苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究

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．．学校代码：１０２８５学号：２０１７７７３４００２系、州Ａ鲁ＳＯＯＣＨＯ同等学力人员硕士学位论文位学）苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染—－＾的流行病学及临床研究ＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｃａｌｃｈａｒａｃｇｉｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｈｕｎｏｆｍａｂｏｃａｉｉｒｕｓｗｌｈｒｅｓｉｒａｔｏｒｔｒａｃｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｐｙｉｎｈｏｓｉｔａｌｉｚｅｄｃｈｉｐｌｄｒｅｎｉｎＳｉｌｉｚｉｏｕａｒｅａ研究生姓名香萍指导教师姓名王宇清专业名称儿科学ｊ研究方向小儿呼吸ｊ所在院部苏州大学儿科临床医学院Ｍ论文提交日期２０１７年３月Ｍ１ 中文摘要苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究II 中文摘要苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究II 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究中文摘要目的了解苏州地区儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学情况及与气候因素的相关性，探讨博卡病毒感染后的临床特征。方法选取2012年1月～2015年12月苏州大学附属儿童医院呼吸科8711例因呼吸道感染住院的患儿，采用无菌负压吸引法采集鼻咽分泌物，聚合酶链反应法（实时PCR）检测博卡病毒（hBoV）、鼻病毒（hRV），逆转录－聚合酶链反应法（RT-PCR）检测人类偏肺病毒（hMPV），直接免疫荧光法检测呼吸道7种常见病毒包括呼吸道合胞病毒(RSV)，流感病毒A、B型(InfA、B)，副流感病毒1、2、3型(PinfⅠ、Ⅱ、Ⅲ)，腺病毒(ADV)。同时收集2012年1月～2015年12月苏州地区月平均气温(℃)、月相对湿度(％)、月降水量(mm)、月总日照时间（h）、月平均风速（m/h）等气象资料，并与月博卡病毒检出率进行多元线性回归分析。结果1．8711例标本中病毒检测阳性2594例（29.78%），其中前五位检出病毒分别是RSV933（10.71%）、hRV666例（10.52%,666/6333）、hBoV358例（4.11%）、PinfⅢ316例（3.63％）、hMPV101例（1.16%）。2.<6月、6～12月、1～2岁、2岁～5岁、≥5岁年龄组检出率分别为1.23%、7.62%、8.83%2.78%和3.47%，6～12月、1～2岁年龄组患儿检出率高于其他年龄组。3.2012年～2015年hBoV年度检出率分别为3.95%、4.40%、3.81%、4.31%。4年2间hBoV检出率比较差异无明显统计学意义（=1.297，P>0.05）。4．hBoV春季检出率2.38%、夏季检出率5.31%、秋季检出率6.36%、冬季检出率22.53%。hBoV季节检出率差异有统计学意义（=65.289，P<0.001），夏季高于春、冬22季（分别为25.857、22.300，P<0.001）。、秋季高于春、冬季（分别为41.926、37.191，2P<0.001）。而春季与冬季、夏季与秋季差异无统计学意义（分别为0.098、2.137，P>0.05）。I 5．hBoV阳性358例患儿中，诊断上呼吸道感染4例（1.12%）；支气管炎4例（1.12%）；毛细支气管炎3例（0.84%）；支气管肺炎288例（80.45%）；大叶性肺炎30例（8.38%）；重症肺炎29例（8.10%）。主要临床表现有咳嗽（97.77%），发热(61.45%)，喘息(51.96%)，鼻塞和/或流涕(37.43%)，气促（13.97%），呼吸困难（5.59%），肺部啰音（88.55%）；胸片异常（98.89%）。6．29例hBoV感染重症肺炎患儿平均年龄11.6±0.9月，均为2岁以下患儿，其中3例有基础疾病，8例混合其他病原菌感染。7.92例hBoV阳性患儿存在混合感染，其中混合感染前三位是：hBoV+hRV41例，hBoV+RSV30例，hBoV+PinfⅢ9例。8．hBoV检出率与月平均气温为中度正相关（r=0.443，P=0.002），与月日照时间（r=0.166，P=0.260）为低度相关。结论1．hBoV是引起苏州地区住院儿童呼吸道感染的重要病毒病原体之一，6～12月、1～2岁年龄组检出率高。2．hBoV感染全年散发，夏、秋季节为高峰期。3.hBoV感染后的临床表现无明显特征性。4.hBoV可引起重症感染，多发生于<2岁患儿。5.hBoV存在一定比例的混合感染，常见的病原是hRV和RSV。6.hBoV检出率与月平均气温呈中度正相关。关键词儿童；呼吸道感染；人类博卡病毒；流行病学；气候作者：何香萍指导教师：王宇清II EpidemiologicalcharacteristicsandclinicalresearchofhumanbocaviruswithrespiratorytractinfectioninhospitalizedchildreninSuzhouareaABSTRACTObjectivesTostudytheepidemiccharacteristicsofhumanbocaviruswithacuterespiratorytractinfectioninhospitalizedchildrenanditsrelationshipofmeteorologicalfactorsinsuzhou,andtoexploretheclinicalcharacteristicsofhBoVinfection.Methods8711casesinvolvingthehospitalizedchildrenwithrespiratorytractinfectionwereobtainedfromJanuary2012toDecember2015indepartmentofrespiration,Children'sHospitalAffiliatedSoochowUniversity.Themethodofsterilenegativepressuresuctionwasusedtocollectnasopharyngealsecretions.Humanbocaviruswasdetectedbyreal-timefluorescentPCR.Humanmetapneumovirus(hMPV)wastsetedwithreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR),directimmunofluorescenceassaywasusedtodetect7commonvirusesinrespiratorytractincludingrespiratorysyncytialvirus(RSV),influenzavirustypeAandB(InfA,B),Parainfluenzavirustype1,2,and3(PinfⅠ，Ⅱ，Ⅲ),adenovirus(ADV).Meanwhile,somemeteorologicaldatawerecollectedsuchasmonthlyaveragetemperature(℃),monthlymeanhumidity(%),monthlyprecipitation(mm),monthlytotalsunshinetime(h)、monthlymeanwindspeed(m/h)etc.fromJanuary2012toDecember2015inSuzhouarea,therelationshipbetweenthedetectionofhumanbocavirusandmetrorologicalfactorswasanalyzedbylinearregressionandstepwiseregressionanalysis.Results1.2594cases(29.78%)werepositiveamong8711cases,thetopfivedetectedviruswereRSV933cases(10.71%)、hRV666cases(10.52%,666/6333)、hBoV358cases(4.11%)、PinfⅢ316cases(3.63%)、hMPV101cases(1.16%).2.Thepositiverateswererespectively1.23%,7.62%,8.83%,2.78%and3.47%III amongthechildrenwhowerelessthan6months,6to12months,1to2yearsold,2to5yearsold,andmorethanorequalto5yearsold.6to12months,1to2yearsgroupofchildrenwithhigherdetectionratethanotheragegroups.3.TheannualdetectionrateofhBoVin2012to2015was3.39%,4.40%,3.81%,and4.31%respectively.TherewasnosignificantdifferenceinthedetectionrateofhBoVbetweenthefouryears(2=1.297,P>0.05).4.ThedetectionrateofhBoVwas2.38%inspring,5.31%insummer,6.36%inautumn,2.53%inwinter,whichwasstatisticallysignificantindifferentseasons(2=65.289,P<0.001).Positivityrateofsummerwashigherthanthatofspringandwinter(2=25.857，22.300,P<0.001).Positivityrateofautumwashigherthanthatofspringandwinter(2=41.926、37.191,P<0.001).ThesedatarevealedthattheprevalenceofhBoVinfectionwasobviouslyhigherduringsummerandautumnthaninspringandwinter.5.Among358casesofhBoV-positivechildren,therewere4cases(1.12%)ofupperrespiratorytractinfection,4cases(1.12%)ofbronchitis,3cases(0.84%)ofbronchilitis,288cases(80.45%)ofbronchopneumonia,30cases(8.38%)oflobarpneumonia,and29cases(8.10%)ofseverepneumonia.Themainclinicalmanifestationswerecough(97.77%),fever(61.45%),wheezing(51.96%),stuffinessand/orrunnynose(37.43%),shortnessofbreath(13.97%),dyspnea(5.59%),lungrales(88.55%),chestradiographabnormalities(98.89%).6.TheaverageageofchildrenwithseverepneumoniacausedbyhBoVwas11.6±0.9months,allofthemwereunder2yearsold,3caseshadunderlinediseaseand8caseswerecoinfectionwithotherpathogensamongthem.7.92casesofhBoV-positivechildrenhadmixedinfection,thetopthreeofwhichincluding41casesofhBoV+hRV,30casesofhBoV+RSV,9casesofhBoV+PinfⅢ.8.ThedetectionrateofhBoVhadmoderateandpositivecorrelationwithmonthlymeantemperature(r=0.443,P=0.002),lowcorrelationwithmonthlysunshinetime(r=0.166,P=0.260).Conclusions1.hBoVisoneofthemostimportantpathogensofrespiratorytractinfectionamongchildreninSuzhouarea.Thedetectionrateofchildrenwiththeagebetween6to12monthsand1to2yearsgroupishigher.IV 2.TheprevalenceofhBoVinfectionwashigherduringsummerandautumn.3.TheclinicalmanifestationsofhBoVinfectionhasnoobviousspecificcharacteristicscomparedwithotherrespiratoryvirus.4.hBoVcancauseseverepulmonaryinfection,occurringmainlyinchildrenunder2yearsold.5.Co-infectionwascommoninpatientswithhBoVinfection.Thecommonpathogenco-infectedwashRVandRSV.6.ThepositiverateofhBoVhasmoderateandpositivecorrelationwithmonthlymeantemperature.KeywordsChildren,respiratorytractinfection,humanbocavirus,epidemiology,climateWrittenby：HeXiangpingSupervisedby:WangYuqingV 