伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失转移质粒的构建

《伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失转移质粒的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

学校代码：10564学号：2013202837分类号：S855.3密级：硕士学位论文伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失转移质粒的构建向柯宇指导教师：琚春梅副教授学院名称：兽医学院专业名称：预防兽医学答辩委员会主席：中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。本人签名：日期：导师签名：日期： 摘要伪狂犬病病毒（Pseudorabiesviurs，PRV）属疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Alpha-herpesviridae），可致多数动物感染发病，并能引起猪的潜伏感染。猪是其主要宿主和病毒携带者，对养猪业的发展危害重大。在2011年之前，由于PRVgE缺失疫苗的广泛使用，国内的PRV疫情得到了很好的控制，但从2011年底开始，PRV疫情突然大面积爆发，传统的gE缺失疫苗已被证实无法提供完全有效的免疫保护，使得国内养猪业面临巨大的威胁。本研究对PRV新流行毒株进行了分离鉴定，并对其主要糖蛋白的分子特征进行了分析；模仿PRVBartha株的gE缺失区域，构建了PRV新流行毒株的gE缺失转移质粒，为新流行毒株gE缺失突变株的构建奠定了基础。具体研究内容如下：1、伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定从安徽某免疫PRVBarthaK61疫苗猪场送检的流产胎儿中采集脑、心、肝、脾、肺、肾，经PCR扩增，结果从脑、肝、脾、肺中检测到PRVgE基因阳性。将脑组织研磨后接种BHK-21细胞，在37℃5%CO2培养箱培养48h后，细胞出现了明显的细胞病变，病变细胞经PCR检测为PRVgE阳性；采用空斑纯化方法纯化了该病毒，并命名为PRVAH-China-2013。将病毒接种昆明小鼠，通过LD50测定评价了该4.15病毒对小鼠的致病性，结果表明其LD50为10TCID50。2、伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析提取PRVAH-China-2013基因组，采用PCR扩增其主要糖蛋白基因gB、gC、gD、gE，经测序后，将gC、gE基因分别与国内外不同年代分离的PRV毒株进行序列比对，通过mega5.0绘制PRVAH-China-2013株gC和gE基因的遗传进化树；通过PRVAH-China-2013gB、gC、gD、gE序列推导其氨基酸序列，并与国内外不同年代分离的PRV毒株相应糖蛋白序列进行比对分析。遗传进化分析结果显示，PRVAH-China-2013株与国内毒株（除2008年分离的7株毒株外）位于同一个分支，且与2011年来新分离毒株的遗传关系更近，而与与国外毒株及疫苗毒株Bartha株遗传关系较远，表明PRVAH-China-2013株属于PRV新流行毒株。氨基酸序列比对结果显示，与国外毒株相比，国内株主要糖蛋白均存在明显的氨基酸的缺失或插入，且部分突变位点位于相应蛋白的关键功能域内，这些突变是否导致病毒毒力及免疫原I 性的改变，进而影响现有疫苗的免疫效果，尚需进一步证实。3、伪狂犬病病毒新流行株gE缺失转移质粒的构建根据新流行毒株PRV-ZJ01的基因组序列，在gE基因上、下游设计长度分别为838bp和961bp的基因片段作为同源重组的同源臂，即同源左臂LA和同源右臂RA；以pEGFP质粒为模板，设计引物扩增包含完整表达盒的绿色荧光蛋白基因EGFP作为标记基因。通过酶切、连接、转化等方法，并按照LA-EGFP-RA的顺序，将LA、RA、EGFP连接到T载体的多克隆位点，构建PRVgE缺失转移质粒，经测序正确的质粒命名为pMD-LA-EGFP-RA。将构建好的转移质粒pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞，通过荧光显微镜观察，结果显示转染细胞中可观察到绿色荧光蛋白EGFP的表达，表明构建的转移质粒可以用于后续同源重组试验。本研究从分子水平上解析了PRV新流行株与疫苗株Bartha株主要糖蛋白的遗传差异，为进一步深入研究Bartha株疫苗免疫失败的原因提供了理论依据；成功构建了PRV新流行株的gE缺失转移质粒，为gE缺失突变株的构建及新疫苗的研制奠定了一定的基础。关键词：伪狂犬病病毒；流行毒株；主要糖蛋白；分子特征分析；转移质粒构建II MolecularcharacteristicsofthemajorglycoproteinsofthenovelpseudorabiesvirusesandtheconstructionoftransferplasmidforgEgenedeletionXiangKeyu(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,510642,China)Abstract:Pseudorabiesvirus(PRV)isamemberofthefamilyHerpersviridae,subfamilyAlphaherpesvirinae,withabroadrangeofanimalinfections.ItiswellknownthatlatentinfectionwithPRVeasilyoccursinitsnaturalreservoir,pigs.Thiscausesseriouseconomiclossesintheswineindustryworldwide.Before2011,thePRVwascontrolledwellbecauseoftheBartha-K61vaccine,butin2011,therewasasuddenoutbreakofdomesticepidemictheSwinePseudorabiesandithadprovedthattheclassicBartha-K61vaccinecan’tprovideefficientprotection，anditmadethedomesticswineindustryunderthreat.ThisstudyanalyzedtheglycoproteinB、C、D、EgenesequenceofPRVnovelepidemicvirusstraininthisstudy;itanalyzedthegeneticdifferencebetweenthenovelepidemicPRVstrainandBarthastrain,whichprovidestheorybasisforfurtherclarificationofnoefficiencyofBartha-K61vaccine.Afterthat，anewplasmidwasconstructedtoremovegEgeneofnovelepidemicPRVstrain.AndthenewrecombinantvirusishelpfultostudythenewvaccinefornovelepidemicPRVstrain.Thecontentsofthedetailedresearchareasfollows:1.TheisolationandidentificationofnovelepidemicPRVstrainThebraintissuefromapigfarminAnHuiwasdelectedbyPCR,andIt’sapositiveresultforgEgene.TheBHK-21cellwasinoculatedbymashedbraintissue,Asfordiseasedcells,It’salsoapositiveresultfromthePRVgEgenePCRdetection.Afterthat,theviruswasisolatedbyplaquepurification.,namedPRVAH-China-2013.Then,theKunMingmicewasinoculatedbyPRVAH-China-2013,andthePathogenicitywas4.15evaluatedbymeasuringLD50,theresultshowthattheLD50is10TCID50.III 2.TheanalysisofnovelepidemicPRVstrainglycoproteinmolecularfeatures。AccordingtothepublishedgenesequencefromnovelepidemicPRVstrainsinChina,theprimersofgenegB、gC、gD、gEweredesigned,andallofthegeneswhichwereamplifiedfromPCRweresequenced,andthephylogenetictreesofgCandgEweremade,andallofthesequenceswereanalyzedbycamparingwithdifferentclassicalPRVstrains.TheresultshowedthatallthedomesticPRVstrainswereinasamebranchexceptthestranwhichisolatedin2008,andthestrainswhichisolatedafter2011showedthegeneticaffinity.ItprovesthatPRVAH-China-2013strainbelongstothenovelepidemicPRVstrains.Inaddition,camparingwiththeclassicalPRVstrainsfromabroad,thedomesticPRVstainsisolatedafter2011,themainglycoproteingenesofdomesticPRVstrainsshowedobviousgeneticmutation,andsomeofthemutationsinthecriticalareaofgenes,andthemutationsmaybeisthereasonforthesuddenoutbreakofdomesticepidemictheSwinePseudorabies.3.TheplasmidconstructionforgE-delectedrecombinantPRV.AccodingtothepublishedPRVstrainZJ01,apairofprimersweredesignedfortwogenesrespectivelylocatedinfrontandbackofgEgene,theyarethehomologousarmsforhomologousrecombinationnamedLAandRA.Meanwhile,anotherprimerwasdesignedforfluorescentproteinfromthepublishedplasmidpEGFP-N1,namedEGFP.Afterthat,connectingLA、RAandEGFPintovectorPMD-18Twiththewaysofenzymedigestion、connectionandconversion.ThenthecelltransfectionforfluorescentproteingeneexpressionfromnewplasmidInthisstudy,ItwasanalyzedthegeneticdifferencebetweenthenovelepidemicPRVstrainandtheotherclassicalstrains,whichprovidestheorybasisforfurtherclarificationofnoefficiencyofBartha-K61vaccineandanewplasmidwasconstructedwhichprovidesbasisforPRVhomologousrecombination.Keywords:Pseudorabiesvirus;Novelepidemicvirusstrain;Majorglycoproteins;Molecularcharacteristics;Theconstructionofgene-transfervectorsIV 本论文常用英文缩写词aaaminoacid氨基酸AmpAmpicillin氨苄青霉素bpbasepair碱基对cmcentimeter厘米ddH2Odoubledistilledwater双蒸水DMSOdimethylsulphoxide二甲基亚砜DNAdeoxyribonucleotideacid脱氧核糖核酸DMEMdulbecco'smodificationofEagle's改良Eagle培养基mediumE.coliEscherichiacoli大肠杆菌ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验ggram克hhour小时kbkilo-basepair千碱基对Lliter升LBlauriabrothLB肉汤mgmilligram毫克minminute分钟mLmilliliter毫升nmnanometer纳米PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PRVpseudorabiesvirus伪狂犬病病毒r/minrevolutionsperminiute每分钟转数RNAribonucleicacid核糖核酸ssecond秒SDSsodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠Tristris-(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷V 目录1前言....................................................................................................................................11.1伪狂犬病的流行病学.....................................................................................................11.2我国伪狂犬病的流行现状.............................................................................................11.3病原学.............................................................................................................................21.3.1病毒的结构..................................................................................................................21.3.2病毒的理化特性..........................................................................................................21.4病毒的传染特点..............................................................................................................21.4.1潜伏感染......................................................................................................................21.4.2隐性感染......................................................................................................................21.4.3显性感染......................................................................................................................31.5伪狂犬病毒的致病机理..................