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密级：论文编号：中国农业科学院学位论文伪狂犬病病毒高温传代毒株生物学特性改变的分子基础ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢａｓｉｓｆｏｒｔｈｅＣｈａｎｇｅｓｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆ＇Ｈ－ｅｍｅｒａｒｅＰａｓｓａｎｉｇｈｔｐｔｕｇｉｇＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ硕士研究生：武吉强指导教师：李国新研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：上海兽医研究所研究生院２０１７年５月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究：１：作及取得的研究成．果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外沦文中不包含其他人己纾发表或撰写过的研％成果１ｆ也不包含为获得中国农业科学茕或其它教育机构的学位或正书而使用过的材抖：Ｔ作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论义屮作／。我同明确．的说明并表示了谢意。：研宄生签名：时间年打月〇□关于论文使用授权的声明本人完全了解中闺农业科学院有关保留、使用学位论文的规＆，即：中Ｗ农业利．、学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅可以采用影印缩、卬或扫描等复制手段保＾汇编学位论文。同意中国农．ｌｋ科学院可以用不同方火＾不同媒体上发表。、传播学位论文的全部或部分内容，．：研究生签名时间：１＿巧丨１导师签名：时问：？年盼 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目伪狂犬病病毒高温传代毒株生物学特性改变的分子基础论文作者武吉强专业领域兽医研究方向不区分研宄方向；指导教师李国新研宄员培养单位（研究所、中心）上瘦＿兽＿医研究所＼姓名职称单位专业／签成—飾；７７｛评）丨葡盲审／／／人盲审／／／／彭大新教授扬州大学预防兽医学■范红结教授南京农业大学预防兽医学方＇，ｙｆ為％于海研宂员上海兽医研宄所预防兽医学￣一—＾ｉ＾？答仇旭升副研究员上海兽医研究所预防兽医学陈宗艳副研宄员上海兽医研究所预防兽医学ｉｆｔｆ—委员ＩＩ会议记录（秘书）顾惠明论文答辩时间地点２０１７年Ｓ月２４Ｈ，上海兽医研宄所 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文伪狂犬病病毒高温传代毒株生物学特性改变的分子基础MolecularBasisfortheChangesofBiologicalCharacteristicofHigh-temperaturePassagingPseudorabiesVirus硕士研究生：武吉强指导教师：李国新研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：上海兽医研究所研究生院2017年5月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationMolecularBasisfortheChangesofBiologicalCharacteristicofHigh-temperaturePassagingPseudorabiesVirusM.S.Candidate：JiqiangWuSupervisor：Prof.GuoxinLiDegree：MasterofVeterinaryScienceSpecialty:VeterinaryMedicineMay2017 摘要自2011年以来，我国许多伪狂犬病疫苗免疫猪场发生了由伪狂犬病毒变异毒株引起的伪狂犬病，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。对于伪狂犬病病毒变异毒株的攻击，Bartha-K61等传统的疫苗已经无法为免疫猪提供完全的保护。2012年，本课题组从江苏省疑似发生伪狂犬病的仔猪中，分离到了一株伪狂犬病病毒变异毒株（JS-2012株）。在40℃条件下，把该变异毒株在Vero细胞上连续传代培养120代，获得了一株毒力减弱的伪狂犬病病毒（JS-2012-F120株）。与变异毒株JS-2012相比，JS-2012-F120接种仔猪不引起任何临床症状，而且其相关生物学特性，如蚀斑大小和病毒滴度也发生了改变。本研究通过蚀斑实验，病毒生长曲线以及小鼠感染实验研究了各个代次病毒（第25、45、50、71、91、110和120代病毒）的生物学特性。结果表明，随着传代次数的增加，病毒滴度呈现出9.0逐渐增高的趋势。第120代病毒（JS-2012-F120株）病毒滴度可以达到10TCID50/ml，明显高7.0于母源毒株（JS-2012株）的滴度（10TCID50/ml）。另外，第50代病毒（JS-2012-F50株）的蚀斑大小只有母源毒株（JS-2012株）50%，而第120代病毒（JS-2012-F120株）的蚀斑大小达到母源毒株（JS-2012株）的95%。此外，随着传代次数的增加，病毒对小鼠的致病力也逐渐减弱。变异毒株（JS-2012株）接种组小鼠的发病率和死亡率分别为100%和50%，而第120代病毒（JS-2012-F120株）接种组小鼠发病率只有30%，并且没有小鼠死亡。为了探索伪狂犬病病毒高温传代毒株生物学特性改变的分子基础，本研究通过高通量测序并结合常规测序方法获得了不同代次病毒（第25、45、50、71、91、110和120代病毒）的基因编码区（CDS）序列。序列比对分析结果显示，与变异毒株JS-2012相比，第120代病毒JS-2012-F120在gEgI基因区域，有2307个碱基缺失；在IE180,UL18,UL44和UL50蛋白上有4个氨基酸突变，并且在UL16和UL46基因均存在+1位移码突变。UL16基因的952位有1个胞嘧啶（C）核苷酸插入，导致C端有13个氨基酸突变；UL46基因的1796位有29个碱基插入，导致C端有130个氨基酸突变。gE-US2基因区域2307个碱基的缺失可能是毒力减弱和蚀斑减小的主要因素；此外，UL16和UL46基因移码突变可能与毒力减弱相关；gC蛋白的点突变（G90D）可能增强了病毒在细胞间的传播能力。上述结果有助于我们更加深入地了解伪狂犬病毒的致病机理及其生长特性。本研究通过3'RACE、Western-blot和IFA实验的方法从转录水平及蛋白水平验证了UL16和UL46基因的移码突变现象。证实该移码突变并未使这两个基因的功能完全丧失，而只是使编码区延长终止，最终导致3’端氨基酸发生了突变。伪狂犬病毒基因组结构极其稳定，病毒发生移码突变现象极为罕见。本研究结果有助于我们更深入地了解伪狂犬病毒UL16和UL46的基因功能。为制备伪狂犬病病毒变异株gE蛋白的单克隆抗体，将gE蛋白主要抗原表位区在大肠杆菌中进行了表达。用纯化的融合蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠，经细胞融合和筛选，获得了4株稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞（2E5，5C3，5B2和6E6）。间接免疫荧光试验（IFA）显示四株单克隆抗体均能与PRV变异株（JS-2012）反应，但与gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株I 无反应。而Westernblot结果显示只有5C3和2E5能与PRV（JS-2012株）gE蛋白反应，而5B2和6E6与gE蛋白不反应。这些gE蛋白单克隆抗体为伪狂犬病病毒变异株的鉴定与功能研究以及建立鉴别诊断方法提供了良好的工具。关键词：伪狂犬病病毒，毒力减弱，移码突变，生物学特性，gE单克隆抗体II AbstractSince2011,anoutbreakofporcinepesudorabiesdiseasecousedbyavariantPRVstrainhasspreadtomanyvaccinatepigfarmsandresultedinconsiderableeconomiclossesinChina.ThetraditionalvaccinestrainssuchasBartha-K61didnotprovidecompleteimmuno-protectionagainsttheemergingvariantPRVinfection.Inthepreviousstudy,aPRVvariantJS-2012strainwasisolatedfrompigletswithsuspectedPRVinfectioninJiangsuProvince,Chinain2012.ThePRVvariantwasseriallypassagedinVerocellsat40˚Candanattenuatedvirus(JS-2012-F120strain)wasobtainedafter120timespassaging.ChallengeexperimentsshowedthatJS-2012-F120couldnotcauseanyclinicalsymptomsinthesuckingpiglets,andsomebiologicalcharacteristicssuchasplaquemorphologyandvirustiterweresignificantlydifferentfromJS-2012.Inthisstudy,thebiologicalcharacteristicsofJS-2012anditsderivativesatdifferentpassages（The25th,45th,50th,71th,91th,110thand120thpassagesvirus）werecomparedbyplaqueassay,viralgrowthabilitiesandchallengeexperimentinamicemodel.Thetitersweregraduallyincreased9.0afterculturingattheVerocells.ThetiterofJS-2012-F120wasupto10TCID50/ml,whichwas100-foldhigherthanthatofJS-2012.However,theplaquesizeoftheJS-2012-F50was50%oftheparentalvirus,whiletheJS-2012-F120couldreachto95%.Furthmore,thevirulencetomicewasgraduallydecreasedaspassagenumberincreased.Themorbidityandmortalitywas100%and50%inJS-2012-inoculatedgrouprespectivly,whilethemorbiditywas30%forJS-2012-F120andnomicediedthroughouttheexperiment.Thecodingsequencesofthevirusesatdifferentpassageswereobtainedbyhigh-throughputsequencingandsangersequencingmethodtoexplainthebiologicalchangesoftheattenuatedpseudorabiesvirusatageneticlevel.ComparedwithJS-2012,sixaminoacidsmutationwerefoundinfourproteins(IE180,UL18,UL44andUL50),twoframeshiftmutationswerefoundintheUL16andUL46genes,anda2307ntcontinousdeletionwasfoundinthegEandgIgenes.TheUL16genehadacytosineinsertionat952nt,whichleadstothefollowing13aminoacidsmutationattheCend.TheUL46genehada29ntinsertionatposition1796,whichleadto130aminoacidsmutationsattheCend.Thedeletionof2307bpofgE-US2genemightbethemainfactorofvirulenceattanuationandplaquereduction.Furthmore,thevirusattenuationmightbeassociatedwiththeframeshiftoftheUL16andUL46genes.Theaminoacidmutation(G90D)ingCproteinmightfaciliatevirustransmissionbetweencells.Alltheseresultswereveryhelpfultounderstandthepathogenicmechanismandgrowthcharacteristicsofpseudorabiesvirus.Inthisstudy,3’RACE,Western-blot,andIFAmethodswereusedtoverifytheUL16andUL46genes’frameshiftmutationsattranscriptionalandtranslationallevel.Itwasconfirmedthattheframeshiftmutationdidnotaffecttheexpressionofthesegenes.FrameshiftmutationisaveryrarephenomenonesincethegenomestructureofPRVisverystable.TheseresultswerehelpfultodeeplyunderstandthefunctionsofUL16andUL46genesofPRV.III ThekeyantigenicepitoperegionsofgEofPseudorabiesvirus(PRV)wasexpressedinE.coliforthepreparationofmonoclonalantibody(MAb)againstgEprotein.Thepurifiedrecombinantproteinwasusedtoimmunize6weekoldBALB/cfemalemice.Fourstrainsofhybridomacelllines(2E5,5C3,5B2,and6E6)stablyproducinganti-gEproteinMAbwereobtainedusingthehybridomatechnique.ThefourMAbswasabletoreactwithPRVvariantstrain(JS-2012),butnotwiththegEdeletedvaccinevirusBartha-K61strainbyIndirectimmunofluorescenceassays（IFA)analysis.Western-Blotresultsshowedthat5C3and2E5wereabletoreactwithPRV(JS-2012)but5B2and6E6werenotabletoreactwithPRV(JS-2012).ThesespecificmonoclonalantibodiesmightprovideagoodtoolforthestudyofthePRVandtheestablishmentofPRdiagnosismethod.Keyword:Pseudorabiesvirus,Attanuation,frameshiftmutation,biologicalcharacteristics,gEmonoclonalantibodyIV 