目录前言....................................................................................................................................2参考文献............................................................................................................................3苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染....................................................................7的流行病学及临床研究........................................................................................................7材料与方法............................................................................................................................8材料.................................................................................................................................8一、对象.....................................................................................................................8二、主要设备.................................................................................................................8三、主要试剂.................................................................................................................8方法.................................................................................................................................9一、分组.........................................................................................................................9二、收集标本.................................................................................................................9三、实时PCR检测hBoV............................................................................................9四、直接免疫荧光法检测7种常见呼吸道病毒.......................................................10五、实时PCR检测偏肺病毒(humanmetapneumovirushMPV)基因......................10六、实时PCR检测鼻病毒(humanrhinovirushRV)................................................11七、病历调查...............................................................................................................11八、统计学分析...........................................................................................................11结果..................................................................................................................................12讨论..................................................................................................................................25结论..................................................................................................................................30参考文献..............................................................................................................................31综述..................................................................................................................................35参考文献..........................................................................................................................40英文缩略词表......................................................................................................................46致谢..................................................................................................................................471 前言苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究前言小儿时期常见疾病中呼吸道感染占有极其重要的地位，研究显示呼吸道感染占患[1]病人数的39.0％～65.5％，肺炎占儿科住院患儿的24.5％～56.2％。2005年世界卫生组织(WHO)公布2000～2003年儿童死亡病因评估报告：全球死亡儿童1060万例，[2]其中5岁以下儿童因肺炎死亡占19%，是第一位的死因。随着生活水平的提高，有效抗菌药物及疫苗的使用，感染性疾病的发生率及严重程度在逐渐下降，但呼吸道感染依然是小儿常见和多发的疾病，威胁着儿童健康和生命，积极采取措施降低肺炎死亡率是我国2011～2020儿童发展纲要规定的重要任务之一。明确病原可以为临床诊断和治疗提供可靠的依据，是降低肺炎的发病率及死亡率的有效办法。呼吸道感染中常见病原菌有细菌、病毒和非典型病原菌。其中病毒是引起儿童呼吸道感染的重要病原微生物之一，2岁以下儿童急性下呼吸道感染中80%以上由病毒感染引起,常见的引起儿童呼吸道感染的病毒有合胞病毒、流感病毒、副流[1]感病毒、鼻病毒、腺病毒等,但仍有一些临床认为是病毒感染，确切的病原尚未得到证实。近年来随着分子生物学和生物信息学的不断进步，在呼吸道感染患者的呼吸道分[3]4,5,6][7]泌物中检测出了一些新的病毒，如人偏肺病毒，冠状病毒、HRV-OPM鼻病毒、8,9][10]KI和WU多瘤病毒，以及人类博卡病毒。人类博卡病毒(Humanbocavirus，hBoV)是2005年瑞典科学家Allander首次从小儿下呼吸道感染分泌物中分离到的一种新的人细小病毒。因为与牛细小病毒（bovinevirus）和犬细小病毒(caninevirus)具有高度的同源性，故命名为人博卡病毒(humanbocavirus，hBoV)，hBoV分为hBoVl、hBoV2、hBoV3和hBoV4四种类型；hBoVl主要在呼吸道分泌物中检出，hBoV2主要在肠[11,12,13]道标本中检出，hBoV3及hBoV4在肠道标本中偶尔检出。继2005年，瑞典学者Allander等首次报道人博卡病毒后，研究者相继报道了人群[14]中hBoV的感染情况，全球各地儿童hBoV阳性检测率为1．5％～22.5％。hBoV的感染[15][16]呈全球性，意大利报道hBoV的检出率为12.1%，美国的检出率为5.6%,沙特的检出[17][18][19]率高达22.5%，日本的检出率15.5%，澳大利亚hBoV阳性率5.6%，2006年瞿小旺[20][21]首次证实了hBoV在我国的存在。我国学者Huang等利用构建的感染性克隆pIhBoV，2 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究前言感染具有极性的呼吸道上皮细胞后，能明显看到呼吸道上皮细胞发生细胞肿胀，细胞连接破坏，绒毛减少等病理改变,证明了博卡病毒的致病性。hBoV是小儿呼吸道疾病[22]的病原之一，有报道其发病率仅次于呼吸道合胞病毒，也是导致婴幼儿呼吸道感染的发病率、住院治疗率和死亡率升高的重要原因之一。[23]hBoV所引起的呼吸道感染疾病四季均可发生，Kesebir等报道hBoV在美国检出的时间为每年的开始3个月和最后3个月,5～8月份（夏季）未发现阳性标本。澳大利[19]亚整个冬季都能检测到hBoV，而在初冬感染较为盛行。hBoV在日本的流行季节是每[24]年的1～5月份（冬春季），高峰是4～5月，在法国流行季节主要是11月到次年的6[25]月（冬春季），高峰期是3～4月。hBoV易感人群为6个月～2岁小儿，6个月以下少[26]见。儿童中hBoV感染引起的疾病可以为上呼吸道感染、支气管炎、毛细支气管炎和肺炎，主要的临床表现有咳嗽、发热、喘息、流涕、呼吸困难等。hBoV也可以引起重症感染，可以出现呼吸困难、低氧血症等表现，但不需要机械通气，没有死亡和ARDS[27][28]病例。一份来自孟加拉国的报道,有4个严重脑炎的儿童，脑脊液中只检测到人博卡病毒，2个儿童因脑炎死亡，另外2个儿童预后不详，这些hBoV脑炎的孩子都存在严重营养不良。说明hBoV感染可导致严重后果。目前国内外尚缺乏大样本、连续的关于hBoV的流行病学及与气候因素的研究，为此本研究应用实时PCR技术检测苏州地区2012年1月至2015年12月四年因急性呼吸道感染住院的儿童鼻咽分泌物中的hBoV，以探讨hBoV感染的流行病学、临床特征，及与气候因素相关性，为临床诊断和治疗提供一定的理论依据。参考文献[1]江载芳.实用小儿呼吸病学[M].北京:人民卫生出版社,2010，1-3.[2]BryceJ,Boschi-PintoC,ShibuyaK,etal.WHOestimatesofthecausesofdeathinchildren[J].Lancet,2005,365(9465):1147–1152.[3]vandenHoogenBG,deJongJC,etal.Anewlydiscoveredhumanpneumovirusisolatedfromyoungchildrenwithrespiratorytractdisease[J].NatMed2001,7(6):719–724.[4]DrostenC,GuntherS,PreiserW,etal.Identificationofanovelcoronavirusinpatientswithsevereacuterespiratorysyndrome[J].NEnglJMed，2003,348(20):1967–1976.[5]FouchierAR,HartwigNG,BestebroerTM,etal.Apreviouslyundescribedcoronavirus3 前言苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究associatedwithrespiratorydiseaseinhumans[J].ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(16):6212–6216.[6]WooPC,LauSK,ChuCM,etal.Characterizationandcompletegenomesequenceofanovelcoronavirus,coronavirusHKU1,frompatientswithpneumonia[J].JVirol,2005，79(2):884–895.[7]McErleanP,ShackeltonLA,LambertSB,etal.Characterisationofanewlyidentifiedhumanrhinovirus,HRV-QPM,discoveredininfantswithbronchiolitis[J].JClinVirol,2007,39(2):67–75.[8]AllanderT,AndreassonK,GuptaS,etal.Identificationofathirdhumanpolyomavirus[J].JournalofVirology,2007,81(8):4130–4136.[9]GaynorAM,NissenMD,WhileyDM,etal.Identificationofanovelpolyomavirusfrompatientswithacuterespiratorytractinfections[J].PLoSPathog,2007,3(5):e64.[10]AllanderT,TammiMT,ErikssonM,etal.Cloningofahumanparvovirusbymolecularscreeningofrespiratorytractsamples[J].ProcNatlAcadSciUSA,2005,102(36):12891-12896.[11]KapoorA,SlikasE,SimmondsP,etal.Anewlyidentifiedbocavirusspeciesinhumanstool[J].JInfectDis,2009,199(2):196-200.[12]ArthurJL,HigginsGD,DavidsonGP,etal.AnovelbocavirusassociatedwithacutegastroenteritisinAustrialianchildren[J].PLoSPathog,2009,5(4):e1000391.[13]KapoorA,SimmondsP,SlikasE,etal.Humanbocavirusesarehighlydiverse,dispersed,recombinationprone,andprevalentinentericinfections[J].JInfectDis,2010,201(11):1633-1643.