伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失转移质粒的构建.pdf

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1、学校代码：10564学号：2013202837分类号：S855.3密级：硕士学位论文伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析及gE缺失转移质粒的构建向柯宇指导教师：琚春梅副教授学院名称：兽医学院专业名称：预防兽医学答辩委员会主席：中国·广州2016年6月华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。本人签名：日期：导师签名：日期：摘要伪狂犬

2、病病毒（Pseudorabiesviurs，PRV）属疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Alpha-herpesviridae），可致多数动物感染发病，并能引起猪的潜伏感染。猪是其主要宿主和病毒携带者，对养猪业的发展危害重大。在2011年之前，由于PRVgE缺失疫苗的广泛使用，国内的PRV疫情得到了很好的控制，但从2011年底开始，PRV疫情突然大面积爆发，传统的gE缺失疫苗已被证实无法提供完全有效的免疫保护，使得国内养猪业面临巨大的威胁。本研究对PRV新流行毒株进行了分离鉴定，并对其主要糖蛋白的分子特征进行了分析；模仿PRVBartha株的gE缺失区域，构建了PR

3、V新流行毒株的gE缺失转移质粒，为新流行毒株gE缺失突变株的构建奠定了基础。具体研究内容如下：1、伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定从安徽某免疫PRVBarthaK61疫苗猪场送检的流产胎儿中采集脑、心、肝、脾、肺、肾，经PCR扩增，结果从脑、肝、脾、肺中检测到PRVgE基因阳性。将脑组织研磨后接种BHK-21细胞，在37℃5%CO2培养箱培养48h后，细胞出现了明显的细胞病变，病变细胞经PCR检测为PRVgE阳性；采用空斑纯化方法纯化了该病毒，并命名为PRVAH-China-2013。将病毒接种昆明小鼠，通过LD50测定评价了该4.15病毒对小鼠的致病性，结果表明其LD50为10TCID50。

4、2、伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析提取PRVAH-China-2013基因组，采用PCR扩增其主要糖蛋白基因gB、gC、gD、gE，经测序后，将gC、gE基因分别与国内外不同年代分离的PRV毒株进行序列比对，通过mega5.0绘制PRVAH-China-2013株gC和gE基因的遗传进化树；通过PRVAH-China-2013gB、gC、gD、gE序列推导其氨基酸序列，并与国内外不同年代分离的PRV毒株相应糖蛋白序列进行比对分析。遗传进化分析结果显示，PRVAH-China-2013株与国内毒株（除2008年分离的7株毒株外）位于同一个分支，且与2011年来新分离毒株的遗传关系

5、更近，而与与国外毒株及疫苗毒株Bartha株遗传关系较远，表明PRVAH-China-2013株属于PRV新流行毒株。氨基酸序列比对结果显示，与国外毒株相比，国内株主要糖蛋白均存在明显的氨基酸的缺失或插入，且部分突变位点位于相应蛋白的关键功能域内，这些突变是否导致病毒毒力及免疫原I性的改变，进而影响现有疫苗的免疫效果，尚需进一步证实。3、伪狂犬病病毒新流行株gE缺失转移质粒的构建根据新流行毒株PRV-ZJ01的基因组序列，在gE基因上、下游设计长度分别为838bp和961bp的基因片段作为同源重组的同源臂，即同源左臂LA和同源右臂RA；以pEGFP质粒为模板，设计引物扩增包含完整表达盒的绿色

6、荧光蛋白基因EGFP作为标记基因。通过酶切、连接、转化等方法，并按照LA-EGFP-RA的顺序，将LA、RA、EGFP连接到T载体的多克隆位点，构建PRVgE缺失转移质粒，经测序正确的质粒命名为pMD-LA-EGFP-RA。将构建好的转移质粒pMD-LA-EGFP-RA转染BHK-21细胞，通过荧光显微镜观察，结果显示转染细胞中可观察到绿色荧光蛋白EGFP的表达，表明构建的转移质粒可以用于后续同源重组试验。本研究从分子水平上解析了PRV新流行株与疫苗株Bartha株主要糖蛋白的遗传差异，为进一步深入研究Bartha株疫苗免疫失败的原因提供了理论依据；成功构建了PRV新流行株的gE缺失转移质粒

7、，为gE缺失突变株的构建及新疫苗的研制奠定了一定的基础。关键词：伪狂犬病病毒；流行毒株；主要糖蛋白；分子特征分析；转移质粒构建IIMolecularcharacteristicsofthemajorglycoproteinsofthenovelpseudorabiesvirusesandtheconstructionoftransferplasmidforgEgenedeletionXiangKeyu(Col