................................................................................31.6伪狂犬病的诊断方法......................................................................................................31.6.1动物接种试验...............................................................................................................31.6.2酶联免疫吸附试验(ELISA).........................................................................................41.6.3免疫荧光试验(FA)........................................................................................................41.6.4聚合酶链式反应（PCR）...........................................................................................41.6.5基因芯片技术...............................................................................................................51.7伪狂犬病的防控.............................................................................................................51.7.1自繁自养.......................................................................................................................51.7.2疫苗免疫.......................................................................................................................51.7.3加强饲养管理...............................................................................................................61.8病毒重组涉及的研究方法..............................................................................................61.8.1同源重组技术..............................................................................................................61.8.2融合PCR技术............................................................................................................71.8.3外源基因转染细胞技术...............................................................................................71.8.4病毒空斑技术...............................................................................................................8VI 2材料与方法........................................................................................................................92.1材料.................................................................................................................................92.1.1细胞、菌种、质粒和动物...........................................................................................92.1.2酶类相关试剂..............................................................................................................92.1.3细胞培养用溶液..........................................................................................................92.1.4病毒DNA抽提相关溶液.........................................................................................102.1.5细菌培养基及常用溶液............................................................................................102.1.6琼脂糖凝胶电泳缓冲液............................................................................................102.1.7主要仪器设备............................................................................................................102.2方法...............................................................................................................................112.2.1PRVAH-China-2013的分离与鉴定..........................................................................112.2.2PRVAH-China-2013株的空斑纯化与TCID50的测定............................................132.2.3PRVAH-China-2013的致病性实验..........................................................................142.2.4PRVAH-China-2013主要糖蛋白基因片段的克隆与鉴定......................................142.2.5PRVAH-China-2013主要糖蛋白基因序列测序结果的分析..................................162.2.6PRVAH-China-2013gE缺失转移质粒的构建........................................................162.2.7绿色荧光蛋白基因EGFP的PCR扩增...................................................................172.2.8转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的构建与表达.........................................................182.2.9重组质粒pMD-LA-RA的构建................................................................................212.2.10转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的构建...................................................................232.2.11转移质粒pMD-LA-EGFP-RA基因的表达检测....................................................253结果与分析......................................................................................................................273.1PRV的分离与鉴定........................................................................................................273.1.1疑似病料的PCR扩增结果......................................................................................273.1.2病料接种细胞产生的细胞病变................................................................................273.1.3病变细胞的PCR检测..............................................................................................283.2PRV的空斑纯化与致病性实验....................................................................................293.2.1PRV的空斑纯化.........................................................................................................293.2.2PRVAH-China-2013TCID50的测定.........................................................................29VII 3.2.3PRVAH-China-2013的致病性实验..........................................................................303.3PRVAH-China-2013的遗传进化与分子特征分析......................................................313.3.1PRVAH-China-2013主要糖蛋白基因的PCR扩增................................................313.3.2PRVAH-China-2013的遗传进化分析.....................................................................333.3.3PRVAH-China-2013主要糖蛋白的分子特征分析.................................................363.4PRVAH-China-2013gE缺失转移质粒的构建...........................................................393.4.1同源臂LA和RA的PCR扩增结果.........................................................................393.4.2EGFP基因表达盒的PCR扩增结果.........................................................................403.4.3重组质粒pMD-LA的酶切鉴定结果.......................................................................413.4.4重组质粒pMD-LA-RA的酶切鉴定结果................................................................413.4.5转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的酶切鉴定结果.....................................................423.4.6转移质粒pMD-LA-EGFP-RA中EGFP基因的表达检测.....................................434讨论与结论......................................................................................................................434.1讨论...............................................................................................................................434.1.1我国猪伪狂犬病的流行趋势....................................................................................434.1.2PRVBartha-K61疫苗免疫失败的原因分析.............................................................444.1.3PRVAH-China-2013主要糖蛋白的突变分析..........................................................454.1.4伪狂犬病病毒新流行毒株基因缺失疫苗的研究策略............................................474.2结论...............................................................................................................................47致谢..............................................................................................................................49VIII 1前言1.1伪狂犬病的流行病学伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的多种畜、禽及野生动物发生以发热、奇痒、脑脊髓炎（除猪外）为主要特征的急性传染病，猪是该病毒的自然宿主和贮存宿主（Mulleretal.,2011）。本病于1902年由匈牙利学者Aujeszky最先发现，因此伪狂犬病也叫奥耶斯基氏病(Aujeszky’sdisease)。在我国，伪狂犬病属于二类动物疫病，病猪、带毒猪为本病的重要传染源（娄高明等，1999）。被污染的饲料、带毒鼠、羊等动物也是本病的传染源。此外，带有病毒的空气飞沫可随风传播，感染健康猪群。猪伪狂犬病病毒可通过胎盘垂直传播，导致怀孕母猪发生流产、产死胎及木乃伊胎等。2周龄以内的仔猪发病，死亡率可达100%，主要表现为体温升高、运动不协调、四肢划水样运动等，最后死亡。