[14]Kimjs，LimCS，KimYK，eta1．Humanbocavirusinpatientswithrespi—ratorytractinfection[J]．KoreanJLabMed，2011，3l(3)：179—184．［15］AlessandraZ，MartaC，ElenaF,etal.Co-circulationofgeneticallydistincthumanmetapneumovirusandhumanbocavirusstrainsinyoungchildrenwithrespiratorytractinfectionsinItaly［J］.JMedVirol，2011，83(1)：156-164.［16］JohnCA，KumudKS，StephenAS，etal.Humanbocavirus：prevalenceandclinicalspectrumatachildren’shospital［J］.ClinInfectDis，2006，43(3)：283-288.4 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究前言［17］Abdel-MoneimAS，KamelMM，Al-GhamdiAS,etal.Detectionofbocavirusinchildrensufferingfromacuterespiratorytractinfectionsinsaudiarabia［J］.PLoSONE，2013，8（1）：e55500.［18］NaokoK，ShinobuT，MikiK，etal.Detectionofhumanbocaviruses1to4fromnasopharyngealswabsamplescollectedfrompatientswithrespiratorytractinfections［J］.JClinMicrobiol，2012，50（6）：2118-2121.［19］SlootsTP，McErleanP，SpeicherDJ，etal.EvidenceofhumancoronavirusHKU1andhumanbocavirusinAustralianchildren［J］.JClinVirol，2006，35（1）:99-102.[20]瞿小旺等,漆正宇，段招军，等．儿童急性呼吸道博卡病毒感染［J］．病毒学报，2006，22(2)：79-82．[21]HuangQ，DengX，YanZ，etal.Establishmentofareversegeneticssystemforstudyinghumanbocavirusinhumanairwayepithelia［J］．PLoSPathogens,2012，8(8):e1002899．[22]GarciaML,CalvoC,PozoF,etal.DetectionofhumanbocavirusinillandhealthySpanishchildren:a2-yearstudy［J］.ArchDisChild,2008,28(5):906-912.[23]KesebirD,VazquezM，WeibelC，eta1．HumanbocavirusinfectioninyoungchildrenintheUnitedStates：Molecularepidemiologicalprofileandclinicalrharacteristiesofanewlyemergingrespiratoryvirus[J].InfectDis,2006,194(9)：1276—1282．[24]MaX,EndoR,IshiguroN,etal.DetectionofHumanBocavirusinJapanesechildrenwithlowerrespiratorytractinfections[J].JClinMicrobiology,2006,44(3):1132–1134.[25]JacquesJ,MoretH,MotteJ,etal.HumanbocavirusquantitativeDNAdetectioninFrenchchildrenhospitalizedforacutebronchitis[J].JournalofClinicalVirologytheOfficialPublicationofthePanAmericanSocietyforClinicalVirology,2008,43(2):142–147.5 前言苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究[26]FoulongneV,OlejnikY,PerezV,etal.HumanbocavirusinFrenchchildren[J].EmergInfectDis,2006,12(8):1251–1253.[27]顾凤珍，柏振江，谢敏慧，等.2009—2010年苏州地区儿童重症人类博卡病毒肺炎的流行病学及临床特点[J].实用儿科临床杂志，2011,26（22）:1728-1730.[28]MituiMT,TabibSM,MatsumotoT,etal.Detectionofhumanbocavirusinthecerebrospinalfluidofchidrenwithencephalitis[J].ClinInfectDis,2012,54（7）:964-967.6 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究正文苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究人博卡病毒是瑞典学者Allander于2005年首次从小儿下呼吸道感染分泌物中分[2]离到的一种细小病毒，因其与牛细小病毒（bovinevirus）和犬细小病毒(caninevirus)具有高度的同源性，故取名为人类博卡病毒(humanbocavirus，hBoV)，hBoV自被发现后，世界各地相继报道人群中HBoV的感染情况，瞿晓旺首次证实了hBoV在我[3]国的存在。hBoV是常见引起呼吸道感染的病毒之一，研究发现不同国家、不同地区、[4，5，6]不同人群中hBoV的流行病学特征有所不同。目前国内外尚缺乏大样本、连续的关于hBoV的流行病学、临床特征及与气候相关性的研究，为此本研究应用实时PCR技术检测苏州地区因急性呼吸道感染住院儿童鼻咽分泌物中的博卡病毒，以探讨博卡病毒感染的流行病学和其临床特征，及与气候相关性的研究，为临床诊断和治疗提供一定的理论依据。7 材料与方法苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究材料与方法材料一、对象选取苏州大学附属儿童医院呼吸科2012年1月至2015年12月收治因呼吸道感染疾病住院的患儿8711例，其中男5426例(62.29%），女3285例(37.71%)，男女比例1.65:1。二、主要设备1.超净工作台苏净集团AirTech公司2.超低温冰箱日本SANYO公司3.TGL－16台式离心机上海医用分析仪器厂4.台式低温高速离心机瑞典Heraeus公司5.GeneAmpPCRsystem9600扩增仪美国PERKINELMER公司6.BIO-icycler扩增仪美国BIO-RAD公司7.荧光显微镜德国莱卡020-518.5008.Leica图像分析系统德国Leica公司9.Vilber凝胶分析系统法国Lourmat公司10.电泳仪美国BIO-RAD公司11.实时荧光PCR自动循环仪美国BIO-RADicycle公司12图像分析仪北京DHC公司三、主要试剂1.病毒快诊试剂盒美国Chemicon公司2.6’-随机引物(hMPV)上海生物工程技术服务有限公司3.正、反相引物(hMPV)上海生物工程技术服务有限公司4.正、反相引物上海生物工程技术服务有限公5.DNA裂解液上海申友生物公司6.TrizolInvitrogen公司7.逆转录酶M-MLVPromgea公司8.Taq酶Promgea公司8 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究材料与方法方法一、分组1、年龄分组：<6月2754例（31.62%），6～12月1517例（16.57%），1～2岁1507例（17.30%），2～5岁1936（22.22%），≥5岁997例（11.45％）。年龄最小25天，最大14岁7月。2.疾病分组：上呼吸道感染565例，支气管炎65例，毛细支气管炎53例，支气管肺炎6829例，大叶性肺炎794例，间质性肺炎18例，重症肺炎337例，支气管哮[1]喘急性发作伴感染50例。临床疾病诊断标准均依据《诸福棠实用儿科学》第8版。3.季节分布：春季（3月～5月）2265例，夏季（6月～8月）2165例，秋季（9月～11月）2107，冬季（12月～2月）2174例。二、收集标本入院后24小时内采用无菌负压抽痰法，将塑料导管经患儿鼻腔插入7～8cm达到咽部以下吸取1～2ml气道分泌物，放入无菌生理盐水中。标本放置-20ºC保存。三、实时PCR检测hBoV1.引物设计：参考GeneBank中已发表的多株不同hBoV的全基因组序列，设计合成了扩增hBoV的VP1蛋白基因的引物，扩增片断长度为92bp。VP1基因引物序列：hBoV-F:5’-TGACATTCAACTACCAACAACCTG-3’hBoV-R:5’-CAGATCCTTTTCCTCCTCCAATAC-3’hBoV-probe:AGCACCACAAAACACCTCAGGGG-TAMRA2.提取病毒DNA：用PH=7.0的PBS洗涤呼吸道分泌物标本，然后吸取沉淀物，加入DNA裂解液95℃，静置10分钟，后以12000转/分的速度离心5分钟吸取上清液。3.PCR扩增：将上清液3ul，加ddH2O14.75ul，RT缓冲液2.5ul，dNTP1ul，25mMMgSO42ul，Taq酶0.25ul，引物F、R各0.5ul，共25ul，置实时荧光PCR自动循环仪94℃30s，56℃30s，72℃30s，扩增40个循环，仪器根据荧光曲线判定阳性结果。4.序列测定和分析：由上海生物工程技术服务有限公司随机选取10份PCR阳性扩增产物进行核酸序列测定，所测到的序列与GeneBank中的基因序列用Chromas软件进行比较。9 材料与方法苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究四、直接免疫荧光法检测7种常见呼吸道病毒1.标本的处理：将标本置于离心管，加PBS4-8ml,用漩涡混合器震荡3～5分钟，再以300-500转/分离心1分钟，去上清液及粘液。沉淀物再加PBS4-8ml,用漩涡混合器震荡3-5分钟，再次去上清液，沉淀物中加入适量的PBS。调整细胞浓度为纤毛6柱状上皮细胞1.0×10/ml。2.细胞片制备：吸管吸取细胞悬液25ul，点于预先准备好的7孔玻片，每个痰标本点于该玻片的7个孔。室温下干燥，然后用4℃丙酮固定10分钟。3.Chemicon：免疫荧光试剂染色25~40ul内含伊文斯蓝的荧光素标记的呼吸道病毒单克隆抗体即抗腺病毒(Adenovirus,ADV)、呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)、流感病毒A型及B型(InfluenzavirusA,InfA;InfluenzavirusB,InfB)、副流感病毒1、2、3型（ParainfluenzaⅠ,Ⅱ,Ⅲ,PinfⅠ,Ⅱ,Ⅲ）单克隆抗体分别滴加于标本上，在37℃孵育30分钟后，用PBS/Tween洗片3次，然后用蒸馏水洗片，风干后用CellsideDown封片剂(pH8.15甘油缓冲液)封片，荧光显微镜观察。4.阳性结果判断及对照设定：呼吸道病毒抗原阳性的细胞在荧光显微镜下观察细胞核和/或细胞胞浆内可见黄绿色荧光，阴性细胞没有荧光，背景淡蓝色，如果一孔涂片中2%以上的细胞显示细胞内染色为阳性，且细胞数大于200个，即为某病毒感染。在确定阳性染色时腺病毒和流感病毒为核染色或浆内染色，呼吸道合胞病毒和副流感病毒显示为细胞浆内染色，由试剂盒提供阳性及阴性对照片作对照。五、实时PCR检测偏肺病毒(humanmetapneumovirushMPV)基因1.病毒mRNA的制备：取分泌物的细胞沉淀100ul，加入1mlTrizol溶解细胞，反复震荡，加入200ul氯仿，用力振摇15sec，使之成为均匀乳化液，室温中置2～3分钟，再12000转/分离心10min。另换管加0.6ml异丙醇，将上清液吸入管中，取水约600ul，重复振摇，置-2℃冰箱10min。置4℃，12000r/min离心10min，后弃上清液，放在滤纸上吸干。RNA沉淀用70%、100%乙醇1ml各洗一遍，每次于4℃，12000r/min离心10min。沉淀物晾干后加DEPC水40ul溶解。2.逆转录合成cDNA：PCR管中加入1ul随机引物、2ugRNA溶液共20ul，70℃反应4min，加入DEPC水8ul，RT缓冲液5ul，2.5ul100mmol/LDTT，1.5ul0.1MdNTP，1ul逆转录酶，1ulRNasin总体积约25ul，37℃孵育60min，然后于94℃灭活5min。10 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究材料与方法3.PCR扩增：将cDNA10ul，另加ddH2O6.5ul，RT缓冲液2.5ul，25mMMgSO43ul，0.5uldNTP，0.5ulTaq酶，引物N1、N2各1ul，共25ul，置PCR自动循环仪于94℃30s，55℃30s，68℃30s，扩增45个循环，最后68℃延伸7min。4．扩增产物检测：取10ulPCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察有213bp荧光片断为阳性。六、实时PCR检测鼻病毒(humanrhinovirushRV)1.引物设计：参考GenBank中已发表的多株不同hRV的全基因组序列，设计合成了扩增hRV的基因引物：hRVFTGGACAGGGTGTGAAGAGC；hRVRCAAAGTAGTCGGTCCCATCC；hRVPRPBEFAM-TCCTCCGGCCCCTGAATG-TAMRA,由上海生物工程技术服务有限公司合成。2.病毒mRNA的制备：用Trizol提取标本中的RNA。3.逆转录合成cDNA：用6-随机引物逆转录合成cDNA，6-随机引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。4．PCR扩增：将DNA3ul,另加ddH2O14.75ul,RT缓冲液2.5ul，25mmol/LMgSO42ul，1uldNTP，0.25ulTaq酶(Promgea公司)，引物F、R各0.5ul，共25ul，置PCR自动循环仪（BIO-RADicvcle公司）于945℃5min，95℃15s，60℃30s，扩增40个循环，仪器根据荧光曲线判定阳性结果。5.序列测定及分析：PCR阳性扩增产物进行核苷酸序列测定，测序反应由上海生物工程技术服务有限公司完成，将所测到的序列与GenBank中的基因序列进行比较，序列比较使用Chromas软件。