目录第一章引言...............................................................................................................11.1猪伪狂犬病病毒的病原学.............................................................................21.1.1伪狂犬病病毒的分类与形态特点.......................................................21.1.2伪狂犬病病毒的DNA特点................................................................21.1.3伪狂犬病病毒蛋白特性.......................................................................31.1.4病毒的理化性质...................................................................................41.1.5伪狂犬病病毒的流行病学...................................................................41.2伪狂犬病病毒基因功能.................................................................................51.2.1必需糖蛋白...........................................................................................51.2.2非必需糖蛋白.......................................................................................61.2.3其他基因...............................................................................................61.2.4非编码基因...........................................................................................71.3伪狂犬病病毒的检测及防治.........................................................................81.4本研究的目的意义.........................................................................................8第二章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的生物学特性分析...................102.1材料和方法...................................................................................................102.1.1毒株.....................................................................................................102.1.2实验动物及材料.................................................................................102.1.3实验方法.............................................................................................102.2结果...............................................................................................................122.2.1蚀斑实验.............................................................................................122.2.2生长曲线.............................................................................................132.2.3小鼠致病性实验.................................................................................132.3讨论...............................................................................................................14第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析...................16V 3.1材料和方法...................................................................................................163.1.1毒株与细胞.........................................................................................163.1.2菌株、试剂与载体.............................................................................163.1.3主要的设备仪器.................................................................................163.1.4病毒基因组DNA的提取..................................................................173.1.5高通量测序.........................................................................................173.1.6常规测序方法补测.............................................................................183.1.7测序结果序列拼接与序列分析.........................................................193.2结果...............................................................................................................193.2.1高通量测序结果.................................................................................193.2.2常规测序.............................................................................................223.2.3F50，F120全序列的获得...................................................................233.2.4JS-2012与各传代毒的序列对比分析................................................243.3讨论...............................................................................................................27第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证.................283.1.1毒株.....................................................................................................284.1.2菌株与试剂.........................................................................................284.1.3主要的设备仪器.................................................................................284.1.4mRNA水平验证..................................................................................284.1.5蛋白水平验证.....................................................................................314.2实验结果.......................................................................................................324.2.13’RACE-PCR电泳结果......................................................................324.2.2测序结果分析.....................................................................................334.2.3UL16，UL46蛋白原核表达结果......................................................334.2.4UL16，UL46Westernblot鉴定.........................................................344.2.5UL16，UL46IFA鉴定.......................................................................35VI 4.3讨论...............................................................................................................35第五章伪狂犬病病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定.........................375.1材料和方法...................................................................................................375.1.1毒株、细胞和实验动物.....................................................................375.1.2载体、试剂和菌株.............................................................................375.1.3pCold-gE重组质粒的构建..................................................................375.1.4重组蛋白的诱导表达与纯化.............................................................385.1.5小鼠免疫.............................................................................................385.1.6McAbs的制备.....................................................................................385.1.7间接免疫荧光试验检测单克隆抗体.................................................385.1.8Westernblot检测单克隆抗体.............................................................385.2结果...............................................................................................................395.2.1pCold-gE重组质粒的构建..................................................................395.2.2重组gE蛋白的表达纯化...................................................................395.2.3间接免疫荧光试验检测gE单克隆抗体的特异性...........................405.2.4Westernblot检测gE单克隆抗体的特异性.......................................405.3讨论...............................................................................................................41第六章全文结论.......................................................................................................43参考文献.....................................................................................................................44附录.........................................................................................................................50附录表S1扩增F50，F120全基因组的引物..................................................50附录表S2传代毒株与JS-2012亲本毒株数据统计表....................................53附录表S3SNP、smallindel数据统计表..........................................................54附录表S4样本中exonic区域突变位点对蛋白翻译的影响..........................56致谢...........................................................................................................................58作者简历.....................................................................................................................59VII 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称PRVPseudorabiesvirus伪狂犬病病毒ELISAEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay酶联免疫吸附试验IFAImmunofluorescenceAssay免疫荧光实验IRSInternalrepeatsequence内部重复序列WBWestern-blot免疫印迹试验RACERapid-amplificationofcDNAendscDNA末端快速扩增SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TRSTerminalrepeatsequence末端重复序列HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶CDSCodingsequence基因编码区PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应bpBasepair碱基对kbKilobasepair千碱基对BLASTBasicLocalAlignmentSearchTool局部比对搜索工具ULUniquelongregion长独特区USUniqueshortregion短独特区TRFTandemRepeatsFinder串联重复序列搜索工具TCID5050%Tissuecultureinfectivedose半数组织细胞感染量DMEMDulbecco’sModifiedEagle’sMedium细胞培养基FBSDetalcalfserum胎牛血清gBGlycoproteinB糖蛋白BgCGlycoproteinC糖蛋白CgDGlycoproteinD糖蛋白DgEGlycoproteinE糖蛋白EgIGlycoproteinI糖蛋白IgHGlycoproteinH糖蛋白HPKProteinkinase蛋白激酶TKThymidinekinase胸苷激酶RR1Ribonueleotidereductase1核苷酸还原酶大亚基RR2Ribonueleotidereductase2核苷酸还原酶小亚基VIII 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR），是由伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）(SpearandRoizman.1972)引起的多种动物以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种急性烈性传染病。伪狂犬病是在十九世纪初由美国学者最早报道，因为该病能引起感染动物的严重瘙痒故而又被称为“奇痒症”(Hanson.1954)。二十世纪初，匈牙利兽医工作者AladarAujeszky采集了出现伪狂犬病症状的病死牛的脑组织，经过各种培养方法均不能从病料中检测到任何的细菌。然而通过肌肉，腹腔，结膜等方式接种病牛脑组织的悬液给其他动物，可使被接种动物出现神经系统紊乱，并在短时间内死亡。而后在1931年Shope等人证实了牛的“奇痒症”和伪狂犬病是同一种病(Shope.1934)。为了纪念Aujeszky发现并分离到该病的病原，伪狂犬病又被人们称为Aujeszky'sdisease(Aujeszky.1902)。该病毒在1960年以前只是在中欧流行，虽然在此时期美国和西欧也分离到了伪狂犬病病毒，但因为其毒力较低，对于养猪业来说影响也不是很大。但到了二十世纪中叶，强毒株逐渐出现，其不仅可以感染1月龄以内仔猪也可感染各种年龄段的猪，感染率和致死率逐渐上升。到了二十世纪中后叶是伪狂犬病的大流行时期，包括美洲，欧洲，亚洲在内的几个大洲的养猪国家均有流行，使全球养猪业承受了巨大的损失(Mettenleiter.1994)。在此期间，各国学者也分离到了一些经典的伪狂犬病毒毒株，其中包括Becker株，Kaplan株，Yamagata-81株，Rice株，新加坡的Singapore株等。我国首先报道此病是在1948年由刘永纯在猫体内发现了该病毒，1956年周圣文等人在哺乳猪的猪群中发现了伪狂犬病，1980年之后黄俊明等学者利用免疫荧光等技术对吉林，黑龙江，河南等省猪场送检的血清进行检测，阳性率超过40%。