成年猪一般无症状，呈隐性感染，部分成年猪可表现呼吸道症状、生长缓慢等。我国于1947年首次报道此病，目前至少已有20多个省（市、自治区）流行过该病（杨尚斌等，2012）。自2011年以来，伪狂犬病在我国许多猪场呈爆发流行趋势，使我国的养猪产业面临巨大威胁。1.2我国伪狂犬病的流行现状在2011年之前，由于PRVgE缺失疫苗的广泛使用，我国的伪狂犬病得到了有效控制，但在全国不同区域仍有发病，主要集中在散养户和小型猪场，其原因可能是发病猪场的环境较差、未免疫疫苗或免疫不当等。从2011年至今，国内伪狂犬病再次大面积流行，规模化猪场也开始出现该病的暴发，且表现典型临床症状。抽样检测结果显示，从2012-2013年，华东地区伪狂犬病毒野毒感染情况最为严重，通过检测发现该地区的PRVgE抗体阳性率均超过20%，国内其他地区的PRVgE抗体阳性率相对较低（邹敏等，2015）。出现这种情况一方面是由于猪群的无序流动以及疫苗的不合理使用等，导致猪场伪狂犬病野毒感染率逐年升高（马林风，2014）；另一方面原因，可能是由于我国的伪狂犬病病毒出现了一定程度的变异，导致传统的gE缺失疫苗无法提供完全的免疫保护（Anetal.,2013），因此新型疫苗的研制已是当务之急。1 1.3病原学1.3.1病毒的结构伪狂犬病病毒（Pseudorabiesviurs，PRV）属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Alpha-herpesviridae）。其形态呈圆形或椭圆形，由芯髓、衣壳、间质层和囊膜四部分组成。芯髓部分为PRV的基因组，由线性双链DNA分子组成，被包裹在衣壳中，衣壳呈二十面体立体对称，由162个壳粒组成。衣壳直径约110~150nm，其外覆盖着一层蛋白质，被称为壳皮蛋白或间层蛋白，组成病毒的间质层。囊膜位于病毒的最外层，囊膜表面镶嵌有多种病毒糖蛋白（Pomeranzetal.,2005），在病毒的感染过程中发挥着重要作用，但囊膜裸露的衣壳也具有感染性，相对于完整的病毒而言，其毒力有所降低（Jonsetal.,1996）。1.3.2病毒的理化特性伪狂犬病毒的抵抗力较弱，对乙醚、氯仿和大多数消毒剂敏感。病毒在-8℃能存活46d左右，在14～18℃能存活30d左右，在25℃能存活10d左右（宋耀彬，1982）。病毒经80℃3min或55～60℃30～50min处理即可被灭活。病毒在-70℃以下保存经冷冻真空干燥后，可长期保存。（何启盖等，2000）。1.4病毒的传染特点1.4.1潜伏感染伪狂犬病病毒的潜伏感染问题是目前消灭和根除伪狂犬病所面临的主要困难。病毒经易感猪口、鼻侵入后，经三叉神经、舌咽神经、嗅神经进入嗅球和三叉神经节，并建立潜伏感染。在潜伏感染期间，病毒基因组可长期存在于动物体内，但不产生具有感染性的病毒粒子,因此被感染的动物并不表现任何的临床症状，同时也不向外界排毒（龙晓婷等，2008）。动物在应激和免疫抑制剂等的作用下，处于潜伏状态的病毒可被激活，产生有感染性的病毒粒子，从而导致新的感染的发生（怀济森等，1997）。1.4.2隐性感染当猪群的群体免疫力较强且猪场伪狂犬病病毒数量较少或毒力较弱时，猪群即使受到感染也不会出现明显的临床症状呈现隐性感染，在此状态下，病毒也能在三叉神经节、扁桃体等组织潜伏，在宿主免疫抑制的情况下会重新激活并向外界排毒（薛双等，2012）。此外，在猪群使用疫苗接种后，若猪群没有得到完全的免疫保2 护，也可能发生隐性感染，这种带毒猪排毒可持续一年以上。1.4.3显性感染当猪的免疫力较弱，伪狂犬病病毒入侵数量多且毒力较强时，被感染的猪会出现典型的伪狂犬病的临床症状，呈现显性感染，此感染多发生于妊娠母猪、仔猪，成年猪相对较少。1.5伪狂犬病毒的致病机理PRV是一种高度嗜神经性病毒，主要分布在感染动物的大脑、小脑、脑干和三叉神经节中，在其他组织器官，如扁桃体、肝脏、肺脏和肾脏等部位也可以检测到（龙晓婷等，2008）。机体感染后，病毒首先在咽黏膜和扁桃体内繁殖，在很短的时间内就可以通过嗅神经、舌咽神经和三叉神经等神经组织到达脑和脊髓。病毒也可随血液到达机体各部位，但血液中病毒含量较少，不易检测到（刘博涛等，2008）。PRV入侵机体组织细胞时，其囊膜糖蛋白与细胞表面的相应受体发生特异性结合，从而吸附到细胞表面。PRV吸附细胞可分为不可逆和可逆两个阶段，用肝素钠溶液可将处于可逆吸附阶段的病毒洗脱下来（Hampletal.,1984）。至少有gB、gD、gH、gL四种囊膜糖蛋白参与了PRV与细胞的融合过程（Mettenleiter,1994），且这些糖蛋白在病毒与细胞融合的过程中是缺一不可的。在融合完成后，PRV核衣壳开始释放入细胞中，随后PRV基因组DNA进入到细胞核内，病毒DNA开始转录翻译合成第一个蛋白，即IE180蛋白，以激活PRV早期和晚期基因的表达（Taharaguchietal.,1995）。PRV基因组的复制开始于早期基因合成之后，复制好的基因组被装配到衣壳中，以“出芽”的方式进入到细胞浆中，再在胞浆中装配成完整的病毒粒子，最后经高尔基体转运到细胞外。受感染细胞的形态、功能受损，同时病变细胞周围组织出现炎症反应，引起感染部位的病理变化，进而导致临床症状的出现。1.6伪狂犬病的诊断方法目前伪狂犬病的诊断方法较多，主要有动物接种试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验、PCR、基因芯片技术等。1.6.1动物接种试验-1取流产胎儿的脑组织，加入含双抗的DMEM充分研磨后，于4℃6800r/min3 离心15min，收集上清液，经0.22μm的滤器过滤后，接种至PK-15单层细胞中，当观察到细胞出现明显病变时，将细胞反复冻融3次后收集病毒。将收集的病毒接种于实验兔的腹部皮下或后腿肌肉，在注射病毒液约60h后，接种部位皮肤潮红、出血，并伴有明显的瘙痒症状，实验兔开始舔咬接种部位；在注射病毒液约72h后，实验动物全部死亡，病理解剖显示肺呈肉色病变,肝脏发生淤血（范伟兴，2002）。接种病毒后若出现以上症状即可确诊为伪狂犬病病毒感染。1.6.2酶联免疫吸附试验(ELISA)酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedImmunosorbentassay，ELISA)是目前应用最为普遍的免疫检测方法，它具有简便、快速、特异，敏感的优点，获得许多国家的官方认可。在我国，建立高效、特异、敏感的PRVELISA检测方法一直都是研究PRV检测方法的热点。雷有玲等建立了猪伪狂犬病病毒野毒抗体间接ELISA检测方法，用该方法和国外IDEXXgE-ELISA检测试剂盒同时检测132份血清样品，二者的符合率为96.2%，表明该方法用于检测PRV野毒感染具有较好的准确性（雷有玲等，2014）。苗得园等将特异性单抗引入到传统的ELISA中，建立了检测PRV的夹心ELISA检测方法，提高了传统ELISA检测方法的特异性和敏感性（苗得园等，2001）。吉艺宽等利用表达的gE蛋白主要抗原表位区建立了ELISA检测方法，与IDEXXELISA试剂盒符合率可达93.1%，且具有良好的特异性、敏感性，应用前景良好（吉艺宽等，2015）。1.6.3免疫荧光试验(FA)免疫荧光试验（Immunofluorescenceassay，IFA）也是一种免疫标记技术，即在抗体上加入荧光素，当特异的抗原和抗体结合后，可在荧光显微镜下观察到特异性荧光，从而达到检测的目的。边亚娟等利用抗PRVVP6蛋白单抗建立了检测PRV的间接免疫荧光试验，结果表明该方法的特异性较好，可用于PRV的诊断（边亚娟等，2007）。1.6.4聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）是由美国学者Mullis于1985年发明（常世敏，2004）。该技术是一种通过酶促反应在体外合成特异DNA的方法，其基本原理是通过特异的寡聚核苷酸引物与靶DNA分子结合，在DNA聚合4 酶的催化下，进行核苷酸序列的扩增，从而得到特异的DNA片段。该技术一般由变性、退火和延伸3个步骤构成，不同DNA片段的扩增要求不同的反应体系和反应条件（林梅等，2007）。PCR技术在PRV病原检测方面得到了广泛应用，其简便、快速、准确的特点为PRV的检测提供了许多便利。顾阳等根据PRV的gH和gE基因序列，建立了可以鉴别PRV疫苗毒和野毒的双重PCR检测方法（顾阳等，2014）。田云等根据PRV的gD基因序列，设计了一条探针和一对保守的引物，建立了检测PRV的荧光定量PCR方法（田云等，2009）。蔺芳等根据PRV的gB、gE、TK基因序列设计了三对引物，建立了快速鉴别PRV野毒和疫苗毒的多重PCR检测方法（蔺芳等，2009）。1.6.5基因芯片技术基因芯片技术可以定性、定量地对遗传信息进行分析，其基本过程是通过寡核苷酸原位合成等方法，将探针片段固化于芯片的表面，然后与生物样品进行杂交，采集杂交信号进行分析，从而得出生物样品的遗传信息，最终达到诊断的目的（王洪水等，2007）。刘丽娜等利用基因芯片技术检测了伪狂犬病病毒的gB、gD、gE基因，结果表明该方法能够鉴别PRV野毒和疫苗毒，且其敏感性比普通PCR方法高10倍以上，因此该技术可作为一种重要手段用于PRV的诊断（刘丽娜，2005）。1.7伪狂犬病的防控目前，对于猪伪狂犬病尚无有效的治疗方法，控制该病还是以预防为主，如坚持自繁自养、采取疫苗免疫及加强饲养管理等。1.7.1自繁自养为了防止猪场内PRV等传染病的入侵，猪场应遵循自繁自养的原则。同时，猪场在自繁自养的前提下，也要确保猪场内部无PRV的传播，因此在选种前，首先要对种公猪及后备母猪进行检测，PRV阴性者方可留作种用；在引进种猪时，要将种猪隔离饲养两周，检测其是否携带PRV，确定无PRV后方可作为种用（廖飞等，2015）。1.7.2疫苗免疫疫苗免疫是防控伪狂犬病的最有效措施之一。疫苗免疫虽不能阻止PRV潜伏感染的建立与再激活，但可有效减少体内循环的病毒及阻止疾病的发生。在我国，由于PRVgE缺失疫苗的广泛使用，猪伪狂犬病得到了很好的控制。但自2011年以来，5 我国PRV再次出现了大流行，且新分离毒株出现了一定程度的变异，导致传统的gE缺失疫苗已不能起到完全的免疫保护（Anetal.,2013；Wangetal.,2014；Wuetal.,2013；Yuetal.,2014）。因此，急需研制针对新流行毒株的疫苗。但是，疫苗的免疫效果在很大程度上也取决于猪群本身的状况，例如疾病、营养缺乏和药物滥用等因素导致动物机体的免疫抑制，也可能导致疫苗免疫失败。1.7.3加强饲养管理良好的饲养管理对于伪狂犬病的防控十分重要。首先，保持猪场的清洁是保证猪群健康的重要环节。其次，应加强猪场的卫生防疫体系建设，严格消毒、灭鼠等措施。同时对来往猪场的人员及车辆等也应该进行严格的消毒，以减少病原体进入猪场的可能。1.8病毒重组涉及的研究方法1.8.1同源重组技术DNA同源重组(homologousrecombination)是目前在基因改造中较为成熟且应用最多的实验技术，其原理如图1所示，是将两个DNA分子的同源序列直接进行交换的重组方式，其中的同源序列可以是相同的也可以是相近的。同源重组技术可以重组出新的基因，或是组合出新的等位基因，这项技术提高了种群内遗传物质的多样性，是非常实用的遗传操作方法（向义和，2015）。在目前伪狂犬病病毒的研究中，DNA同源重组技术常被用来改造病毒基因组。范伟兴等用DNA同源重组技术缺失了PRVTK基因部分序列，并在缺失部位插入了EGFP和CSFV-E2基因，构建了表达EGFP和CSFV-E2的TK缺失重组伪狂犬病病毒（范伟兴，2002）。彭金美等利用DNA同源重组技术将绿色荧光蛋白EGFP筛选标记和BAC质粒插入到PRVBarthaK61株的TK基因中，成功对PRV基因组进行了改造（彭金美等，2009）。6 图1基因同源重组示意图1.8.2融合PCR技术融合PCR技术(FusionPCR)是一种高效构建DNA同源重组片段的方法，此方法首先设计具有互补末端的引物，在扩增出带有重叠链的PCR产物，最后通过延伸PCR产物重叠链，将不同源的任意几段DNA片段连接在一起，此方法不需要连接酶和限制性内切酶的处理，从而省去了许多繁琐的步骤，极大地节约了构建DNA同源重组片段的时间。Robert等应用融合PCR方法，将3个基因片段融合，最终成功获得了由3个片段组成的融合产物（Davidsonetal.,2002）。Majid等运用分步的融合PCR方法，成功完成了4个基因片段的融合（Zarrinetal.,2005）。李敏等改进了融合PCR方法，使3~4段基因片段的融合反应可以同时进行，且每个基因片段都在4~5kb以上，大大增加了该方法的实用性（李敏等，2007）。1.8.3外源基因转染细胞技术外源基因转染细胞技术是将外源基因掺入到真核细胞中，并获得新遗传特性的过程。细胞转染技术分为稳定转染和瞬时转染两类，稳定转染是指外源基因通过一定方式整合到宿主细胞的基因组中，并且能够稳定遗传和长期表达目的蛋白的转染类型（Gloveretal.,2005）；瞬时转染是指外源基因不整合到宿主细胞的基因组中，7 且持续时间较短，转染进的外源基因会随着细胞分裂或环境因素的改变而丢失（Recillas-Targa,2006）。外源基因转染细胞技术不仅是研究基因突变、表达等的常规工具，也是基因免疫、基因治疗及基因功能研究等的技术和理论基础。外源基因转染细胞技术有多种方法，除病毒载体外，目前主要有脂质体转染法、磷酸钙共沉法、基因枪轰击法及电穿孔法等（王月丽等，2014）。1.8.4病毒空斑技术病毒空斑技术是病毒学研究中不可或缺的基本方法，其不仅可用于测定病毒的感染性、病毒滴度，而且可以用于筛选病毒突变株、纯化病毒和检测干扰素、病毒抗体或抗病毒的其他药物。病毒空斑技术作为一种基本的实验技术，运用较为广泛，其基本方法有琼脂细胞悬浮法和细胞单层法两种，前者步骤较为简便，敏感性高，但需高活力高浓度的细胞，且不适用于直径>120~150nm的病毒，空斑较为模糊，此法应用较少；后者空斑清晰，且病毒大小不影响效果，能够固定染色，目前此法应用较多。（孟继鸿等，1989）。1.9研究的目的和意义目前，许多发达国家已采用PRVgE缺失疫苗及相应鉴别诊断方法成功根除伪狂犬病。在2011年之前，我国广泛使用PRVgE缺失疫苗来防控伪狂犬病，使该病得到了很好的控制，但在2011年年末，我国PRV再次出现了大流行，且新分离毒株出现了一定程度的变异，导致传统的gE缺失疫苗已不能提供完全的免疫保护。关于国内PRV再次暴发的原因，目前还不是很清楚。本研究拟对PRV新流行毒株进行遗传进化分析及主要糖蛋白gB、gC、gD、gE的分子特征分析，为进一步深入研究PRV新流行毒株的变异机制提供理论依据。在此基础上，本研究拟利用PRV新流行毒株的同源序列，构建携带绿色荧光蛋白标记基因的gE缺失重组转移质粒，为PRV新流行毒株gE缺失突变株的构建及其疫苗研制奠定一定的基础。8 2材料与方法2.1材料2.1.1细胞、菌种、质粒和动物细胞：PK-15细胞，即猪肾上皮细胞；BHK-21细胞，幼年叙利亚地鼠肾细胞。由华南农业大学兽医学院兽医微生物学与免疫学教研室提供。菌种：E.coliDH5α工程菌：由华南农业大学兽医学院微生物教研室保存，基因型为：hsdR17（rk-mk+），supE44thi-1，recA1，gyrA（Nalr），recA1，∆（lacZYA-argF），u169（m80lacZ∆M15）。质粒：pEGFP-N1荧光质粒，能够表达荧光蛋白，在荧光显微镜下观察发绿色荧光（其物理图谱见附录A）动物：6-10周龄SPF级雌性昆明小鼠，购于南方医科大学实验动物中心。2.1.2酶类相关试剂LATaq酶、PrimerStar酶、限制性内切酶EcoRⅠ、EcoRⅤ、HindⅢ、PstⅠ、T4DNA连接酶，DNAMarker均购于TaKaRa公司；胰酶是GIBCO公司产品；质粒抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购于OMEGA公司；胎牛血清、DMEM培养液是Hyclone公司产品；DMSO是Sigma公司产品；一次性细胞培养皿、细胞冻存管、巴氏吸管、氨苄青霉素、细胞裂解液、琼脂粉、LB肉汤培养基、蛋白酶K、EB替代物均购于广州健阳生物技术有限公司；一次性无菌手套和口罩、脱脂棉花、酒精购自广州芸荟生物技术有限公司；Tris饱和酚、异戊醇、无水乙醇、氯仿、冰乙酸、氯化钾、氢氧化钠、氯化钠等均为国产分析纯。2.1.3细胞培养用溶液PBS缓冲液：14.16gNaCl，0.69gNaH2PO4·H2O，0.89gNa2HPO4·2H2O，加ddH2O至400mL，待完全溶解后，调节pH值至7.4，最后定容到500mL，保存于4℃冰箱中备用。细胞生长液：在DMEM培养液中，加入终浓度为15%的胎牛血清，再加入终浓度为1%的青链霉素溶液，充分混匀后保存于4℃冰箱中备用。细胞维持液：在DMEM培养液中，加入终浓度为2%的胎牛血清，再加入终浓度为1%的青链霉素溶液，充分混匀后保存于4℃冰箱中备用。细胞冻存液：按照血清：DMEM：DMSO=5：4：1的比例配制。9 2.1.4病毒DNA抽提相关溶液蛋白酶K（10mg/mL）：在9.5mLddH2O中加入100mg的蛋白酶K，充分摇动至蛋白酶K完全溶解后，定容至10mL，分装贮存于-20℃冰箱中。苯酚、氯仿、异戊醇混合液（25:24:l）：分别吸取Tris饱和酚25mL、氯仿24mL和异戊醇1mL，充分混匀后避光保存。