七、病历调查回顾分析所有患儿的临床病历资料，包括年龄、性别、临床表现、实验室检查、影像学检查及转归，通过查阅出院后病历完成。八、统计学分析统计学数据用SPSS17.0分析，计数资料组间率的变异采用卡方检验，不满足条件采用Fisher精确概率法。计量资料作正态性W检验和方差齐性检验，数据满足正态分布采用Pearson相关分析，不满足正态分布采用Spearman非参数检验。P<0.05为差异有显著性。11 结果苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究结果1.各病原检出情况8711病例中病毒检测阳性2594例，占29.78%，其中呼吸道合胞病毒（RSV）933例（10.71%），鼻病毒（hRV）666例（10.52%，666/6333，hRV2013年起开始检测)，博卡病毒（hBoV）358例（4.11%），副流感病毒-3型（PinfⅢ）316例（3.63％），偏肺病毒（hMPV）101例（1.16%）,流感病毒A（InfA）80例（0.92％）,腺病毒（ADV）51例（0.59%）,流感病毒B（InfB）39例（0.45％）,副流感病毒-1型（PinfⅠ）25例（0.29％）,副流感病毒-2型（PinfⅡ）8例（0.09％）。两种病毒混合感染182例:RSV+hRV30例,RSV+InfA27例,RSV+hMPV5例，RSV+PinfⅢ3例，hRV+PinfⅢ16例,hRV+ADV2例，hRV+InfA2例，PinfⅢ+hMPV4例，PinfⅢ+ADV1例；其中hBoV混合感染92例：hBoV+hRV41例，hBoV+RSV30例，hBoV+PinfⅢ9例，hBoV+InfA7例，hBoV+PinfⅠ2例，hBoV+InfB2例，hBoV+hMPV1例。见图1。图1常见病毒的检出率2.hBoV年龄分布2012年1月至2015年12月四年间共检测标本8711例，hBoV阳性数358例，检12 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究结果出率4.11%。其中年龄最小者1月，最大者9岁11月，中位年龄13月（1～119月）。将其按照年龄段分为5组：<6月、6～12月、1～2岁、2～5岁、≥5岁。其中<6月34例，检出率1.23%；6月～12月110例，检出率7.62%；1岁～2岁133例，检出率8.83%；2岁～5岁72例，检出率2.78%；5岁及以上9例，检出率3.47%。见表1。2不同年龄段hBoV感染差异有统计学意义，总体比较（=213.003，P<0.001），其2中<6月与≥5岁、6～12月与1～2岁两两比较差异没有统计学意义(分别为0.711，1.410，P值分别为0.235，0.399)，其余差异均有统计学意义，6～12月、1～2岁2hBoV检出率高于<6月、2～5岁、≥5岁组（分别为116.63,24.73,57.40，149.04,39.46,70.40，P值均<0.001），6～12月、1～2岁检出率高于其它组。见图2。表1各年龄组hBoV的阳性检出率年龄分组阳性病例数检测病例数检出率<6月3427541.23%6～12月11015177.25%1～2岁13315078.83%2～5岁7219363.72%≥5岁99970.9%总计35887114.11%图2各年龄段hBoV检出率13 结果苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究3.hBoV性别分布男性hBoV阳性患儿243例，检出率4.48%，女性hBoV阳性患儿115例，检出率23.50%；男女比2.11:1（=4.963,P=0.026）,差异有统计学意义。4.hBoV月份分布常年可检出hBoV，2012年hBoV检出高峰期为7月，11月，低谷期在1月，3～4月；2013年hBoV检出高峰期为7～9月，11月，低谷期在1～3月，2014年hBoV检出高峰期在4月，8～11月，低谷期在1～3月；2015年hBoV检出高峰期在7月，10～11月，低谷期在3～4月。见表2，图3。表22012-2015年不同月份hBoV的检出率年份2012年2013年2014年2015年月份检检住院出检出住院出住院检出检出住院检出月份检出率检出率人数人率人数人人数人数率人数人数数数1月21520.93%20420.98%17910.56%19321.04%2月18363.28%17521.14%22120.90%15442.60%3月21410.47%19931.51%18421.09%16000.00%4月20941.91%20473.43%179126.70%17410.57%5月20762.90%17252.91%20063.00%16374.29%6月200105.00%18552.70%18121.10%13510.74%7月181158.29%163116.75%202115.45%161127.45%8月212115.19%195178.72%177105.65%173105.78%9月21962.74%153117.19%154127.79%17574.00%10月23493.85%18484.35%180116.11%173148.09%10.8111月148161551610.32%16495.49%168158.93%%12月15685.13%17284.65%13243.03%190147.37%合计2378943.95%2161954.40%2153823.81%2019874.31%14 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究结果图32012-2015年hBoV月份检出率5.hBoV季节分布2012-2015四年间1月hBoV检出率0.88%（7/791）,2月hBoV检出率1.91%（14/733）,3月hBoV检出率0.79%（6/757）,4月hBoV检出率3.13%（24/766）,5月hBoV检出率3.23%（24/742），6月hBoV检出率为2.57%（18/701），7月hBoV检出率6.93%（49/707），8月hBoV检出率6.34%（48/757）,9月hBoV检出率5.14%（36/701）,10月hBoV检出率5.45%(42/771),11月hBoV检出率8.82%（56/635）,12月hBoV检出率5.23%（34/650），每个月均有hBoV检出。见表3、图3。春季检测标本2265例，hBoV阳性数54例，检出率2.38%；夏季检测标本2165例，阳性数115例，检出率5.31%；秋季检测标本2107例，阳性数134例，检出率6.36%；冬季检测标本2174例，阳性数55例，检出率2.53%。hBoV检出率季节间差异有统计学意2义（=65.289，P<0.001），夏季高于春季、秋季高于春季、夏季高于冬季、秋季高2于冬季（分别为25.857、41.926、22.300、37.191，P<0.001）。而春季与冬季、2夏季与秋季之两两比较差异没有统计学意义（分别为0.098、2.137，P>0.05）。见表3，表4，图4，图5.15 结果苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究表3358例hBoV阳性患儿的每月检出率月份阳性病例送检病例检出率一月77910.88%二月147331.91%三月67570.79%四月247663.13%五月247523.19%六月187012.57%七月497076.93%八月487576.34%九月367015.14%十月427715.45%十一月566358.82%十二月346505.23%合计35887114.11%图4358例hBoV阳性患儿月检出情况16 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究结果表42012年-2015年hBoV季节检出率年份2012年2013年2014年2015年季节住住检院检出院出检出住院检出检出住院检出月份检出率检出率人人数人人率人数人数率人数人数数数数春季630111.75%575152.61%563203.55%49781.61%夏季593366.07%543336.08%560234.11%469234.90%秋季601315.16%492357.11%498326.43%516366.98%冬季554162.89%551122.18%53271.32%537203.72%图52012年-2015年hBoV季节检出率表5hBoV感染各季比较的卡方检验2各组比较的卡方检验值P值春-夏比较25.857<0.001春-秋比较41.926<0.001春-冬比较0.0980.75417 结果苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究夏-秋比较2.1370.144夏-冬比较22.3<0.001秋-冬比较37.191<0.0016．hBoV年检出率四年共检测标本8711例，hBoV阳性检出人数为358例，检出率为4.11%。其中2012年检测标本2378例，hBoV阳性检出人数94例，检出率为3.95%，2013年检测标本2161例，hBoV阳性检出人数95例，检出率为4.40%,2014年检测标本2153例，hBoV阳性检出人数为82例，检出率3.81%,2015检测标本2019例，hBoV阳性检出人2数为87例，检出率为4.31%。4年间hBoV检出率的比较（=1.297，P值0.73）,差2异无明显统计学意义，各年间hBoV检出率两两比较均无统计学差异（值分别为0.557,0.063,0.351,0.946,0.019，0.671，P均>0.05）。见表6，图6。表6不同年份hBoV的阳性检出率年份送检病例数阳性数检出率2012年2378943.95%2013年2161954.40%2014年2153823.81%2015年2019874.31%总计87113584.11%图6不同年份hBoV的阳性检出率18 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究结果7．不同呼吸道感染性疾病博卡病毒检出情况2上呼吸道感染组hBoV检出率低于其它组，差异有统计学意义（值分别为13.790、6.651、16.942、12.758、37.352，P值均<0.05）；重症肺炎组hBoV检出率2高于上呼吸道感染组、支气管肺炎组及大叶性肺炎组，差异有统计学意义（值分别为37.352、14.626、11.149、，P值<0.001），重症肺炎与支气管炎及毛细支气管炎组2hBoV检出率两两比较没有统计学差异（值分别为0.435、0.527，P值>0.05）。不同呼吸道感染性疾病博卡病毒检出率见表7。表7不同呼吸道感染性疾病hBoV检出情况疾病名称送检例数阳性例数检出阳性率上呼吸道感染56540.71%支气管炎6546.15%毛细支气管炎5335.67%支气管肺炎68292884.22%大叶性肺炎794303.78%重症肺炎337298.61%8．hBoV感染后临床特征8.1临床症状和体征咳嗽：350例（97.77%）患儿有不同程度的咳嗽；喘息：186例(51.96%)患儿有喘息症状；鼻塞和/或流涕：134例(37.43%)患儿有鼻塞和/或流涕等卡他症状；发热：220例(61.45%)患儿有不同程度发热症状；气促：50例（13.97%）患儿有气促表现；呼吸困难：20例（5.59%）患儿有呼吸困难表现；肺部啰音：317例（88.55%）患儿入院肺部可及湿啰音和/或喘鸣音。见表8。表8hBoV感染的临床症状症状病例数百分比咳嗽35097.77%喘息18651.96%发热22061.45%鼻塞和/或流涕13437.43%19 结果苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究呼吸困难205.59%气促5013.97%紫绀123.35%肺部啰音31788.55%8.2实验室检查血常规：本组患儿血常规白细胞均值9.15×10^9/L,白细胞低于4×10^9/L有10例患儿，白细胞高于10×10^9/L有175例患儿。淋巴细胞比例均值37.83%。C反应蛋白均值5.1mg/L,有132例患儿CKMB升高。8.3影像学检查胸片有354例（98.89%）异常，其中斑片状影287例（80.17%），大片浸润影37例（10.34%）,肺纹理增深模糊30例（8.38%），伴肺不张6例（1.68%），伴肺气肿5例（1.40%），伴胸腔积液3例（0.84%）。8.4重症病例358例hBoV阳性患儿中有29例为重症肺炎，重症肺炎患儿平均年龄11.6±0.9月，其中<6月2例（6.90%），6～12月16例（55.17%），1～2岁11例（37.93%），2岁以上没有重症病例；重症患儿春季有5例（17.24%），夏季有12例（41.38%），秋季有9例（31.03%），冬季有3例（10.34%）。重症患儿中3例有基础疾病（1例为运动发育落后、1例为肺纤维化、1例有先天性房间隔缺损）；21例为单纯hBoV感染，8例混合其他病原菌感染：其中4例混合细菌感染（2例卡它布兰汉菌阳性、1例洋葱伯克霍尔德菌阳性、1例肺炎链球菌阳性），2例混合肺炎支原体感染，1例混合RSV病毒感染，1例混合PinfⅢ感染。4例伴有心功能不全，5例伴有呼吸衰竭。12例由PICU转出，1例接受过呼吸机辅助通气2天，所有病例经治疗好转出院，没有死亡病例，中位住院时间9天（3-36天）。8.5临床诊断358例hBoV阳性病例中诊断上呼吸道感染4例（1.12%），支气管炎4例（1.12%），毛细支气管炎3例（0.84%），支气管肺炎288例（80.45%），大叶性肺炎30例（8.38%），重症肺炎29例(8.10%)。8.6转归358例患儿全部好转出院，没有死亡病例，中位住院时间7天（1-36天）。20 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究结果9．hBoV单纯感染与混合感染的比较本组研究中，单纯hBoV感染266例，混合感染92例，混合感染率25.7%；混合感染患儿平均月龄小于单纯感染，P值0.027,差异有统计学意义；单纯感染患儿入院前病程短于混合感染，P值0.043，差异有统计学意义；hBoV单纯感染与混合感染在2喘息、鼻塞和/或流涕方面差异有统计学意义（值分别为6.099、5.714，P值分别为0.014、0.017,均<0.05），在性别、咳嗽、发热、呼吸困难、气促、紫绀、肺部啰音及临床诊断、平均住院日期等方面比较差异均无明显统计学意义（P均>0.05）。见表9。表9hBoV单纯感染与混合感染的比较2临床表现hBoV单纯hBoV混合感染值P值感染n(%)n(%)男性病例180（67.7）63（68.5）0.0210.886咳嗽258（97）92（100）0.119喘息128（48.1）58（63.0）6.0990.014发热171（64.3）49（53.3）3.5070.061鼻塞和/或流涕90（33.8）44（47.8）5.7140.017呼吸困难16（6）4（4.3）0.3600.548气促39（14.7）11（12）0.4160.519紫绀10（3.8）2（2.1）0.738肺部罗音234（88）83（90.2）0.3400.560上呼吸道感染3（1.1）1（1.1）1.000气管肺炎213（80.1）75（81.6）0.2820.595大叶性肺炎22（8.3）8（8.7）0.0160.899重症肺炎24（9）5（5.4）1.1820.277支气管炎4（1.5）0毛细支气管炎1（0.4）2（2.2）0.163平均住院日期8.068.5-1.0010.317平均月龄20.315.82.2160.027入院前病程9.512.1-2.0310.04321 结果苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究10.