavedcaspase-3蛋白的表达。Supple.figure1-5Bcl-2,BaxandCleavedcaspase-3proteinexpression.23 重庆医科大学硕士研究生学位论文第二部分吴茱萸碱对K562细胞中HDACs的调控1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验药品曲古抑菌素A（美国Sigma公司，TrichostatinA,TSA），纯度98%。1mgTSA完全溶解于1mlDMSO中，配制成原液（浓度=3.3mmol/L），﹣20℃长期保存。使用时用RPMI1640（含10%FBS）完全培养液稀释成实验要求浓度。取10mg吴茱萸碱（南京泽朗药科技有限公司，纯度=98%）在329.6μlDMSO中充分溶解配制成原液（浓度=100mmol/L），﹣20℃保存。使用时用RPMI1640（含10%FBS）完全培养液稀释成实验要求浓度。1.1.2主要试剂HATActivityColorimetricAssayKit(K332)BioVision公司异硫氰酸荧光素标记山羊抗兔IgG(H＋L)碧云天生物技术研究所鼠抗人p38、p-ERK、p-JNK单克隆抗体美国SantaCruc公司HistoneDeacetylaseAntibodySamplerKit(9928)CellSignalingTechnology(CST)公司CDK4多克隆抗体武汉三鹰生物技术有限公司兔抗人p16、p21多克隆抗体武汉三鹰生物技术有限公司兔抗人JNK、ERK、p-p38多克隆抗体美国SantaCruc公司兔抗人细胞周期蛋白D1(CyclinD1)多克38隆抗体Epitomics公司ColorimetricHDACActivityAssayKit(K331)BioVision公司兔抗人HistoneH3(acetylK9)多克隆抗体美国Abcam公司Nuclear/CytosolFractionationKit(K266)BioVision公司辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H＋L)碧云天生物技术研究所24 重庆医科大学硕士研究生学位论文1.2方法1.2.1化学比色法检测K562细胞中HATs/HDACs活性收集Evo诱导6h后的K562细胞，预冷0.01mol/LPBS（pH7.2）漂洗2次，然后用Nuclear/CytosolFractionationKit（BioVision,K266-100）试剂盒提取K562细胞核蛋白，核蛋白浓度测定使用BCA法，分别取50µg核蛋白，用HATActivityColorimetricAssayKit（K332）和ColorimetricHDACActivityAssayKit（BioVision,K331）检测HATs和HDACs分别在波长为450nm、415nm处的吸光度（A）值，将（A）值作为HATs以及HDACs活性的指标。实验重复3次。1.2.2Westernblot检测K562细胞HDACs蛋白的表达将处于生长期的K562细胞种植于六孔板，每孔总体积为3ml，细胞密度为81×10/L。实验分组：空白对照（Control）组：加入终浓度为0.1%的DMSO；药物组：药物Evo的终浓度为2、4、8μmol/L。在条件为37℃、5%CO2饱和湿度下环境培养，24h后收集细胞。预冷PBS(pH7.2，0.01mol/L)漂洗细胞2次，然后提取细胞全蛋白，全蛋白浓度测定使用BCA法。取50μg蛋白样品进行SDS-PAGE（120g/L）电泳，然后电转至PVDF膜，PVDF膜在封液室温封闭2h。封闭完后分别加入HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6（稀释度为1：2000）和β-actin抗体（稀释度为1∶1500）4℃冰箱中静置孵育12h；用TBST漂洗去掉PVDF膜上的抗体之后，加入稀释度为1∶3000的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔（或抗小鼠）IgG(H+L)，室温孵育2h，之后用TBST洗净，然后用ECL显色剂化学发光显色，图像分析软件QuantityOne分析个目的条带的吸光度值，β-actin作为内参对照。实验重复3次。1.2.3Westernblot检测K562细胞中组蛋白H3乙酰化水平Westernblot具体实验步骤将上文（方法1.2.2）。本次实验全蛋白来源是不同浓度Evo诱导K562细胞6h后，提取所得。HistoneH3（acetylK9）抗体稀释度为1∶1000。实验重复3次。25 重庆医科大学硕士研究生学位论文1.2.4Westernblot检测K562细胞MAPK信号通路的关键蛋白Westernblot具体实验步骤同上文（方法1.2.2）。本次实验全蛋白来源是不同浓度Evo诱导K562细胞48h后，提取所得。JNK、p-JNK、p38、p-p38、ERK、p-ERK抗体稀释度均为1∶1000。实验重复3次。1.2.5统计学方法SPSS22.0（SPSS公司，美国）用于统计学分析，使用单因素方差分析方法，结果使用x±s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有明显统计学意义。