在这之后，随着对伪狂犬病的检测地区的增加，结果显示全国大部分猪场均有伪狂犬病的流行。二十世纪九十年代，随着伪狂犬病的全国大流行，我国学者也分离到了一些具有代表性的毒株，如京A株(江焕贤等.1993)、鄂A株(陈焕春，方六荣.1998)、YN株(王永贤等.,1984)等。由于该病的传播范围广，对养殖业的危害极大，为了彻底净化伪狂犬病，许多国家成立了根除计划。为了达到清除该病的目的，世界各国均开始了伪狂犬病疫苗的研究计划。其中较为著名的疫苗毒株包括匈牙利研制的Bartha株(Lomniczietal.,1987)，罗马尼亚研制的TK200株和Bucharest株(Kitetal.,1987)等。虽然这些疫苗株研制方法不同，但病毒主要的毒力基因gE均有缺失。随着分子生物学技术的发展，人们可以很好的区分疫苗免疫猪和野毒感染猪（gE蛋白间接ELISA方法的应用）。基因缺失疫苗的广泛应用使得控制和消灭该病成为可能（通过扑杀，淘汰野毒感染猪）。之后美国，德国，英国，瑞典，丹麦，澳大利亚等国均宣布消除该病。由于我国养殖环境复杂，散养户居多，淘汰、扑杀野毒感染猪力度不够，导致伪狂犬病一直在我国猪群中流行。虽然在一段时间内该病的控制效果良好，但是随着免疫压力的增加，该病毒也在不断地进化。2011年起，全国很多使用伪狂犬弱毒疫苗Bartha株免疫的规模化猪场爆发了伪狂犬病，该病毒传播迅速，发病快，仔猪死亡率高。童武、彭金美等人(Anetal.,2013a;童武等.2013)也分别从发病猪中分离到了伪狂犬野毒株，通过基因序列分析与抗体中和试验证实了分离的野毒株较疫苗株和经典毒株发生了较大的变异(Anetal.,2013b;Yeetal.,2015)。在之后的报道中，全国各地均分离到了伪狂犬的野毒株(Huetal.,2015;Wuetal.,2013;Zetal.,2015)。这表明伪狂犬病在我国又发生了抬头。1 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.1猪伪狂犬病病毒的病原学1.1.1伪狂犬病病毒的分类与形态特点根据病毒的分子生物学特性可将疱疹病毒分为α、β和γ3个亚科，其中α亚科是以单纯疱疹病毒为代表，核酸分子量小，复制比较快；β亚科以人巨噬细胞病毒为代表，核酸分子量较大，复制慢；γ亚科以爱泼斯坦-巴尔氏（EB）病毒为代表，主要感染淋巴细胞。猪伪狂犬病病毒则属于α病毒科α病毒亚科。PRV病毒的主要存在形式分为两种，一种是存在于细胞外的具有感染力的成熟病毒粒子，另一种则是存在于细胞内的未成熟的病毒核酸分子。成熟的伪狂犬病病毒粒子的形态为球形，因为其皮层蛋白的厚度与囊膜层的厚度与病毒的完整状态不同，其直径为100nm~300nm(Nauwynck.1997)不等。成熟的PRV病毒粒子结构分为四层，由内而外依次为病毒核酸（DNA），衣壳蛋白，皮层蛋白与最外层的囊膜蛋白（如图1.1）。PRV病毒的核酸被二十面体对称的衣壳蛋白包在中间，最外层是由脂质双分子层形成的囊膜包裹，而位于这些囊膜的表面有很多的突起，这些突起为病毒的糖蛋白。位于囊膜和衣壳蛋白之间的蛋白则表现为密度不均而且分布也不均匀的皮层(Pomeranzetal.,2005)。图1.1PRV病毒粒子电镜图片及示意图（Pomeranzetal,2005）Fig1.1ElectronmicrographandorganizationimageofaPRVvirion.(Pomeranzetal,2005)1.1.2伪狂犬病病毒的DNA特点伪狂犬病病毒的核心DNA直径约为75nm，形状不规则。基因组全长约143kb，GC含量高达73%，为双链的线性DNA分子(Mulder.1995)，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成。其存在4个复制起始位点（Oris），其中两个位于US两侧的反复重复序列，一个位于基因组左侧的末端，另外一个位于UL区(Ben-PoratandKaplan.1985)。伪狂犬病病毒可编码70多种蛋白（如图1.2）。病毒复制类型为“滚环复制”，即当病毒核酸由核孔进入到细胞核之后，基因组两端序列的互补配对形成一个环状DNA分子。其借助UL29，UL30，UL42组成的DNA聚合酶复合体和由UL9，ICP8以及解旋酶/引发酶复合体组成的复制体开始滚环复制过程。此时从病毒的复制起始位点开始DNA复制，并向不同的方向进行延伸，从而形成“滚环复制”(Card2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言etal.,1993)。其形成的新的DNA分子则为一条病毒DNA首尾相连的长链大分子，经过UL6，UL15和UL28组成的蛋白质复合体将其切割成一个个单独的DNA分子，经过加工成熟之后再在这个蛋白质复合物的引导下导入到新合成的病毒衣壳蛋白之内。之后初级病毒粒子出核孔到达细胞质中，经过高尔基体的二次加工包被上囊膜最终释放到细胞外，成为成熟的具有感染力的子代病毒。由于包装过程复杂，有超过50%的包装不完整的子代病毒被迅速降解了(Pomeranzetal.,2005)。图1.2伪狂犬病病毒基因组示意图Fig1.2Thegenomepatternpseudorabiesvirusgenome1.1.3伪狂犬病病毒蛋白特性伪狂犬病病毒可以编码超过70种的蛋白质，根据转录的先后顺序可分为立即早期基因（Immediate-earlygene），早期基因（Earlygene）和晚期基因（Lategene）。所编码的蛋白中，有很多的结构蛋白，转录调节因子，毒力因子，酶类以及其他一些与病毒生命周期相关的蛋白。PRV所编码的蛋白质主要分为三类：衣壳蛋白，皮层蛋白和囊膜蛋白(Homaetal.,2013)。伪狂犬病病毒的病毒粒子衣壳蛋白由162个衣壳粒子组成。其中150个衣壳粒子为六邻体，12个为五邻体。所谓五邻体和六邻体，其均为衣壳形态的亚单位。每一个成熟的衣壳蛋白都包含955个UL19（VP5）分子，900个UL35（VP26）分子，640个UL18（VP23）分子，320个UL38（VP19c）分子以及12个UL6分子（接入蛋白）。每个成熟的衣壳蛋白至少包含7种蛋白。它们最直观最根本的作用就是将病毒DNA保护在内，但是也有一些其他功能，有的和病毒在细胞中的转运相关，有的和不同阶段的衣壳蛋白合成相关。皮层蛋白位于成熟病毒粒子的衣壳蛋白与囊膜蛋白之间，是一层不均质的蛋白。随着皮层蛋白在病毒中的位置不同其表现的厚度也不相同，且其层次分明，因而又被分为内层皮层蛋白和外层皮层蛋白。内皮层蛋白主要与衣壳蛋白相连，主要由UL36与UL37组成的复合体蛋白组成；外皮层蛋白对称性不高，主要与囊膜蛋白相互作用(Mettenleiter.2006)。皮层蛋白至少由14种病毒蛋白组成了，其中UL11/UL16/UL21，UL46/UL47/UL48/UL49/UL13/UL41是以蛋白质复合体的形式存在(WalterFuchs.2003)，其他蛋白大多以单个蛋白分子形式存在，如US2，UL51，US3等。囊膜蛋白主要来源于宿主细胞的细胞膜以及内质网和高尔基体膜，是病毒在成熟过程中通过膜融合和内膜出芽方式得来。虽然来源于细胞膜但是与细胞膜却不尽相同，病毒囊膜表面含有很多的纤突，这些纤突主要为病毒的糖蛋白。伪狂犬病病毒编码的糖蛋白有16种，其中包括gB（UL27），gC（UL44），gD（US6），gE（US8），gG（US4），gH（UL22），gI（US7），gK（UL53），gM（UL10），gL（UL1）与gN（UL49.5）。伪狂犬蛋白中gB，gD，gE，gL，gC，gN，gM与gG是毒力基因，而gB，gD，gL，gK和gH是增殖所必需的基因。以及4种未糖基化的蛋白US9，UL20，UL43和UL24(Kluppetal.,2005)。另外一个蛋白UL34则是一种Ⅱ型膜蛋白（不存在于成3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言熟病毒粒子中，只存在于初级病毒粒子中）(Kluppetal.,2000)。囊膜蛋白的主要功能一是保护PRV病毒粒子不被外界环境影响，二是它是病毒与细胞识别的主要成分，有利于病毒的吸附，在细胞融合与病毒在细胞间的水平传播有着很大的作用。1.1.4病毒的理化性质由于囊膜的存在，伪狂犬病病毒对外界的恶劣环境抵抗力很强。伪狂犬病病毒在60℃条件下要半小时以上才能灭活，80℃要3分钟以上才能灭活。夏季可在猪舍内存活多达30天，冬季更是达到了46天，若在0～6℃其可生存长达3年。病毒粒子在pH4～9仍可保持稳定，0.3%的石炭酸处理一个月后仍具有感染力。PRV对氯仿，乙醇，甲醛等有机化学试剂比较敏感，这与其具有脂溶性能够破坏病毒囊膜有关(Brownetal.,1990)。因此伪狂犬病病毒可以长期存在于土壤，饲料，青草，木材，猪粪等物中，使得养猪场很难将该病毒彻底清理干净。灭活疫苗在研制过程中最重要的步骤就是在保留病毒抗原性的同时将病毒灭活。研究表明，通过化学方法（二乙烯亚胺等）处理，物理方法（辐射）处理以及化学结合物理方法（吖啶染料）等方式处理之后可以使病毒粒子丧失感染力，同时保持一定的抗原性(Sunetal.,1978)。其中比较理想的灭活方式是用二乙烯亚胺，这种方法可以很大程度的保留病毒粒子的抗原性(Sunetal.,1978)。还有学者使用了光化学灭活法灭活病毒，在增大仪器电流之后结合磁性搅拌子进行搅拌，可使病毒粒子很快的灭活且保留抗原性(Badylaketal.,1983)。光灭活法是一种经济有效，简单便宜的灭活方式。1.1.5伪狂犬病病毒的流行病学伪狂犬病病毒的宿主广泛，自然状态下可以感染猪、牛、羊、犬、猫等家畜以及貂、狐等多种经济动物，对野猪、熊、野鼠、鹿等多种野生动物也很易感。小鼠、兔子、豚鼠等实验动物对该病毒易感，其中兔子表现为最易感。PRV传播途径主要有两个，一是病原从传染源到接触易感动物这条途径，此途径主要通过外界环境中的各种传播媒介，包括空气、水、土壤、饲料、精液、野生动物、医疗器械以及人类等；二是病原从接触易感体表到体内的这一过程，主要通过消化道、呼吸道、生殖道以及皮肤黏膜等。和其他α疱疹病毒类似，伪狂犬病病毒的感染也表现为两种形式，即生产性感染与潜伏感染。生产性感染指能够产生子代病毒的感染，潜伏感染指病毒在特定条件下保留了DNA的全部功能并且存在于感染动物体内，但是不会产生子代病毒的感染，也不出现临床症状。生产性感染对于仔猪往往是致死性的，对于育肥猪死亡率会降低很多。但是，所有在感染伪狂犬病病毒之后不死亡的猪均会有伪狂犬病病毒的潜伏感染(Crandell.1982)。家畜和野生动物的感染均表现为感染-潜伏-激活，因此该病长期存在于猪群与野生动物群中。伪狂犬病病毒的流行没有较明显的季节差异，但是在冬春季节较夏秋阳性率稍微高一些。随着集约化养殖程度的提高，一些养殖水平低下的猪场成了该病长期存在的场所，更有利于其在猪群中的传播(Crandell.1982)。4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.2伪狂犬病病毒基因功能与其他α疱疹病毒相比，伪狂犬病病毒编码的基因都有其同源基因，而且基因的命名也是其与在UL区与US与的位置不同效仿HSV-1命名的。根据病毒感染宿主后核酸的复制及转录顺序，可将伪狂犬病毒基因分为立即早起基因（Immediate-earlygene），早期基因（Earlygene）和晚期基因（Lategene）。这些基因可编码至少70种蛋白质，其中大部分基因功能已经知晓，但还有少量基因功能有待研究。在所有疱疹病毒中约有40种基因为核心基因，其所编码的蛋白质是病毒复制所必需的，参与病毒复制的基本过程。因为核心基因的存在致使疱疹病毒核衣壳，基因的复制以及病毒的侵入与释放等方面都很相似。并且所有疱疹病毒的核心基因全部存在于UL区域(Pomeranzetal.,2005)。1.2.1必需糖蛋白gB（UL27）：gB基因全长2745bp，编码913个氨基酸，是病毒最为保守且为复制所必需的囊膜蛋白。其参与细胞的融合过程，参与病毒粒子在细胞间的传输，增强病毒在细胞间的传输效率(CuranovicandEnquist.2009)。其结构为三聚体结构，由三个亚基以二硫键形成一个单体蛋白。gB蛋白作为伪狂犬病病毒重要的免疫原可以刺激机体产生补体依赖性和非依赖性两种中和抗体(Nixdorfetal.,2000)。gD（US6）：gD基因全长1212bp，编码402个氨基酸，是病毒的囊膜蛋白之一。该基因是伪狂犬病病毒在侵入宿主时所必需的基因也参与细胞融合。病毒在入侵细胞时，首先是gC蛋白与细胞表面受体结合，之后gD再与宿主受体结合，从而介导病毒与宿主结合(Mulderetal.,1996)。但病毒在细胞间传输的时候gD蛋白是非必需的。作为伪狂犬病病毒的重要免疫原，gD蛋白也可以诱导机体产生中和抗体，同时也可作为亚单位疫苗的候选蛋白(Haagmansetal.,1999)。gH（UL22）：gH基因全长2058bp，可编码686个氨基酸，也是PRV病毒的一个高度保守基因，其保守性仅次于gB基因。gD蛋白可刺激机体产生补体非依赖性中和抗体，同时参与病毒感染与细胞融合过程(Haagmansetal.,1999)。其一般是与gL蛋白形成复合体，存在形式也主要以gH/gL复合体形式存在(Kluppetal.,1992)。gL（UL1）：gL基因全长471bp，编码产生157个氨基酸。gL蛋白能与gH蛋白形成复合体并以gH/gL复合体形式存在，这两个蛋白若缺失一个则另一个也同时消失(Kluppetal.,1997;Kluppetal.,1992)。gL蛋白也是病毒入侵细胞和在细胞间运输所必需的，是病毒复制所必需的蛋白之一(Kluppetal.,1997)。gK（UL53）：gK基因全长939bp，能够编码产生311个氨基酸。gK蛋白定位于病毒囊膜上，参与病毒在细胞间的传播，是细胞间传播所必需的蛋白之一（gK基因缺失的病毒对细胞重复感染率降低），但在病毒入侵宿主过程中是非必需的。gK蛋白在病毒的复制中也发挥着很大的作用，gK蛋白缺失的病毒，其病毒的滴度下降(Dietzetal.,2000)。5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.2.2非必需糖蛋白gC（UL44）：gC基因是病毒复制的非必需基因，gC蛋白有糖基化和非糖基化两种形式。gC蛋白也可诱导产生细胞免疫从而诱导产生中和抗体。gC基因也是病毒的毒力基因之一，其可结合猪的C3蛋白并激活补体系统，其也可以与gE、gI蛋白形成复合体从而促进病毒释放(Mettenleiteretal.,1988)。gE（US8）：gE基因是伪狂犬病病毒的主要毒力基因之一，是病毒复制非必需的(Vanetal.,1991)，也是人们研究的最多的毒力蛋白之一。gE蛋白能够诱导细胞融合，加快病毒在细胞之间的传递过程。gE蛋白还能够促进病毒在宿主中枢神经中的传播。因其能够与gI蛋白形成gE/gI蛋白二聚体，从而可以作为一个功能单位发挥作用(Bracketal.,2000;Cardetal.,1992)。缺失gE，gI基因的病毒对小鼠，大鼠以及猪的致病性均有下降。gI（US7）：gI基因编码的gI蛋白定位于病毒的囊膜上，可参与病毒在细胞间传播，能与gE蛋白形成gE/gI复合体，从而作为一个功能单位发挥功能。gE/gI蛋白复合体能与gC蛋白共同介导病毒在细胞中的释放(vanOirschotetal.,1991)。gG（US4）：gG蛋白为病毒的非结构蛋白之一，是一种分泌型的蛋白，只存在于被感染细胞的胞浆中，是病毒在吸附，穿入细胞以及在细胞中释放非必需的基因之一(Viejoborbollaetal.,2009)。且其在免疫逃避当中有着一定的作用(Tangetal.,2003)。gM（UL10）：gM基因是病毒复制非必需的，但作为糖蛋白之一，其能够抑制由其他糖蛋白介导的膜融合过程(Dijkstraetal.,1997)。gM蛋白存在1个潜在的糖基化位点和8个潜在的跨膜区域。gM蛋白可与gN蛋白以二硫键形式形成gM/gN蛋白复合体从而共同发挥抑制膜融合过程作用，也可在gN蛋白缺失的情况下单独发挥作用(Dijkstraetal.,1996)。gN（UL49.5）：gN基因所编码蛋白产物是胰蛋白激活肽（TAP）的抑制剂，而胰蛋白酶激活肽可与抗原降解物一起递呈给MHC-1类分子，故gN蛋白的功能是抑制此现象。gN蛋白可与gM蛋白形成gM/gN蛋白复合体而共同发挥作用(Jönsetal.,1998)。gN基因在疱疹病毒中相对保守，缺失后不会影响病毒在小鼠体内的毒性。1.2.3其他基因UL23（TK）：TK基因编码病毒的胸腺激酶，只存在于α与γ疱疹病毒中，因与宿主的胸腺激酶相比有着更加广泛的底物特异性，这使得许多抗病毒药（如阿昔洛韦）能很好地抑制该病毒(Malewiczetal.,1983)。TK基因是病毒复制增殖非必需的，但是缺少了TK基因的缺失病毒在小鼠，兔子以及猪身上的毒力明显下降(Kitetal.,1985)。US3（PK）：PK基因为α疱疹病毒的蛋白激酶（Proteinkinase），PK基因对于病毒是非必需的，缺失TK基因只会使病毒滴度稍微降低。PK基因缺失之后不会影响囊膜和皮层的组装。PK蛋白可通过对目的蛋白直接的磷酸化作用从而阻止细胞凋亡从而发挥抗凋亡作用(L.M.Olsen.2006;Wagenaaretal.,1995)。IE180：IE180基因是伪狂犬病病毒现知的唯一的立即早期基因，一个PRV基因组存在两个基因序列拷贝，并且其大部分序列都与基因组LLT（潜伏感染转录基因）部分重叠(Ouetal.,2003)。6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言IE180是一个潜在的转录激活因子，因为其是第一个病毒被转录的基因，故而IE180蛋白能够激活gG，TK，VHS及EP0基因的表达(Pomeranzetal.,2005)。EP0：EP0基因是伪狂犬病病毒编码的早期基因之一，在细胞感染病毒之后2个小时就能够检测到EP0基因的表达。与IE180类似，该基因的大部分序列也与LLT部分重叠(Guoetal.,2009)。EP0蛋白既能激活IE180，gG等基因的表达，也能抑制gE基因及VHS（UL41）基因的启动子的活性(Ouetal.,2003)。UL41（VHS）：VHS基因编码宿主关闭蛋白，是一个保守性较高的基因。其能够抑制RNase的活性，与HSV-1宿主关闭蛋白不同，其关闭作用要比其弱一些，并且需要病毒蛋白重新的合成(Linetal.,2010)。有学者分析发现其有4个保守区域，且第3个保守区域与内切酶FEN-1同源性较高(Linetal.,2004)。UL48（VP16）：VP16蛋白是伪狂犬病病毒一个比较保守的基因，其在病毒释放与病毒基因表达上有一定的作用。跟其他α疱疹病毒VP16蛋白类似，其能够增强伪狂犬病病毒立即早期基因的表达(Fuchsetal.,2002a)。缺失UL48基因的缺失病毒感染宿主后不能正常的产生IE180蛋白，对缺失病毒小鼠致病性实验中，小鼠的死亡时间与发病时间均有延迟(WalterFuchs.2003)。