不同气候因素时hBoV检出率苏州地区2012-2015年月平均气温为（℃）17.4±8.5，月相对湿度为（％）72.7±6.1，月总雨量（mm）为109.0±70.1，月总日照时间（h）为151.6±54.1，月平均风速为2.5±0.4（m/s）。见表。将月平均气温、月相对湿度、月总雨量、月日照总和、月平均风速与月hBoV检出率进行多元线性回归分析，hBoV检出率与月平均气温为中度正相关（r=0.443，P=0.002），与月日照时间（r=0.166，P=0.260）为低度相关，与月平均雨量（r=-0.005，P=0.971）月平均湿度（r=-0.003，P=0.993）、月平均风速（r=0.043，P=0.673）不相关。除气温外，其余气象因素均未入选逐步回归方程，温度与hBoV检出率密切相关(β=0.720，P=0.001)。见表。表102012年-2015年博卡病毒检出率与各气候因素资料年份月份检出率月平均气温月相对湿度月总雨量月日照总和平均风速201210.93%4.37271.684.71.9201223.28%4.17585.377.82201230.47%9.773147.9131.52.3201241.91%187056.5189.42.4201252.90%21.972133.4190.62.2201265.00%25.281110.8136.52.4201278.29%3077154261.52.4201285.19%29.185215.5213.23.4201292.74%23.87492.1185.22.42012103.85%19.76737.3200.1220121110.81%11.970117.614922012125.13%5.77186.1109.22.3201310.98%4.27629.8125.61.7201321.14%6.482113.882.92.4201331.51%11.27082.7175.72.4201343.43%166051.7241.52.6201352.91%21.874126.2178.32.7201362.70%24.681229.3110.22.222 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究结果201376.75%32.36374.7321.52.5201388.72%31.56989256.32.9201397.19%25.26985.7179.92.52013104.35%19.768257.1177.82.420131110.32%13.76219.31651.62013124.65%16.36247.21591.4201410.56%6.56922.1173.12.5201420.90%5.780140.487.13.2201431.09%11.86976.61773201446.70%16.372141.4153.93201453.00%22.26592.5198.83.3201461.10%24.377135.5101.92.8201475.45%27.879124162.72.9201485.65%26.283190.189.22.3201497.79%24.180100.297.932014106.11%206925.4205.62.62014115.49%14.27361.1121.32.42014123.03%5.5619170.82.6201511.04%5.87061.3106.62.4201522.60%6.77386.3100.22.4201530.00%10.874107.4112.32.6201540.57%16.567127.3170.53.1201554.29%21.570126.3155.83.1201560.74%24.580409.587.92.7201577.45%2779166120.32.7201585.78%27.976174.6142.53201594.00%24.47394.5159.12.62015108.09%19.57254.4128.62.32015118.93%13.482120.266.72.52015127.37%7.57473.385.52.323 结果苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究表11气候因素与博卡病毒检出率之间的相关分析和逐步回归分析气候因素Spearman相关分析多元逐步回归分析rs值P值β值P值平均气温0.4430.0020.7200.001相对湿度-0.0080.957-0.0340.869总雨量-0.0050.971-0.3290.066总日照0.1660.260-0.2060.376风速-0.0420.775-0.2050.16424 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究讨论讨论小儿时期常见疾病中呼吸道感染占有极其重要的地位，肺炎仍然是我国5岁以下儿童死亡的第一位死因。呼吸道感染中常见病原菌有细菌、病毒和非典型病原菌。其中病毒感染是引起儿童呼吸道感染的重要病原体之一，常见的引起儿童呼吸道感染的病毒有呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、腺病毒等。近年来随着分子生物学和生物信息学的不断进步，在呼吸道感染患者的呼吸道分泌物中检测出了一些新的病毒，如SARS冠状病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒。人博卡病毒是瑞典科学[2]家Allander于2005年首次从小儿下呼吸道感染分泌物中分离到的一种人细小病毒(Parvovirus)，因为与牛细小病毒（bovinevirus）和犬细小病毒(caninevirus)具有高度的同源性，故命名为人博卡病毒(humanbocavirus，hBoV)。继2005年，Allander首次报道hBoV后，人们都相继报道了人群中hBoV的感染情况，[4][5]意大利报道hBoV的检出率为12.1%，美国的检出率为5.6%,沙特的检出率高达[6][2]22.5%。我国瞿小旺等对2005年10月～2006年1月，湖南郴州市第一人民医院具有呼吸道感染症状的72例住院患儿鼻咽抽吸物标本，检测到hBoV基因片段的存在，检出[7]率为8.3%（6/72）,这是我国关于hBoV的首次报道。我国赵林清等收集了2003年11月到2004年2月这15月期间首都儿研所门诊或住院患儿中排除了7种常见呼吸道病毒感染患儿的急性呼吸道感染患儿319例，检测出hBoV阳性有13例，检出率为4.1%。长[8][9]春地区hBoV的检出率为4.2%（29/691）。广州地区hBoV的检出率7.68％(49／63)，[10][11]重庆地区hBoV检出率为5.3%（21/375）,兰州地区检出率为8.21%（43/524）。我们采用实时PCR的方法检测2012年1月至2015年12月因呼吸道感染住院的8711例患儿鼻咽抽吸物标本,结果为hBoV阳性标本358例，检出率4.11%，四年间检出率没有明显差异。检出率与美国报道基本符合，与国内北京、长春地区相近，与日本、沙特及国内广州、兰州地区的检出率有差异。沙特阿拉伯检出率最高，其收集的是2012年1月～5月份80例住院患儿的鼻咽部分泌物标本，检出hBoV阳性18例，检出率高考虑与收集的病例时间短及样本量少有关。[12]hBoV感染可发生于各年龄段，以6月至2岁儿童感染最多见。国外报道,HBoV的感染人群基本为2岁以下，6个月以上的婴幼儿。但一些大年龄儿童和成人也可以感25 讨论苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究[13]染。日本学者研究发现6岁以下的儿童血清中均能检测到hBoV反应性抗体，可见儿[9]童期hBoV感染比较普遍。我国钟家禹等研究2010年3月～2011年6月广州地区638例住院患儿呼吸道分泌物标本，hBoV阳性49例（7.68%），2岁以下检出率为8.95%，占阳性标本的91.84%，2～4岁的检出率为2.96%，2岁以下检出率高于其它年龄组。赵林清[7]等对北京地区6小时～16岁的儿童进行了hBoV的检测，结果<5月及>5岁的患儿均未检出hBoV，阳性的标本分布的年龄为5月～5岁，其中92.3%（12/13）为2岁及以下的患儿，2岁以下检出率最高。本组研究最小发病年龄1月，最大发病年龄9岁11月，中位年龄13月（1～119月）。其中<6月检出率1.23%，6～12月检出率7.62%，1～2岁检出率8.83%，2～5岁检出率2.78%，≥5岁检出率3.47%，2岁以下占77.38%，6～12月、1～2岁检出率高，考虑与婴幼儿免疫功能发育不完善有关，<6月发病率低考虑与胎传抗体有关，≥5岁发病率低考虑与产生博卡病毒相关抗体有关。Abdel-Moneim等[5][14]研究报道hBoV感染83.3%（10/12）为2岁以下患儿。王娟丽等研究武汉市2014年2月～2015年1月756例急性呼吸道感染住院患儿，检测得出6月～1岁及1～3岁的感染率显著高于其他年龄组。我们研究的结果年龄分布特点为6月～2岁检出率高，与国内外研究相近。本组资料中，男性检出率4.48%，女性检出率3.50%；男、女比例为2.11:1,2[2,7,9,10,11=4.963,P=0.026<0.05,差异有统计学意义，但多数文献报道hBoV感染无性别差异。[15]hBoV所引起的呼吸道感染疾病四季均可发生，美国的Kesebir报道2010年3月至2011年6月15个月期间，研究对象638例，hBoV检测阳性49例，阳性率最高的为6月份9.09%。日本北方有研究认为，hBoV的流行季节是每年的1～5月份（冬春季），高峰[16]是4～5月。在法国流行季节主要是11月到次年的6月（冬春季），高峰期是3～4月[17][18]。我国李亚敏等收集2008年5月至2010年3月，北京市儿童医院重症急性呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物259份，分析得出hBoV分布无明显季节差异，无明显性别差异，[19]无明显地区差异。吴占国等收集2013～2014年北京地区6岁以下儿童呼吸道感染患[20]儿的呼吸道分泌物,研究得出hBoV的检出高峰为每年的8～11月。曹长青等报道兰[21]州地区2009年12月～2010年11月hBoV的检出高峰为5～8月和11～12月。王宇清等研究2010年初至2011年底苏州地区住院喘息性疾病患儿1527例,hBoV检出率5.8%[9]（89/1527），每年的6月到8月为检出高峰。广州地区2010年3月至2011年6月15个月期间，研究对象638例，hBoV检测阳性49例，阳性率最高的为6月份9.09%，3、4、526 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究讨论月亦有较高的检出水平，分别为8.89%、8.70%、7.46%,12月份检出率最低为4.55%。本研究中每月都可检测到博卡病毒感染，阳性率最高的是7月、10月、11月，提示在夏秋季出现检出高峰，12月后检出率下降，3月份检出率最低，仅0.89%，7月又出现一个小高峰6.93%。11月达高峰11.09%。我们研究的hBoV季节分布与美国、日本、法国研究有差异，与国内广州、兰州地区的研究结果相近。说明不同国家及地区，hBoV流行的季节特征不同，我们需要进一步长期、持续的监测来发现hBoV流行的规律。hBoV主要引起呼吸道的感染，本组资料中，hBoV检测阳性患儿诊断为上呼吸道感染（1.12%），支气管炎（1.12%），毛细支气管炎（0.84%），支气管肺炎（80.45%），大叶性肺炎（8.38%），重症肺炎（8.1%）。其中支气管肺炎占的比例最高，考虑与我们的研究对象主要为支气管肺炎的住院患儿有关。hBoV感染的临床表现与其它病毒感染的临床表现相同，没有特异性。多表现为咳嗽、发热、鼻塞流涕、喘息、呼吸困难、气急、紫绀等。本组资料中咳嗽（97.77%）、喘息(51.96%)、鼻塞和/或流涕(37.43%)、发热(61.45%)、气促（13.97%）、呼吸困难（5.59%）、肺部啰音（88.55%）。[15]美国的Kesebir等研究的22例hBoV阳性患儿中，90%流涕，70%发热，50%喘鸣，30%氧供不足，其中的17例做了胸片检查，70.6%有异常。我们的资料中没有引起脑[22]炎的病例，但一份来自孟加拉国的报道,4个严重脑炎的儿童，脑脊液中只检测到人博卡病毒，2个儿童因脑炎死亡，另外2个儿童预后不详，因为父母要求自动出院了，这些博卡病毒脑炎的孩子都存在严重营养不良，说明hBoV感染可导致严重后果。我们的资料中患儿没有死亡病例。国内外均有报道博卡病毒与喘息的相关性，[23]Allander研究425例喘息患儿中，博卡病毒阳性49例（19%），大部分为混合感4染，单纯hBoV感染只有12例（5%），但是单纯hBoV感染的病毒拷贝数都高（＞10），[24]认为hBoV感染与急性喘息有密切相关。邓昱等报道12例hBoV感染的持续喘息患儿中有2例哮喘发作，我们研究hBoV感染的患儿有喘息的185例（51.68%），提示hBoV感染与喘息发作密切相关。hBoV感染可单独存在，也可与其他病毒被共同检出，混合感染率18%-90%，平均[25]42.5%，文献报道hBoV的混合感染常见的共同检出病毒有RSV、hMPV、hRV等，其中最常见的共同检出病毒是RSV。本组资料中混合感染92例，混合感染率25.70%，与其它报道基本相符。其中混合RSV30例（8.38%），混合hRV41例（11.45%），混合PinfⅢ9例（2.51%）混合InfA7例（1.96%）,混合PinfⅠ2例（0.56%），混合InfB227 讨论苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究例（0.56%），混合hMPV1例（0.28%），共同检出最多的是hRV，hRV感染高峰期也是[26]春秋季，11月份检出率最高，与hBoV的检出高峰相近可解释易混合感染的原因。吴[19][27]占国等报道北京地区hBoV混合感染率为18.42%(7/38)。GarciaML等发现呼吸道感染患儿hBoV阳性的为153例，其中混合感染99例，混合感染率高达65%。严华杰等[28]研究认为hBoV混合感染率高与博卡病毒感染后引起呼吸道局部免疫功能失调，而增加了其它病毒感染的机会。在我们研究中，单纯hBoV感染患儿从发病年龄、发热、咳嗽及气促等临床表现及住院时间上与hBoV混合感染均无明显差异（P>0.05），提示[29]hBoV与其他呼吸道病毒混合感染没有加重病情。