2实验结果2.1吴茱萸碱调节K562细胞中HATs/HDACs的活性给予不同浓度Evo诱导K562细胞6h后，化学比色法检测K562细胞HATs/HDACs活性的变化。结果显示，不同浓度Evo（2、4、8µmol/L）诱导K562细胞6h后，随着浓度的增加，HATs的吸光度值(A)降低逐渐增加，其吸光度值(A)分别为(0.2598±0.0083)、(0.2659±0.1115)和(0.2749±0.0683)，和空白对照组(0.1947±0.0770)相比，差异具有明显统计学意义（P＜0.01），见图2-1A。随着浓度的增加，HDACs的吸光度值(A)降低逐渐降低，其吸光度值(A)分别为(0.1092±0.0114)、(0.0847±0.1164)和(0.0434±0.0133)，和空白对照组(0.1352±0.0135)相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），其中4、8µmol/LEvo组与空白对照组相比，差异更明显（P＜0.01），见图2-1B。26 重庆医科大学硕士研究生学位论文注：n=3;与空白对照组比较:*P＜0.05,**P＜0.01。Note:n=3;*P＜0.05,**P＜0.01vsThecontrolgroup.图2-1Evo对K562细胞中HATs/HDACs活性的影响。Figure2-1EffectsofEvoontheactivityofHATs/HDACsinK562cells.2.2吴茱萸碱可提高K562细胞中组蛋白H3的乙酰化水平给予不同浓度Evo(2、4、8µmol/L）诱导K562细胞6h后，Westernblot结果显示，Evo可以提高K562细胞中组蛋白H3的乙酰化水平，与空白对照组相比，具有统计学意义（P＜0.01），并且在Evo浓度为4µmol/L时达到最大值,见图2-2A，附图2-1A。将165nmol/L曲古抑菌素A(TSA）作为阳性对照组；浓度为8µmol/L的Evo为药物组，诱导K562细胞6h后，Westernblot结果显示，Evo与TSA有相似的功效，都能提高H3(K9)的乙酰化水平，与空白对照组相比，差异具有明显的统计学意义（P＜0.01），见图2-2B，附图2-1B。27 重庆医科大学硕士研究生学位论文注：n=3;与空白对照组比较:**P＜0.01。Note:n=3;**P＜0.01vsThecontrolgroup.图2-2Evo诱导K562细胞组蛋白H3乙酰化水平的变化。Figure2-2ThelevelchangeofacetylatedhistoneH3inK562cellsinducedbyEvo.2.3吴茱萸碱调控K562细胞中HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6蛋白的表达给予不同浓度Evo（2、4、8µmol/L）诱导K562细胞24h后，Westernblot结果显示，HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6蛋白的表达具有不同程度的下调，当Evo浓度为2µmol/L时，HDAC2下调达到最低值；当Evo浓度为4µmol/L时，HDAC1和HDAC6下调达到最低值；当Evo浓度为8µmol/L时，HDAC3下调达到最低值；与空白对照组相比，均有统计学意义（P＜0.01），见图2-3，附图2-2。注：n=3;与空白对照组比较:*P＜0.05,**P＜0.01。Note:n=3;*P＜0.05,**P＜0.01vsThecontrolgroup.图2-3Evo影响K562细胞中HDAC蛋白的表达。Figure2-3TheexpressionofHDACsinK562cellstreatedwithEvo.28 重庆医科大学硕士研究生学位论文2.4吴茱萸碱调控K562细胞内MAPK通路给予不同浓度Evo（2、4、8µmol/L）诱导K562细胞24h后，westernblot结果显示，p-ERK和JNK蛋白表达降低，p38、p-p38和p-JNK蛋白的表达升高，而ERK蛋白没有明显的变化，与空白对照组相比，具有统计学意义（P＜0.01），见图2-4，附图2-3。提示Evo能够活化K562细胞内的MAPK通路。注：n=3；与空白对照组比较：*P＜0.05,**P＜0.01。Note:n=3;*P＜0.05,**P＜0.01vsThecontrolgroup.图2-4Evo对K562细胞中MAPK信号通路的影响。Figure2-4EffectofEvoontheMAPKsignalingpathwayinK562cells.3讨论组蛋白乙酰化可以调控基因的转录和表达，组蛋白乙酰化还参与了细胞多种[37]生理病理过程，因而推测组蛋白乙酰化的异常调节与肿瘤的发生发展有关。HDACs和HATs共同调节组蛋白乙酰化，近年来大量研究表明，抑制HDACs可以导致多种肿瘤细胞的增殖抑制，也能促进细胞凋亡，HDACs已经成为潜在肿[37-40]瘤治疗的靶点。29 重庆医科大学硕士研究生学位论文有研究报道，白血病患者体内发生染色体易位，导致HDACs被某些融合蛋白异常招募，结果组蛋白高度去乙酰化，从而使患者体内抑癌基因转录明显抑制，[41]这可能是白血病发生的原因。本实验研究中发现，一定浓度范围内（1~8µmol/L）的Evo能够降低HDACs的活性，并且随着浓度的增加，HDACs的活性逐渐降低，在Evo浓度为8µmol/L时达到最低值（见图2-1B）；在相同浓度下，Evo可以增加HATs的活性，并呈浓度依赖性，在Evo浓度为8µmol/L时达到最高值（见图2-1A）。