福州地区儿童急性呼吸道人类偏肺病毒感染

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果福州地区儿童急性呼吸道人类偏肺病毒感染【摘要】目的探讨人类偏肺病毒在福州市冬春季儿童急性呼吸道感染中的流行情况及其临床意义。方法6例年龄8个月～14岁ARTI患儿的咽拭子，用巢式逆转录聚合酶反应的方法检测脱落细胞的HMPV的M基因、呼吸道合胞病毒的N基因。结果HMPV阳性19例(%)，RSV阳性11例；其中3例HMPV与RSV均阳性。DNA测序显示，3份HMPVPCR产物核苷酸序列相同，与GenBank中的HMPVM基因片段核苷

2、酸序列同源性88%～98%。结论HMPV是引起福州市儿童ARTI的常见病原之一。HMPV可与RSV合并引起ARTI。【关键词】人类偏肺病毒呼吸道合胞病毒呼吸道感染急性病序列分析DNA福州呼吸道病毒是引起小儿急性呼吸道感染的常见病原。传统的呼吸道病毒有呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒等，约1/3患者的感染病原不明。XX年，荷兰科学家发现一种新的可引起人类呼吸道感染的副黏病毒人类偏肺病毒[1]。目前HMPV已被认为是导致婴幼儿以及成人ARTI的重要病原。HMPV存在的两种基因型均能导致ARTI[24]。为探讨HMPV与福州市儿童A

3、RTI的关系，笔者对福州市ARTI患儿进行了HMPV的检测。1对象和方法课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果对象XX年12月～XX年4月因ARTI就诊的患儿，选择发病主要试剂及材料病毒核酸提取试剂盒(MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit)、ExTaqDNA聚合酶为日本TaKaRa公司产品。A3500逆转录试剂盒为美国Prom

4、ega公司产品。HMPVM基因引物由香港中文大学PaulKSChan教授惠赠。RSVN基因引物参考文献[6]设计，大连宝生物工程公司合成，引物序列见表1。表1HMPV与RSVRTPCR引物的寡核苷酸序列HMPV:人类偏肺病毒;RSV：呼吸道合胞病毒;RTPCR:逆转录聚合酶链反应；W:T或A.病毒核酸提取及逆转录采集每例患儿咽拭子1份，将采集的咽拭子置入装有无菌生理盐水的EP管中洗涤。按照病毒核酸提取试剂盒及逆转录试剂盒说明书操作。聚合酶链反应巢式PCR扩增HMPVM基因。PCR反应体系50μL含dNTP/L，Mg2+/L，DNA模板200ng，ExTaq

5、DNA聚合酶。用Hema40基因扩增仪进行PCR反应。第1次PCR：引物P1，P2各1μmol/L；反应条件：9℃min→9℃0s→5℃0s→7℃0s，扩增40个循环；7℃延伸10min。第2次PCR：取第1次PCR反应产物1μL，引物P3，P4各0.μmol/L；反应条件：9℃min→95℃0s→5℃0s→7℃0s，扩增40个循环；7℃延伸min。扩增产物为43bp。PCR扩增RSVN基因。引物P5，P6各1μmol/L，其余成分同上。反应条件：9℃min→9℃0s→50℃0s→7℃0s，扩增40课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在

6、一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果个循环；7℃延伸10min。扩增产物为27bp。PCR扩增产物用含0.μg/mL溴化乙啶的%琼脂糖凝胶电泳检测。对2种病毒各取3份阳性PCR扩增产物送大连宝生物公司做DNA测序。统计学处理用SPSS软件进行χ2检验。核苷酸序列同源性及系统进化树比较用DNAMAN软件。结果.1PCR扩增琼脂糖凝胶电泳显示19份(%)HMPVM基因扩增产物在43bp处出现清晰条带。11份(%)RSV

7、N基因扩增产物在27bp处出现清晰条带，其中3份标本2种病毒同时阳性。1，2：呼吸道合胞病毒；M:100bpDNAmarker；3，4：人类偏肺病毒.图1HMPVM基因与RSVN基因PCR产物电泳图(%琼脂糖)Fig1ElectrophoretogramforthePCRproductsofHMPVMandRSVNgenes(%agarose).2PCR产物核苷酸序列测定与分析随机选取3份HMPVM扩增产物进行核苷酸序列测定，结果见图2。3份扩增产物的核苷酸同源性为100%。将其命名为FZ，并已登陆GenBank(AccessionNo:DQ)。课题份量和难易

8、程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，