2.1.5细菌培养基及常用溶液LB液体培养基：称取21gLB肉汤粉末溶于适量ddH2O中，待粉末充分溶化后，调节pH值至7.0，最后用ddH2O定容至1000mL，高压灭菌后贮存于4℃冰箱中备用。LB固体培养基：将琼脂粉加入到LB液体培养基中使其终浓度为1.5%（w/v），高压灭菌后，冷却至不烫手时，迅速适量地加到无菌平皿内，在室温中凝固后置4℃冰箱中保存备用。氨苄青霉素贮存液：用ddH2O配成100mg/mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃冰箱中保存备用。LB液体选择性培养基：在LB液体培养基中加入氨苄青霉素（Amp），使其终浓度为100μg/mL，4℃冰箱中保存备用。LB固体选择性培养基：将琼脂粉加入到LB液体培养基中使其终浓度为1.5%（w/v），高压灭菌后，冷却至不烫手时加入适量Amp，使其终浓度为100μg/mL，摇匀后加到无菌平皿内，在室温中凝固后置4℃冰箱中保存备用。2.1.6琼脂糖凝胶电泳缓冲液50×TAE缓冲液（50mL）：将12.1gTris碱、1.86gNa2EDTA·2H2O、2.85mL冰乙酸，用ddH2O定容至50mL后保存于室温，使用时需再配制成工作浓度为1×TAE缓冲液。2.1.7主要仪器设备Bio-Rad公司PCR扩增仪、核酸电泳仪；广州誉为凝胶成像及分析系统；ThermoORIORSTARpH计；美的电磁炉和微波炉；BarnsteadMaxQ4000恒温振荡摇床；Thermo低速冷冻离心机；TS-1转移脱色摇床；ELGAPURELABUltra纯水仪；苏州AIRTECH超净工作台；GRANTXB-70雪花制冰机；光学倒置显微镜(Nikon)；MEMMOL/LERAT恒温培养箱；EppendorfBioPhotometer分光光度计；10 IKA®RCTbasic磁力搅拌器；MN-1型微量振荡器；SartoriusBS224S电子天平；OptimaL-100XP超速离心机（Beckman）；EppendorfCentrifuge5415R离心机；XHE-D型高速电动匀浆机；-40℃低温冰箱（中科美菱）；ThermoCO2培养箱；CRYOSYSTEM4000液氮罐；全自动高压灭菌锅(Tommy)。2.2方法2.2.1PRVAH-China-2013的分离与鉴定2.2.1.1病料的处理取得安徽一受PRVgE缺失疫苗保护猪场流产小猪，取其脑、心、肝、脾、肺、肾等组织，分别做好标记后，将病料组织分别置于于研钵中充分研磨，再分别加入5mLDMEM溶液混匀，将其置于离心机中4℃6800r﹒min-1离心15min，小心吸取上清液，用0.22μm的滤器过滤上清液，做好标记。2.2.1.2病毒DNA的提取（1）各取出500μL2.2.1.1中的上清液置于5mL无菌离心管中。（2）加入蛋白酶K（10mg/mL）5μL，10%SDS25μL，于50℃的水浴锅中作用2～3h。（3加入等量的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分混匀后，于离心机中12000r/min离心10min，抽取上清液，重复2～3次。（4）于上清液中加入上清液2倍体积的无水乙醇，在室温中静置30min，于离心机中12000r/min离心10min，弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀一次，风干后用30μL双蒸水或TE溶解沉淀，分别做好标记后，-20℃贮藏备用。2.2.1.3PRVgE基因的PCR扩增参考GenBank登录的PRVgE基因序列(登录号：AF171937)，设计1对引物扩增PRVgE基因用于检测，如下表:11 表1扩增gE基因的引物序列基因名称上游引物（5′-3′）下游引物（5′-3′）gEgacgatgacctcaacggccgagaagagctgcgagtg用2.2.1.2中抽提的各组织病料的DNA作为模板进行PCR扩增，条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环;72℃终延伸10min．PCR产物经0.01g·mL－1琼脂糖凝胶电泳检测．2.2.1.4细胞培养与病毒的接种细胞培养：（1）从液氮保存罐中取出冻存的BHK-21细胞一支，于37℃水浴锅中快速解冻后放入离心机中1000r/min离心5min。（2）小心弃去上清后加入1mL细胞培养液并轻轻混匀，接着将其加入到细胞培养皿中，补入适量的细胞培养液后再次混匀后，于37℃5%CO2的细胞培养箱中培养。（3）当细胞已充分贴壁后更换新的细胞培养液继续培养。（4）当细胞长满培养皿底壁时，弃去细胞培养液，加入0.25%胰酶消化细胞，等到细胞间出现空隙或细胞变圆后，弃掉胰酶，加入适量的细胞培养液轻轻反复吹悬，尽量使细胞分散成单个细胞，分装于多个培养皿中，再在每个培养皿中补加适量细胞培养液。（5）将培养皿置于37℃细胞培养箱中培养，逐日观察细胞形态。病毒增殖：（1）当BHK-21细胞长满培养皿底部80%-90%时，弃掉培养液。（2）加入适量处理好的脑组织病料上清液和细胞维持液，轻轻混匀后放入37℃5%CO2的细胞培养箱中吸附1h，每间隔15min轻轻摇晃一次。（3）取出细胞，补加适量细胞维持液，继续在37℃5%CO2的细胞培养箱中培养24~72h。（4）待大部分细胞出现病变后，从培养箱中取出并置于-20℃冰箱中，完全冻结后置于室温自然解冻，如此反复冻融3次，以使细胞完全从培养皿上脱落及裂解。（5）收集病毒液并做好标记，置于-80℃贮藏备用。12 2.2.2PRVAH-China-2013株的空斑纯化与TCID50的测定2.2.2.1PRVAH-China-2013株的空斑纯化（1）将已准备好的BHK-21细胞消化均匀铺于6孔板中。（2）细胞长成单层后吸去培养液，将病毒做10倍稀释，共做5个梯度并向每孔滴加1.0mL稀释好的病毒液,置37℃吸附2小时后弃残液，并用PBS洗细胞3次。（3）制备2％的低熔点琼脂糖，置40-50℃水浴待用。（4）将上述琼脂糖和2×无酚红DMEM等量混合后，加入培养板各孔，每孔2mL，使冷却凝固成覆盖层。（5）把培养板倒置，在37℃5%CO2培养箱培养48h。（6）将0.001%中性红加入培养板各孔，每孔1mL，在37℃5%CO2培养箱染色2-3h，待白色空斑出现。（7）挑取空斑接种BHK-21细胞进行扩大培养。2.2.2.2PRVAH-China-2013株TCID50的测定（1）取出长满单层BHK细胞的培养皿，用胰酶消化细胞后，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液至15mL左右，轻轻摇匀。（2）将配好的培养液加入到96孔微量培养板中，每孔100uL。（3）病毒的倍比稀释：取出10个高压灭菌后的1.5mL离心管，向每管中加入900uLDMEM溶液；在第一管中加入100uL的PRVAH-China-2013病毒液，混匀后取出100uL到第二管中，一次稀释到第十管。（4）取出第一管病毒液加到96空微量培养板中的第一列，每孔100uL。往后依次加入稀释好的10管病毒液，每孔100uL。在第11、12列中加入100uLDMEM溶液作为阴性对照。（5）将96空微量培养板置于细胞培养箱中，逐日观察并记录结果。伪狂犬病毒的TCID50测定一般需要观察4~5天左右。13 （6）结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法注：CPE：Cytopathiceffect距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数2.2.3PRVAH-China-2013的致病性实验（1）将30只5周龄的昆明小鼠平均分成6组，分别命名为第一组、第二组、第三组、第四组、第五组、第六组。-1-2-3-4（2）用DMEM溶液稀释PRVAH-China-2013病毒液至10、10、10、10稀释度待用。（3）第一组小鼠肌肉注射100μL未稀释的病毒液作为阳性对照，第二组、第三-1-2-3-4组、第四组、第五组分别接种10、10、10、10稀释度的病毒液，第六组接种100μLDMEM作为阴性对照。（4）每天对小鼠的临床症状和死亡情况进行观察、记录，根据试验结果计算出病毒的LD50。2.2.4PRVAH-China-2013主要糖蛋白基因片段的克隆与鉴定2.2.4.1PRVAH-China-2013病毒基因组DNA的抽提（1）取出-80℃冰箱中保存的500μLPRVAH-China-2013病毒液，于室温阴凉处融化（2）、加入蛋白酶K（10mg/mL）5μL，10%SDS25μL，于50℃的水浴锅中作用2～3h。（3）加入等量的苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分混匀后，于离心机中12000r/min离心10min，抽取上清液，重复2～3次。（4）于上清液中加入上清液2倍体积的无水乙醇，在室温中静置30min，于离心机中12000r/min离心10min，弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀一次，风干后用30μL双蒸水或TE溶解沉淀，-20℃贮藏备用。2.2.4.2PRVAH-China-2013主要糖蛋白基因片段的引物设计参照GenBank登录的伪狂犬病病毒新流行毒株ZJ01（GI:32187339）为模板，用软件Primer5.0分别设计PRV主要糖蛋白gB、gC、gD、gE完整基因序列的引物，14 引物由生工生物（上海）有限公司合成。具体如表2：表2扩增主要糖蛋白基因的引物序列基因名称上游引物（5′-3′）下游引物（5′-3′）gBccgctgttcttcttgctggtgcgtcagtgagttgCggggggccattcgcagcgggggcgtcacaggDgccatgctgctcgcactgcggaggctacgggEggggttgagaccatgcggcggttctcccggtattta2.2.4.3PRVAH-China-2013主要糖蛋白基因片段的克隆与鉴定以抽提的PRVAH-China-2013病毒基因组DNA为模板，建立gB、gC、gD、gE基因片段的PCR扩增反应体系为：ddH2O6.3μLdNTP（2.5mmol/L）2.0μL2×GCbufferⅡ12.5μL上游引物（10μmol/L）1.0μL下游引物（10μmol/L）1.0μLLATaq酶0.2μLTemplate2.0μL总体积25.0μL按照上述体系加样后，采用PCR技术分别扩增gB、gC、gD、gE基因片段，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火温度45s，72℃延伸2min，循环30次；72℃末次延伸10min，4℃保存。gB、gC、gD、gE基因的PCR扩增最适退火温度分别为：50、56、58、55℃。扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳和送公司序列测定以鉴定各基因片段。15 2.2.5PRVAH-China-2013主要糖蛋白基因序列测序结果的分析用软件mega5.0制作出已得PRVAH-China-2013主要糖蛋白基因片段的进化树，确定PRVAH-China-2013是否为PRV新型流行毒株；将各糖蛋白基因序列与国内外经典PRV毒株主要糖蛋白的基因序列进行比对，记录突变情况；查找国内外文献，确定突变区域的功能，以期从分子水平上解释2011年PRV大面积爆发的原因。2.2.6PRVAH-China-2013gE缺失转移质粒的构建2.2.6.1同源臂基因片段LA和RA的引物设计参照GenBank登录的伪狂犬病病毒新型流行毒株ZJ01（GI:32187339）序列，用软件Primer5.0分别设计同源臂左臂（LA）和同源臂右臂（RA）的引物，在LA的5’端引入EcoRⅠ酶切位点；在RA的5’端依次引入PstⅠ、EcoRⅤ酶切位点，再在其3’端引入HindⅢ酶切位点。LA和RA分别位于gE基因的上下游，引物由生工生物（上海）有限公司合成。具体如表3。表3扩增同源臂基因的引物序列引物名称引物序列(5’→3’)扩增位置(nt)扩增长度(bp)LAF1：ccggaattcaccagcaccgcacgtacaagtt120511-121349838R1：cagcagcgtcccgtctatcgtRAF2：aaactgcaggatatccggaagtgacgaatgg124033-124994961R2：ctcggtggtgatgtagaaaagcttggg2.2.6.2同源臂基因片段的克隆与鉴定以抽提的PRVAH-China-2013病毒基因组DNA为模板，建立同源臂基因片段的PCR扩增反应体系为：ddH2O6.3μLdNTP（2.5mmol/L）2.0μL2×GCbufferⅡ12.5μL16 上游引物10μmol/L）1.0μL下游引物（10μmol/L）1.0μLLATaq酶0.2μLTemplate2.0μL总体积25.0μL按照上述体系加样后，采用PVR技术分别扩增LA、RA基因片段，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火45s，72℃延伸2min，循环30次；72℃末次延伸10min，4℃保存。LA、RA基因的PCR扩增最适退火温度分别为60℃和55℃，扩增片段送公司测序鉴定。2.2.7绿色荧光蛋白基因EGFP的PCR扩增2.2.7.1引物设计与合成参照GenBank登录的荧光质粒pEGFP-N1序列（GI:1377911），设计1对引物扩增片段EGFP，在其上有引物的5’端依次引入EcoRⅤ和PmeⅠ酶切位点，在其下游引物的3’端引入EcoRⅤ酶切位点，扩增区包含完整表达盒的荧光基因序列。引物由生工生物（上海）有限公司合成。引物信息见表4。表4扩增EGFP基因的引物序列引物名称引物序列(5’→3’)扩增位置(nt)扩增长度(bp)EGFPF1：aacgatatcgtttaaacgttctttcctgcgttatcc4679-17551809R1：aacgatatcaaccctatctcggtctattct2.2.7.2EGFP基因片段的PCR扩增以荧光质粒pEGFP-N1为模板，建立EGFP基因片段的PCR扩增反应体系为：ddH2O6.3μLdNTP（2.5mmol/L）2.0μL17 2×Buffer12.5μL上游引物（10μmol/L）1.0μL下游引物（10μmol/L）1.0μLPrimerStar酶0.2μLTemplate2.0μL总体积25.0μL上述反应体系混匀后，将EGFP基因片段PCR的扩增条件设置为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃终延伸10min。反应结束后，取5ul的PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。2.2.8转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的构建与表达2.2.8.1EGFP基因PCR产物的回收与纯化根据OMEGA公司的DNA凝胶回收试剂盒（E.Z.N.A®GelExtractionKitI）使用说明，对pEGFP-Y基因片段的PCR产物进行回收。具体步骤为：（1）通过琼脂糖凝胶电泳扩增出p-EGFP-Y的基因片段，用无菌的刀片将p-EGFP-Y的基因片段从琼脂中分离出来，放入离心管中待用。（2）向离心管中按照1g/1mL的量加入BindingBuffer，于55℃水浴锅中加热使琼脂融化，加热期间应不断摇匀。（3）将融化后的琼脂液全部转移至组装好2mL收集管的Hibindspin-colum吸附柱中，室温12000r/min离心1min，弃去收集管中的液体。（4）加入750μL用无水乙醇稀释的SPWBuffer，于室温中静置2min，弃去收集管中的液体，重复次步骤后空管12000r/min离心1min。（5）弃去收集管并用干净的1.5mL离心管代替，加30μL无菌的ddH2O至柱的膜中央，室温下12000r/min离心1min。1.5mL离心管中的液体即为回收的目的DNA片段。（6）回收产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果，回收产物于-20℃保存备用。2.2.8.2LA片段与T载体的连接按照2.2.8.1的方法纯化同源臂LA的基因片段，并将F1基因纯化产物连接至18 pMD18-Tvector中，连接体系为:LigationsolutionⅠ5.0µLF1片段纯化产物4.5µLpMD18-Tvector0.5µL总体积10.0µL将各组分轻轻混匀后，于16℃连接仪中连接过夜。2.2.8.3DH5α感受态细胞的制备（1）将DH5α菌液涂在无抗性的LB培养皿中，在37℃5%CO2的培养箱中培养14-16h。（2）从培养皿中挑取DH5α单菌落于4mL无抗性的LB培养液中，37℃，200r/min的摇床中培养14-16h。（3）按1:100的量加至50mL新鲜无抗性的LB培养液中，37℃，200r/min振荡培养至OD600为0.5～0.6；将培养好的菌液冰浴30min。