结果提示，Evo可以通过调节HATs和HDACs的活性，从而增加K562[42]细胞内组蛋白的乙酰化水平。在接下来的试验中，我们选用TSA（165nmol/L）作为阳性对照组，不同浓度Evo作为实验组。实验结果表明，Evo可以增加组蛋白H3(K9）的乙酰化水平，在Evo浓度为4µmol/L时达到最大值（见图2-2A，附图2-1A）；并且与阳性对照组相比，浓度为8µmol/L的Evo对K562细胞有与TSA相似的效果，二者均能增加H3(K9）的乙酰化水平（见图2-2B，附图2-1B）。提示，Evo可能是通过调节HATs/HDACs平衡比例，提高组蛋白H3(K9）的乙酰化水平，来发挥其抗肿瘤作用的。Westernblot检测结果显示，Evo诱导K562细胞后，HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的表达明显下调（见图2-3，附图2-2）。HDAC1/2在多种肿瘤中都表达异常，并且研究发现HDAC1/2的异常表达与肿瘤细胞的增殖和凋亡有密不可[43]分的关系。抑制HDAC2可以促使p21基因启动子区域的组蛋白乙酰化增强，[44][45]导致细胞凋亡的发生，并且HDAC2的下调可以恢复P16的活性，p21和p16的表达增加进一步破坏CyclinD1/CDK4的复合体，导致细胞周期异常，将K562细胞周期阻滞于G0/G1期，从而抑制细胞增殖，这与前期的实验结果一致（见图1-3，附图1-4）。提示，Evo引起K562细胞周期阻滞和凋亡可能与HDAC1/2的抑制有关。HDAC6广泛分布于人体各个器官，HDAC6是一个特殊的同型体，底物是组[46]蛋白或非组蛋白（如α-微管蛋白、过氧化物还原酶、皮动蛋白及热激蛋白90）。HDAC6参与了多种肿瘤的发生和发展，HDAC6能从多个方面对肿瘤细胞发挥作[47]用，抑制肿瘤细胞的增殖，此外HDAC6还与肿瘤细胞中MAPK信号通路的激[48]活相关。Westernblot结果显示，Evo诱导K562细胞后，p-ERK和JNK蛋白表达下调，p38、p-p38和p-JNK蛋白表达上调，而ERK蛋白表达没有变化，由此30 重庆医科大学硕士研究生学位论文我们猜测，Evo可能是抑制了HDAC6蛋白的表达，然后激活了MAPK信号通路，进而促进K562细胞凋亡。小结Evo抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的表达，打破HATs/HDACs的平衡，使K562细胞内组蛋白H3(K9)的乙酰化水平增高，激活下游MAPK信号通路，最终导致K562细胞的周期阻滞和细胞凋亡。31 重庆医科大学硕士研究生学位论文第二部分图片附图2-1Evo诱导K562细胞中组蛋白H3的乙酰化水平的变化Supple.figure2-1ThelevelchangeofacetylatedhistoneH3inK562cellsinducedbyEvo.附图2-2Evo影响K562细胞中HDACs的表达。Supple.figure2-2TheexpressionofHDACsinK562cellstreatedwithEvo.32 重庆医科大学硕士研究生学位论文附图2-3Evo影响K562细胞中MAPK信号通路Supple.figure2-3EffectofEvoontheMAPKsignalingpathwayinK562cells.33 重庆医科大学硕士研究生学位论文全文总结吴茱萸碱是从中药吴茱萸中提取出来的活性碱之一，具有广泛的抗肿瘤作用，其具体的作用机制十分复杂。本实验研究的实验对象是人白血病K562细胞，结论如下：1.Evo在1~16µmol/L浓度范围内可以有效抑制K562增殖，并且呈时间和浓度依赖性；2.Evo可以通过下调CyclinD1和CDK4蛋白，上调p21和p16蛋白将K562细胞阻滞在G0/G1期；3.Evo通过调控K562细胞内Bcl-2/Bax的比例，然后激活Caspase-3，从而导致K562细胞凋亡；4.Evo可以抑制K562细胞HDACs活性，增加HATs活性，从而提高组蛋白H3乙酰化水平；5.Evo通过抑制HDACs蛋白的表达，激活下游MAPK信号通路导致K562细胞发生凋亡。综上，Evo能够有效抑制人红白血病细胞K562的增殖，阻滞其周期，促进其凋亡，其作用机制可能是与Evo抑制HDACs的活性和HDACs蛋白的表达相关。34 重庆医科大学硕士研究生学位论文参考文献[1]刘利琼,任伟,谢丽,胡静,杨觅,钱晓萍,刘宝瑞.吴茱萸碱诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制研究进展.现代肿瘤医学.2015.(10).1471-1474.[2]张醇,梁华平.吴茱萸碱抗肿瘤活性研究进展.中国新药杂志.2010.(17).1558-1562.[3]PanX.,HartleyJ.M.,HartleyJ.A.,WhiteK.N.,WangZ.,BlighS.W.Evodiamine,adualcatalyticinhibitoroftypeIandIItopoisomerases,exhibitsenhancedinhibitionagainstcamptothecinresistantcells.Phytomedicine:internationaljournalofphytotherapyandphytopharmacology.2012.19(7).618-624.