UL54（ICP27）：UL54蛋白在病毒感染细胞后定位于细胞核中，能够结合polyGRNA(HuangandWu.2004)。预测软件预测其在C端有一个锌指结构，N端富含精氨酸与甘氨酸。缺失UL54基因的病毒在胞间的传播能力明显降低(Schwartzetal.,2006)。UL50：UL50虽然不能组装到病毒粒子中但其有dUTPases（脱氧尿苷三磷酸酶）作用，能与宿主dUTPase共同催化dUTP的水解。作为非必需基因，缺失UL50基因的缺失病毒在细胞上的增殖没有太大变化，但是接种动物之后，其毒力有所减弱，因而可作为一个弱毒活疫苗的潜在位点(Jönsetal.,1997;JönsandMettenleiter.1996)。UL39（RR1）与UL40（RR2）：这两个基因分别编码病毒核糖核苷酸还原酶的大（RR2）小（RR1）亚基，UL39、UL40基因的保守性较高。核糖核苷酸还原酶是以核苷酸为底物生成脱氧核糖核苷酸。与其他核苷酸还原酶不同，其能够抵抗dTTP产物的负反馈作用。缺失病毒毒力也表现为减弱(Yanetal.,2016)。UL31与UL34：UL31和UL34蛋白共定位于细胞核的外膜，并与US3共同参与病毒的释放(Fuchsetal.,2002b)。UL29（ICP8）：UL29基因含有一个保守的DNA结合域与锌指结构，且对于病毒基因组的复制至关重要(Sheltonetal.,1994)。UL2（UNG）：UL2基因编码尿嘧啶-DNA糖基化酶（Uracil-DNAglycosylase，UNG或UDG），其能够修复DNA损伤后对于尿嘧啶部分的移除(Caietal.,2013)。1.2.4非编码基因在伪狂犬病病毒IR区域LLT部分存在与潜伏感染相关的转录物（Latency-associatedtranscription）的转录本，且与EP0，IE180有重叠，但是转录方向相反(Cheung.1996)。伪狂犬病病毒潜伏感染时期可在感染猪的三叉神经节内提取到大小不同的LATs，其中较大部分约为8.4kb的潜伏感染转录产物，较小部分很可能是LLT转录产物剪切产生的内含子。在潜伏感染时期LAT7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言区域转录水平很高(Taharaguchietal.,2002)。在LLT区域有两个启动子，其中一个位于LLT起始位点的上游34bp的位置，另外一个位于LLT起始位点的下游143bp的位置(Ouetal.,2003)。虽然人们对于人疱疹病毒（HSV-1）的潜伏感染研究很多，但是对于伪狂犬病病毒的研究还是很少，因而建立小鼠的潜伏感染模型对于更深入的研究伪狂犬病病毒以及消除伪狂犬病十分重要(Margolisetal.,2007;TanakaandMannen.2002)。MicroRNA（miRNA）是一种由内源基因表达的单链微小RNA，长度约为22~24nt。MiRNA存在多种的形式，最初的为pri-miRNA，长约300~1000nt；pri-miRNA经过加工后，成为pre-miRNA，长约70~90nt；pre-miRNA再经Dicer酶酶切之后，成为20~24nt的成熟miRNA(PawlickiandSteitz.2008;Zeng.2006)。由病毒编码产生的miRNA在病毒生命周期内调控病毒的增殖和基因的表达有着很重要的作用。另外其还可以调控细胞凋亡，免疫与代谢。伪狂犬病病毒所编码的miRNA也可以调控很多细胞与病毒基因的表达(Bossetal.,2009)。1.3伪狂犬病病毒的检测及防治伪狂犬病病毒在感染猪后一般潜伏2~6d后便会发病。两周内仔猪感染后往往表现为最急性型，3d之后便发病死亡，致死率为100%(Crandell.1982)，表现为发烧、腹泻、运动失调、四肢出现划水样动作，濒死出现角弓反张；3周龄的仔猪死亡率为50%；育肥猪感染PRV常伴有呼吸困难，体温升高等症状(Brittleetal.,2005)，一般不发生死亡，症状消失之后为隐性感染状态，长期带毒排毒；成年猪只有略微发烧，没有明显症状；妊娠母猪感染病毒之后常会出现流产、死胎、木乃伊胎。伪狂犬病的诊断方法分为两种，一是临床诊断：根据伪狂犬病在各年龄猪群中的发病症状不同进行初步诊断；二是实验室诊断：包括病理学诊断，免疫学诊断与病原学诊断。实验室诊断中最常用的为免疫学诊断，包括免疫荧光（IFA）诊断技术，血凝血抑诊断技术，酶联免疫吸附（ELISA）诊断技术，中和实验诊断技术，病原学诊断（病原的分离与鉴定，PCR检测技术及动物接种检测技术）等。伪狂犬病的防治：为了控制伪狂犬病，我国猪场自上世纪90年代开始就已广泛使用伪狂犬疫苗（如PRVBartha株活疫苗），使得猪伪狂犬病的发病率明显下降，并且部分种猪场实际上已经根除了此病毒。对于这种烈性传染病，疫苗的使用是唯一能够预防并控制乃至消除该病毒的方法。自二十世纪开始，各国学者研制了许多种疫苗来控制此病，如灭活疫苗、弱毒活疫苗、基因缺失苗、核酸疫苗等，效果好性价比高的疫苗是该病防控的重点。1.4本研究的目的意义自2011年以来，我国许多使用gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场发生了由伪狂犬病病毒变异毒株引起的伪狂犬病。目前，新发的伪狂犬病病毒变异毒株已经遍布我国主要养猪地区，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。对于伪狂犬病病毒变异毒株的攻击，传统的疫苗已经无法为免疫猪提供完全的保护。2012年，本课题组从江苏省某伪狂犬病活疫苗免疫猪场发生的疑似伪狂犬病的病死仔猪的脑8 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言组织中，分离到了一株伪狂犬病病毒变异毒株（JS-2012株），并获得了该毒株的全基因组序列。该毒株对不同年龄猪的致病性都高于传统毒株。该毒株在40℃条件下在Vero细胞传代培养120代，获得了一系列传代毒株，并且发现随着传代次数的增加，病毒对仔猪的致病力是逐渐减弱的。第120代病毒（JS-2012-F120株）对仔猪不致病，而且在Vero细胞上的培养特性发生改变，比如病毒滴度明显提高等。推测伪狂犬病病毒变异毒株在高温传代过程中，生物学特性是逐渐发生改变的，相应地，其基因序列也会经历一系列的演变过程。本研究拟探明不同代次毒株的生物学特性，了解其病毒毒力、蚀斑特点以及病毒生长特性等在传代过程过程中的演变规律；同时，通过对不同代次病毒的序列测定，了解伪狂犬病病毒这些生物学特性的改变与基因突变的对应关系。这些研究为进一步探索伪狂犬病病毒相关基因功能奠定基础。并且，通过本研究，寻找伪狂犬病病毒可能的毒力相关基因及与病毒增殖密切相关基因，可以为获得毒力减弱毒株及高产毒株提供理论依据。伪狂犬病病毒有着高度的潜伏感染特性，易在体内外环境变化的应激下爆发疫情。gE缺失疫苗免疫与gE-ELISA血清学诊断方法配合使用，是净化甚至根除伪狂犬病的最佳策略。本研究拟制备伪狂犬病病毒gE蛋白的单克隆抗体，为研究伪狂犬病病毒以及建立伪狂犬病的诊断方法提供了良好的工具。9 中国农业科学院硕士学位论文第二章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的生物学特性分析第二章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的生物学特性分析摘要：为了探索伪狂犬病病毒在高温传代的过程生物学特性改变的规律，本研究对伪狂犬病病毒变异株（JS-2012株）及其一系列高温传代毒株（F25，F50，F71，F91，F110，F120）的基本生物学特性进行了研究。各个代次毒株的蚀斑实验结果显示，第50代毒株（F50）的蚀斑大小只有JS-2012毒株的50%，而第120代毒株（F120）的蚀斑大小达到JS-2012毒株的95%；一步生长曲线研究结果显示，随着传代次数的增加，病毒滴度呈现出逐渐增高的趋势，F120毒株病毒9.07.0滴度可以达到10TCID50/ml，明显高于JS-2012毒株的滴度10TCID50/ml；小鼠致病性实验发现，随着传代次数的增加，病毒对小鼠的致病力也逐渐减弱，变异毒株（JS-2012株）接种组小鼠的发病率和死亡率分别为100%and50%，而第120代病毒（JS-2012-F120株）接种组小鼠发病率只有30%，并且没有小鼠死亡。综上所述，JS-2012毒株在高温传代过程中发生了明显的改变。2.1材料和方法2.1.1毒株JS-2012，F25，F50，F71，F91，F110，F120毒株均由本实验室保存。2.1.2实验动物及材料8周龄清洁级昆明小鼠购自上海斯莱克公司；Vero细胞由本实验室保存，细胞在37℃，5％CO2，10%FBS(FBS;Sigma,Shanghai,China)条件下培养；1ml注射器购自BD（上海）公司。2.1.3实验方法2.1.3.1蚀斑实验为了观察病毒在细胞上形成的蚀斑形态与大小，我们将7个毒株分别进行了蚀斑染色，以观察其生物学特性，步骤如下：1．将Vero细胞铺在6孔细胞培养板中，待细胞长满孔面积的90%时使用；-1-62．将JS-2012，F25，F50，F71，F91，F110，F120以10~10倍比稀释到1.5mlEP管中，使用无血清DMEM进行稀释；3．弃去培养板中培养基，每孔加1mlPBS清洗2遍；4．吸出PBS，每孔加入步骤1稀释的病毒液，800μL/孔，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中吸附1h；5．配置1%低熔点琼脂糖，配方如表2.1。10 中国农业科学院硕士学位论文第二章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的生物学特性分析表2.11%低熔点琼脂糖配方Table2.11%Theformulaoflowmeltingpointagarose成分数量2%低熔点琼脂糖5ml2×MEM4.8mlFBS0.2ml总体积10ml37℃预热；6．弃去病毒液，每孔加1mlPBS清洗细胞培养板2次，每孔加2ml1%低熔点琼脂糖，置于室温30mim~2h；7．待琼脂糖凝胶完全凝固，将细胞板倒置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；8．3~4d后观察病毒蚀斑长到合适大小之后进行结晶紫染色（4%甲醛固定20min，5%结晶紫染色10min，清水清洗）。2.1.3.2生长曲线测定（一步法）为了研究不同代次毒株与亲本毒株在Vero细胞上的增殖情况，我们通过一步法生长曲线的方法测定了7个毒株的生长曲线。1．将Vero细胞铺在T25细胞培养瓶中，待其长满孔面积的90%时使用；2．将JS-2012，F25，F50，F71，F91，F110，F120稀释到1.5mlEP管中，使用无血清DMEM进行稀释；3．弃去培养瓶中培养基，每孔加1mlPBS清洗2遍；4．1MOI接毒量接毒于T25细胞培养瓶中，每隔4小时收取一次细胞上清（吸取300μL上清，补充300μL无血清DMEM），收到40小时；5．对所收的样品进行滴定，测定TCID50，绘制生长曲线。2.1.3.2小鼠致病性实验为了解JS-2012，F25，F50，F71，F91，F110，F120毒株对小鼠的致病性，我们将昆明小鼠470只，随机分为14组每组5只。每个毒株均以10TCID50接毒量接种小鼠，接种方法为：200μL/只，腹部皮下注射。每隔1d观察小鼠的发病情况以及小鼠的死亡情况，结果经过汇总得到不同代次毒株对小鼠的致病性。11 中国农业科学院硕士学位论文第二章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的生物学特性分析2.2结果2.2.1蚀斑实验将六孔板置于细胞培养箱中，3~4d后观察病毒蚀斑长到合适大小之后进行结晶紫染色（4%甲醛固定20min，5%结晶紫染色10min，清水清洗）。结果（图2.1）表明，JS-2012亲本毒株形成的蚀斑最大，F25代毒株蚀斑面积只有亲本毒株的80%，F71、F110代毒株蚀斑面积为亲本毒株的90%，F120代毒株为亲本毒株的95%，F91代毒株形成的蚀斑大小与亲本毒相同，而F50代毒株蚀斑面积最小，只有亲本毒株的50%，F110、F120蚀斑面积略小于F91（原因可能为实验误差所导致）。通过对蚀斑面积的测量以亲本毒面积为1，其他传代毒面积与其相比较绘制了图2.2。JS-2012F25F50F91F110F120图2.1JS-2012，F25，F50，F71，F91,F110，F120蚀斑染色图Fig.2.1TheplaqueofJS-2012，F25，F50，F71，F91,F110，F120strains图2.2JS-2012，F25，F50，F71，F91,F110，F120蚀斑面积图Fig.2.2TheplaqueareamapofJS-2012，F25，F50，F71，F91,F110，F120strains12 中国农业科学院硕士学位论文第二章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的生物学特性分析2.2.2生长曲线对每个时间点收取的病毒液进行病毒毒价滴定，4d后读取病毒毒价并用Reed-Muench法计算病毒毒价，根据结果绘制生长曲线。结果表明JS-2012与F25代毒生长趋势基本一致，F50与F71代毒生长趋势基本一致，F91、F110、F120生长趋势基本一致。亲本毒JS-2012较F50，F1208代毒株在细胞上的生长趋势均缓慢，且F50毒株的最高毒价可达到10TCID50/ml，F120毒株更97是达到了10TCID50/ml，而亲本毒JS-2012最高毒价只有10TCID50/ml（如图2.3）。图2.3不同代次生长曲线差异图Fig.2.3Differenceofgrowthcurvesofdifferentgenerations2.2.3小鼠致病性实验4我们将昆明小鼠70只，随机分为14组每组5只。每个毒株均以10TCID50接毒量接种小鼠，13 中国农业科学院硕士学位论文第二章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的生物学特性分析接种方法为：200μL/只，腹部皮下注射。每隔1d观察小鼠的发病情况，神经症状出现情况以及小鼠的死亡情况。结果（如表2.2所示），F25代毒株与亲本毒株JS-2012对小鼠致病力与致死率基本一致，攻毒2d小鼠发病，病程持续3d，存活率50%左右；F50代毒株攻毒3d小鼠发病，病程持续4d，存活率80%左右；F71代毒株攻毒4d小鼠发病，病程持续4d，存活率80%左右；F91，F110，F120代毒株攻毒4d小鼠发病，病程持续3~5d，存活率80%~100%。表2.2同一剂量不同毒株注射小鼠后发病与死亡情况Table2.2Incidenceandmortalityofmiceinjectedwiththesamedoseofdifferentstrains时间1d2d3d4d5d6d7d8d9d10存活（只）存活率JS-20124/04/42/1550%F252/07/16/23/1660%F502/03/02/25/04/0880%F714/02/22/02/0880%F912/03/02/02/010100%F1101/01/12/04/12/0880%F1201/01/01/010100%（注：发病只数/死亡只数）2.3讨论为了探索伪狂犬病病毒在高温传代的过程生物学特性改变的规律，本研究对伪狂犬病病毒变异株（JS-2012株）及其一系列高温传代毒株（F25，F50，F71，F91，F110，F120）的基本生物学特性（生长曲线，蚀斑大小，小鼠致病性）进行了比较分析。蚀斑实验结果显示，病毒在高温传代过程中，传代毒株的蚀斑呈现了先减小后恢复的趋势。F25代毒株蚀斑只有亲本毒的80%，F50代毒株蚀斑面积最小，只有亲本毒的50%，而F71代毒株蚀斑面积为亲本毒的90%，F91、F110和F120代毒株蚀斑面积也不低于90%。一步生长曲线实验中，F25与JS-2012代毒株生长趋势基本一致，F50与F71代毒株生长趋8势基本一致。但F50代毒株的最高毒价可达到10TCID50/ml，高于F25，比JS-2012高一个滴度；9F91、F110、F120代毒株生长趋势基本一致，F120代毒株更是达到了10TCID50/ml，毒价明显高于F50，比JS-2012高2个滴度。JS-2012在高温传代的过程中，病毒在细胞上的增殖速度呈现出越来越快的趋势。小鼠致病性实验结果显示，F25代毒株与JS-2012对小鼠致病力与致死率基本相一致，攻毒2d小鼠发病，病程持续3d，存活率50%左右；F50攻毒3d小鼠发病，病程持续4d，存活率80%左右；F71攻毒4d小鼠发病，病程持续4d，存活率80%左右；F91，F110，F120攻毒4d小鼠发病，病程持续3~5d，存活率80%~100%。JS-2012在高温传120代的过程中，病毒毒力表现出越来越弱的趋势。上述实验结果表明，伪狂犬病病毒变异毒株（JS-2012株）在高温传代的过程中，逐渐适应Vero细胞，病毒滴度呈现逐渐增高的趋势；但是，随着传代次数的增加，病毒对小鼠的致病力越14 中国农业科学院硕士学位论文第二章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的生物学特性分析来越弱；另一方面，病毒蚀斑则呈现了先减小后恢复的趋势。我们推测，在病毒传代过程中，一定是病毒的基因发生了一个渐变的过程，才导致病毒生物学特性发生了改变。伪狂犬病病毒这些生物学特性改变的分子基础有待于进一步研究。15 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析摘要：为了探寻伪狂犬病病毒高温传代毒株生物学特性改变的分子基础，我们选取不同代次毒株（F25、F45、F50、F71、F91、F110及F120）进行了全基因组高通量测序。由于伪狂犬病病毒基因组庞大，GC含量高，高级结构多，所以高通量测序很难得到其基因组全长。因此，我们又通过常规测序的方法对一些基因进行了补充测序，最终得到了F50和F120代毒株的基因组全长以及其他代次毒株的全部CDS区的序列信息。通过对序列的比较分析，发现随着传代次数的增加，病毒基因编码区也逐渐发生了该变。与变异毒株JS-2012相比，第120代病毒JS-2012-F120在gE-US2基因区域，有2307个碱基缺失，在IE180、UL18、UL44和UL50蛋白上有4个氨基酸突变，并且在UL16和UL46基因有移码突变。UL16基因952位有1个C插入，导致C端有13个氨基酸突变；UL46基因1796位有29个碱基插入，导致C端有130个氨基酸突变。gE-US2基因区域2307个碱基的缺失可能是毒力减弱和蚀斑减小的主要因素；此外，UL16和UL46基因移码突变可能与毒力减弱相关；gC蛋白的点突变（G90D）可能增强了病毒在细胞间的传播能力。