（4）4℃4000r/min离心10min，弃去上清液，用适量的冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬沉淀，再次冰浴30min。（5）4℃4000r/min离心10min，弃去上清；向沉淀中加入适量的冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液和终浓度15%的无菌甘油，轻轻重悬后分装于1.5mL无菌离心管中，于-80℃贮存备用。2.2.8.4重组质粒pMD-LA的转化（1）取出冷冻保存的DH5α感受态细胞，于冰上融化后加入F1和T载体的连接产物5μL，同时设立pMD18-Tvector自环质粒的阳性对照，和空白感受态细胞对照，轻轻混匀后冰浴30min。（2）42℃水浴锅中热激90s，立即冰浴2min。加入500μL新鲜LB液体培养基，在恒温摇床中37℃，200r/min震荡45min。（3）4℃4000r/min离心5min，弃去上清500μL，剩余100μL菌液轻轻吹悬后，涂布在含Amp（100μg/mL）的LB琼脂平板上。19 （4）正面放置吸收10min后，37℃倒置培养12～16h。2.2.8.5重组质粒pMD-LA的筛选（1）在无菌试管中加入4mLLB液体培养基和4μL氨苄青霉素（100mg/mL）（2）每个平皿选取5个单菌落，做好标记后，用无菌镊子夹取100μL枪头挑取菌落，将枪头置于试管中。37℃，200r/min的摇床中培养14-16h。（3）取400μL菌液加到无菌的1.5mLEp管中，室温12000r/min，离心2min，弃上清后每管加ddH2O30μL吹悬菌体，于沸水中煮5-10min。（4）每管取2μL作为模板进行PCR检测，反应体系同2.2.5.2。（5）用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，选择条带较亮的对应菌液进行质粒抽提。2.2.8.6重组质粒pMD-LA的抽提®使用OMEGA公司的质粒小提试剂盒（E.Z.N.A.TMPlasmidMiniKitI），对重组质粒F1-T进行抽提，步骤如下：（1）将菌液加入1.5mL无菌离心管中室温10000g离心1min，弃去上清后重复该步骤2-3次。（2）弃去上清后，加250μLSolutionⅠ/RnaseA，轻轻重悬菌体。（3）加250μLSolutionⅡ，轻轻上下颠倒离心管4～6次，室温静置2min直至菌液变得清亮即可。（4）加350μLSolutionⅢ，，轻轻上下颠倒离心管直至出现白色沉淀，12000r/min离心10min。（5）离心后的上清转移到组装好收集管的HB离心柱中，室温12000r/min离心1min。（6）弃掉收集管中的液体，于HB柱内加入500μLBufferHB，在室温条件下12000r/min离心1min。（7）弃掉收集管中的液体，于HB柱内加入700μLDNAWashBuffer，在室温条件下12000r/min离心1min。重复次步骤一次。（8）空柱12000r/min离心1min,将HB离心管柱置于新的无菌1.5mLEp管中，向柱中加入30μLddH2O,12000r/min离心1min收集重组质粒。（9）用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提效果，于-20℃冰箱中保存备用。20 2.2.9重组质粒pMD-LA-RA的构建2.2.9.1pMD-LA质粒与RA基因片段的双酶切用限制性内切酶PstⅠ和HindⅢ对pMD-LA质粒和RA基因片段的PCR纯化产物进行双酶切，在37℃水浴锅中酶切4h后，用1.0％琼脂糖凝胶进行检测。反应体系如下：pMD-LA5.0µLddH2O11.0µL10×BufferM2.0µLHindⅢ1.0µLPstⅠ1.0µL总体积20.0µLRA5.0µLddH2O11.0µL10×BufferM2.0µLHindⅢ1.0µLPstⅠ1.0µL总体积20.0µL2.2.9.2酶切产物的连接用2.2.7.1的纯化方法纯化pMD-LA质粒和RA基因片段的酶切产物，接着将纯化后的酶切产物连接，连接体系如下：21 RA基因片段酶切回收产物12.0µLpMD-LA酶切回收产物5.0µL10×T4ligationBuffer2.0µLT4连接酶1.0µL总体积20.0µL按照上述体系加完样后，轻轻混匀，16℃连接4小时以上。2.2.9.3重组质粒pMD-LA-RA的转化具体操作步骤参照2.2.8.4方法进行。2.2.9.4重组质粒pMD-LA-RA的筛选具体操作步骤参照2.2.8.5方法进行。2.2.9.5重组质粒pMD-LA-RA的抽提具体操作步骤参照2.2.8.6方法进行。2.2.9.6重组质粒pMD-LA-RA的双酶切鉴定反应体系如下：pMD-LA-RA5.0µLddH2O11.0µL10×BufferM2.0µLHindⅢ1.0µLPstⅠ1.0µL总体积20.0µL将上述混合液瞬时离心混匀，然后37℃水浴锅中作用4h。取适量的酶切产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。22 2.2.10转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的构建2.2.10.1pMD-LA-RA质粒和EGFP基因片段PCR纯化产物EcoRⅤ的单酶切反应体系如下：pMD-LA-RA5.0µLddH2O11.0µL10×BufferH2.0µLEcoRⅤ2.0µL总体积20.0µLEGFP回收产物5.0µLddH2O11.0µL10×BufferH2.0µLEcoRⅤ2.0µL总体积20.0µL将上述混合液瞬时离心混匀，然后37℃水浴锅中作用4h。取适量的酶切产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。2.2.10.2pMD-LA-RA和EGFP酶切产物的回收纯化具体操作步骤参照2.2.7.1方法进行2.2.10.3pMD-LA-RA质粒单酶切回收产物的去磷酸化将pMD-LA-RA质粒单酶切回收产物去磷酸化处理，其反应体系如下：23 Shrimp（去磷酸化酶）5.0µL10×Buffer5.0µLpMD-LA-R回收产物6.0PmolddH2O加至50.0µL总体积50.0µL按照上述体系加完样品后，先在37℃的水浴锅中反应30min，再在65℃水浴锅中灭活去磷酸化酶15min，接着使用DNA清洁试剂盒将去磷酸化后的片段回收纯化，具体步骤如下：（1）计算去磷酸化后总反应液的体积，向其中加入5被该体积的BufferPC，充分混匀。（2）将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入20ulBufferPS，室温12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（3）将（1）中的溶液加入到吸附柱中，室温静置2min，室温12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（4）向吸附柱中加入650ulBufferPW（已加入无水乙醇），室温12000g离心1min，倒掉收集管中的废液。（5）将吸附柱重新放回收集管中，室温12000g空管离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温中晾干。（6）将吸附柱放入一个新的离心管中，向吸附膜中央加入30~50ulBufferEB，室温放置2min后，室温12000g离心2min，收集溶液，-20℃保存备用。2.2.10.4pMD-LA-RA质粒单酶切回收产物与EGFP单酶切回收产物的连接反应体系如下：pMD-LA-RA质粒单酶切回收产物4.0µLEGFP单酶切回收产物13.0µL10×T4ligationBuffer2.0µLT4连接酶1.0µL总体积20.0µL24 加完样后，轻轻混匀，16℃连接4小时以上。2.2.10.5转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的转化具体操作步骤参照2.2.8.4方法进行。2.2.10.6转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的筛选具体操作步骤参照2.2.8.5方法进行。2.2.10.7转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的抽提具体操作步骤参照2.2.8.6方法进行。2.2.10.8转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的酶切鉴定反应体系如下：F1-EGFP-Y-F2质粒5.0µLddH2O11.0µL10×BufferH2.0µLEcoRⅤ2.0µL总体积20.0µL2.2.11转移质粒pMD-LA-EGFP-RA基因的表达检测2.2.11.1转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的去内毒素抽提根据OMEGA公司的去内毒素抽提试剂盒，抽提不含内毒素的pMD-LA-EGFP-RA质粒，具体步骤如下：（1）将转化后扩大培养的菌液置于10000g/min的离心机中，室温离心1min后用25 1.5mL离心管收集菌体。（2）弃去离心管中的上清，添加250μLSolutionⅠ/RnaseA，轻轻地重悬菌体。（3）添加250μLSolutionⅡ，轻轻上下翻转混匀4-6次至溶液清亮，室温静置2min。（4）加入125μL冰预冷的BufferN3，轻轻上下翻转至出现白色沉淀后，于12000g/min的离心机中，4℃离心10min。（5）用移液枪吸取离心后上清至新的1.5mL离心管中，加入总体积1/10的ETRSolution，轻轻上下翻转7-10次，于冰中静置10分钟，期间多次轻轻翻转摇匀。（6）将离心管放入42℃水浴锅中加热5min至上清再次浑浊后，室温12000g离心3min，离心管底出现蓝色沉淀。（7）用移液枪吸取上清至新的1.5mL离心管中，加入总体积1/2的无水乙醇，轻轻混匀6-7次，于室温中静置2min。（8）用移液枪将混合液移至HinBindTM柱子中，室温10000g离心2min。（9）在HinBindTM柱子中加入500μLBufferHB，室温10000g离心1min，弃去收集管中的滤液。（10）在HinBindTM柱子中加入700μLWashBuffer，室温10000g离心1min。（11）重复步骤（10）。（12）室温12000g空管离心2min。（13）在HinBindTM柱子下换上新的1.5mL离心管，向HinBindTM柱子加入30-50μLEndotoxin-FreeElutionBuffer（或ddH2O），静置2min后，室温13000g离心2min，1.5mL离心管中的液体即是无内毒素的重组质粒pMD-LA-EGFP-RA。2.2.11.2转移质粒pMD-LA-EGFP-RA在BHK细胞中的转染表达使用Lipofectamine®2000Reagent转染试剂进行转染，具体步骤如下：（1）准备好足够量的无内毒素的的重组质粒pMD-LA-EGFP-RA，将BHK细胞均匀传入无菌的24空细胞培养皿，让细胞长满皿底的70-90%左右。（2）将48μL的转染试剂加入到600μL的Opti-MEM培养液中进行稀释，再把12μg的质粒加入到600μL的Opti-MEM培养液中进行稀释。将两者混在一起，轻轻摇匀，室温静置5min。26 （3）弃去24孔细胞培养皿中的细胞培养液，用PBS清洗细胞三遍，每孔分别加入500μL含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液。（4）分别每孔加入混合静置后的转染试剂50μL，轻轻摇匀。（5）将细胞放入37℃5%CO2的细胞培养箱中培养12h，于荧光显微镜下观察转染效果。3结果与分析3.1PRV的分离与鉴定3.1.1疑似病料的PCR扩增结果从流产胎儿脑、心、肝、脾、肺、肾中抽提DNA进行PRVgE基因的PCR扩增。结果显示脑、脾、肝、肺组织的gE基因PCR呈阳性，心、肾组织的gE基因PCR呈阴性（图2）。结合发病猪场所使用的疫苗为PRVgE缺失的BarthaK61疫苗这一情况推断，该猪场可能存在PRV野毒感染，因此有必要通过病毒分离鉴定进一步证实。由PCR扩增条带的明亮程度可见，脑组织中的PRV含毒量最高，因此选取脑组织作为后续病毒分离的首选材料。图2疑似病料中PRVgE基因的PCR扩增结果M：DL2000DNAMarker；1：肝；2：心；3：脑；4：肾；5：脾；6：肺；7：阴性对照；8：阳性对照。3.1.2病料接种细胞产生的细胞病变将流产胎儿脑组织经研磨、过滤后接种BHK-21细胞，在37℃5%CO2细胞培27 养温箱中培养48h后，BHK-21细胞出现明显的细胞病变，主要表现为细胞肿胀、变圆、聚集等（图3）。图3脑组织病料接种BHK-21细胞后的病变情况(×100)左图为正常的BHHK-21细胞，右图为病变的BHK-21细胞（接种36h）3.1.3病变细胞的PCR检测将病变细胞反复冻融3次后，在BHK-21细胞上连续传3代，收集病毒，提取病毒基因组作为模板进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了PRVgE基因的特异性扩增条带，大小是552bp，与预期结果一致（图4），证实病变细胞中含有PRV病毒。图4病变细胞中PRVgE基因的PCR扩增结果M：DL2000DNAMarker；1：病变的BHK-21细胞；2：阴性对照28 3.2PRV的空斑纯化与致病性实验3.2.1PRV的空斑纯化将PRV病毒液进行连续10倍稀释，接种到已长满细胞单层的6孔细胞培养板上-5-6进行病毒的空斑纯化，结果表明在10、10孔出现有单个空斑（图5），挑取单个空斑接种BHK-21细胞进行扩大培养，经空斑纯化获得的病毒命名为PRVAH-China-2013。图5PRVAH-China-2013株的空斑纯化3.2.2PRVAH-China-2013TCID50的测定采用Karber法计算PRVAH-China-2013的TCID50，具体结果见表5。表5PRVAH-China-2013TCID50的测定结果病毒液稀释度出现CPE的孔数出现CPE孔的比率-11081（8/8）-21081（8/8）-31081（8/8）-41081（8/8）29 -51081（8/8）-61060.75（6/8）-71040.5（4/8）-81030.375（3/8）-91010.125（1/8）-101000（0/8）lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数；d：稀释度对数之间的差；s：阳性孔比率总和；lgTCID50=-1-1×(6.75-0.5)=-7.25-7.25TCID50=10/0.1mL3.2.3PRVAH-China-2013的致病性实验-1-2将PRVAH-China-2013按不同剂量接种小鼠后，接种10和10稀释度病毒液-3-4的小鼠全部死亡，接种10稀释度病毒液的小鼠有3只发生死亡，接种10稀释度病毒液的小鼠未发生死亡，具体死亡情况见图6和表6。所有接种死亡的小鼠都表现典型的伪狂犬病症状，如神经症状和奇痒症状。根据小鼠的死亡情况，按Karber法4.15计算出PRVAH-China-2013对5周龄昆明小鼠的LD50为10TCID50。表6PRVAH-China-2013对小鼠的LD50测定结果病毒稀释度病毒滴度小鼠死亡数量（只）小鼠死亡的比率7.25原液10TCID5051（5/5）-16.251010TCID5051（5/5）30 -25.251010TCID5051（5/5）-34.251010TCID5030.6（3/5）-43.251010TCID5000（0/5）空白000（0/5）lgLD50=L-d(s-0.5)L：最高稀释度的对数；d：稀释度对数之间的差；s：小鼠死亡比率总和；lgLD50=-1-1×(2.6-0.5)=-3.1-3.1-3.17.254.15LD50=10/0.1mL=10×10TCID50=10TCID503.3PRVAH-China-2013的遗传进化与分子特征分析3.3.1PRVAH-China-2013主要糖蛋白基因的PCR扩增以提取PRVAH-China-2013基因组为模板，利用PCR分别扩增其gB、gC、gD、gE基因，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了预期大小的扩增条带，序列测定结果显示gB、gC、gD、gE基因大小分别为2887bp、1464bp、1106bp、1720bp（图6-9）。