[4]WangC.,LiS.,WangM.W.Evodiamine-inducedhumanmelanomaA375-S2celldeathwasmediatedbyPI3K/Akt/caspaseandFas-L/NF-kappaBsignalingpathwaysandaugmentedbyubiquitin-proteasomeinhibition.Toxicologyinvitro:aninternationaljournalpublishedinassociationwithBIBRA.2010.24(3).898-904.[5]HuangD.M.,GuhJ.H.,HuangY.T.,ChuehS.C.,ChiangP.C.,TengC.M.Inductionofmitoticarrestandapoptosisinhumanprostatecancerpc-3cellsbyevodiamine.TheJournalofurology.2005.173(1).256-261.[6]KanS.F.,HuangW.J.,LinL.C.,WangP.S.InhibitoryeffectsofevodiamineonthegrowthofhumanprostatecancercelllineLNCaP.Internationaljournalofcancer.2004.110(5).641-651.[7]YangJ.,WuL.J.,TashinoS.,OnoderaS.,IkejimaT.Proteintyrosinekinasepathway-derivedROS/NOproductionscontributetoG2/Mcellcyclearrestinevodiamine-treatedhumancervixcarcinomaHeLacells.Freeradicalresearch.2010.44(7).792-802.[8]VanSpeybroeckL.Fromepigenesistoepigenetics:thecaseofC.H.Waddington.AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences.2002.981.61-81.[9]李文艺.表观遗传学及其研究进展.安徽农业科学.2009.(14).6358-6360.35 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重庆医科大学硕士研究生学位论文文献综述组蛋白去乙酰化酶抑制剂在白血病治疗中的应用表观遗传学在生物学调控中扮演着十分重要的角色，其中，染色质的改变可能是导致肿瘤为首的许多疾病发生发展的主因。与传统遗传学不同，表观遗传学是一个可逆的生物学过程。近年来，以表观遗传修饰为治疗方向的药物已经得到充分的发展，而且，其中的部分药物已经被许可用于临床病人的治疗。组蛋白的表观遗传学修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等。组蛋白的修饰如同密码一样，他们组合在一起，共同组成一种表观语言，也称之为“组蛋白密码”。但是组蛋白的修饰比我们想象的复杂得多，同一种修饰在不同情况下可能发挥不同的生物学功效，多种修饰可能具有同一种功能。组蛋白的乙酰化由组蛋白乙酰化酶（histoneacetylases,HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases,HDACs）共同修饰。HATs/HDACs的动态平衡是组蛋白乙酰化的驱动力。人体中HDACs家族总共有18种蛋白，根据与酵母蛋白质序列的同源性，可将其分成四大类：ClassesI：(HDAC1-2-3-8)，与酵母RAD3同源，位于细胞核，其N端有一个去乙酰化酶结合域；ClassesII：可以细分为两小类，（1）IIa：(HDAC4-5-7-9)，位于细胞质和细胞核的局部；（2）IIb:(HDAC6and10)，HDAC6主要位于细胞核，在细胞质中也有分布，其拥有两个化学性结合域，而HDAC10则拥有一个功能完整的N端结合域和一个残缺的C端结合域；ClassIII：即乙酰化酶(SIRT1–SIRT7)，他们与酵母Sirt2同源，但是与其他HDACs结构不同，依赖NAD+的催化；ClassIV：只有一个HDAC（即HDAC11），与classesI/II具有相同的催化域。HDACs与其他生物因子形成大分子复合物发挥其调控作用，其中HDAC1和HDAC2在mSin3A、NURD和Co-REST组成的复合体中被发现；HDAC3在N-CoR[1]和SMRT复合体中被发现；HDAC6与泛素化途径中某些蛋白有密切的关联。40 重庆医科大学硕士研究生学位论文一、HDACs和组蛋白乙酰化调控HATs通过增加组蛋白乙酰化水平修饰尾部的赖氨酸残基，使染色体结构松弛，促进基因的转录，相反，HDACs的作用是降低组蛋白乙酰化水平，导致染色体结构紧密，抑制基因转录。用于研究HDACs的科研方法一直在不断更新，从免疫沉淀法到第二代测序，所有的实验方法均证实：HDACs与基因的活化密切相关，而且与基因的转录也有一定的关系。