3.1材料和方法3.1.1毒株与细胞伪狂犬病病毒JS-2012毒株，F25、F45、F50、F71、F91、F110及F120传代毒株，Vero细胞均由上海兽医研究所保存。细胞均在37℃，5％CO210%FBS(FBS;Sigma,Shanghai,China)条件下培养。3.1.2菌株、试剂与载体E.coliDH5α，K12感受态细胞，pCold-TF载体，购自Takara（上海）公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG；内切酶EcoRI购自NEB（上海）公司；DNA提取试剂盒购自天根公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、酚氯仿均购自于Invitrogen公司。3.1.3主要的设备仪器DYY-6C琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）、紫外成像仪(基因科技)、DK-8D三孔电热恒温水浴箱(上海齐欣科学仪器有限公司)、HZQ-C空气浴震荡摇床(哈尔滨东联电子技术有限公司)、恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）、生物安全柜BIO1500-Ⅱ-A1（上海振梓创空气净化设备有限公司）、蛋白电泳仪（BIO-RAD）、蛋白质半干转印仪（BIO-RAD）。16 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析3.1.4病毒基因组DNA的提取实验材料：病毒液，RNaseA，10%SDS，蛋白酶K，酚氯仿，75%酒精，无水乙醇，冰盒。实验方法：1．取570μL病毒液置于1.5mLEP管中，做好标记；2．每个EP管中加入30μL10%SDS并轻轻混匀；3．每个EP管加入6μLRNaseA，轻轻混匀，置于37℃水浴锅中1h；4．每个EP管加入6μL蛋白酶K，轻轻混匀，置于37℃水浴锅中1h；5．1:1体积加入酚氯仿抽提3次，轻轻颠倒混匀之后置于冰上，4℃离心，10000×g10分钟，分离水相；5．抽提3次之后，待水相无明显粘稠状物之后，吸出水相于新的EP管中；6．加入2倍体积的无水乙醇用于沉淀核酸，EP管置于-30℃冰箱过夜；7．于-30℃冰箱取出EP管，离心（4℃，12000rpm，10min），弃去上清，用900μL75%酒精洗涤核酸，轻轻混匀（该操作于超净台中进行），离心（4℃，12000rpm，10min）；8．弃去上清，将EP管倒置于吸水纸上，加入50μLTE溶液（配方如表3.1所示）溶解核酸，测定核酸浓度。表3.1TEbuffer配方Table3.1TheformulaofTEbuffer成分数量1MTris-HCl（pH=8.0）5ml0.5MEDTA（pH=8.0）5ml超纯水490ml总体积500ml3.1.5高通量测序将提取传代毒株的F25，F45，F50，F71，F91，F110及F120七个代次毒株的DNA送于美吉（上海）公司进行高通量测序，并对测序结果进行分析。运用BWA软件将测序得到的reads与参考基因组序列进行比对，利用Picard-tools去除PCR-duplication产生的测序reads。接着根据比对bam结果文件，计算出相对于参考基因组的测序深度和覆盖度。利用GATK软件对InDel附近的reads进行局部的重新对齐，获得realign后的bam文件，可以消除InDel周边的假阳性SNP。然后用GATK软件进行SNP、smallindel信息的检测，并过滤掉测序深度和比对质量值较低的位点。利用Annovar软件和参考基因组的gff信息进行注释，得到SNP、indel的注释信息（流程如图3.1所示）。17 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析图3.1生物信息分析流程Fig.3.1Technologicalprocessforbioinformaticsanalysis3.1.6常规测序方法补测由于伪狂犬病病毒基因组GC含量高，结构复杂，高级结构多，因此高通量测序很难将病毒的全部基因组测通，因此我们又通过常规测序的方法将F50，F120毒株DNA全长进行了测序。3.1.6.1PCR扩增亲本毒株JS-2012，F50，F120代毒株全长通过附录表S1设计引物进行PCR扩增，在200μL离心管中配制以下反应体系，扩增体系如表3.1所示。表3.2PCR扩增组分Table3.2TheamplificationcomponentforPCR成分数量TakaraExTaq0.5μLdNTP4μL2×GCBufferI25μL下游引物1μL下游引物1μLDEPCWater16.5μL模板2μL18 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析总体积50μL反应程序：95℃5min；95℃30s，68℃15s，72℃90s（30cycles）；72℃10min；4℃保存。3.1.6.2PCR产物回收取PCR反应产物10μL进行琼脂糖凝胶电泳，并对于阳性产物条带进行切胶回收，具体胶回收步骤参照说明书（Qiagen）进行。3.1.6.3目的片段连接PMD18-T载体取胶回收纯化的PCR产物进行TA克隆（表3.3），4℃过夜。表3.3T载体连接体系Table3.3TheconnectionsystemofTvector成分数量PMD18-T1μLSolutionI5μLPCR纯化产物4μL总体积10μL3.1.6.4载体转化K12感受态细胞与测序于-80℃冰箱取出感受态细胞置于冰盒中，待其溶解后将连接产物全部吸出加入到感受态细胞中，轻轻吹匀（冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min），涂布氨苄平板。平板倒置于37℃恒温培养箱24h后挑取单克隆菌落于液体氨苄LB培养基中，37℃摇床增殖培养24h，送桑尼（上海）公司进行测序。3.1.7测序结果序列拼接与序列分析测序结果经经过比较（MegAlign）分析之后，利用Seqman（DNASTAR，WI，Madison）对于相邻的片段进行序列拼接与分析。3.2结果3.2.1高通量测序结果利用生物信息统计学方法，对所有测序reads的碱基分布和质量波动进行统计，从宏观上可以直观的反映出测序样本的测序质量和文库构建质量。具体结果见图3.2,3.3，表3.4。利用GATK校正比对结果，用GATK进行SNP、smallindel的检测，并过滤掉测序深度和比19 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析对质量值较低的位点，得到高可信度的SNP和smallindel数据集，过滤的条件如下：1.最低覆盖深度：30(reads)；2.最小的突变频率：20%；3.最少的突变碱基数：15(reads)；4.突变检测位点的最低质量值：Q20；5.正反向reads都需支持该突变位点，并且正向reads与反向reads的数量差异在10%以下。结果见附录表S2，S3，S4。%oftotal(readposition)Readposition图3.2原始数据碱基分布图Fig.3.2FIGoforiginaldatabasedistribution20 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析），-15=Lowest：40=Highest（solexaScaleQualityscoreReadposition图3.3原始数据碱基质量分布图Fig.3.3FIGoforiginaldatabasequalitydistribution表3.4测序数据统计表Table3.4ThestatisticsofsequencingdataReadRawRawreadsAverageCleanCleanreadsSampleQ20(%)lengthdata(Mb)numbercoveragedata(Mb)numberF25301PE532.141,767,90870.67%3662X348.971719080F45301PE620.172,060,35269.44%4267X396.411979406F50301PE599.421,991,44469.63%4125X386.791941461F71301PE772.642,566,89469.89%5317X501.712523348F91301PE803.022,667,82870.58%5526X523.352587483F110301PE790.042,624,73470.77%5437X518.742563670F120301PE712.992,368,73666.73%4907X437.912268972高通量测序得到了传代毒基因组数据，通过拼接整理得到了PRVF25，F45，F50，F71，F91，F110及F120代毒株的DNA序列，通过mVista（http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml）网站，分析不同代次与亲本JS-2012毒株（序列号：KP257591.1）之间的序列差异。结果显示这些传代毒株序列均在相同的位置发生了缺失，由于伪狂犬病病毒基因组特性，怀疑序列缺失结果并不可信，但是对于测通的序列区域，经过序列比对，证实结果是可信的（图3.4）。21 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析F25F45F50F70F91F110F120F25F45F50F70F91F110F120F25F45F50F70F91F110F120F25F45F50F70F91F110F120图3.4不同代次毒株序列比较图Fig.3.4Comparisonofsequencesofdifferentgenerations3.2.2常规测序由于高通量测序显示传代毒株序列发生了多处缺失，为了验证传代毒株在这些位置是否确实发生了缺失，也为了得到F50，F120代毒株全部基因组序列，故以JS-2012，F50，F120的DNA为模板，以附录1设计引物进行PCR扩增，同时设定空白对照。PCR扩增结果如图3.5所示。bpM1234567M20001000750500250100M891011121314M22 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析M15161718192021MM22232425262728MM29303132333435MM36373839404142MM43444546474849M图3.5PRVJS-2012，F50，F120基因组分段扩增结果Fig.3.5TheresultsofJS-2012，F50，F120genomeamplificationM:2000DNA分子量标准;1-49:以引物PRV-1至PRV-49扩增得到的PCR产物片段（注：由于PCR扩增难度大，个别片段经多次调整后才扩增出，所以此图有些泳道存在拼合。每条引物模板均为JS-2012，F50，F120三个，图中从左至右依次为JS-2012，F50，F120）。M:2000DNAMarker;1-49：ThePCRproductsbyprimers1-49.3.2.3F50，F120全序列的获得通过PCR扩增，F50、F120代毒株的DNA扩增结果与亲本毒JS-2012对比发现高通量测序显示的传代毒的gap区域与实际不符合（只有US8，US2区域发生了缺失，且实验室前期基础已经证实），之后将这些PCR产物连接载体送桑尼（上海）公司进行测序，之后将所得序列经过Seqman（DNASTAR，WI，Madison）对于相邻的片段进行序列拼接与分析，得到F50，F120毒23 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析株的DNA全序列。3.2.4JS-2012与各传代毒的序列对比分析本研究通过高通量测序以及常规补测得到了PRV高温传代毒株F25，F45，F50，F71，F91，F110及F120代毒株DNA的全部CDS区序列，通过MegAlign软件进行与JS-2012全部CDS区序列的对比分析。结果表明F25代毒株较JS-2012毒株发生的突变在于UL18基因142位A-V，270位T-M的两个氨基酸的突变；F45，F50代毒株较F25代毒株发生的突变在于US8，US2区域(在gE基因CDS区的第436位碱基之后至US2基因CDS区的397位碱基之前发生了连续性缺失，共计缺失2307个碱基)的缺失以及gC基因107位R-H一个氨基酸突变；F71代毒株较F50代毒株发生的突变为gC基因90位G-D一个氨基酸的突变；F91代毒株较F71代毒株发生的突变为UL16基因3’端1个碱基的插入导致的移码突变；F110代毒株较F91代毒株发生的突变为IE180基因76位氨基酸L-P一个氨基酸突变，UL46基因3’端29个bp核苷酸插入导致3’端移码突变；F120代毒株较F110代毒株发生的突变为UL50基因191位G-R一个氨基酸突变（突变位置均在图3.6中用黄色颜色标识）。对所有代次毒株间的突变进行了汇总，如表3.5所示。B（US8-US2）24 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析25 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析FUL50图3.6不同代次间突变位置图：A:F25较JS-2012发生的突变示意图；B:F50较F25发生的突变示意图；C:F71较F50发生的突变示意图；D:F91较F71发生的突变示意图；E:F110较F91发生的突变示意图；F:F120较F110发生的突变示意图Fig.3.6Themutationsitesofdifferentstrains:A:ThemutationsitebetweenF25andJS-2012;B:ThemutationsitebetweenF50andF25;C:ThemutationsitebetweenF71andF50;D:ThemutationsitebetweenF91andF71;E:ThemutationsitebetweenF110andF91;B:ThemutationsitebetweenF120andF110表3.5各传代毒较亲本毒突变汇总表Table3.5ThesummaryofmutationsamongdifferentstrainsGenenameF25F45F50F71F91F110F120注释000001176位氨基酸L-P，1aaIE1800000移码移码移码3’端移码突变，13aaUL162222222142位氨基酸A-V，270位UL18T-M，2aa011222290位氨基酸G-D，107位UL44（gC）R-H，2aa00000移码移码3’端移码突变，130aaUL460000001191位氨基酸G-R，1aaUL500缺失缺失缺失缺失缺失缺失2307个碱基缺失US8（gE）-US226 中国农业科学院硕士学位论文第三章不同代次的伪狂犬病病毒高温传代毒株的基因组序列分析3.3讨论PRV基因组全长约14.3kb，GC含量高达73%，使得高通量测序也很难将PRV全部基因组测通，故而我们又用传统测序的方法进行了人工补测，最终得到了各传代毒的全部CDS区序列。F25代毒株蚀斑只有亲本毒的80%，可能是病毒为了适应40℃的生存环境而发生基因突变（UL18），转而回到37℃环境中生长不适应导致的；F50代毒株蚀斑面积小的原因是gE和US2基因的缺失，已有研究表明gE基因的缺失会导致病毒在细胞间传播能力降低；F71代毒株蚀斑面积明显大于F50代毒株，接近亲本毒蚀斑面积，这可能是由于病毒gC基因在90位氨基酸G-D的突变导致其在细胞间的传播能力增强导致。JS-2012与F25代毒株生长趋势基本一致，说明UL18点突变并不能影响病毒在细胞上的生长。F50与F71代毒株生长趋势基本一致，且最高毒价相比JS-2012高一个滴度，增殖速度也明显高于亲本毒，说明gE和US2基因的缺失并未影响病毒在细胞上的增殖，但gC107位氨基酸R-H的点突变很可能会影响病毒在细胞上增殖，最终也影响到了病毒的在细胞上的毒价，使其毒9价升高。F91、F110和F120代毒株的生长曲线基本一致，但是F120代最高毒价可达到10TCID50/ml，说明UL16的C端移码突变很可能会导致病毒在细胞上的增殖变强，导致最终毒价升高。同时也说明UL46C端基因移码，UL50151位氨基酸G-R点突变以及IE18076位氨基酸L-P点突变并未影响病毒在细胞上的增殖。F25代毒与JS-2012对小鼠致病力与致死率基本相一致，表明UL18基因的点突变并未影响病毒毒力。F50代毒毒力较亲本毒株毒力明显下降，原因主要为gE基因的缺失。本实验室前期的研究表明，对于2周龄仔猪，JS-2012毒株攻毒5d之后可以使仔猪全部死亡；F50存活率为60%，且猪全部发病；F91代毒株攻毒之后仔猪只有一过性发烧；F120攻毒猪不发病也不死亡（Liangetal.,2017）。结合本实验小鼠实验结果，表明UL16的C端移码突，gC基因在90位氨基酸G-D的点突变很可能会使病毒毒力下降。UL46C端基因移码，UL50151位氨基酸G-R点突变以及IE18076位氨基酸L-P点突变可能使病毒毒力下降。UL16和UL46基因在高温传代过程中发生了移码突变，这在疱疹病毒上是极为罕见的，本研究推测这两个基因的移码突变可能是JS-2012在高温传代过程中病毒生物学特性发生明显改变的主要原因。27 中国农业科学院硕士学位论文第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证摘要：为了研究PRV高温传代毒株毒力致弱的分子基础，我们通过全基因测序的方法得到了JS-2012-F120毒株的全基因组序列。序列分析发现UL16基因在其952位核苷酸处有一个胞嘧啶（C）的插入，UL46基因在其1796~1824位核苷酸处有29个碱基的插入。而这些碱基的插入都造成了这两个基因的+1位移码突变，且这些移码突变有可能使得基因的功能完全丧失，也有可能只对C端产生影响，而这在疱疹病毒是很罕见的(AnthonyGriffiths.2003;Zhangetal.,2007)。为了研究移码突变是否对基因功能的发挥产生影响，我们利用3’RACE(rapid-amplificationofcDNAends)的方法在转录水平对两个基因进行了验证。同时制备了两个蛋白的多克隆抗体，并对病毒的两个蛋白的表达进行了检测。上述试验证实两个基因的移码突变并未使这两个基因的功能丧失，而只是使编码区延长终止，最终导致C端氨基酸发生了突变。4.1.1毒株JS-2012F120毒株为实验室本实验室保存。