3.3.1.1PRVAH-China-2013株gB基因的PCR扩增结果所扩增gB基因全长2887bp，实验结果与预期相符，如下图所示：31 图6PRVAH-China-2013gB基因的PCR扩增M：DL10000DNAMarker1：阴性对照2：gB基因3.3.1.2PRVAH-China-2013株gC基因的PCR扩增结果所扩增gC基因全长1464bp，实验结果与预期相符，如下图所示：图7PRVAH-China-2013gC基因的PCR扩增M：DL10000DNAMarker1：阴性对照2：gC基因3.3.1.3PRVAH-China-2013株gD基因的PCR扩增结果所扩增gD基因全长1106bp，实验结果与预期相符，如下图所示：32 图8PRVAH-China-2013gD基因的PCR扩增M：DL10000DNAMarker1：阴性对照2：gD基因3.3.1.4PRVAH-China-2013株gE基因的PCR扩增结果所扩增gE基因全长1720bp，实验结果与预期相符，如下图所示：图9PRVAH-China-2013gE基因的PCR扩增M：DL10000DNAMarker1：阴性对照2：gE基因3.3.2PRVAH-China-2013的遗传进化分析分别以PRVgC和gE基因对新流行毒株与其他毒株进行遗传进化分析。在PRV33 gC基因的遗传进化分析中，采用了30株国内不同年代或不同地点分离的PRV毒株和5株国外分离的PRV毒株，结果表明除2008年分离的7株毒株外，其他国内毒株都位于同一个分支，且2011年来新分离毒株的遗传关系更近，这些毒株与国外毒株及疫苗毒株Bartha株遗传关系较远（图10），这与Fonseca等（Fonsecaetal.,2010；Yeetal.,2016）的结果相符。本研究中所分离的毒株PRVAH-China-2013与2011年来分离的PRV毒株位于同一分支，因此归属于新流行毒株。图10PRVgC基因的遗传进化分析在PRVgC基因的遗传进化分析中，采用了14株国内不同年代或不同地点分离34 的PRV毒株和9株国外PRV毒株，结果显示所有国内毒株与国外毒株（P-PrV-Malaysia株除外）分属于不同分支，说明国内分离毒株与国外毒株存在较大遗传差异，且国内分离毒株的遗传进化关系与分离年代关系不大；PRVAH-China-2013株与ZJNB-China-2012及HNHB-China-2012遗传关系最近（图11）。图11PRVgE基因的遗传进化分析35 3.3.3PRVAH-China-2013主要糖蛋白的分子特征分析3.3.3.1PRVAH-China-2013gB糖蛋白的分子特征分析将PRV国内分离株的gB糖蛋白序列与Bartha株及国外分离株的gB糖蛋白序列进行比较，结果显示，所有国内株在75～78氨基酸处均存在4个连续氨基酸的缺失，在93～94氨基酸处均存在2个连续氨基酸的插入。在所有加入分析的毒株中，Kaplan毒株较为特殊，其在121-125氨基酸处存在5个连续氨基酸酸的插入（图12）。图12不同PRV毒株gB氨基酸的序列比对分析36 3.3.3.2PRVAH-China-2013gC糖蛋白的分子特征分析将PRV国内分离株的gC糖蛋白序列与Bartha株及国外分离株的gC糖蛋白序列进行比较，结果显示，国内分离株（除2008年分离的7株毒株外），包括经典毒株Ea、Fa、SA215及2011年以来新分离的流行毒株在62～69氨基酸处都存在8个连续氨基酸的插入（图13）。图13不同PRV毒株gC氨基酸的序列比对分析37 3.3.3.3PRVAH-China-2013gD糖蛋白的分子特征分析与Bartha株相比较，在所分析的毒株中，多数国内分离株的糖蛋白gD在275～276氨基酸处存在2个连续氨基酸的插入，而PRVEa株在275～279氨基酸处存在5个连续氨基酸的插入（图14）。图14不同PRV毒株gD氨基酸的序列比对分析3.3.3.4PRVAH-China-2013gE糖蛋白的分子特征分析在糖蛋白gE区域，不同分离株的区别主要位于48位氨基酸和495～498氨基酸38 处，如与国外经典毒株Kaplan株和Becker株相比较，国内2011年以来的新分离株（除HNHB株外）在496～498氨基酸处均存在1或3个氨基酸的插入，部分国内株在48位氨基酸处还存在1个氨基酸的插入（图15）。图15不同PRV毒株gE氨基酸的序列比对分析3.4PRVAH-China-2013gE缺失转移质粒的构建3.4.1同源臂LA和RA的PCR扩增结果提取PRVAH-China-2013病毒基因组为模板，用同源左臂LA和同源右臂RA的引物进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果获得了LA和39 RA的特异性扩增条带，大小约为838bp和961bp，与预期结果相符。（图16）图16同源臂LA和RA的PCR扩增结果M：DL10000DNAMarker；1：阴性对照；2：LA；3：RA3.4.2EGFP基因表达盒的PCR扩增结果以提取的pEGFP-N1质粒为模板，用扩增EGFP基因表达盒的引物进行PCR，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果获得了特异性扩增条带，大小约为1809bp，与预期结果相符。（图17）图17EGFP基因表达盒的PCR扩增结果M：DL5000DNAMarker；1：阴性对照；2：EGFP基因表达盒40 3.4.3重组质粒pMD-LA的酶切鉴定结果将重组质粒pMD-LA用EcoRⅠ进行单酶切，酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果获得了pMD18-T和LA基因片段的扩增条带，大小约为2658bp和872bp，以及pMD-LA的单酶切条带，大小约3496bp。根据实验设计，将pMD-LAEcoRⅠ单酶切后，经凝胶电泳检测只有一条带的为正向连接的质粒,两条带则为反向链接的质粒（图18），选取正向连接的质粒进行下一步研究。图18重组质粒pMD-LA的酶切鉴定结果M：DL10000DNAMarker；1-4：pMD-LA/EcoRⅠ；1和3：反向连接；2和4：正向连接3.4.4重组质粒pMD-LA-RA的酶切鉴定结果将重组质粒pMD-LA-RA用PstⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果获得了pMD-LA和RA基因片段的特异性扩增条带，大小约为3530bp和961bp，与预期结果相符。（图19）41 图19重组质粒pMD-LA-RA的酶切鉴定结果M：DL5000DNAMarker；1：pMD-LA-RA/PstⅠ+HindⅢ3.4.5转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的酶切鉴定结果将转移质粒pMD-LA-EGFP-RA用EcoRⅤ进行单酶切，酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果获得了pMD-LA-RA和EGFP基因表达盒的特异性扩增条带，大小约为4491bp和1809bp，与预期结果相符。（图20）图20转移质粒pMD-LA-EGFP-RA的酶切鉴定结果M：DL10000DNAMarker；1：pMD-LA-EGFP-RA/EcoRⅤ42 3.4.6转移质粒pMD-LA-EGFP-RA中EGFP基因的表达检测使用Lipofectamine®2000Reagent将转移质粒pMD-LA-EGFP-RA导入到BHK-21细胞中，在转染后48h，经荧光显微镜观察，可发现细胞发出绿色荧光（图21），表明绿色荧光蛋白EGFP获得了成功表达。图21转染后BHK-21细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光（×100）左图为转染后的细胞图；右图为正常的细胞图4讨论与结论4.1讨论4.1.1我国猪伪狂犬病的流行趋势伪狂犬病是由PRV引起的一种多种动物共患的急性传染病。猪是其自然宿主，可引成仔猪大量死亡、种猪繁殖障碍、商品猪生长迟缓等。PRV对仔猪的致死率可高达100%，且可引起潜伏感染，带毒猪可终身排毒，对养猪业危害巨大。目前，在许多发达国家，PRV已被根除，而相比之下，我国的伪狂犬病的流行形势依然十分严峻，且流行过程也具有明显的特点，如传播途径多样化、感染率高、感染地域广、多病原混合感染等，给疾病的有效防控带来了巨大困难（邓仕伟等，2006）。国内PRV阳性猪场普遍存在，对各地猪场的抽检结果显示，阳性率多在50%以上，部分地区猪场阳性率高达100%，但不同猪场抽检样品的阳性率差异较大，在5%~50%之间，个别阳性猪场的样品阳性率可高达93.33%（薛双等，2012）。由于PRVgE缺失疫苗的广泛使用，规模化猪场的伪狂犬病得到了较好控制，部分种猪场采取净化措施甚至已经根除了该病。但在2011年年末，国内伪狂犬病再次大面积流行，且疫苗免疫也不能提供完全的免疫保护（Anetal.,2013；Wangetal.,2014；Wuetal.,2013；Yuetal.,2014）。对新分离的PRV流行毒株进行的致病性实验结果显示，43 其毒力相较于国内以往分离的经典毒株，如Fa株，毒力有所增强（Yangetal.,2016）。PRV新流行毒株的主要糖蛋白基因序列都存在一定的突变，但这些突变对病毒的具体影响尚不清楚（Yuetal.,2014）。最近，有研究发现某些PRV新流行毒株是由国内流行毒株和Bartha-K61疫苗毒株重组而来，如PRVSC株，这对于解析PRV新流行毒株的遗传演化规律具有重要意义（Yeetal.,2016）。4.1.2PRVBartha-K61疫苗免疫失败的原因分析自2011年以来，我国PRV出现了大面积流行的情况，传统的PRVBartha-K61疫苗已被证实无法提供完全的免疫保护（Anetal.,2013）。对于Bartha-K61疫苗免疫失效的原因，目前还不清楚，可能与营养、应激、疫苗、管理、病毒变异等有关，是多因素共同作用的结果。（1）营养因素。目前国内许多猪场，特别是中小型猪场，并未形成标准的集约化养殖模式，对于猪群的营养控制得并不是很好，尤其是VA、VB、VD等维生素和Fe、Zn、Sn等微量元素的缺乏，会直接引起机体免疫器官发育不良或退化，导致猪群的免疫力下降，从而影响疫苗的免疫效果（何利民等，2015）。（2）应激因素。如果猪群受到惊吓或冷、热、噪音等外界环境变化过大时，会产生应激反应，使机体肾上腺素分泌增加，导致机体免疫功能下降，从而影响疫苗的免疫效果。此外，疫苗免疫本身也是一种应激反应，频繁的免疫不仅会影响猪的生产性能，同时也会影响疫苗的免疫效果（吴星星等，2014）。（3）疫苗的保存和使用不当。疫苗的储存及使用条件比较严格，储存条件不良或使用方法不当都会影响疫苗的使用效果。PRV新流行毒株的毒力较强，因此针对该病毒的免疫更应严格控制免疫的各个环节，以达到最佳的免疫效果，尽量减少该病毒在猪场内的传播。（4）管理因素。猪群的生长环境对其免疫力有较大的影响，若是猪场的管理措施不当，猪群的生长势必受到影响，其免疫力也会随之降低，最终也会导致疫苗免疫效果不好，因此建立规范的猪场管理制度并付诸实施，对于疫病的防控至关重要。（5）病毒的变异。对新分离的PRV流行毒株进行的致病性实验结果显示，其毒力相较于国内以往分离的经典毒株，如Fa株，毒力有所增强（Yangetal.,2016）。本研究结果显示，PRV新流行毒株主要糖蛋白的关键氨基酸位点与Bartha株相比均存在突变，这些突变可能会导致病毒抗原性的改变，从而影响Bartha-K61疫苗的免44 疫效果。生物个体都具备进化的能力，PRV也不列外。疫苗的免疫压力对病毒的生存造成了一定程度的威胁，为了应对这些威胁，PRV选择了一定程度的变异来逃避机体的免疫及干扰疫苗的免疫，这其实是自然选择的结果。目前对于PRV的变异机制尚不清楚，国内流行毒株间、流行毒株与疫苗毒株间及疫苗毒株间发生重组可能是一种重要方式，这就要求猪场在使用疫苗时不要频繁更换，以防止不同毒株间重组的发生。4.1.3PRVAH-China-2013主要糖蛋白的突变分析PRVAH-China-2013株是从安徽某Bartha-K61疫苗免疫猪场的流产胎儿脑组织4.15中分离得到，经动物试验测得其毒力较强，对小鼠LD50可达10TCID50。为了了解PRVAH-China-2013株和国内外其他PRV毒株的关系，我们分别以PRVgC和gE基因进行了遗传进化分析，结果显示PRVAH-China-2013株和2011年来造成国内PRV大流行的毒株十分相似。伪狂犬病毒的糖蛋白不仅在病毒的侵入、释放以及细胞间传播等过程中起重要作用，而且也是参与机体免疫反应的主要靶蛋白。因此，对这些糖蛋白进行深入分析有助于解析新毒株的致病性及免疫原性等。对PRVgB、gC、gD、gE糖蛋白的序列分析表明，国内不同时期分离的毒株，特别是新流行毒株序列非常相似，但与Bartha株存在较为明显的差异，主要表现为多个连续氨基酸的插入或缺失，且部分差异区域位于这些糖蛋白的重要功能区。在PRVgB糖蛋白N端的59～126氨基酸序列存在3个连续的抗原表位区，这一区域的氨基酸序列具有高柔韧性、易接近性和亲水性，具有抗体结合位点（ABD）的特征（Zaripovetal.,1999）。在本研究中，与Bartha株相比，所有国内毒株均存在4个氨基酸的缺失（75～78氨基酸）和2个氨基酸的插入（93～94氨基酸），这些突变都在59～126氨基酸区域，可能会影响PRV与疫苗诱导产生的抗体的有效结合。PRVgC在诱导感染动物体液免疫和细胞免疫起着重要作用。在猪群，无论是野毒感染还是弱毒疫苗免疫，机体诱导产生的PRV中和抗体主要是针对gC糖蛋白。此外，gC糖蛋白也是介导病毒与靶细胞的黏附所必须，主要通过其表面的3个肝素结合区域（HBDs）与靶细胞表面硫酸乙酰肝素糖胺聚糖链结合。HBDs区域同时也是gC糖蛋白N端的抗体结合区域（44～290氨基酸）的一部分，用gC特异性抗体45 结合该区域可干扰病毒的黏附作用（Oberetal.,2000）。在本研究中，与Bartha株相比，国内新流行毒株的gC氨基酸序列在ABD区域均存在8个连续氨基酸的插入，这可能会改变该区的环状结构，从而影响gC抗体与其有效结合，导致疫苗诱导产生的中和抗体对新毒株的中和能力降低，这可能也是造成Bartha-K61疫苗对当前PRV流行毒株免疫效果不好的原因之一。PRVgD糖蛋白可介导细胞间的融合，主要通过与细胞表面被称为疱疹病毒侵入介质（Herpesvirusentrymediators,Hve）的受体发生结合，以稳定病毒与细胞的相互作用。gD糖蛋白也是诱导产生中和抗体的靶蛋白之一，这种抗体可阻止PRV侵入细胞，从而在抗病毒免疫中发挥重要作用（Eloitetal.,1990）。在本研究中，与Bartha株相比，国内PRV新流行毒株的gD氨基酸序列在267～276氨基酸处存在(Pro-Arg)5序列，而Bartha株是(Pro-Arg)4序列，且在这一区域脯氨酸的连续间隔排列可以在蛋白表面形成严格的亲水结构，从而有利于蛋白质之间的相互作用（Petrovskisetal.,1986）。这些特殊氨基酸序列在PRV感染中的具体作用尚不清楚。国内毒株在gD蛋白中的这些突变是否会影响其与Bartha-K61疫苗抗体的有效结合尚需进一步证实。PRVgE糖蛋白在介导细胞融合、病毒扩散和释放等方面起着重要作用（Zsaketal.,1989；Zsaketal.,1992），同时gE基因也与PRV的毒力相关（Kimmanetal.,1992；Tirabassietal.,1997）。在本研究中，国内毒株gE氨基酸序列的主要区别在于48位和496～498位存在不同数量氨基酸的插入，这些插入可能会导致病毒毒力的改变。综上所述，与Bartha株相比，国内PRV毒株的主要免疫原性蛋白gB、gC、gD均存在明显差异，这也可能是影响Bartha-K61疫苗在国内猪场免疫效果不佳的原因之一。在2011年后国内分离的PRV毒株中，除gE蛋白外，糖蛋白gB、gC、gD无明显突变，且与国内经典毒株Ea、Fa、SA215等基本相似。因此，国产疫苗，如由Ea株致弱的HB-98毒株，可能可以提供更好的免疫保护，但国产疫苗在生产工艺等方面仍需改进以提高疫苗的质量。此外，疫苗的免疫效果很大程度上取决于猪群本身的状况，例如疾病、营养缺乏和药物滥用等因素导致动物机体的免疫抑制也可能导致疫苗免疫失败。46 4.1.4伪狂犬病病毒新流行毒株基因缺失疫苗的研究策略基因缺失疫苗是通过基因工程技术，人为地缺失或插入一段基因序列于病毒的基因组中，从而使其某些基因丧失表达的能力，达到致弱病毒同时保留其免疫原性的目的。对于PRV基因缺失疫苗而言，这些人为缺失的基因片段，通常是PRV的非必需基因，这些基因的缺失不会影响病毒的繁殖，如毒力基因胸苷激酶（TK）和一些囊膜糖蛋白基因gE、gG等。目前根据这些基因片段已经构建了PRV单基因、双基因和多基因缺失疫苗，这些基因缺失疫苗在猪伪狂犬病的防控与净化中起到非常重要的作用（金升藻等，2002）。PRV疫苗毒株Bartha-K61株是匈牙利学者Bartha于1961年通过反复传代致弱获得。通过序列分析发现，该毒株的整个gE基因和11K基因都被完全缺失，且部分gI和28K基因也存在大片段的缺失。由该毒株制备的Bartha-K61疫苗免疫效果较好，但由于Bartha株的主要毒力基因TK基因并未缺失，Bartha-K61疫苗依然具有引发疫苗毒感染的可能（Petrovskisetal.,1986；Lomniczietal.,1987；Mettenleiteretal.,1987）。PRVTK基因缺失毒株靶向神经细胞及在神经细胞中的复制能力减弱，因此TK未缺失的gE基因缺失疫苗不仅能在注射部位和周围淋巴结繁殖，还能在伪狂犬病毒三叉神经节等潜伏组织中有限增殖，由于这种“占位”作用，使弱毒疫苗能够预防或减少潜伏感染的发生。