当基因转录开始后，HDACs能够抑制已被HATs活化的乙酰化基团，为下一次转录提供所需要的染色质结构。实际上，转录区域组蛋白过度乙酰化使[2]得染色质结构遭到破坏，最终导致转录起始点错误。在果蝇体内试验中，HDACs[3]不得不去阻止组蛋白乙酰化从启动子区域扩散，以此限制转录过程中的干扰。HATs和HDACs不但是组蛋白乙酰化可逆的原因，同时也是许多反应底物比如转录因子、DNA修复酶和细胞质和细胞核蛋白乙酰化可逆的原因。但是，并不是所有的蛋白质的乙酰化修饰都是由HATs/HDACs驱动，线粒体中，蛋白质乙酰[4]化修饰可能是由线粒体基质中pH升高和高浓度乙酰辅酶A活化所驱动。非组蛋白乙酰化修饰和他们功能的调控增添了我们对HATs/HDACs复合体的理解，同时，这也告诉我们：HDACs不仅仅只是一种“表观遗传学因子”，它的[5]更多功能和作用机制还需要研究人员共同去探索。二、组蛋白去乙酰化酶抑制剂的发展组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor,HDACi)作为抗肿瘤药物用于临床已经具有很长的历史,但HDACi会干扰体内某些正常的生理过程，而且还有其他不可预料的副作用，故HDACi并不是首选的临床抗肿瘤药物。在发现HDACi可以抑制HDACs之前，HDACi就已经被报道可以在体内外有很好的抗肿瘤作用。在发现HDACs抗肿瘤的潜力后，人们推测，HDACs在体内扮演着癌基因角色，可能会导致机体发生癌变。实际工作中，已经在多种实体瘤中发现了HDACs过表达，比如，激素受体阳性乳腺癌中发现HDAC1的过表[6]达，激素受体阴性肿瘤中，发现HDAC2和HDAC3过表达。但是，明确HDACs的具体作用机制是很困难的，在许多肿瘤细胞系和原发肿瘤细胞中，发现了组蛋41 重庆医科大学硕士研究生学位论文白H4赖氨酸第16和20位点乙酰化存在缺失的情况，可能的原因是classIIIHDAC[7]SIRT1的过表达导致组蛋白H4K16和H4K20去乙酰化。HDACs表达增加能够降低乙酰化水平，导致包括细胞周期和DNA修复在内的多种通路的功能受到抑[8]制。HDACs过表达与DNA修复基因BRCA1和ATR的抑制有关。HDACs过表达也可能影响非组蛋白的底物，比如HDAC1/2可以调控抗癌基因P53的乙酰[9]化，从而抑制P53的功能。有案例报道，HDACs过表达是一种不良的预后指标，而且还不受肿瘤分类和分级的影响；但是，在ER-阳性乳腺癌中，HDAC6的过表[10]达却预示着良好的预后。虽然有报道在肿瘤中HATs基因的突变或扩增导致HATs的功能改变甚至缺失，但是这样的案例少之又少，而肿瘤中HDACs基因的突变却可能扮演着十分[11]重要的作用。研究结果提示各个HDACs的突变频率各不相同，在有些肿瘤中，突变率达到30%（如黑色素瘤，肺癌），这可能与长期暴露于致癌物质（阳光，吸烟）下有关。一般情况下，大部分肿瘤的HDACs的突变率与其他基因的突变率具有一致性。classIIHDACs有比较高的突变率，主要集中在HDAC4和HDAC9，它们的突变分布在整个编码序列，相互之间没有相关性。综合而言，从基因的突变和基因表型的改变方面来看，还不能得出HDACs与肿瘤的关系，HDACs的抗肿瘤机制还需要进一步的研究和探索。HDACi具有明显的抗肿瘤作用，比如，细胞周期阻滞，诱导分化，细胞死亡，抗血管生成和抑制免疫系统。已有的研究报道显示，表观遗传学可能是肿瘤治疗[12]新的方向，HDACs在肿瘤的发生与发展中有着十分重要的作用。越来越多的HDACi已经被发现和合成，其中部分已经用于临床，但是临床治疗效果还没有达到人们的预期，这使得发现新的HDACi以及探究HDACi的作用机制成为一项有意义的研究。敲除小鼠ClassI中HDACs基因的实验研究证实，不同HDAC基因具有各不相同的作用：敲除HDAC1后，小鼠生长迟缓，并在E10.5后死亡；敲除HDAC2后，小鼠心脏畸形，在出生24h后死亡；敲除HDAC3，[13-14]小鼠原肠胚形成存在缺陷，引起DNA修复功能异常，在E9.5以前小鼠死亡。由此推测，HDACs的抑制可能是肿瘤治疗的新途径，如果推测正确，HDACi在肿瘤的临床治疗中将发挥巨大的作用。42 重庆医科大学硕士研究生学位论文三、白血病中HDACs在空间和时间上独特的作用与实体瘤相比较，我们更加了解血液性肿瘤中HDACs。在临床上，不同的HDACi在对白血病患者有不相同的治疗效果。急性早幼粒细胞白血病(APL)是最早证明有HDACs参与的疾病之一。APL的特点是早幼粒细胞浆内充满异常颗粒，出现特异性染色体t（15；17）改变，早幼粒细胞（thepromyelocyticleukaemiaprotein,PML）蛋白和视黄酸受体(retinoicacidreceptor-a，RAR)形成PML-RAR融合蛋白。在证实视黄酸（Retinoicacid,RA）[15]直接作用于融合致癌蛋白之前，RA就已经用于临床APL病人的治疗。后续RA治疗APL的研究中，在分子水平上有两中代表的治疗方法，分别是转录治疗（其作用点是靶向作用与致癌基因的转录）和分化治疗，两种治疗使白[16]血病细胞向末期分化。所以，APL虽然是一种罕见的疾病，但这些年的努力，研究者已经建立了具体的模型去研究它的特性，这个研究过程值得在其他癌症学习。在正常细胞中，RA受体是一个转录因子，主要作用是调控白血病细胞的分化，RAR-靶基因中发现维甲酸受体还与维甲酸反应元件（RA-X受体特异性序列）结合形成异二聚体。