4.1.2菌株与试剂E.coliDH5α，K12感受态细胞；HRP标记的山羊抗鼠IgG；内切酶EcoRI购自NEB（上海）公司；质粒提取试剂盒购自天根公司；RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基、酚氯仿、3’RACE试剂盒均购自于Invitrogen公司。4.1.3主要的设备仪器DYY-6C琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）、紫外成像仪(基因科技)、DK-8D三孔电热恒温水浴箱(上海齐欣科学仪器有限公司)、HZQ-C空气浴震荡摇床(哈尔滨东联电子技术有限公司)、恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）、生物安全柜BIO1500-Ⅱ-A1（上海振梓创空气净化设备有限公司）、蛋白电泳仪（BIO-RAD）、蛋白质半干转印仪（BIO-RAD）。4.1.4mRNA水平验证4.1.4.1病毒总RNA的提取1.以0.1MOI接毒量将JS-2012F120接于T25的Vero细胞中，12h后用细胞刮收取细胞于1.5mlEP管中，10000rpm离心3min，弃去上清；2.加入1mlPBS，用枪头吹打细胞，10000rpm离心3min，清洗细胞两次；3.用适量的BufferRLT（使用前在通风橱中加入β-巯基乙醇10μL/ml）在EP管内溶解细胞；28 中国农业科学院硕士学位论文第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证4.加入等体积的75%乙醇溶解细胞，用1ml枪头吹匀；5.将液体全部转移到柱子上，8000rpm15s，弃去下液；6.加入700μLBufferRW1，8000rpm15s，弃去下液；7.加入500μLBufferRPE，8000rpm15s，弃去下液；8.重复步骤（7），8000rpm2min；9.12000rpm2min，空离柱子；10.加入40μLRNase-freeWater洗脱RNA，10000rpm1min；11.测量浓度，-20℃冻存。4.1.4.2病毒mRNA的DNA酶处理为了避免所提取的RNA中DNA的影响，需用DNA酶处理所提取的mRNA，反应条件如表4.1：表4.1DNase处理反应体系Table4.1ThereactionsystemforDNasetreated成分数量1μg总RNAnμL10×DNAseIBuffer2μLDNAseI（1U/μL）1μLDEPCWaterUpto20μL总体积20μL1.冰上操作反应体系，之后将EP管置于25℃，15min；2.加入2μL25mMEDTA，65℃热失活10min；3.处理产物置于-20℃冻存，用于RNA的反转录。4.1.4.33’RACE-PCR扩增引物设计根据已知的PRVJS-2012毒株UL16（987bp），UL46（2088bp）基因序列设计特性的上游引物UL16F、UL46F，再利用传统3’RACE方法合成下游引物QO，QT（引物由自刘欢博士馈赠）。具体设计如表4.2所示：表4.2巢式PCR引物设计Table4.2TheprimerdesignfornestPCR引物名称序列（5’-3’）UL16FGCTGGCGCCTGGTGGCCCTUL46FGCACCCGTTCAAGCACAAGQOCCAGTGAGCAGAGTGACG29 中国农业科学院硕士学位论文第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证QTCCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGA(T16)4.1.4.4反转录为了获取比较完整的第一链cDNA，我们用Invitrogen公司SuperscriptII进行病毒mRNA的反转录，体系如表4.3：表4.3获取第一链反应体系Table4.3Thereactionsystemtogetthefirstchain成分数量模板RNA（DNAsetreated）8μLQT1μLdNTP（10mMeach）1μL总体积10μL1.短暂离心后，置于65℃水浴锅中保温5min，迅速放入冰上；2.在另外一个EP管中准备2×Reactionmix，体系如下表4.4；表4.4反转录反应体系Table4.4Thereactionsystemforreversetranscription成分数量10×RTbuffer5μLDEPCWater4μL25mMMgCl210μL0.1MDTT5μLRNaseOUT1μL总体积25μL预热2×ReactionMix至50℃；之后向每一个第一链混合物EP管中加入15μLDEPCWater，在加入25μL2×Reactionmix；加入1μLSuperscriptIIRT，混匀后50℃放置50min；70℃15min失活。4.1.4.5半巢式PCR扩增在200μL离心管中配制表4.5反应体系：表4.5半巢式PCR反应体系Table4.5SeminestedPCRamplificationreactionsystem成分数量TakaraExTaq0.5μLdNTP4μL2×GCBufferI25μL30 中国农业科学院硕士学位论文第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证QT1μLQO1μL上游引物1μLDEPCWater15.5μLcDNA2μL总体积50μL反应程序：95℃5min；95℃30s，68℃15s，72℃90s（30cycles）；72℃10min；4℃保存。4.1.4.6琼脂糖凝胶及胶回收取PCR反应产物10μL进行琼脂糖凝胶电泳，并对于阳性产物条带进行切胶回收，具体胶回收步骤参照说明书（Qiagen）进行。4.1.4.7目的片段连接PMD18-T载体取胶回收纯化的PCR产物进行TA克隆（如表4.6），4℃过夜。表4.6T载体连接体系Table4.6TheconnectionsystemofTvector成分数量PMD18-T1μLSolutionI5μLPCR纯化产物4μL总体积10μL4.1.4.8载体转化K12感受态细胞于-80℃冰箱取出感受态细胞置于冰盒中，待其溶解后将连接产物全部吸出加入到感受态细胞中，轻轻吹匀（冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min），涂布氨苄平板。平板倒置于37℃恒温培养箱24h后挑取单克隆菌落于液体氨苄LB培养基中，37℃摇床增殖培养24h，送桑尼（上海）公司进行测序。4.1.5蛋白水平验证4.1.5.1UL16，UL46蛋白多克隆抗体的制备为了制作UL16，UL46蛋白的多克隆抗体，我们通过优化大肠杆菌密码子的方式合成（诺唯赞公司）这两个基因1~450bp的CDS区域并将其插入到pColdI表达载体中，转化至BL21（DE3）大肠杆菌，经IPTG（1mM），低温（16℃）诱导24h，成功表达了约20kDa的蛋白。通过包涵体31 中国农业科学院硕士学位论文第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证蛋白纯化的方式纯化目的蛋白，免疫6周龄BALB/c雌性小鼠，6周后眼球采血获得多克隆抗体。1.将合成质粒pCold-UL16，pCold-UL46转化到BL21（DE3）大肠杆菌中，37℃振荡培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，16℃振荡24小时。收集菌体加入PBS进行超声裂解，加入5×SDSbuffer煮沸10min后进行SDS-PAGE电泳，对SDS-PAGE蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，观察蛋白表达情况，同时设置空载体表达组作为对照；2.包涵体纯化目的蛋白：参照参考文献(陆长梅等.2004)进行；3.取100μg纯化蛋白与弗式完全佐剂1:1混乳化，接种6周龄健康雌性BALB/c小鼠，此后每间隔为2周用等量纯化蛋白与弗氏不完全佐剂乳化进行二、三次免疫；4.小鼠眼眶采血获得小鼠血清即多克隆抗体。4.1.5.2间接免疫荧光鉴定将Vero细胞铺在12孔板中，1MOIPRV感染18h之后弃去上清PBS洗3遍，用丙醇在-20℃固定细胞20分钟，5%BSA室温封闭1h，PBS洗板之后加入小鼠血清（1:500）于细胞上，室温孵育1h。PBS洗3遍之后避光加入FITC标记的羊抗鼠IgG（1:800PBS稀释）抗体室温避光孵育1h。在荧光显微镜下观察荧光。4.1.5.3Westernblot鉴定蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，使用伯乐Trans-Blot®SDcellsystem(BIO-RAD,USA)转印NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，用1:500稀释小鼠血清4℃孵育10h，TBST洗膜3次后，20min/次。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温反应1h，TBST洗膜后用经过发光，曝光，显影，定影之后扫描保存图片。4.2实验结果4.2.13’RACE-PCR电泳结果按照3.1.4.5的实验方法，进行核酸电泳，UL16基因在200bp处较空白对照明显多出一条条带，而且大小与目的片段大小相符；UL46基因在1900bp处较空白对照明显多出一条条带，而且大小与目的片段大小相符。如图4.1所示：32 中国农业科学院硕士学位论文第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证bpM12bpM12AB2000200010001000750750500500250250100100图4.1F120UL16，UL463’RACE琼脂糖凝胶电泳图Fig.4.1TheagarosegelelectrophoresisimageofF120UL16，UL463’RACEPCRA:UL163’RACEPCR结果:1：UL16；2:空白对照的PCR结果;M:DNA分子量标准B:UL463’RACEPCR结果:1：UL46；2:空白对照的PCR结果;M:DNA分子量标准A:3’RACEPCRAmplificationofUL16.；1:UL16；2:BlankcontrolPCRresults;M:DNAMarkerB:3’RACEPCRAmplificationofUL46.；1:UL46；2:BlankcontrolPCRresults;M:DNAMarker4.2.2测序结果分析因为F120毒株的UL16，UL46基因均发生了移码突变，我们通过3’RACE-PCR的方法得到了F120毒株UL16，UL46基因的3’端序列。测序结果表明，这两个基因均在其原有终止密码子的基础上发生了延迟终止现象。其中UL16基因延迟了6bp终止，C端有13aa的氨基酸发生了突变；UL46基因延迟了102bp终止，C端有130aa氨基酸发生了突变。具体结果如图4.2所示。JS2012-UL16F120-UL16JS2012-UL46F120-UL46图4.2F120毒株UL16，UL46基因突变位点Fig.4.2UL16,UL46genemutationsiteofF120strain4.2.3UL16，UL46蛋白原核表达结果pCold-UL16，pCold-UL46载体转化的表达菌EcoliBL21(DE3)经IPTG诱导后，收集菌体超声裂解进行SDS-PAGE凝胶检测。考马斯亮蓝染色结果显示与IPTG诱导的载体对照组组相比，pCold-UL16，pCold-UL46表达菌在用IPTG诱导剂诱导后出现了相对分子量约均为20KDa的目的条带，与目的蛋白大小相符，并且目的蛋白大部分都在裂解物沉淀中。蛋白经包涵体纯化后，电泳结果显示纯化后的目的蛋白条带纯度较高，反应原性好。SDS-PAGE结果如图4.3所示。33 中国农业科学院硕士学位论文第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证kDaM1234kDaM1234BA251525101510图4.3UL16，UL46蛋白的诱导表达和纯化Fig.4.3SDS-PAGEanalysisofinducedexpressionandpurificationofUL16，UL46proteinA:UL16蛋白：1：IPTG诱导的UL16转化菌裂解物沉淀;2：IPTG诱导的UL16转化菌裂解物上清;3：纯化的UL16蛋白；4:IPTG诱导的pColdI转化菌;M:未预染蛋白质分子量标准B:UL46蛋白：1：IPTG诱导的UL46转化菌裂解物沉淀;2：IPTG诱导的UL46转化菌裂解物上清;3：纯化的UL46蛋白；4:IPTG诱导的pColdI转化菌;M:未预染蛋白质分子量标准A:UL16protein:1：IPTGinducedtransformationofUL16lysates;2:IPTGinducedtransformationofUL16lysatesupernatant;3:PurificationofUL16proteins;4:IPTGinducedtransformationofpCold-I;M:UnprestainedproteinMakerA:UL46protein:1：IPTGinducedtransformationofUL46lysates;2:IPTGinducedtransformationofUL46lysatesupernatant;3:PurificationofUL46proteins;4:IPTGinducedtransformationofpCold-I;M:UnprestainedproteinMaker4.2.4UL16，UL46Westernblot鉴定1MOIPRVJS-2012以及F120两个毒株分别感染Vero细胞后24h，收集细胞进行Westernblot检测多克隆抗体与不同毒株的特异性反应。蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，使用伯乐Trans-Blot®SDcellsystem(BIO-RAD,USA)转印NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，用1:500稀释小鼠血清4℃孵育10h，TBST洗膜3次后，20min/次。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温反应1h，TBST洗膜后用经过发光，曝光，显影，定影之后扫描保存图片。结果显示JS-2012，F120毒株UL16基因在40kDa位置均有条带，大小与目的条带相符；UL46基因在130kDa，100kDa位置均有条带，大小与目的条带相符。具体结果如图4.4所示。34 中国农业科学院硕士学位论文第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证kDaM123kDaM123AB13040100图4.4UL16，UL46蛋白多抗的Westernblot鉴定Fig.4.4Westernblotidentificationofanti-UL16，UL46A：UL16蛋白：M:蛋白质分子量标准;1:PRVJS-2012感染的Vero细胞;2:PRVF120感染的Vero细胞；3:未感染的Vero细胞B：UL46蛋白：M:蛋白质分子量标准;1:PRVJS-2012感染的Vero细胞;2:PRVF120感染的Vero细胞；3:未感染的Vero细胞A：UL16：M:ProteinMarker;1:PRVJS-2012infectedVerocell;2:PRVBarthaK61infectedVerocell3:uninfectedVerocellB：UL46：M:ProteinMarker;1:PRVJS-2012infectedVerocell;2:PRVBarthaK61infectedVerocell3:uninfectedVerocell4.2.5UL16，UL46IFA鉴定将Vero细胞铺在12孔板中，1MOIPRV感染18h之后弃去上清PBS洗3遍，用丙醇在-20℃固定细胞20分钟，5%BSA室温封闭1h，PBS洗板之后用1:500稀释小鼠血清37℃孵育1h。PBS洗3遍之后避光加入FITC标记的羊抗鼠IgG（1:800PBS稀释）抗体室温避光孵育1h。在荧光显微镜下观察荧光。间接免疫荧光检测结果显示JS-2012，F120毒株均能与相对应的UL16蛋白，UL46蛋白的多克隆抗体反应，抗体与空细胞不反应。具体结果如图4.5所示。JS-2012F120ControlUL16UL46图4.5UL16，UL46蛋白的IFA鉴定Fig.4.5IFAidentificationofanti-UL16，UL464.3讨论猪伪狂犬病病毒编码至少70个基因，其中已知的毒力基因包括gB、gC、gE等，这些基因也是学者关注的热门。但是伪狂犬病病毒基因组庞大，有许多的基因功能有待研究。为了研究PRV高温传代毒株毒力致弱的分子基础，我们通过全基因测序的方法得到了JS-2012-F120毒株的全基35 中国农业科学院硕士学位论文第四章PRV高温传代毒株F120UL16，UL46基因移码突变的验证因组序列。序列分析发现UL16基因在其952位核苷酸处有一个胞嘧啶（C）的插入，UL46基因在其1796~1824位核苷酸处有29个碱基的插入。3’RACE-PCR结果显示这两个基因均得到了转录。其中UL16基因延迟了6bp终止，C端有13aa的氨基酸发生了突变；UL46基因延迟了102bp终止，C端有130aa氨基酸发生了突变。Westernblot与IFA鉴定结果显示这两个基因在蛋白水平上均得到了表达。这说明移码突变没有终止这两个基因的转录与表达，但改变了其C端的氨基酸序列。PRVUL16基因的缺失会使病毒滴度明显降低（KluppBG,etal.2005），UL46与UL47、UL48、UL49形成复合体参与蛋白质转运（WalterFuchsHG,etal.2003）。虽然人们对这两个基因有着初步的了解，但是其具体的功能与其参与并发挥功能的结构域还尚未可知。而F120毒株UL16和UL46基因发生了移码突变，但是并未使其功能丧失，这对于结构稳定的DNA病毒来说是非常罕见的。同时这些移码突变也导致了的蛋白C端的突变，这可能是JS-2012在高温传代过程中病毒一部分生物学特性改变的主要原因。本研究对于人们更加深入地了解研究伪狂犬病病毒有着重大意义。36 中国农业科学院硕士学位论文第五章伪狂犬病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定第五章伪狂犬病病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定摘要：为制备伪狂犬病病毒变异株gE蛋白的单克隆抗体，PCR扩增伪狂犬病病毒gE蛋白主要抗原表位区的基因片段，并将其克隆至原核表达载体pCold-TF。