Maggi等研究认为hBoV感染在呼吸道感染致病机制中起协同作用，hBoV与其它病毒混合感染与hBoV单纯感染相比可能并[30]且会加重。也有人报道hBoV有可能是呼吸道的携带菌而并非就是致病菌。博卡病毒混合感染的致病机制需要进一步的研究来明确。[31]有约旦学者收集312例的急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本，hBoV检测阳性需要住院的患儿57例（18.3%），其中30例（21.7%）有重症呼吸道感染，说明hBoV是可导致重症感染的病原体之一。本研究中358例hBoV阳性患儿中重症肺炎29例，占8.10%，重症肺炎患儿平均年龄11.6±0.9月，其中<6月2例（6.90%），6～12月16例（55.17%），1～2岁11例（37.93%），2岁以上没有重症病例；重症病例春季有5例（17.24%），夏季有12例（41.38%），秋季有9例（31.03%），冬季有3例（10.34%）。重症患儿中4例伴有心功能不全，5例伴有呼吸衰竭，3例患儿有基础疾病（1例为运动发育落后、1例为肺纤维化、1例有先天性房间隔缺损）；8例患儿混合其他病原菌感染，重症患儿年龄均为2岁以下，提示重症患儿有基础疾病、混合其他病原感染、及<2岁可能是发生重症的原因。所有病例经治疗好转出院，没有死亡病例。早期的研究结果表明hBoV感染似乎有季节分布特征，比如在日本hBoV阳性病人1月到5月最多，高峰期在4～5月；在法国11月到次年6月最多，高峰期在3到4月；在具[32]有相似亚热带气候的广州地区，hBoV活动常年存在，高峰期是6月；然而在热带气[33]候的印度hBoV看起来并没有明显的季节分布特征。这些研究表明不同气候的不同地区hBoV流行有不同的季节特征。气候因素可能会影响呼吸道感染性疾病的发生和传[34]播，环境在呼吸道病毒的季节性爆发有一定的作用。本研究连续收集了4年的气象资料，将月平均气温、月相对湿度、月总雨量、月日照总和、月平均风速与月hBoV28 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究讨论检出率进行多元线性回归分析，结果显示hBoV检出率与月平均气温为中度正相关，与月日照时间为低度相关，与月平均雨量、月平均湿度、月平均风速不相关。Zheng-Rong[35]Chen等报道认为hBoV活动同平均温度及相对湿度有很大关联，夏天的温度和相对湿度比其它季节相对要高很多，并且hBoV活动同平均温度之间有一个月的时间滞后效应，和相对湿度之间不存在滞后效应，hBoV活动中高温要比高的相对湿度作用要大。我们的研究在温度的相关性方面与之是一致的。总之，通过本研究发现，hBoV是苏州地区住院儿童呼吸道感染的重要病原之一，hBoV感染在6～12月、1～2岁年龄组的儿童检出率高。hBoV感染全年可检出，其中夏秋季节为检出高峰，平均气温与hBoV的检出率成正相关。hBoV引起的呼吸道感染无特异性的临床表现，且可引起重症肺炎，hBoV存在一定比例的混合感染。作为一种新发现的病毒在急性呼吸道感染中有重要的作用，我们需要继续对hBoV的流行病学进行监测，了解了其流行病学特征，以便更好的指导临床。本研究仍存在不足，首先，研究对象均为住院患儿，尚缺乏门诊患儿的资料；其次，本研究为单中心研究，故并不能完全代表hBoV整体的检出情况，今后仍需纳入门诊患儿的资料及多中心的研究。29 结论苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究结论1．hBoV是引起苏州地区住院儿童呼吸道感染的重要病毒病原体之一，6～12月、1～2岁年龄组检出率高。2．hBoV感染全年散发，夏、秋季节为高峰期。3.hBoV感染后的临床表现无明显特征性。4.hBoV可引起重症感染，多发生于<2岁患儿。5.hBoV存在一定比例的混合感染，常见的病原是hRV和RSV。6.hBoV检出率与月平均气温呈中度正相关。30 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究参考文献参考文献[1胡亚美，江载芳．诸福棠实用儿科学［M］.第8版.北京:人民卫生出版社，2015:631-1199．[2]AllanderT，TamrmMT，EfikssonM，etal.Cloningofahumanparvovirusbymalecatarscreeningofrespiratorytractsamples［J］.ProcNatlAcadSciUSA．2005,102(36)：12891-12896．[3]瞿小旺等,漆正宇，段招军，等．儿童急性呼吸道博卡病毒感染［J］.病毒学报，2006，22(2)：79-82．[4]AlessandraZ，MartaC，ElenaF，etal.Co-circulationofgeneticallydistincthumanmetapneumovirusandhumanbocavirusstrainsinyoungchildrenwithrespiratorytractinfectionsinItaly［J］.JMedVirol，2011，83(1)：156-164..［5］JohnCA，KumudKS，StephenAS，etal.Humanbocavirus：prevalenceandclinicalspectrumatachildren’shospital［J］.ClinInfectDis，2006，43(3)：283-288.［6］Abdel-MoneimAS，KamelMM，Al-GhamdiAS，etal.Detectionofbocavirusinchildrensufferingfromacuterespiratorytractinfectionsinsaudiarabia［J］.PLoSONE，2013，8（1）：e55500.［7］赵林清，钱渊，朱汝南，等.北京地区婴幼儿急性呼吸道感染与新近报道的人细小病毒相关性的初步研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2006,26（5）：385-388.[8]李丽红，高玉堂，孙利炜,等.长春地区儿童急性呼吸道感染人博卡病毒检测及分析［J］.中华儿科杂志，2009,47(2)：146-147.31 参考文献苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究[9]钟家禹，朱冰，谢嘉慧，等.广州地区儿童呼吸道感染人博卡病毒的分子流行病学研究［J］.中华流行病学杂,2012,33(3):346-347.[10]丁媛，赵晓东，陈昕，等.重庆地区儿童呼吸道博卡病毒感染特点［J］.中华儿科杂志，2009,47(6):466-467.[11]曾长青，李宇宁，金玉，等.兰州地区呼吸道感染患儿中人类博卡病毒1～3型检测与临床研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志,2011,25(1):5-7.[12]TuomasJartti,KlausHedman,LauraJartti,etal.Humanbocavirus—thefirst5years[J].ReviewsinmedicalVirology，2012,22(1):46.[13]EndoR,IshiguroN,KikutaH,etal.SeroepidemiologyofhumanbocavirusinHokkaidoprefecture,Japan[J].JClinMicrobiol,2007,45(10):3218–3223.[14]王娟丽，熊诗思，梁敏，等.武汉地区重症急性呼吸道感染住院患儿人博卡病毒感染的流行病学研究[J].中华医院感染学杂志，2016,26（19:）4512-4514.[15]KesebirD,VazquezM，WeibelC，eta1．HumanbocavimsinfectioninyoungchildrenintheUnitedStates：Molecularepidemiologicalprofileandclinicalrharacteristiesofanewlyemergingrespiratoryvirus[J].InfectDis,2006，194(9)：1276—1282．[16]MaX,EndoR,IshiguroN,etal.DetectionofHumanBocavirusinJapanesechildrenwithlowerrespiratorytractinfections[J].JournalofClinicalMicrobiology,2006,44(3):1132–1134.[17]JacquesJ,MoretH,RenoisF,etal.HumanbocavirusquantitativeDNAdetectioninFrenchchildrenhospitalizedforacutebronchitis［J］.JournalofClinicalVirology,2008,43(2):142-147.[18]李亚敏，周为民，王延群，等.重症急性呼吸道感染儿童中人博卡病毒的分型检测与基因进化分析［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2014，28(5)：346-348.[19]吴占国，李爱华，张铁钢，等.北京地区6岁以下儿童急性呼吸道感染病例人博32 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究参考文献卡病毒流行状况分析［J］.疾病监测,2016，31(1):24-28.[20]曹长青,李宇宁，金玉，等.兰州地区呼吸道感染患儿中人类博卡病毒1～3型检测与临床研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2011,25（1）:5-7.[21]王宇清，季伟，严永东，等.1527例喘息住院患儿病毒病原学分析［J］.临床儿科杂志,2012,30(12):1144-1149.[22]MituiMT,TabibSM,MatsumotoT,etal.Detectionofhumanbocavirusinthecerebrospinalfluidofchidrenwithencephalitis[J].ClinInfectDis,2012,54（7）:964-967.[23]AllanderT,JarttiT,GuptaS,etal.Humanbocavirusandacutewheezinginchildren[J].ClinInfectDis,2007,44(7):904–910.[24]邓昱，刘恩梅，赵晓东，等.人类博卡病毒感染的持续喘息患儿临床特点分析[J].中华儿科杂志，2007，45(10)：732—735.[25]陈倩，胡正．人博卡病毒的研究进展[J].中国当代儿科杂志，2010，12(8)：1430—1432．[26]王涛，张兵，肖霓光，等.RSV与HRV在ALRTI住院儿童中的流行状况和临床特征比较[J].湖南师范大学学报(医学版)，2012，9(2):28-32.[27]GarciaML,CalvoC,PozoF,etal.DetectionofhumanbocavirusinillandhealthySpanishchildren:a2-yearstudy［J］.ArchDisChild,2008,28(5):906-912.[28]严华杰,盛军,董蔚，等.90例儿童人博卡病毒感染临床分析[J].中国当代儿科杂志,2011，13(4):300-302.[29]MaggiF，AndreoliE，PifferiM，etal.HumanbocavirusinItalianpatientswithrespiratorydiseases［J］.JClinVirol，2007，38(4):321-325．[30]SchildgenO,MullerA,AllanderT，etal.HumanBocavirus:PassengerorPathogenin33 参考文献苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究AcuteRespiratoryTractInfections?［J］.ClinMicrobiolReviews,2008,21(2):291-304.[31]KaplanNM，DoveW，AhmadF，etal．Humanbecavirusinfectionamongchildren，Jordanl［J］．EmergInfectDis，2006，12(9)：1418-l420.[32]XuL,HeX,ZhangDM,etal.SurveillanceandgenomeanalysisofhumanbocavirusinpatientswithrespiratoryinfectioninGuangzhou,China[J].PLoSONE,2012,7(9):e44876.[33]BharajP,SullenderWM,KabraSK,etal.HumanbocavirusinfectioninchildrenwithacuterespiratorytractinfectioninIndia［J］.JournalofMedicalVirology,2010,82(5):812-816.[34]duPrelJB,PuppeW,GröndahlB,etal.Aremeteorologicalparametersassociatedwithacuterespiratorytractinfections?［J］.ClinInfectDis,2009,49(6):861–868.[35]Zheng-RongChen,MaximillionMize,Yu-QingWang，etal.ClinicalandEpidemiologicalProfilesofLowerRespiratoryTractInfectioninHospitalizedChildrenduetoHumanBocavirusinaSubtropicalAreaofChina［J］.JournalofMedicalVirology,2014,86(12):2154–2162.34 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究综述综述人博卡病毒儿童感染的研究进展何香萍（综述）王宇清（审校）摘要：人博卡病毒是2005年国外学者Allander新发现的一种细小病毒，hBoV分为hBoVl、hBoV2、hBoV3和hBoV4四种类型，hBoVl主要引起呼吸道的感染，hBoV2主要引起胃肠道的感染，博卡病毒的易感人群为6月以上，2岁以下儿童，有较高的混合感染率，全年有发病，不同地区的季节特点有差别。博卡病毒感染的临床表现与其它病毒相比没有明显的特异性。博卡病毒的检测方法有病毒分离培养、PCR、荧光实时定量PCR、血清抗体检测等，检测方法各有优缺点，常需要相互结合，临床上最常规用的是PCR和血清抗体检测。关键词：人博卡病毒；儿童；流行病学；临床特征。一、病原学hBoV属于细小病毒科，细小病毒亚科，博卡病毒属。hBoV测定的氨基酸序列与牛微小病毒氨基酸序列的同源性为42％，与犬类微小病毒氨基酸序列的同源性为43％[1],因有较高同源性,故结合牛微小病毒(bovineparvovirus)和犬微小病毒(canineminutevirus)的前字母命名为博卡病毒（bocavirus)。