在没有RA时，发现RAR可以和HDAC结合成复合体，抑制转录。在APL细胞中，生理浓度的RA不会导致HDAC-辅阻遏物复合物从PML-RAR的释放，而药理剂量的RA(10-100倍高于生理浓度)反转融合蛋白的作用，诱导降解，导致APL细胞分化激活。在患者体内，RA的治疗仅有暂时的作用，没有长久的治疗作用，可能联合砷或者化疗可以对APL有良好的治疗效果。1.时间上HDACs在APL中有着十分重要的作用，它是融合蛋白阻滞白血病分化所必须的。但是新的研究表明，APL中HDACs的作用机制比之前认识到的复杂很多，同时表明，HDACs在APL发生发展过程中的双重作用。[17]有研究报道，敲除小鼠HDAC1/2可以加快白血病的发展，HDAC1/2的敲除或抑制也有可能加速其他肿瘤的发展，所以推测HDAC1/2可能具有抑癌基因43 重庆医科大学硕士研究生学位论文[18]的效果。并不是所有的HDACs都有这样的功效：HDAC3在白血病早期作为抑癌因子存在，敲除HDAC3或药物抑制HDAC3后可以导致细胞分化，凋亡增加，[19]阻碍白血病的发展。有几个问题没有明确的答案。（1）如何抑制HDAC1/2的表达?（2）HDAC1/2的抑制是否足以改变细胞的命运?（3）最重要的是，HDACs可能有抑制肿瘤的作用，是不是意味着使用HDACi治疗肿瘤的同时可能会导致其他肿瘤的发生?2.空间上肿瘤中有些细胞具有自我生长不受限制的特点，导致肿瘤细胞数量不断增加和体积不断增大，根据这些特点，我们称这类系细胞为“肿瘤干细胞”cancerstem[20]cells’(CSCs)，在白血病中又称为LICs。现有的疗法（如化疗）不能根除肿瘤干细胞，只对肿瘤细胞（没有无限增殖）起作用，这被认为是肿瘤复发的最直接的原因之一。一些实验方法可以用于衡量LICs，比如在小鼠移植性白血病模型中用于探索细胞的增殖限制。目前，已有学者开始研究各种肿瘤中HDACi的具体作用。丙戊酸可以提高APL小鼠的生存率，但是在短期停药之后，APL复发，导致小鼠死亡。实验证实，丙戊酸的治疗并没有减少LICs的细胞数量。所以丙戊酸是通过作用于肿瘤细胞，导致细胞的分化和凋亡，而不是影响LICs的自我更新能[21]力。现在还不清楚，HDACi在不同生物环境中是否具有不同的生物学功效，也不清楚敲除基因实验与药理结果是否一致。我们推测，VPA不能抑制其他HDACs和含有HDACs的复合物，故不能影响LICs的自我修复，因此，HDACs在特定的肿瘤细胞中，其作用有差异性。在APL病人中分析其他药物对LICs的影响，砷对LICs具有十分明显的治疗[22]作用，RA对LICs的作用具有剂量依赖性，低浓度就有明显的治疗效果。在临床模型中，药物联合VPA（三氧化二砷）对LICs的作用的研究具有显示：VPA不能靶向对LICs起作用，故VPA无法治疗肿瘤，但是靶向LICs也不一定能对肿瘤细胞起作用，肿瘤细胞依旧能在治疗后继续生长，导致病人的死亡在药物对LICS起作用之前。只有联合靶向治疗，才可能快速有效地达到治疗效果。44 重庆医科大学硕士研究生学位论文四、展望HDACi可以对部分血液病患者起到治疗作用，但是他们单独使用的治疗效果一直不能令人满意。病人对HDACi的敏感性不能单独地归结于某个独立的因素，所以不能对病人进行简单的统一化的治疗。然而，我们认为尽管治疗效果不尽人意，但是该领域依旧值得我们去努力，HDACi治疗白血病依旧是一个很有前途的治疗方法。将来，我们会选择效果最好的HDACi用于临床，同时能将副作用降到最低。小鼠白血病模型的实验结果表明：我们不但要去探究HDACs相互之间的差异，也要去探究他们之间存在共同的作用机制。特别地，我们认为：我们应该更加系统和详细的研究HDACs对干细胞的影响，这样有利于临床用药。参考文献[1]MinucciS.,PelicciP.G.Histonedeacetylaseinhibitorsandthepromiseofepigenetic(andmore)treatmentsforcancer.NatRevCancer.2006.6(1).38-51.[2]WangZ.,ZangC.,CuiK.,SchonesD.E.,BarskiA.,PengW.,ZhaoK.Genome-widemappingofHATsandHDACsrevealsdistinctfunctionsinactiveandinactivegenes.Cell.2009.138(5).1019-1031.[3]Rincon-AranoH.,HalowJ.,DelrowJ.J.,ParkhurstS.M.,GroudineM.UpSETrecruitsHDACcomplexesandrestrictschromatinaccessibilityandacetylationatpromoterregions.Cell.2012.151(6).1214-1228.[4]WagnerG.R.,PayneR.M.Widespreadandenzyme-independentNepsilon-acetylationandNepsilon-succinylationofproteinsinthechemicalconditionsofthemitochondrialmatrix.JBiolChem.2013.288(40).29036-29045.