经1mMIPTG低温诱导，表达了约90kDa的gE融合蛋白。融合蛋白用镍离子金属亲和层析柱纯化后，免疫6周龄BALB/c雌性小鼠，经细胞融合和筛选，获得了4株稳定分泌抗gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞（2E5，5C3，5B2和6E6）。间接免疫荧光试验（IFA）显示四株单克隆抗体均能与PRV变异株（JS-2012）反应，但与gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株无反应。而Westernblot结果显示只有5C3和2E5能与PRV（JS-2012株）gE蛋白反应，而5B2和6E6与gE蛋白不反应。本研究获得的gE蛋白单克隆抗体为伪狂犬病病毒变异株的鉴定与功能研究以及野毒株和疫苗株的鉴别诊断提供了良好的工具。5.1材料和方法5.1.1毒株、细胞和实验动物伪狂犬病病毒JS-2012株，Bartha-K61株，SP2/0骨髓瘤细胞，PK-15，Vero细胞均由中国农业科学院上海兽医研究所保存。细胞均在37℃，5％CO2和10%FBS（FBS，Sigma，Shanghai，China）条件下培养。BALB/c雌性小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。5.1.2载体、试剂和菌株pCold-TF载体，大肠杆菌BL21（DE3）购自Takara（上海）公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG和FITC标记的山羊抗鼠IgG购于Sigma（上海）公司；核酸内切酶EcoRI购自NEB（上海）公司。5.1.3pCold-gE重组质粒的构建根据NCBI发表的PRV（JS-2012）gE基因序列（序列号：KP257591.1），设计特异性引物扩增gE基因第151-750位核苷酸。上游引物gE-F：5’-accctcgagggatccgaattcATGACCGAGGCCGACGAC-3’；下游引物gE-R：5’-caggtcgacaagcttgaattcTTAGACCACGCGCGGCAT-3’。小写部分是与pCold-TF进行同源重组的同源臂序列，扩增产物为600bp。按照天根DNA小量提取试剂盒说明书提取PRV（JS-2012）DNA（-20℃保存），用PrimestarHS（Takara）高保真酶扩增gE部分基因。PCR扩增程序：95℃5min；98℃10s，68℃10s，72℃1min（35个循环）；72℃10min。将PCR产物通过同源重组（诺唯赞）的方法，与pCold-TF载体多克隆位点的相应位置重组，质粒测序正确后，阳性质粒命名为pCold-gE。37 中国农业科学院硕士学位论文第五章伪狂犬病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定5.1.4重组蛋白的诱导表达与纯化将重组质粒pCold-gE转化到BL21（DE3）大肠杆菌中，37℃振荡培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，16℃振荡24小时。收集菌体加入PBS进行超声裂解，加入5×SDSbuffer煮沸10min后进行SDS-PAGE电泳，对SDS-PAGE蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，观察蛋白表达情况，同时设置空载体表达组作为对照。之后将pCold-gE转化表达菌按1:1000比例接种到4mL含100μg/mLAmp的LB培养基中，37℃、200r/min振荡培养12h。然后再按1:100将复苏的菌液接种于100mL含100μg/mLAmp的LB培养液中，37℃、200r/min培养，至OD600达到0.6～0.8时停止，加入终浓度为1mmol/LIPTG，16℃诱导24h后，离心收集菌体。表达后的菌体进行超声破碎，差速离心后收集上清蛋白。采用带His标签的磁珠（Biotool）根据说明书进行纯化，纯化的蛋白分装后保存于-80℃。5.1.5小鼠免疫取100μg纯化蛋白与弗式完全佐剂1:1混合乳化，接种6周龄健康雌性BALB/c小鼠，此后每隔2周用等量纯化蛋白与弗氏不完全佐剂乳化进行第二和第三次免疫，第三次免疫后第10天采血，测定ELISA抗体效价，效价在1:10000以上的小鼠，在细胞融合前第3-4天经腹腔注射纯抗原200μg，进行加强免疫。5.1.6McAbs的制备融合前1d取小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，之后选取免疫效价最高的小鼠进行脾细胞与SP2/0细胞融合。将杂交瘤细胞培养在铺有饲养层细胞的96孔板里，在37°C、5%CO2在HAT选择性培养基条件下培养。在杂交瘤细胞长满96孔板1/3~1/2面积时，通过间接ELISA以及IFA的方法检测以筛选阳性细胞克隆株。将筛选的阳性细胞克隆株经3~5轮细胞亚克隆之后，对能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，液氮冻存。将筛选的杂交瘤细胞株连续传代20代，分别取第5、10、15和20代细胞上清液，用间接ELISA的方法进行检测，鉴定杂交瘤细胞分泌抗体稳定性。5.1.7间接免疫荧光试验检测单克隆抗体将Vero细胞铺在12孔板中，1MOIPRV感染18h后，弃去上清后，用PBS洗3遍，用丙醇在-20℃固定细胞20分钟，5%BSA室温封闭1h，PBS洗板之后加入收集的杂交瘤细胞上清液，室温孵育1h。PBS洗3遍，避光加入FITC标记的羊抗鼠IgG（1:800PBS稀释）室温避光孵育1h。在荧光显微镜下观察荧光。5.1.8Westernblot检测单克隆抗体将PRV(JS-2012)病毒感染Vero细胞，12h以后用细胞裂解液裂解细胞，收取细胞蛋白进行38 中国农业科学院硕士学位论文第五章伪狂犬病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定SDS-PAGE电泳。使用伯乐Trans-Blot®SDcellsystem（BIO-RAD,USA）转印NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，用1:500稀释的杂交瘤细胞上清4℃孵育10h，TBST洗膜3次后，20min/次。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温反应1h，TBST洗膜后，经过发光，曝光，显影，定影之后扫描图片。5.2结果5.2.1pCold-gE重组质粒的构建PCR扩增得到了伪狂犬病病毒gE基因约600bp的片段（图5.1A），PCR产物经凝胶电泳分离，将目的片段纯化回收并克隆到pCold-TF表达载体中。重组质粒酶切鉴定结果显示，阳性质粒出现与预期大小一致的片段（图5.1B）。测序结果显示阳性质粒携带目的基因与预期序列一致，阳性质粒pCold-gE可以用于下一步的试验研究。AbpM12BbpM1220005000100025007505001000250100250图5.1gE基因扩增和重组质粒pCold-gE酶切鉴定Fig.5.1AmplificationofgEgeneandidentificationofrecombinationplasmidpCold-gEbyrestrictionenzymesdigestionA:gE基因的PCR扩增.1:gE基因PCR扩增结果;2:阴性对照;M:DNA分子量标准B:重组质粒pCold-gE酶切鉴定.1:pCold-TF质粒EcoRI酶切;2:pCold-gE质粒EcoRI酶切;M:DNA分子量标准A:PCRAmplificationofgEgene.1:PCRamplificationresultofgEgene;2:Control;M:DNAMarkerB:IdentificationofrecombinationplasmidpCold-gEbyrestrictionenzymesdigestion.1:pCold-TFdigestedwithEcoRI;2:pCold-gEdigestedwithwithEcoRI;M:DNAMarker.5.2.2重组gE蛋白的表达纯化pCold-gE载体转化的表达菌EcoliBL21(DE3)经IPTG诱导后，收集菌体超声裂解进行SDS-PAGE凝胶检测。结果显示，与载体对照组相比，pCold-gE表达菌出现了相对分子量约为90kDa（TF辅助蛋白约60KDa）的目的条带，与重组蛋白大小相符。目的蛋白主要都在裂解物上清中。重组蛋白经磁珠纯化后，电泳结果显示纯化目的蛋白纯度较高（图5.2）。39 中国农业科学院硕士学位论文第五章伪狂犬病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定kDa1M2341301007055图5.2gE重组蛋白的表达与纯化Fig.5.2SDS-PAGEanalysisofexpressionandpurificationofrecombinationproteingE1:纯化的重组gE蛋白;2:IPTG诱导的pCold-gE转化菌裂解物上清;3:IPTG诱导的pCold-gE转化菌裂解物沉淀;4:IPTG诱导的pCold-TF转化菌;M:蛋白质分子量标准.1:PurifiedfusiongEprotein;2:SupernatantoflysateofpCold-gEinducedbyIPTG;3:PalletoflysateofpCold-gEinducedbyIPTG;4:pCold-TFinducedbyIPTG;M:ProteinMaker.5.2.3间接免疫荧光试验检测gE单克隆抗体的特异性以1MOIPRV（JS-2012株或Bartha-K61株）感染Vero细胞24h，固定细胞进行间接免疫荧光试验，以检测单克隆抗体与不同毒株的特异性反应。结果显示，4株单克隆抗体均能与PRVJS-2012毒株反应，而不与Bartha-K61毒株反应，也不与Vero细胞发生反应（图5.3）。JS-2012Bartha-K61Control2E55B25C36E6图5.3IFA鉴定gE蛋白单克隆抗体的特异性Fig.5.3IFAidentificationofanti-gEMcAbs5.2.4Westernblot检测gE单克隆抗体的特异性以1MOIPRV（JS-2012株或Bartha-K61株）感染Vero细胞24h，收集细胞后，用Westernblot40 中国农业科学院硕士学位论文第五章伪狂犬病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定方法检测单克隆抗体与不同毒株的特异性反应。结果显示，单克隆抗体5C3和2E5能与JS-2012毒株发生特异性反应，在70kDa和100kDa大小处显示两条特异性条带，而不与Bartha-K61毒株和Vero细胞发生反应（图5.4）。AkDaM123BkDaM1231001007070图5.4gE蛋白单抗的Westernblot鉴定Fig.5.4Westernblotidentificationofanti-gEMcAbsA:WesternblotanalysisofthespecificityofMcAb5C3；B：WesternblotanalysisofthespecificityofMcAb2E5.M:蛋白质分子量标准;1:PRVJS-2012感染的Vero细胞;2:PRVBarthaK61感染的Vero细胞；3:未感染的Vero细胞M:ProteinMarker;1:VerocellinfectedbyPRVJS-2012;2:VerocellinfectedbyPRVBarthaK61;3:UninfectedVerocell5.3讨论猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的一种烈性传染病，该病在世界大部分地区流行。为了彻底净化伪狂犬病，许多国家实施了根除计划(Mülleretal.,2003;Taft.2000)。而gE基因缺失疫苗的广泛的应用使控制和消灭该病是成为可能。2011年以来，我国发生了由伪狂犬病病毒变异株引起的猪伪狂犬病，给我国养殖业带来了巨大的经济损失。2012年，我们分离到一株PRV变异毒株（JS-2012株），与经典强毒株相比，该变异毒株致病力明显增强，基因序列发生了改变，主要毒力基因gE也发生了改变(童武etal.,2013)。伪狂犬病潜伏感染能力强，能够有效区分疫苗免疫猪与野毒感染猪的血清学检验方法是净化甚至根除PR的重要手段。目前，检验gE抗体的商品化试剂盒已有多种。本研究制备的抗伪狂犬病病毒变异株gE蛋白单克隆抗体，与PRV具有良好的反应性，可以用来研制具有自主知识产权的检测gE抗体的试剂盒。gE基因是PRV主要毒力基因之一，也是基因缺失疫苗的靶基因。gE基因位于基因组的US区，全长1.7kb，是病毒的糖蛋白之一，由N端的胞外区，中间的跨膜区及C端的胞内区组成(Tirabassietal.,1997)。PRVgE蛋白已经鉴定出的6个抗原表位中，有5个位于N端的52-238位氨基酸之间(Favoreeletal.,1997;Tirabassi.1998)。本研究表达的gE蛋白（第150-750位氨基酸）包含了上述5个抗原表位。间接免疫荧光试验（IFA）结果显示，本研究获得的四株单克隆抗体（2E5，5C3，5B2和6E6）均能与PRV变异株（JS-2012）反应，但与gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株无反应。而Westernblot结果显示，只有5C3和2E5能与PRV（JS-2012株）gE蛋白反应，而5B2和6E6与gE蛋白无反应。上述结果提示，5C3和2E5单克隆抗体可能是针对gE蛋白的线性表位的，这两株单克隆抗体所针对的表位需要进一步研究验证。而5B2和6E6单克隆抗体针对的可能是gE蛋白的构象表位，这与本研究表达的融合蛋白具有良好的可溶性密切相关，融合蛋白可能形成了简单的构象结构。总之，上述四株单克隆抗体均具有建立检测gE抗体的检测方法的潜力。41 中国农业科学院硕士学位论文第五章伪狂犬病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定Westernblot结果显示，5C3和2E5与gE蛋白具有特异性反应，但显示有两条特异性条带。PRVgE蛋白存在5个潜在的糖基化位点(TirabassiandEnquist.2000)，两条特异性条带的产生可能是gE蛋白在形成的过程中产生了糖基化修饰的缘故，分子量约为70kDa的条带是未发生糖基化修饰的蛋白，分子量约为100kDa的条带是发生糖基化修饰的蛋白。这种现象在以前的研究中已经被证实(Tongetal.,2016)。本研究利用pCold-TF表达载体表达了伪狂犬病病毒gE可溶性融合蛋白，并制备了四株特异性单克隆抗体。这些抗体为伪狂犬病病毒变异株的鉴定与功能研究及建立相应的gE抗体检测方法奠定了良好的基础。42 中国农业科学院硕士学位论文第六章全文结论第六章全文结论1.随着传代次数的增加，伪狂犬病病毒高温传代毒株对小鼠的致病力逐渐减弱，病毒滴度逐渐增高，而蚀斑则呈现先减小后又逐渐恢复的趋势。2.与母源毒株相比，第120代高温传代病毒（JS-2012-F120）在gE-US2基因区域有2307个碱基缺失，在IE180,UL18,UL44和UL50蛋白上有4个氨基酸突变，并且在UL16和UL46基因存在移码突变。这些基因突变与缺失与病毒的致病力和生长特性密切相关。3.从转录水平及蛋白翻译水平证实UL16和UL46基因存在移码突变现象。4.获得了4株针对伪狂犬病毒变异毒株gE蛋白的单克隆抗体。其中，两株单克隆抗体可能针对gE蛋白的线性表位，另两株单克隆抗体可能针对gE蛋白的构象表位。43 中国农业科学院硕士学位论文参考文献参考文献1.陈焕春,方六荣.猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定[J].畜牧兽医学报,1998,28(2):156-161.2.江焕贤,孙序新,陈润清.猪伪狂犬病病毒京A株的分离及鉴定[J].中国兽医杂志,1993,(4):6-7.3.陆长梅,李继影,陈阳等.XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究[J].南京师大学报自然科学版,2004,27(4):67-71.4.童武,张青占,郑浩等.免疫后发病仔猪中伪狂犬病病毒的分离和鉴定[J].中国动物传染病学报,2013,(3):1-7.5.王永贤,陆明昌,罗子起.伪狂犬病病毒YN株的分离鉴定[J].