本研究缺失了PRV新流行毒株2684bp的基因序列，基本包含其完整的gE基因，试图从一定程度上模仿Bartha株的缺失区域，从而研制出针对PRV新流行毒株的基因缺失疫苗。PRVgE糖蛋白在介导细胞融合、病毒扩散和释放等方面起着重要作用，因此从理论上而言，缺失PRV新流行毒株的gE基因可以使病毒致弱，同时利用gE基因作为诊断标记，可以用于疫苗免疫动物与野毒感染动物的鉴别诊断，从而有利于PRV的净化。4.2结论（1）成功分离了一株伪狂犬病病毒PRVAH-China-2013，并评价了该病毒对小鼠的4.15致病性，其LD50为10TCID50。（2）分析了伪狂犬病病毒新流行毒株主要糖蛋白的分子特征，与国外毒株相比，国内毒株主要糖蛋白均存在明显的氨基酸的缺失或插入，且部分突变位点位于相应蛋白的关键功能域内。47 （3）利用EGFP基因作为标记基因构建了伪狂犬病病毒新流行株的gE缺失转移质粒，通过转染实验证实EGFP获得了成功表达，为伪狂犬病病毒新流行株gE缺失突变株的构建奠定了良好的基础。48 致谢谨在此论文完稿之际，向我的导师琚春梅副教授致以最衷心的感谢和最诚挚的敬意！在这三年来的学习时光里，从课题选择、问题解决到论文撰写以及生活中困难的解决，她都一直给予着我指导和支持。感谢导师对我的殷切教诲和辛勤培养，时刻关注我的实验和生活情况，同时也感谢导师一直以来的鼓励和理解，琚老师是位负责、敬业的好老师，她的严谨和勤奋已深深印在我的脑海里，成为我时刻学习的榜样！时光飞逝，转眼间自己的研究生生活竟已步入尾声，回首这段时光，感触颇多。我现在犹然记得刚来华农时的兴奋和憧憬，和等到一切尘埃落定后，自己经历的迷茫和坚定。在华农，在兽医微生物学实验室，我学到的不仅是实验的技巧和知识，同时还有如何为人处事，三年的研究生生涯让我变得越发成熟了。如今毕业在即，我已经感受到未来迫不及待的召唤，同时也感受到风雨欲来的压力。社会不同于学校，我已不能再在学校和老师的庇护下成长了。感谢导师把我领进了微生物与免疫学研究领域的大门，在今后的生活和工作中，我会认认真真的工作、踏踏实实的做事，争取为学校和老师争光，以无愧于学校和老师的培养。感谢在论文开展过程中给予我大力帮助和指导的郭霄峰教授、陈金顶教授、罗永文副教授、郭慧霞老师，在此向他们表示最诚挚的谢意!本论文的完成还得到程艺、吉艺宽、王雨、张宝石、潘慧、李艳华、勾红潮、刘文俊、袁晋、何文成、陈玉明、阳佑天、张戴婷、郑仲华、吴云燕、朱俊灵、孙秀、漆月、王立军、陈耀、赖强、陈俊全等人的热情和无私的帮助，在此表示衷心的感谢！同时，我也要感谢的父母！对于这份恩情，我感觉语言的描述已是苍白无力了。我爱我的父母，也为他们的皱纹和白发而心酸。我心中的那点小愿望，就是有朝一日能够带着我的亲人去看看这个世界，这是愿望，也是理想，更是我不懈努力的动力源泉。最后，向三年来所有关心、支持和帮助过我的人们再次表示崇高的敬意和衷心的感谢！本论文得到了国家自然科学基金（31001074）、广东省科技计划项目（2016A020210046、2016B090921009）的资助，在此一并致以感谢！49 参考文献AnTQ,PengJM,TianZJ,etal..PseudorabiesvirusvariantinBartha-K61-vaccinatedpigs,China,2012[J].EmergingInfectiousDiseases,2013,19(11):1749-1755.DavidsonRC,BlankenshipJR,KrausPR,etal..APCR-basedstrategytogenerateintegrativetargetingalleleswithlargeregionsofhomology[J].Microbiology,2002,148(Pt8):2607-2615.EloitM,BouzghaiaH,TomaB.Identificationofantigenicsitesonpseudorabiesvirusglycoproteingp50implicatedinviruspenetrationofthehostcell[J].JournalofGeneralVirology,1990,71(Pt9):2179-2183.FonsecaAJ,CamargosMF,deOliveiraAM,etal..MolecularepidemiologyofBrazilianpseudorabiesviralisolates[J].VeterinaryMicrobiology,2010,141(3-4):238-245.GloverDJ,LippsHJ,JansDA.Towardssafe,non-viraltherapeuticgeneexpressioninhumans[J].NatureReviewsGenetics,2005,6(4):299-310.HamplH,Ben-PoratT,EhrlicherL,etal..Characterizationoftheenvelopeproteinsofpseudorabiesvirus[J].JournalofVirology,1984,52(2):583-590.JonsA,GranzowH,KuchlingR,etal..TheUL49.5geneofpseudorabiesviruscodesforanO-glycosylatedstructuralproteinoftheviralenvelope[J].JournalofVirology,1996,70(2):1237-1241.KimmanTG,deWindN,Oei-LieN,etal..ContributionofsinglegeneswithintheuniqueshortregionofAujeszky'sdiseasevirus(suidherpesvirustype1)tovirulence,pathogenesisandimmunogenicity.[J].TheJournalofgeneralvirology,1992,73(Pt2):243-251.LomnicziB,WatanabeS,Ben-PoratT,etal..GenomelocationandidentificationoffunctionsdefectiveintheBarthavaccinestrainofpseudorabiesvirus[J].JournalofVirology,1987,61(3):796-801.MettenleiterTC.Initiationandspreadofalpha-herpesvirusinfections[J].TrendsinMicrobiology,1994,2(1):2-4.MettenleiterTC,ZsakL,KaplanAS,etal..Roleofastructuralglycoproteinofpseudorabiesinvirusvirulence[J].JournalofVirology,1987,61(12):4030-4032.MullerT,HahnEC,TottewitzF,etal..Pseudorabiesvirusinwildswine:aglobalperspective[J].ArchivesofVirology,2011,156(10):1691-1705.OberBT,TeufelB,WiesmullerKH,etal..TheporcinehumoralimmuneresponseagainstpseudorabiesvirusspecificallytargetsattachmentsitesonglycoproteingC[J].JournalofVirology,2000,74(4):1752-1760.PetrovskisEA,TimminsJG,ArmentroutMA,etal..DNAsequenceofthegeneforpseudorabiesvirusgp50,aglycoproteinwithoutN-linkedglycosylation[J].JournalofVirology,1986,59(2):216-223.PetrovskisEA,TimminsJG,GiermanTM,etal..Deletionsinvaccinestrainsofpseudorabiesvirusandtheireffectonsynthesisofglycoproteingp63[J].JournalofVirology,1986,60(3):1166-1169.PomeranzLE,ReynoldsAE,HengartnerCJ.Molecularbiologyofpseudorabiesvirus:impactonneurovirologyandveterinarymedicine[J].MicrobiolMolBiolRev,2005,69(3):462-500.Recillas-TargaF.Multiplestrategiesforgenetransfer,expression,knockdown,andchromatininfluenceinmammaliancelllinesandtransgenicanimals[J].MolecularBiotechnology,2006,34(3):337-354.TaharaguchiS,OnoE,YamadaS,etal..Mappingofafunctionalregionconferringnuclearlocalizationofpseudorabiesvirusimmediate-earlyprotein[J].ArchivesofVirology,1995,140(10):1737-1746.TirabassiRS,TownleyRA,EldridgeMG,etal..Characterizationofpseudorabiesvirusmutantsexpressingcarboxy-terminaltruncationsofgE:Evidenceforenvelopeincorporation,virulence,andneurotropism50 domains[J].JournalofVirology,1997,71(9):6455-6464.WangCH,YuanJ,QinHY,etal..AnovelgE-deletedpseudorabiesvirus(PRV)providesrapidandcompleteprotectionfromlethalchallengewiththePRVvariantemerginginBartha-K61-vaccinatedswinepopulationinChina[J].Vaccine,2014,32(27):3379-3385.WuR,BaiC,SunJ,etal..EmergenceofvirulentpseudorabiesvirusinfectioninnorthernChina[J].JournalofVeterinaryScience,2013,14(3):363-365.YangQY,SunZ,TanFF,etal..PathogenicityofacurrentlycirculatingChinesevariantpseudorabiesvirusinpigs[J].WorldJVirol,2016,5(1):23-30.YeC,GuoJC,GaoJC,etal..GenomicanalysesrevealthatpartialsequenceofanearlierpseudorabiesvirusinChinaisoriginatedfromaBartha-vaccine-likestrain[J].Virology,2016,491:56-63.YuX,ZhouZ,HuD,etal..Pathogenicpseudorabiesvirus,China,2012[J].EmergingInfectiousDiseases,2014,20(1):102-104.ZaripovMM,MorenkovOS,FodorN,etal..DistributionofB-cellepitopesonthepseudorabiesvirusglycoproteinB[J].JournalofGeneralVirology,1999,80(Pt3):537-541.ZarrinM,LeederAC,TurnerG.ArapidmethodforpromoterexchangeinAspergillusnidulansusingrecombinantPCR[J].FungalGeneticsandBiology,2005,42(1):1-8.ZsakL,MettenleiterTC,SuggN,etal..Releaseofpseudorabiesvirusfrominfectedcellsiscontrolledbyseveralviralfunctionsandismodulatedbycellularcomponents.[J].JournalofVirology,1989,63(12):5475-5477.ZsakL,ZuckermannF,SuggN,etal..GlycoproteingIofpseudorabiesviruspromotescellfusionandvirusspreadviadirectcell-to-celltransmission.[J].JournalofVirology,1992,66(4):2316-2325.边亚娟,林长水,田志军,等.应用PRVVP6蛋白McAb间接免疫荧光法检测猪轮状病毒[J].中国兽医杂志,2007(04):36-37.常世敏.PCR在食品微生物检测中的应用[J].邯郸农业高等专科学校学报,2004(04):23-25.邓仕伟,汪勇,薛春芳.我国伪狂犬病流行现状及新特点[J].动物医学进展,2006(09):105-107.范伟兴.PRV鲁A株的分离鉴定及表达EGFP和CSFV-E2的TK～-重组伪狂犬病毒的构建[D].南京农业大学,2002.顾阳,高晓云,程琨,等.鉴别猪伪狂犬病病毒强毒与疫苗毒双重PCR检测方法的建立[J].华北农学报,2014(02):94-97.何利民,王军强,骆宁华.现代猪业免疫失败的原因分析及防治措施[J].当代畜禽养殖业,2015(02):52-53.何启盖,刘正飞,吴斌,等.猪伪狂犬病疫苗的研究进展[J].河南畜牧兽医,2000(05):9-11.怀济森,陈焕春.伪狂犬病病毒潜伏感染的研究[J].动物医学进展,1997(03):18-20.吉艺宽,王雨,程艺,等.伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立[J].华南农业大学学报,2015(04):11-15.金升藻,熊符,陈焕春.伪狂犬病基因缺失疫苗研究进展[J].中国农业科学,2002(01):89-93.雷有玲,张文.猪伪狂犬病毒野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[J].畜牧与兽医,2014(11):60-64.李敏,杨谦.一种高效构建同源重组DNA片段的方法——融合PCR[J].中国生物工程杂志,2007(08):53-58.廖飞,黄增荣,赵孝木,等.猪伪狂犬病的致病机制与防控措施[J].贵州畜牧兽医,2015(01):20-23.林梅,宋璐璐,毛国军.PCR技术的研究进展[J].大众科技,2007(05):109-110.蔺芳,尹双辉,尚佑军,等.多重PCR方法快速鉴别猪伪狂犬疫苗毒和野毒[J].安徽农业科学,2009(13):5889-5891.51 刘博涛,宋昌军,刘翊中.伪狂犬病毒致病机理的研究进展[J].西北民族大学学报(自然科学版),2008(04):65-68.刘丽娜.应用多重PCR技术和基因芯片技术区分伪狂犬病病毒强弱毒和胸膜肺炎放线杆菌血清型2菌株荚膜多糖的初步研究[D].华中农业大学,2005.龙晓婷,梁木荣,陈展开,等.伪狂犬病病毒潜伏感染检测方法研究进展[J].动物医学进展,2008(S1):10-13.龙晓婷,刘俊磊,郭洪,等.伪狂犬病毒在潜伏感染猪体内的组织分布[J].畜牧兽医学报,2008(05):645-651.娄高明,杜伟贤.伪狂犬病流行概况及猪场防制策略[J].中国动物检疫,1999(05):43-45.马林风.猪伪狂犬病的流行现状及防控措施[J].中国动物保健,2014(07):46-47.孟继鸿,朱圣禾.病毒空斑技术的研究和应用概况[J].国外医学(微生物学分册),1989(01):9-13.苗得园,杨兵,李富强,等.单抗夹心LAB-ELISA检测猪伪狂犬病病毒的研究[J].华北农学报,2001(01):127-131.彭金美,王瑜,田志军,等.带BAC质粒的重组伪狂犬病毒的构建及其体外生长特性研究[J].中国预防兽医学报,2009(01):10-15.宋耀彬.猪伪狂犬病[J].辽宁畜牧兽医,1982(01):35-38.田云,任裕其,屈源泉,等.伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J].广东畜牧兽医科技,2009(04):31-33.王洪水,侯相山.基因芯片技术研究进展[J].安徽农业科学,2007(08):2241-2243.王月丽,魏继楼,程红蕾,等.外源基因转染细胞技术的研究进展[J].