[5]MinucciS.,PelicciP.G.Histonedeacetylaseinhibitorsandthepromiseofepigenetic(andmore)treatmentsforcancer.NatRevCancer.2006.6(1).38-51.[6]MullerB.M.,JanaL.,KasajimaA.,LehmannA.,PrinzlerJ.,BudcziesJ.,WinzerK.J.,DietelM.,WeichertW.,DenkertC.DifferentialexpressionofhistonedeacetylasesHDAC1,2and3inhumanbreastcancer--overexpressionofHDAC2andHDAC3isassociatedwithclinicopathologicalindicatorsofdisease45 重庆医科大学硕士研究生学位论文progression.BMCCancer.2013.13.215.[7]FragaM.F.,BallestarE.,Villar-GareaA.,Boix-ChornetM.,EspadaJ.,SchottaG.,BonaldiT.,HaydonC.,RoperoS.,PetrieK.,IyerN.G.,Perez-RosadoA.,CalvoE.,LopezJ.A.,CanoA.,CalasanzM.J.,ColomerD.,PirisM.A.,AhnN.,ImhofA.,CaldasC.,JenuweinT.,EstellerM.LossofacetylationatLys16andtrimethylationatLys20ofhistoneH4isacommonhallmarkofhumancancer.NatGenet.2005.37(4).391-400.[8]Eot-HoullierG.,FulcrandG.,Magnaghi-JaulinL.,JaulinC.Histonedeacetylaseinhibitorsandgenomicinstability.CancerLett.2009.274(2).169-176.[9]InsingaA.,MonestiroliS.,RonzoniS.,CarboneR.,PearsonM.,PruneriG.,VialeG.,AppellaE.,PelicciP.,MinucciS.Impairmentofp53acetylation,stabilityandfunctionbyanoncogenictranscriptionfactor.EMBOJ.2004.23(5).1144-1154.[10]SajiS.,KawakamiM.,HayashiS.,YoshidaN.,HiroseM.,HoriguchiS.,ItohA.,FunataN.,SchreiberS.L.,YoshidaM.,ToiM.SignificanceofHDAC6regulationviaestrogensignalingforcellmotilityandprognosisinestrogenreceptor-positivebreastcancer.Oncogene.2005.24(28).4531-4539.[11]RoperoS.,FragaM.F.,BallestarE.,HamelinR.,YamamotoH.,Boix-ChornetM.,CaballeroR.,AlaminosM.,SetienF.,PazM.F.,HerranzM.,PalaciosJ.,ArangoD.,OrntoftT.F.,AaltonenL.A.,SchwartzS.Jr,EstellerM.AtruncatingmutationofHDAC2inhumancancersconfersresistancetohistonedeacetylaseinhibition.NatGenet.2006.38(5).566-569.[12]DawsonM.A.,KouzaridesT.Cancerepigenetics:frommechanismtotherapy.Cell.2012.150(1).12-27.[13]HaberlandM.,MontgomeryR.L.,OlsonE.N.Themanyrolesofhistonedeacetylasesindevelopmentandphysiology:implicationsfordiseaseandtherapy.NatRevGenet.2009.10(1).32-42.[14]YangX.J.,SetoE.TheRpd3/Hda1familyoflysinedeacetylases:frombacteriaandyeasttomiceandmen.NatRevMolCellBiol.2008.9(3).206-218.[15]MinucciS.,PelicciP.G.Histonedeacetylaseinhibitorsandthepromiseofepigenetic(andmore)treatmentsforcancer.NatRevCancer.2006.6(1).38-51.