中国兽医学报,1984,(4).6.AnTQ,PengJM,TianZJ,etal.PseudorabiesvirusvariantinBartha-K61-vaccinatedpigs,China,2012[J].EmergingInfectiousDiseases,2013a,19(11):1749.7.AnTQ,PengJM,TianZJ,etal.PseudorabiesVirusVariantinBartha-K61–VaccinatedPigs,China,2012[J].EmergingInfectiousDiseases,2013b,19(11):1749-1755.8.AnthonyGriffithsS-HC,BrianC.Horsburgh,DonaldM.Coen.TranslationalCompensationofaFrameshiftMutationAffectingHerpesSimplexVirusThymidineKinaseIsSufficientToPermitReactivationfromLatency[J].JournalofVirology,2003,77(8):4703-9.9.AujeszkyAC.UbereinneueInfektionskrankheitbeiHaustieren[J],1902.10.BadylakJA,ScherbaG,GustafsonDP.Photodynamicinactivationofpseudorabiesviruswithmethylenebluedye,light,andelectricity[J].JournalofClinicalMicrobiology,1983,17(2):374.11.Ben-PoratT,KaplanAS.MolecularBiologyofPseudorabiesVirus[M].1985:105-173.12.BossIW,PlaisanceKB,RenneR.Roleofvirally-encodedmicroRNAsinherpesvirusbiology[J].TrendsinMicrobiology,2009,17(12):544-53.13.BrackAR,KluppBG,GranzowH,etal.RoleofthecytoplasmictailofpseudorabiesvirusglycoproteinEinvirionformation[J].JournalofVirology,2000,74(9):4004.14.BrittleEE,ReynoldsAE,EnquistLW.TwoModesofPseudorabiesVirusNeuroinvasionandLethalityinMice[J].JournalofVirology,2005,78(23):12951-12963.15.BrownTM,OsorioFA,RockDL.Detectionoflatentpseudorabiesvirusinswineusinginsituhybridization[J].VeterinaryMicrobiology,1990,24(3-4):273-280.16.CaiMS,WangBY,CuiW,etal.MolecularcharacterizationofthepseudorabiesvirusUL2gene[J].Genetics&MolecularResearchGmr,2013,12(4):4147.17.CardJP,WhealyME,RobbinsAK,etal.PseudorabiesvirusenvelopeglycoproteingIinfluencesbothneurotropismandvirulenceduringinfectionoftheratvisualsystem[J].JournalofVirology,1992,66(5):3032-3041.18.CardJP,RinamanL,LynnRB,etal.Pseudorabiesvirusinfectionoftheratcentralnervoussystem:ultrastructuralcharacterizationofviralreplication,transport,andpathogenesis[J].JournalofNeurosciencetheOfficialJournaloftheSocietyforNeuroscience,1993,13(6):2515.44 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中国农业科学院硕士学位论文附录附录附录表S1扩增F50，F120全基因组的引物AppendixtableS1PrimersforamplifyingthegenomeofF50，F120引物名称序列（5’-3’）PRV-1FGCGCCCGGGCCGCCGCCCPRV-1RGGGCTCCTCCTCCTCGCTPRV-2FGCCGGTACCCGCGCCGCGPRV-2RAAGGCCCTGTACCCCGTCAPRV-3FCGGCCTCGCAGAACGCGCPRV-3RGACGAGCGCCTCGAGGCGPRV-4FGGTCTTGGCCGCGGCCTCPRV-4RCCAGGCACCGCGGCGCGAPRV-5FTGCGGGCCAGGAAGCCCTPRV-5RCGTCGTTGTCGTCGCCGTPRV-6FCGGCGAAGCGCTCCAGCAPRV-6RCGCACGTCGCGGGCTACGPRV-7FGGCGCTGCCCGTGTGGGCPRV-7RAACAGCGCCACCTCGCGAPRV-8FCCTGCTGGACCTGCCGGCPRV-8RAAGGTCTTTGGCTCGCTGCPRV-9FGGGATGCGGGGAGCGCCGPRV-9RGCGAGCTGGTGGAGGCGGPRV-10FAGCACTTTGCGCAGTACCTCAPRV-10RGTGGTCTTCTACCACCACGGCPRV-11FCGGGCGTGGAGTTCTTCGPRV-11RCGGTACCTGCAGAAGCGCCPRV-12FCCCAGCGTGCACGTGGTGPRV-12RTGCGGCGCGTCGAAGCTGPRV-13FTGCGCGAGGCCCGCATCCPRV-13RCTCGCGCCAGCGCGGCGCPRV-14FTCCTCGCGCCGAGGATGGPRV-14RCGGCTGCCAGACTACAATTTACCPRV-15FCCCTACCCTCTGTGCCTGGPRV-15RTCACGTCCGGGGGAAGCGPRV-16FAGCCGGGGCGCTTCCTCCPRV-16RCGCCACAGACAGCGGCGC50 中国农业科学院硕士学位论文附录PRV-17FGCCCGTCGTCTCTCCCGCPRV-17RGCGGGCTCCGGGGACGCGPRV-18FCTGATTGGCTCGCTAGCACCPRV-18RGCTGGAGTTGGAGTTGGAGTTGPRV-19FCTCCTCCACCACCGTCGCPRV-19RCTGCCGGTGATGAAGGAGCPRV-20FCGGCTTCCGCGGCGGCGAPRV-20RTGCCCCTTCCGTCGCACCPRV-21FCGACGGAAGGGGCAGGCTPRV-21RCGCTCCCCGGGGGCCGCGPRV-22FACGACGATGACTACTACGGCTACGPRV-22RGATGCGCACCACCGCGGCPRV-23FCTCATCACCACGGTGACGCTPRV-23RGCCGTCTCCATGCCGCGGPRV-24FGGGCGTCGCGGACGCCCTPRV-24RTGCTGGTACACGTGGTCGGPRV-25FGACGGCTCCCACGGACTCPRV-25RCGCAACCCCATGAAGGCCPRV-26FGCACGCACTGCGCCAGGCPRV-26RGCGAGCTGCAGTTCTGGCTPRV-27FGGACCCTGTGACGGAGGTTGPRV-27RAGGACGACGGGTTCGTCCPRV-28FTACGTGCGCCTCGGCACCPRV-28RAGAAGGCCTTGAGCCCGTCPRV-29FGCACCAACTACACGGGGACCPRV-29RCTCCGTCTCACCTCGCCGPRV-30FAGGACACGCAGCGCTACGPRV-30RGCCCGTCCAGGCCTCGGTPRV-31FGACTCTGCTCTCCGGGCGPRV-31RTCCTGACCGCCTTCGGCGPRV-32FTCGACGGCGAGGCGCAGCPRV-32RGCCAGCTCGGCGTGCCGCPRV-33FACCATCATCATCCCCCCTCTPRV-33RCGGACGCATCAGCGTGCCPRV-34FGGCACGCTGATGCGTCCGPRV-34RCGACCGTGCATACACCCCGPRV-35FGGTGTATGCACGGTCGTCCCPRV-35RAATCTTCGCCCCCACCGC51 中国农业科学院硕士学位论文附录PRV-36FACGACCTCGACGCGTCCCPRV-36RGAAGCGGTCATATGTAAATGAGGGPRV-37FGCAGTTCCCTGTACTGACCACCPRV-37RTGAACCAGCTCGAGTCTCTGAGAPRV-38FCTGCTGGCTGTGCTGGTGGPRV-38RACAGCATCGTTCTCTGCCAACPRV-39FATCTTGCCCACTCGACGGCPRV-39RGGCGACAAAAGTATCCAAGGCPRV-40FCTTGGATACTTTTGTCGCCCAPRV-40RGCTGTTGGCTGTTGGCTGAPRV-41FTCCCCATCCCCGCCGGCCPRV-41RCTCCTACTCCTACTATATTACTATGACTACTACTATGPRV-42FCTGCGTTCGCCGGTCGCGPRV-42RGCGCTCCCCCGCCGCCTGPRV-43FCCCGAGCGCGGATCTGTGPRV-43RGTCTCGCCCTCTAGGGTTGGPRV-44FGCCTGCAAGATGTAGACGGAGAPRV-44RCCACGGGCCTGTGAGGCCPRV-45FCAAGACCGCCCGCTCGGCPRV-45RCCCCACGGCCGCGCAGAAPRV-46FTCGCGACCGCGACGGTCGPRV-46RTTTATACGCCCCGCCCACPRV-47FCCTCCGGCGACTCAGCCTPRV-47RCTACCAGCGCCTCGAGAACGPRV-48FACCACCGCAGGACCACCAPRV-48RTGGAGGCGGCCATCTTGGPRV-49FTCGATGAAGTCAAAGAGATCGTCGPRV-49RGAAGACTCCGGCTCTCCGG52 中国农业科学院硕士学位论文附录附录表S2传代毒株与JS-2012亲本毒株数据统计表AppendixtableS2ThedatacomparisonamongdifferentstainsSamplePCR-dupMappedMappedMappedCoveredCoverageAverageRateDataReadsReads%Bases(bp)Depth(bp)NumberF2540.46%14,131,79576,4924.45%129,43689.07%97.25XF4534.42%76,739,361408,36620.63%131,88190.76%528.10XF5032.81%64,920,426364,08318.75%131,37990.41%446.77XF7133.77%172,075,385982,86338.95%134,28892.41%1184.18XF9125.26%169,305,506901,14534.83%134,16992.33%1165.12XF11040.04%43,447,555235,0829.17%131,56690.54%299.00XF12030.93%52,647,804281,51612.41%131,88190.76%362.31X53 中国农业科学院硕士学位论文附录附录表S3snp、smallindel数据统计表AppendixtableS3Datastatisticsofsnp、smallindelSampleSNPNumberSmallIndelNumberF251797F4554028F5053629F7166950F9168856F11034525F12039631F25SNPSmallIndeldownstream71exonic1615upstream20upstream;downstream101F45SNPSmallIndeldownstream356exonic44918intergenic20upstream161upstream;downstream393F50SNPSmallIndeldownstream376exonic44918upstream152upstream;downstream353F71SNPSmallIndeldownstream537exonic53735intergenic62upstream162upstream;downstream595F91SNPSmallIndeldownstream547exonic55238intergenic11upstream19354 中国农业科学院硕士学位论文附录upstream;downstream647F110SNPSmallIndeldownstream245exonic27215upstream131upstream;downstream374F120SNPSmallIndeldownstream264exonic31521intergenic01upstream171upstream;downstream38555 中国农业科学院硕士学位论文附录附录表S4样本中exonic区域突变位点对蛋白翻译的影响AppendixtableS4Thetableofexonicregionmutationsites’effectonproteintranslationF25SNPSmallIndelnonsynonymous1120synonymous490frameshift_deletion03frameshiftinsertion01nonframeshiftinsertion01F45SNPSmallIndelnonsynonymous3390synonymous1100frameshift_deletion07frameshiftinsertion05nonframeshiftdeletion01nonframeshiftinsertion05F50SNPSmallIndelnonsynonymous3430synonymous1050stopgain10frameshift_deletion09frameshiftinsertion05nonframeshiftdeletion01nonframeshiftinsertion03F71SNPSmallIndelnonsynonymous3980synonymous1390frameshift_deletion013frameshiftinsertion011nonframeshiftdeletion04nonframeshiftinsertion06nonframeshiftsubstitution01F91SNPSmallIndelnonsynonymous4130synonymous1390frameshift_deletion019frameshiftinsertion09nonframeshiftdeletion0356 中国农业科学院硕士学位论文附录nonframeshiftinsertion07F110SNPSmallIndelnonsynonymous1980synonymous740frameshift_deletion06frameshiftinsertion04nonframeshiftdeletion02nonframeshiftinsertion02nonframeshiftsubstitution01F120SNPSmallIndelnonsynonymous2350synonymous790stopgain10frameshift_deletion09frameshiftinsertion05nonframeshiftdeletion02nonframeshiftinsertion04nonsynonymous235057 中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢时光荏苒，岁月如梭，转眼间三年研究生生活即将结束。回想起来，思绪万千。14年4月份怀着满满的激情来所参加复试，为了能够取得更好的成绩彻夜难眠，最终来到了A417这个大家庭，心中无比雀跃。刚一开始实习，什么都觉得好奇，什么都想着要学，从不知疲倦。也是那时从隔离器里开始养猪，做动物实验，实验室实验也开始接触。还记得当年的说说:吾日三省吾身，今日猪喂否，实验做完否，午饭有空去吃否？之后就有了与涛哥松江养猪的日子，生活虽然无聊但也因为这，转遍了上海，风雨无阻。9月份开学之后就开始了正式的研究生生活，北京的日子虽然只有八个月，但确收获了无比的快乐，很是怀念当年吃喝玩乐的日子，无忧无虑。在此谢谢与我一起疯的舍友刘军涛硕士，徐帅兵硕士，张祖航硕士以及同级于之清硕士，张欣硕士，吴巧梅硕士，崔晓霞硕士。北京的生活刚一结束，又怀着满满的激情来到了上海，开始了真正的实验室生活，也开始了自己的实验。万事开头难，课题不会弄，实验不会做，只有慢慢的摸索。多亏童武老师对于我实验的精心指导，才使得实验顺利进行。也感谢田青师兄，刘飞师姐，梁超师姐对于我实验上的指导。在经过了前期的努力之后，终于知道自己该做什么，该怎么去做。叶超师兄的到来给予了我跟涛哥很多的启发，也给了我很多的指导，在遇到问题时也是你们的指导才使我实验更加顺利，在此也是十分感谢！师妹徐晶晶的自打从北京回来就一直跟着我做实验，由于自己的活特别多也使得师妹没有了周六日，也是辛苦了师妹了。作为一个女生能够如此不知疲倦我也是十分佩服，安排这么多的实验给你我心中也十分愧疚。我相信，你以后一定会有很有前途的！李国新老师与我亦师亦友，感谢有你作为我的导师，在我研究生三年生活中对我实验上的指导，生活上的帮助，精神上的指引。在此感谢童光志老师对我实验课题的设计指导，童老师对于我们实验的严格要求，才使得我对于科研更加的热爱。同时也感谢周艳君老师，郑浩老师，姜一峰老师，高飞老师，单同领老师，于海老师，黄勤峰老师，对于我实验上的指导，感谢王志娥老师，张段玲老师对于实验的支持。也谢谢杨莘博士，虞凌雪博士，李丽薇博士，郑旭晨博士，孔宁博士，刘欢博士，李林博士，夏天奇博士，闫大为博士，于磊博士，汪秀会博士，赵款博士，陈鹏飞博士，王鑫博士，曲泽慧博士，宫晓倩博士以及堂兄武专昌博士，师姐王鑫博士对实验的指导。也感谢王康硕士，潘溪硕士，谢春硕士，曹艳云硕士，孟琼硕士，杨德强硕士，王忠泽硕士，张文超硕士，刘晓敏硕士，宿鑫硕士，张耀丹硕士，张鹏硕士，张玉娇硕士，李慧春硕士，汪琪硕士，左叶雯硕士，杨海明硕士，程雪飞硕士，李先斌硕士，王帅勇硕士以及师弟王蒙在生活上以及实验上的帮助。最后感谢父母对于我学业的大力支持，特别感谢女友唐建云对于我学业的支持，生活上无微不至的照顾，谢谢哥哥嫂嫂对我生活的帮助。三年生活转眼即逝，感谢陪我一路走来的家人，老师，朋友。祝你们生活美满，快乐，事业有成。也预祝我们的新生活一帆风顺！58 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历武吉强，男，1991年02月出生于山东省德州市，汉族，共青团员。2010年-2014年在山东农业大学动物医学专业，获农学学士学位。2014年考入中国农业科学院上海兽医研究所，攻读兽医学专业，主要从事猪伪狂犬病病毒分子生物学研究。攻读硕士期间发表论文情况：1.武吉强，徐晶晶，童武，王涛，叶超，郑浩，单同领，童光志，李国新.伪狂犬病病毒变异株gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定.2017.03.2.LiangChao,TongWu,ZhengHao,LiuFei,WuJiqiang,LiGuoxin,ZhouEnmin,TongGuangzhi.(2017).Ahigh-temperaturepassagingattenuatedpseudorabiesvaccineprotectspigletscompletelyagainstemergingprvvariant.ResearchinVeterinaryScience,112,109.59
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