博卡病毒外观为球状，正20[2]面体，无包膜，直径大约为20nm，其基因组为单链线性ＤＮＡ，长度大约是５ｋｂ。博卡病毒基因序列结果显示，基因组全长为5217—5299bp，包含3个主要的开放读码框（ORFs）：编码结构蛋白VPl和VPl，编码非结构蛋白NSl和NPl，编码NP1蛋白。因VPl[3]有不同的核苷酸序列，hBoV分为hBoVl、hBoV2、hBoV3和hBoV4四种类型，hBoVl主要在呼吸道分泌物中检出，hBoV2主要在肠道标本便中检出，hBoV3及hBoV4在肠道标本中偶尔检出。二、流行病学特征1．发病率[4]继2005年，瑞典学者Allander等首次报道人博卡病毒，随后，人们都相继报道[5-6]了人群中hBoV的感染情况，全球各地儿童hBoV阳性率为1．5％～22.5％，表明博[7]卡病毒的分布呈全球性。意大利报道博卡病毒的检出率为12.1%，美国的检出率为35 综述苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究[8][9][10]5.6%,沙特的检出率高达22.5%，日本的检出率15.5%，澳大利亚博卡病毒阳性率[11]5.6%。[12]瞿小旺等对2005年10月～2006年1月湖南郴州市第一人民医院具有呼吸道感染症状的72例住院患儿鼻咽抽吸物标本，检测到博卡病毒基因片段的存在，这是[13]我国关于该病毒的首次检测报道。我国赵林清等收集了2003年11月到2004年2月这15月期间首都儿研所门诊或住院患儿中排除了7种常见呼吸道病毒感染患儿的急性呼[14]吸道感染患儿319例，检测出博卡病毒阳性有13例，检出率为4.1%。郑田利等收集2009年10月到2013年10月1842例儿童检测发现博卡病毒的感染率为6.84％，与其它呼吸道病毒混合感染率为58.73％。2、易感人群博卡病毒感染包括上呼吸道或者下呼吸道感染。成人博卡病毒感染比较少见，[15]LongtinJ等对126例成人肺炎或慢性支气管炎患者的鼻咽分泌物检测人博卡病毒，[16]结果1例为阳性，仅占0.8%。日本学者研究发现6岁以下的儿童血清中均能检测到博卡病毒反应性抗体，可见儿童期博卡病毒感染比较普遍。hBoV的感染人群基本为2岁以下，6个月以上的婴幼儿，6月以内婴儿博卡病毒感染率低考虑与母传抗体有关。何[17]霞等报道5岁左右博卡病毒的感染率明显下降，与大部分人产生了博卡病毒抗体有[18]关。郑敏巧等用ELISA法检测316例配对母子血清HBoV-IgG抗体，结果孕妇血清hBoV-IgG抗体阳性127例，占40．20％，新生儿脐血IgG抗体阳性93例，占29．43％，93例hBoV-IgG阳性的新生儿其母亲均为血清hBoV-IgG抗体阳性，得出博卡病毒抗体可[19]以通过胎盘传递给新生儿。有研究者对北京地区6h～16岁的儿童进行了博卡病毒的检测，结果<5月及>5岁的患儿均未检出博卡病毒，阳性的标本分布的年龄为5月～5岁，其中92.3%（12/13）为2岁及以下的患儿，易感人群的年龄分布与国外研究相近。3、季节分布[20]博卡病毒所引起的呼吸道感染疾病四季均可发生，Kesebir等研究，在美国425例呼吸道感染患者中，hBoV的检出率为5．2％，检出的时间为每年的开始3个月和[21]最后3个月。在5～8月份（夏季）未发现阳性标本。Sloots等报道，整个冬季都能检测到hBoV，而在初冬感染较为盛行。日本北方有研究认为，博卡病毒的流行季[22]节是每年的1～5月份，高峰是4～5月。在法国流行季节主要是11月到次年的6[23][24-25]月，高峰期是3～4月。而在香港和泰国，流行季节分别是秋季和冬季。我国36 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究综述[26]李亚敏等收集2008年5月至2010年3月，北京市儿童医院重症急性呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物259份，分析得出博卡病毒分布无明显季节差异，无明显性别差异，[27]无明显地区差异。王宇清等研究2010年初至2011年底苏州地区住院喘息性疾病患儿1527例认为，hBoV和PinfIII为夏秋季节引起喘息的主要病原，RSV是冬春季引起喘息的主要病原。4、传播途径迄今hBoV病毒没有明确的传播途径。人博卡病毒大多在呼吸道分泌物标本中被检测出，考虑与其它常见呼吸道病原体一样，空气传播的可能性很大，或者为接触传播。传染源除了患病儿童，也可能为成人或者没有症状的儿童。然而在血清样本、肠道样本及泌尿系样本中也能检测到hBoV，故不能排除血液传播及粪-口传播的可能性，以上可能需进一步研究得以证实。目前为止没有博卡病毒大规模流行的报道。三、混合感染在对hBoV的检测中，hBoV可单独存在，也可与其他病毒被共同检出，而多数时候[28]是与其他病毒被共同检出。博卡病毒的混合感染率达18-90%，平均42.5%。博卡病[29]毒的混合感染常见的共同检出病毒有呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒等，其中最常见的共同检出病毒是呼吸道合胞病毒。有研究指出博卡病毒载量低比博卡病毒载量高的患儿混合感染率高，健康儿童的呼吸道分泌物中也能检测到人博卡病毒，说[30][31]明该病毒存在无症状携带。有研究得出1型人博卡病毒在中国健康献浆人群的血液制品和原料血浆中存在较高流行率,但大多处于低载量流行，病毒载量范265.01×10-3.02×10copies/mL。而单一人博卡病毒感染主要为急性上呼吸道感染患[20]儿，单一博卡病毒所致的下呼吸道感染中，反复喘息和支气管炎是最为常见的疾病。单一感染时病情严重程度与病毒载量的高低呈正相关，而混合感染两者的相关性没有[32]得到证实。四、临床表现特征鼻炎、喉炎、支气管炎、肺炎等是博卡病毒感染引起的常见呼吸道疾病，主要临[33]床表现为发热、流涕、咳嗽、喘息、呼吸困难等，其中下呼吸道感染最常见。白细胞计数大多不高，中性粒细胞比例不高，胸片X线的改变与其他病毒所致的肺炎相比无明显特异性。苏州地区89例感染人博卡病毒的患儿大部分出现咳嗽86例（96.3%），其次是发热50例（56.18%），喘息41例（46.07%），胃肠道症状12例（13.48%），临37 综述苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究[34]床诊断以支气管肺炎为主，占85.38，还有少数诊断为大叶性肺炎、上呼吸道感染、重症肺炎，分别占5.62%、4.49%、4.49%。重症博卡病毒感染者，多为发热、咳嗽、喘息、呼吸困难等呼吸道表现，有低氧血症，但不需要机械通气，没有死亡和ARDS[35][36]病例。一份来自孟加拉国的报道,有4个严重脑炎的儿童，脑脊液中只检测到人博卡病毒，2个患儿因脑炎死亡，另外2个患儿预后不详，因为父母要求自动出院了。这些博卡病毒脑炎的孩子都存在严重营养不良，说明博卡病毒感染可导致严重后果。呼[37]吸道感染主要由hBoVl引起,临床表现没有明显的特异性。YuDeng等报道，高病毒载量的博卡病毒感染可以导致严重下呼吸道感染，持续的喘息。hBoV2主要引起急性[38,39]胃肠病，有研究指出，在人的消化系统中博卡病毒的感染率为2.1%～9%，临床表现为恶心、呕吐、腹泻等。五、致病机制博卡病毒感染支气管内膜后,不仅在细胞内产生明显的局灶性细胞病变，而且在[40]其细胞核内增殖，能够导致细胞发生特征性生物学改变，支气管内膜上皮细胞对博[41,42]卡病毒有较高的敏感性。很多的研究报道博卡病毒具有致病性，但是有部分研究[43]称博卡病毒与其它病毒混合感染时并不会加重患者的症状，而且正常人群中也有博卡病毒的高阳性检出率,所以博卡病毒是否是定植菌，或者即便有致病性，但是否需要其它病原菌的辅助作用，需要进一步的研究支持。hBoV-IgG抗体可从孕母的胎盘传给新生儿，但人博卡病毒母婴垂直传播是否存在，目前没有相关报道。[44]Zhang等利用hBoV克隆载体转染细胞，发现hBoV能明显抑制多聚脱氧腺-胸苷酸和仙台病毒诱导的IFN-β生成，并证实是非结构蛋白NP1发挥了重要的作用。[45]我国学者Huang等研究报道，利用构建的感染性克隆pIHBoV感染具有极性的呼吸道上皮细胞后，能明显看到呼吸道上皮细胞发生细胞肿胀，细胞连接破坏，绒毛减少等病理改变。六、检测方法1、病毒分离培养法由荷兰学者首次培养成功，在立体培养的呼吸道上皮中培养出hBoV1，能最大程[46]度模仿人气管上皮细胞的分化。感染性克隆和反向遗传学技术及博卡病毒成功的体外培养，为研究其致病性提供了技术基础。2、多聚酶链式反应技术（PCR）38 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究综述PCR是通过体外酶促合成特异性的DNA。具有敏感、快速的优点，是临床上博卡病毒检测的最常用的方法，也逐渐成为病毒检测的金标准。可以检测出博卡病毒的四个[47]基因型，hBoV4就是这个检测方法发现的。3、荧光实时定量PCR[48]Lu等人在2006年针对NS1和NP1建立Taqman探针real-timePCR技术。与传统PCR相比，对PCR反应可以实时监控，可以检测出博卡病毒的病毒量，灵敏度高，特异性更强，操作时间短（2-3小时），自动化，减少污染及假阳性。可作为博卡病毒的早期快速诊断方法，有助于了解感染程度，指导医生合理用药，缺点是成本高。向蕾等[49]用实时荧光定量RT-PCR建立快速检测人呼吸道合胞病毒、人博卡病毒、人腺病毒、人偏肺病毒等四种呼吸道病毒的方法，研究得出荧光RT-PCR对临床样本检验的特异性为100％，此体系可快速、准确地检测人呼吸道合胞病毒、人博卡病毒、人腺病毒、人偏肺病毒等四种呼吸道病毒,且重复性较好。4、间接酶联免疫吸附实验（间接ELISA法）利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体。具有快速、灵敏、简便，载[50]体易于标准化等优点。林峰等收集40例来自温州医学院附属温岭医院儿科因下呼吸道感染住院患儿的临床血清标本,用荧光定量PCR检测出hBoV阳性2例,用间接ELISA法检测出hBoV抗体阳性2例，两种方法检测出的结果是一致的，说明ELISA法检测HBoV[51]抗体具有一定可靠性.李玲等收集714例因下呼吸道感染在苏州儿童医院住院的患儿为研究对象，用ELISA法检测血清中hBoV特异性lgG、IgM抗体，实时荧光定量PCR法检测血清、痰液及肺泡灌洗液中hBoVDNA。以血清和(或)肺泡灌洗液DNA检测结果为评价标准，分析得出hBoV血清抗体、痰液hBoVDNA检测结果与评价标准具有高度一致性，且检出率优于评价标准。血清抗体产生以后的滴度在体内2～3周有一个动态变化的过程，所以双份血清检测更有意义。博卡病毒感染后有较长时间的低载量病毒存在，PCR能检测出，但不能认为是急性感染，间接ELISA法可以弥补这一缺点，而有些感染早期血清抗体还没有来得及产生或滴度不高，但实时定量PCR检测病毒载量高，说明还是存在明确的感染。所以PCR技术与血清学抗体检测结合更能提高检测的准确率。七、小结人博卡病毒是2005年国外学者Allander新发现的一种细小病毒，目前国内外在人39 综述苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究博卡病毒的分子生物学及流行病学方面的研究已取得一定的成就。hBoV１可以引起呼吸系统病变，hBoV2主要引起消化系统的病变。博卡病毒主要感染人群为6月以上，2岁以下的婴幼儿，博卡病毒混合感染率较高，不同国家及地区博卡病毒流行的季节特征不同。目前为止没有博卡病毒大规模流行的报道。博卡病毒感染的临床表现没有明显的特异性,其致病机制尚不明确，有待于进一步研究。检测手段主要有多重PCR和间接ELISA法，方便、快捷、技术成熟。荧光实时定量PCR可作为博卡病毒的早期快速诊断方法。博卡病毒感染病程自限，尚没有特效的抗病毒药物，治疗方面有待于进一步研究。参考文献[1]McIntoshK.Humanbocavirus:developingevidenceforpathog-enicity[J].JInfectDis，2006，194（9）：1197-1199.［2］LusebrnkJ,SchilddgenV,TillmannRL,etal.Detectionofhead-to-tailDNAsequencesofhumanbocavirusinclinicalsamples[J].PLoSOne,2011，6(5):e19457.[3]崔换弟，金玉，谢广成，等．人博卡病毒1型的近似全基因组扩增及HBoVl-4重组分析[J]．中华实验和临床病毒学杂志，2014，28(1)：28—31．[4]AllanderT，TamrmMT，EfikssonM，etal.Cloningofahumanparvovirusbymalecatarscreeningofrespiratorytractsamples[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005,102(36)：12891-12896．[5]Kimjs，LimCS，KimYK，etal．Humanbocavirusinpatientswithrespiratorytractinfection[J].KoreanJLabMed，2011，3l(3)：179—184．[6]BezerraPG，BrittoMC，CorreiaJB，etal．Viralandatypicalbacterialdetectioninacuterespiratoryinfectioninchildrenunderfiveyears[J].PLoSOne，201l，6(4)：e18928．［7］AlessandraZ，MartaC，ElenaF，etal.Co-circulationofgeneticallydistincthumanmetapneumovirusandhumanbocavirusstrainsinyoungchildrenwithrespiratory40 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究综述tractinfectionsinItaly［J］.JMedVirol，2011，83（1）：1423-1430.［8］JohnCA，KumudKS，StephenAS，etal.Humanbocavirus：prevalenceandclinicalspectrumatachildren’shospital［J］.ClinInfectDis，2006，43(3)：283-288.［9］Abdel-MoneimAS，KamelMM，Al-GhamdiAS，etal.Detectionofbocavirusinchildrensufferingfromacuterespiratorytractinfectionsinsaudiarabia［J］.PLoSONE，2013，8（1）：e55500.