现代生物医学进展,2014(07):1382-1384.吴星星,李爱巧,杨启元,等.规模化猪场免疫失败的原因分析及应对措施[J].新疆畜牧业,2014(01):13-15.向义和.DNA同源重组机制的确立[J].自然杂志,2015(04):287-296.薛双,冯艳,周坤,等.猪伪狂犬病在我国的流行现状[J].中国猪业,2012(12):41-42.杨尚斌,高洪,黄慧,等.大理地区散养户猪伪狂犬病病毒野毒株感染的血清学分析[J].动物医学进展,2012(01):121-123.邹敏,杨旭兵,郑辉,等.2012—2013年我国部分地区猪伪狂犬病流行病学调查[J].中国动物检疫,2015(04):1-5.52 附录A：荧光质粒pEGFP-N1的图谱53 附录B：pMD18-T质粒图谱54 附录C：PRV-AH株gB、gC、gD、gE糖蛋白的基因序列gB:ATGCCTGCAGGTCGACGATTTGGTGCGTCAGTGAGTTCCGCGGCTTCTACCGCTTCCAGACGTCCGGCGTAACCGCCACCCAGCGGCAGGCCTGGCGATATATCCGCGAGCTGGTGCTGGCGGTTGCAGTCTTCAGGTCCGTCTTCCACTGCGGGGACGTCGAGGTCCTCCGCGCGGATCGCTTCGCCGGACGCGACGGGCTGTACCTGACCTACGAGGCGTCATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGGCGCGGGCCCCGCGGGCATCGGCCCGGGCACCACGGCGGTGCTGGCCTCGGACGTCTTTGGCCTGCTCCACACCACGCTGCAGCTGCGCGGGGCGCCGTCGCGCTAGCGCTGCTGCTGCTGGCGCTCGCCGCGACCCCGACGTGCGGCGCGGCGGCCGTGACGCGGGCCGCCTCGGCCTCGCCCGCGCCCGGGACGGGCGCCACCCCAGACGGCTTCTCCGCGGAGGAGCCCCTCGAGGAGATCGACGGGGCCGTCTCCCCCGGCCCCTCGGACGCCCCCGACGGCGAGTACGGCGACCTGGACGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGGCCGCGACCGAGCGGGACCGCTTCTACGTCTGCCCGCCGCCGTCCGGCTCCACGGTGGTGCGCCTGGAGCCCGAGCAGGCCTGCCCCGAGTACTCGCAGGGGCGCAACTTCACGGAGGGGATCGCCGTGCTCTTCAAGGAGAACATCGCCCCGCACAAGTTCAAGGCCCACATCTACTACAAGAACGTCATCGTCACGACCGTGTGGTCCGGGAGCACGTACGCGGCCATCACGAACCGCTTCACGGACCGCGTGCCCGTCCCCGTGCAGGAGATCACGGACGTGATCGACCGCCGCGGCAAGTGCGTCTCCAAGGCCGAGTACGTGCGCAACAACCACAAGGTGACCGCCTTCGACCGCGACGAGAACCCCGTCGAGGTGGACCTGCGCCCCTCGCGCCTGAACGCGCTCGGCACCCGCGGCTGGCACACCACCAACGACACCTACACCAAGATCGGCGCCGCGGGCTTCTACCACACGGGCACCTCCGTCAACTGCATCGTCGAGGAGGTGGAGGCGCGCTCCGTGTACCCCTACGACTCCTTCGCCCTGTTCACGGGGGACATCGTGTACATGTCCCCCTTCTACGGCCTGCGCGAGGGGGCCCACGGGGAGCACATCGGCTACGCGCCCGGGCGCTTCCAGCAGGTGGAGCACTACTACCCCATCGACCTGGACTCGCGCCTCCGCGCCTCCGAGAGCGTGACGCGCAACTTTCTGCGCACGCCGCACTTCACGGTGGCCTGGGACTGGGCCCCCAAGACGCGGCGCGTGTGCAGCCTGGCCAAGTGGCGCGAGGCCGAGGAGATGATCCGCGACGAGACGCGCGACGGGTCCTTCCGCTTCACGTCGCGGGCCCTGGGCGCCTCCTTCGT55 CAGCGACGTCACGCAGCTCGACCTGCAGCGCGTGCACCTGGGCGACTGCGTCCTCCGCGAGGCCTCGGAGGCCATCGACGCCATCTACCGGCGGCGCTACAACAACACGCACGTGCTGGCCGGCGACAAGCCCGAGGTGTACCTCGCCCGCGGGGGCTTCGTGGTGGCCTTCCGCCCGCTGATCTCGAACGAGCTGGCGCAGCTGTACGCGCGCGAGCTCGAGCGCCTCGGCCTCGCCGGCGTCGTGGGGCCCCGCGTCCCCCGCGGCCGCCCGTCGGGCCCGGCGCTCCCCCGGCCCGGCGGGGACGCCCGAGCCGCCGGCCGTCAACGGCACGGGGCACCTGCGCATCACCACGGGCTCGGCCGAGTTTGCGCGCCTGCAGTTCACCTACGACCACATCCAGGCGCACGTGAACGACATGCTGAGCCGCATCGCGGCCGCCTGGTGCGAGCTGCAGAACAAGGACCGCACCCTGTGGGGCGAGATGTCGCGCCTGAACCCCAGCGCCGTGGCCACGGCCGCGCTGGGCCAGCGCGTCTCGGCGCGCATGCTCGGCGACGTGATGGCCATCTCGCGGTGCGTGGAGGTGCGCGGCGGCGTGTACGTGCAGAACTCCATGCGCGTGCCCGGCGAGCGCGGCACGTGCTACAGCCGCCCGCTGGTGACCTTCGAGCACAACGGCACGGGCGTGATCGAGGGCCAGCTCGGCGACGACAACGAGCTCCTCATCTCGCGCGACCTCATCGAGCCCTGCACCGGCAACCACCGGCGCTACTTTAAGCTGGGCGGCGGGTACGTGTACTACGAGGACTACAGCTACGTGCGCATGGTGGAGGTGCCCGAGACGATCAGCACGCGGGTGACCCTGAACCTGACGCTGCTCGAGGACCGCGAGTTCCTGCCCCTCGAGGTGTACACGCGCGAGGAGCTCGCCGACACGGGCCCCCTGGACTACAGCGAGATCCAGCGCCGCAACCAGCTGCACGCGCTCAAGTTCTACGACATTGGCCGCGTGGTCAAGGTGGACCACAACGTGGTGCTGCTGCGCGGCATCGCCAACTTCTTCCAGGGCCTCGGCGACGTGGGCGCCGCCGTCGGCAAGGTGGTCCTGGGCGCCACGGGGGCCGTGACCTCGGCCGTCGGCGGCATGGTGTCCTTCCTGTCCAACCCCTTCGGGGCGCTCGCCATCGGGCTGCTGGTGCTGGCCGGCCTGGTCGCGGCCTTCCTGGCCTACCGGCACATCTCGCGCCTGCGCCACAACCCCATGAAGGCCCTGTACCCCGTCACGACGAAGGCGCTCAAGGAGGACGGCGTCGAAGAGGACGACGTGGACGAGGCCAAGCTGGACCAGGCCCGGGACATGATCCGGTACATGTCCATCGTGTCGGCCCTCGAGCAGCAGGAGCACAAGGCGCGCAAGAAGAACAGCGGAATCTCTAG56 gC:ATGGCCTCGCTCGCGCGTGCGATGCTCGCGCTGCTGGCGCTCTACACGGCGGCCATCGCCGCGGCGCCGTCGTCCACGACGGCGCTCGGCACGACGCCCAACGGGGGCGGGGGCGGCAACAGCAGCGCGGGCGAGCTCTCGCCCTCGCCGCCCTCGACGCCCGAGCCCGTCTCGGGGACGACGGGGGCCGCGGCCTCCACGCCCGCCGCCGTCTCGACGCCCCGGGTCCCGTCGCCCTCGGTCTCGCGCCGGAAGCCCCAGCGGGACGGCAACAGGACGCGCGTCCACGGCGACAAGGCCACCTCGCACGGGCGCAAGCGCATCGTGTGCCGCGAGCGGCTGTTCTCGGCGAGGGTGGGGGACGCGGTCAGCTTCGGGTGCGCCGTCGTCCCGCGCGCCGGGGAGACCTTCGAGGTCCGCTTCTGCCGCCGCGGGCGCTTCCGCTCGCCCGACGCCGACCCCGAGTACTTTGACGAGCCCCCGCGCCCGGAGCTCCCGCGGGAGCGGCTCCTCTTCAGCTCCGCCAACGCCTCCCTCGCCCACGCGGACGCGCTCGCCTCCGCCGCCGTCGTCGAGGGCGAGCGCGCGACCGTCGCCAACGTCTCGGGCGAGGTGTCCGTGCGCGTGGCCGCGGCGGACGCCGAGACCGAGGGCGTCTACACGTGGCGCGTGCTGTCCGGCAACGGCACCGAGGTCCGCAGCGCCAACGTCTCGCCCGTCCTGTACCACCAGCCCGAGTTCGGCCTGAGCGCGCCGCCCGTCCTCTTCGGCGAGCCCTTCCGGGCGGTGTGCGTCGTCCGCGACTACTACCCGCGGCGCAGCGTGCGCCTGCGCTGGTTCGCGGACGGGCACCCGGTGGACGCCGCCTTCGTGACCAACAGCACCGTGGCCGACGAGCTCGGGCGCCGCACGCGCGTCTCCGTGGTGAACGTGACGCGCGCGGACGTCCCGGGCCTCGCGGCCGCGGACGACGCGGACGCGCTCGCGCCGAGCCTGCGCTGCGAGGCCGTGTGGTACCGCGACAGCGTGGCCTCGCAGCGCTTCTCCGAGGCCCTGCGCCCCCACGTCTACCACCCGGCGGCGGTCTCGGTGCGCTTCGTCGAGGGCTTCGCCGTCTGCGACGGCCTCTGCGTGCCCCCGGAGGCGCGCCTCGCCTGGTCCGACCACGCCGCCGACACCGTCTACCACCTCGGCGCCTGCGCCGAGCACCCCGGCCTGCTCAACGTGCGGAGCGCCCGCCCGCTGTCGGACCTCGACGGGCCCGTCGACTACACCTGCCGCCTCGAGGGCATGCCCTCGCAGCTGCCCATCTTCGAGGACACGCAGCGCTACGACGCCTCCCCCACGTCCGTGAGCTGGCCCGTCGTGACCAGCATGATCACCGTCATCGCCGGCATCGCCATCCTAGCCATCGTGCTGGTCATCATGGCGACGTGCGTCTACTACCGCCGGTCCGCGCTGTGA57 gD:ATGTAGACGCACACGCCCACCAGGAGCGCGCCCATCGCGGTGCCCGTGCCGACGATCACCGAGCGGTGGCGCGAGACGCCCGGCGCGGCGGTGGTCCGGGGCGGGAACGGCTCCGCGGGCTGCGGCCACCCGCTGGGCACGACGGCCGGCGGGGCGAAGGGGCGGTGCGGCGTCTCGGGCCTCGGGGGTCGCGGCGTGGGGCGCCCCCCGGCGGCGTGGTCCCGCGTCGCCGGCTCGGGCAGGCGGCCGGGGGGCGCGGGCGTCGCCGGGGCGGGCTCGGGCTTCGGCCGGGGCCTGGGCCGGGGCCGGGGCCTGGGCCTCGGCGAGCCCGCCGAGGGCCGCGCGGGGTCGATGGCGTACGGCGTGGCGGCGGCGTAGGCCCGCGGGAGCGTCCGGCCGTTCTTGCGGTACCAGTAGTTCACCACCTCCCGGTGCGGGGGCTGCTGGTAGAACGGCGTCAGGAATCGCATCACGTCCACGCCCCGCTTGAAGCTGTCGTCGCTCCAGCACGCGCCGAACTTGTACGTGCGGTGCTGGTCCACGCGGGCGAACGGGCACTCTTGCCCCTCGGGGAGCGCCACCATGAAGTCGGTGAGGATGTTCACGCCGTCGACGGACACCAGGCGCCGGTATTGGCCCTCGTTGAACCGCCCCGGGGCCACCATGAGCAGCCCCAGCTCGTCCTCCGTGGGGAACATGTAGTCCGCGGACGGGGTCCACCACATCGGCGTGGTGCGGCGCCGGCAGCGCCCAAAGATCTGCCTGGGGCCGCAGTCGGCGTACTCGATAAAGTACAGCAGGTGCGCGCACCCGTCCGCGATGCGGTACCAGGCCACGTGGGCGCGGTACGTGGGCCGCCGGTGGGCCACCGCCTCGTTCAGCAGCCGGTCCACCTGCGGGTCGGAGATCAGCGCCACCACCCCGCACGGGTCCTCCAGCGGGCGCGTGTGGTAGACGTCCGCGGGGCCGACGAAGGGCGAGGGGACCGTCGTCAGCGTCAGCTGCCACGACTCGGTGTACGGGTACGCGGGCGGGGGGAAGGTCGGCGCGGGCACGGCGTCCACGTCCGCGCCGAGCGTCGTCCGGGCGACCAGCGCCGCCAGTAGgE:ATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGACGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTG58 CCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGGTGACCACGGTGTGCTTCGAGACCGCGTGCCACCCGGACCTGGTGCTGGGCCGCGCCTGCGTCCCCGAGGCCCCGGAGATGGGCATCGGCGACTACCTGCCGCCCGAGGCGCCGCGGCTCCGGCGCGAGCCGCCCATCGTCACCCCGGAGCGGTGGTCGCCGCACCTGAGCGTCCTGCGGGCCACGCCCAACGACACGGGCCTCTACACGCTGCACGACGCCTCGAGGCCGCGGGCCGTGTTCTTTGTGGCGGTGGGCGACCGGCCGCCCGCGCCGGCGGACCCGGTGGGCCCCGCGCGCCACGAGCCCCGCTTCCACGCGCTCGGCTTCCACTCGCAGCTCTTCTCGCCCGGGGACACGTTCGACCTGATGCCGCGCGTGGTCTCGGACATGGGCGACTCGCGCGAGAACTTTACCGCCACGCTGGACTGGTACTACGCGCGCGCGCCCCCGCGGTGCCTGCTGTACTACGTGTACGAGCCCTGCATCTACCACCCGCGCGCGCCCGAGTGCCTGCGCCCGGTGGACCCGGCGTGCAGCTTCACCTCGCCGGCGCGCGCGCGGCTGGTGGCGCGCCGCGCGTACGCCTCGTGCAGCCCGCTGCTCGGGGACCGGTGGCTGACCGCCTGCCCCTTCGACGCCTTCGGCGAGGAGGTGCACACGAACGCCACCGCGGACGAGTCGGGGCTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGTCACGGTCATCAAGGAGCTGACGGCCCCGGCCCGGGCCCCGGGCACCCCGTGGGGCCCCGGCGGCGACGACGCGATCTACGTGGACGGCGTCACGACGCCGGCGCCGCCCGCGCGCCCGTGGAACCCGTACGGCCGGACGACGCCCGGGCGGCTGTTTGTGCTGGCGCTGGGCTCCTTCGTGATGACGTGCGTCGTCGGGGGGGCCATCTGGCTCTGCGCGCTGTGCTCCCGGCGCCGGGCGGCCTCGCGGCCGTTCCGGGTGCCGACGCGGGCGCGGACGCACATGCTCTCTCCGGTGTACACCAGCCTGCCCACGCACGAGGACTACTACGACGGCGACGACGACGACGACGAGGAGGCGGGCGTCATCCGCCGGCGGCCCGCCTCCCCCAGCGGAGACAGCGGCTACGAGGGGCCGTACGCGAGCCTGGACCCCGAGGACGAGTTCAGCAGCGACGAGGACGACGGGCTGTACGTGCGCCCCGAGGAGGCGCCCCGCTCCGGCTTCGACGTCTGGTTCCGCGATCCGGAGAAACCGGAAGTGACGAATGGACCCAACTATGGCGTGACCGCCAACCGCCTGTTGA59