[16]HuangM.E.,YeY.C.,ChenS.R.,ChaiJ.R.,LuJ.X.,ZhoaL.,GuL.J.,WangZ.Y.Useofall-transretinoicacidinthetreatmentofacutepromyelocyticleukemia.Blood.1988.72(2).567-572.46 重庆医科大学硕士研究生学位论文[17]SantoroF.,BotrugnoO.A.,DalZuffoR.,PallaviciniI.,MatthewsG.M.,CluseL.,BarozziI.,SeneseS.,FornasariL.,MorettiS.,AltucciL.,PelicciP.G.,ChioccaS.,JohnstoneR.W.,MinucciS.AdualroleforHdac1:oncosuppressorintumorigenesis,oncogeneintumormaintenance.Blood.2013.121(17).3459-3468.[18]WinterM.,MoserM.A.,MeunierD.,FischerC.,MachatG.,MattesK.,LichtenbergerB.M.,BrunmeirR.,WeissmannS.,MurkoC.,HumerC.,MeischelT.,BroschG.,MatthiasP.,SibiliaM.,SeiserC.DivergentrolesofHDAC1andHDAC2intheregulationofepidermaldevelopmentandtumorigenesis.EMBOJ.2013.32(24).3176-3191.[19]MatthewsG.M.,MehdipourP.,CluseL.A.,FalkenbergK.J.,WangE.,RothM.,SantoroF.,VidacsE.,StanleyK.,HouseC.M.,RuscheJ.R.,VakocC.R.,ZuberJ.,MinucciS.,JohnstoneR.W.Functional-geneticdissectionofHDACdependenciesinmouselymphoidandmyeloidmalignancies.Blood.2015.126(21).2392-2403.[20]KresoA.,DickJ.E.Evolutionofthecancerstemcellmodel.CellStemCell.2014.14(3).275-291.[21]LeivaM.,MorettiS.,SoilihiH.,PallaviciniI.,PeresL.,MercurioC.,DalZuffoR.,MinucciS.,deTheH.Valproicacidinducesdifferentiationandtransienttumorregression,butsparesleukemia-initiatingactivityinmousemodelsofAPL.Leukemia.2012.26(7).1630-1637.[22]NasrR.,GuilleminM.C.,FerhiO.,SoilihiH.,PeresL.,BerthierC.,RousselotP.,Robledo-SarmientoM.,Lallemand-BreitenbachV.,GourmelB.,VitouxD.,PandolfiP.P.,Rochette-EglyC.,ZhuJ.,deTheH.Eradicationofacutepromyelocyticleukemia-initiatingcellsthroughPML-RARAdegradation.NatMed.2008.14(12).1333-1342.47 重庆医科大学硕士研究生学位论文致谢三年硕士研究生的学习和生活带给我许多难忘和不舍，满满的敬意和感谢始终充实其中！首先，在本课题完成之际，谨向我的导师陈地龙研究员致以无上的敬意和衷心的感谢！一直以来，陈老师严谨进取的工作作风、一丝不苟的耐心指导、无微不至的关怀教诲始终令我受益匪浅；本课题研究内容从选题到实验设计，从验证修正到论文发表，都倾注了导师的无限心血；正是在他孜孜不倦的指导和帮助下，我才得以完成这篇论文。导师开阔的胸襟、求实向上的治学精神和乐观开朗的人生态度，无时不刻指引着我，为我树立了积极奋进的治学典范。我要感谢指导老师李静副教授。三年来，她带领和指导我们学习团队，竭尽全力克服课题研究过程中的困难，引导我们分析问题、寻求方法、分享快乐，不厌其烦帮助我们、提醒我们和关心我们，给予了大量的精力和毫无保留的指导，为我们的学习和研究付出了太多的辛劳！衷心感谢人体解剖与组织胚胎学教研室的各位老师、基础医学院及实验平台的各位老师，在我学习期间给予的帮助和指导！由衷感谢我所在团队的师兄、师姐、师弟、师妹们给予的大力支持、关心和帮助！也衷心感谢有幸融入了这样一个团队，在学习和人生态度上广有所获！特别要感谢陈益、刘泽红、李晓朋、熊伟、李科琼等师弟师妹和李丹阳师兄等，给予我的无私帮助和大力支持！同时，感谢我的家人对我学习的鼓励，感谢我的同事对我学习的支持！最后，再次谨向所有关心、支持、帮助、指导我的老师、同学、朋友们致以最诚挚的敬意，衷心感谢您们！48 重庆医科大学硕士研究生学位论文攻读硕士学位期间发表的论文[1]袁龙,陈益,刘泽洪,王芬,李科琼,李静,陈地龙.吴茱萸碱抑制HDAC6促进人白血病K562细胞周期阻滞和凋亡的机制研究《中草药》.（修改后发表）.[2]袁龙,李科琼,陈益,王宏,白燕,袁轲,李静,陈地龙.重庆过敏性鼻炎儿童吸入性变应原趋势分析.（已修回）.49