［10］NaokoK，ShinobuT，MikiK，etal.Detectionofhumanbocaviruses1to4fromnasopharyngealswabsamplescollectedfrompatientswithrespiratorytractinfections［J］.JClinMicrobiol，2012，50（6）：2118-2121.［11］SlootsTP，McErleanP，SpeicherDJ，etal.EvidenceofhumancoronavirusHKU1andhumanbocavirusinAustralianchildren［J］.JClinVirol，2006，35（1）：99-102.［12］瞿小旺等,漆正宇，段招军，等.儿童急性呼吸道博卡病毒感染［J］.病毒学报，2006，22(2)：79-82．[13]赵林清，钱渊，朱汝南，等.北京地区婴幼儿急性呼吸道感染与新近报道的人细小病毒相关性的初步研究［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2006,26（5）：385-388.[14]郑田利，董泽芬，周玲旭，等.成都地区2009-2013年儿童人博卡病毒感染分析［J］.中国公共卫生，2016,32（1）：42-44.[15]LongtinJ,BastienM,GilcaR,etal.Humanbocavirusinfectionsinhospitalizedchildrenandadult［J］.EmerginginfectiousDiseases,2008,14(2):217-221.[16]EndoR,IshiguroN,KikutaH,etal.SeroepidemiologyofhumanbocavirusinHokkaidoprefecture,Japan［J］.JournalofClinicalMicrobiology,2007,45(10):3218–3223.[17]何霞，曹开源.人博卡病毒在中国的流行现状[J].病毒学报，2013,29(1):56-63.41 综述苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究[18]郑敏巧，林峰，郑美云，等.人博卡病毒母婴感染的临床前瞻性研究[J].中华实验和临床病毒学杂志，2007,21（4）:331-333.[19]赵林清，钱渊，朱汝南，等.北京地区婴幼儿急性呼吸道感染与新近报道的人细小病毒相关性的初步研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2006,26（5）：385-388.[20]KesebirD,VazquezM，WeibelC，etal.HumanbocavirusinfectioninyoungchildrenintheUnitedStates：Molecularepidemiologicalprofileandclinicalrharacteristiesofanewlyemergingrespiratoryvirus[J].InfectDis,2006,194(9)：1276—1282．[21]SlootsTP,McerleanP,SpeicherDJ,etal.EvidenceofhumanCoronavirusHKU1andhumanbocavirusinAustralianchildren[J].JClinVirol,2006,35(1):99-102.[22]MaX,EndoR,IshiguroN,etal.DetectionofHumanBocavirusinJapanesechildrenwithlowerrespiratorytractinfections[J].JClinMicrobiology,2006，44(3):1132–1134.[23]JacquesJ,MoretH,MotteJ,etal.HumanbocavirusquantitativeDNAdetectioninFrenchchildrenhospitalizedforacutebronchitis[J].JournalofClinicalVirologytheOfficialPublicationofthePanAmericanSocietyforClinicalVirology,2008,43(2):142–147.[24]IpM,NelsonEA,CheukES,etal.PediatrichospitalizationofacuterespiratorytractinfectionswithHumanBocavirusinHongKong[J].JClinVirol,2008,42(1):72–74.[25]ChieochansinT,SamransamruajkitR,ChitinimitkulS,etal.Humanbocavirus(HBoV)inThailand:clinicalmanifestationsinahospitalizedpediatricpatientandmolecularviruscharacterization[J].JournalofInfection,2008，56(2):137–142.[26]李亚敏，周为民，王延群，等.重症急性呼吸道感染儿童中人博卡病毒的分型检测与基因进化分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，2014，28(5)：346-348．[27]王宇清，季伟，严永东，等.1527例喘息住院患儿病毒病原学分析[J].临床儿科杂志,2012,30(12):1144-1149.[28]FryAM，LuX，ChiunganpitchM，etal.Humanbocavims：anovelparvovirus42 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究综述epidemiologicallyassociatedwithpneumoniarequiringhospitalizationinThailand[J]．JournalofInfectiousDiseases，2007，195(70)：1038—1045．[29]陈倩，胡正.人博卡病毒的研究进展[J]．中国当代儿科杂志，2010，12(8)：1430—1432．[30]赵百慧，王春，腾峥，等.儿童下呼吸道人类博卡病毒感染的病毒载量和疾病严重程度相关性研究[J].检验医学,2013，28(7):1016-1020.[31]李红学.人博卡病毒在健康献浆人群中的基因组和血清学抗体流行情况研究[D].北京：北京协和医学院，2014:1-52.[32]王婷，李昌崇，陈晓芳，等．急性喘息患儿人博卡病毒的检出及病毒载量与疾病严重程度的相关性[J]．中国实用儿科杂志，2012，27(8)：608—611.[33]林广裕，朱玲,林创兴，等.粤东地区细支气管炎患儿中人偏肺病毒和人博卡病毒的检出[J]．中华儿科杂志，2009，47(4)：306—307.[34]利蓓荃，季伟，蔡利红，等.2009-2010年苏州地区博卡病毒感染住院患儿临床特征分析[J].临床儿科杂志,2012，30(8):753-756.[35]顾凤珍，柏振江，谢敏慧，等.2009—2010年苏州地区儿童重症人类博卡病毒肺炎的流行病学及临床特点[J].实用儿科临床杂志，2011,26（22）:1728-1730.[36]MituiMT,TabibSM,MatsumotoT,etal.Detectionofhumanbocavirusinthecerebrospinalfluidofchidrenwithencephalitis[J].ClinicalInfectiousDiseases,2012,54（7）:964-967.[37]YuDeng，XiaoyangGu，XiaodongZhao，etal.HighViralLoadofHumanBocavirusCorrelateswithDurationofWheezinginChildrenwithSevereLowerRespiratoryTractInfection[J].PlosOne,2012,7(3):e34353.［38］AlbuquerqueMCM，RochaLN，BenatiFJetal.Humanbocavirusinfectionin43 综述苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究childrenwithgastroenteritis［J］.EmergingInfectiousDiseases，2007，12(11)：1756-1758.［39］NatalieB，GayB，SegondyM，etal.Electronmicroscopyobservationofhumanbocavirus（HBoV）innasopharyngealsamplesfromHBoV-infectedchildren［J］.JClinMicrobiol，2007，45（10）：3419-3420.[40]林峰，滕灵方，郑美云,等.利用人支气管上皮细胞系分离和培养人博卡病毒［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2009,23（6）:437-439.[41]DengX,YanZ,LuoY,etal.Invitromodelingofhumanbocavirus1infectionofpolarizedprimaryhumanairwayeplthella[J].JVirol,2013,87(7):4097-4102.[42]MaggiF，AndreoliE，PifferiM，etal.HumanbocavirusinItalianpatientswithrespiratorydiseases［J］.JClinVirol，2007，38(4):321－325．[43]SchildgenO,MullerA,AllanderT，etal.HumanBocavirus:PassengerorPathogeninAcuteRespiratoryTractInfections?［J］.ClinMicrobiolReviews,2008,21(2):291-304.[44]ZhangZ，ZhengZ，LuoH，etal.HumanbocavirusNP1inhibitsIFN-βproductionbyblockingassociationofIFNregulatoryfactor3withIFNBpromoter［J］.JournalofImmunology，2012，189(3):1144-1153．[45]HuangQ，DengX，YanZ，etal.Establishmentofareversegeneticssystemforstudyinghumanbocavirusinhumanairwayepithelia［J］.PLoSPathogens，2012，8(8):e1002899．[46]DijkmanR,KoekoekSM,MolekampR,etal.Humanbocaviruscanbeculturedindifferentiatedhumanairwayepithelialcells[J].JVirol,2009,83(15):7739-7748.[47]KapoorA,SimmondsP,SlikasE,etal.Humanbocavirusesarehighlydiverse,dispersed,recombinationprone,andprevalentinentericinfections[J].JInfect44 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究综述Dis,2010,201(11):1633-1643.[48]LuX,M.Chittaganpitch,SJOlsen,etal.Real-timePCRassaysfordetectionofbocavirusinhumanspecimens[J].JournalofClinicalMicrobiology,2006,44(9):3231–3235.[49]向蕾，陈仕菊,王昕，等.实时荧光定量RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究[J].热带医学杂志,2014,14(4):461-465.[50]林峰，滕灵方，郑敏巧，等.检测人博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附法的建立及临床应用[J].中华生物医学工程志,2010,16(4):359-362.[51]李玲,王关娟,严永东,等.血清特异性抗体检测在儿童急性下呼吸道人博卡病毒感染诊断中的应用[J].中华儿科杂志,2014,52（5）:378-382.45 英文缩略词表苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究英文缩略词表(按英文字母顺序)英文缩写英文全称中文全称HBoVHumanbocavirus人类博卡病毒ADVAdenovirus腺病毒cDNAcomplementarydeoxyribonucleic互补脱氧核糖核酸DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二己酯DNADeoxyribonucleic脱氧核糖核酸dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸DTTDithiothretol二硫苏糖醇hMPVHumanmetapneumovirus人类偏肺病毒hRVhumanrhinovirus人类鼻病毒InfInfluenzavirus流感病毒mRNAMessagerribonucleicacid信息核糖核酸PBSSulfatedderivativesofsialicacid磷酸盐缓冲液PinfParinfluenzaviruses副流感病毒PCRPolymersechianreaction聚合酶链反应RNARibonucleicacid核糖核酸RNasinRibonucleaseinhibitor核酸酶抑制剂RSVRespiratorysyncytialvirus呼吸道合胞病毒RT-PCRReverse-transcriptionpolymersechian逆转录-聚合酶链反应reactionTaqThermusaquaticus水生栖热菌46 苏州地区住院儿童呼吸道人类博卡病毒感染的流行病学及临床研究致谢致谢值此论文完成之际，献上我最真诚的敬意和谢意！感谢我的导师王宇清教授对我的悉心教导！从选题到论文的撰写、修改都凝集着王老师的心血与汗水，他求实的科研作风、渊博的学识、求精的治学态度、以及高尚的人格魅力为我树立了榜样，让我终生受益！导师之恩我会一直铭记在心！衷心感谢呼吸科郝创利主任、季伟主任、严永东主任、刘继贤主任、范丽萍主任、陆燕红主任及孙慧明、戴银芳老师的热情帮助！衷心感谢研究生周丹、周进进、黄圆美、陶会、武敏对我的热情帮助！衷心感谢昆山市第三人民医院的院领导及儿科同事们的支持与帮助！衷心感谢我的家人对我工作的理解、支持和鼓励！衷心感谢苏州大学及附属儿童医院所有关心和帮助我的老师和朋友们！47 苏州大学同等学力人员硕士学位论文（学术学位）ｈ－－