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学校代码：10663学号：4201310000530贵州师范大学硕士学位论文盘锦地区呼吸道感染病毒病原检测及分离DetectionandIsolationofARIVirusPathogeninPanjinArea专业名称:生物化学与分子生物学专业代码:071010研究方向:应用生物化学申请人姓名:那永东导师姓名:乙引教授2017年6月11日 目录摘要..........................................................IABSTRACT...........................................................II第一章前言...................................................................11国内外研究现状..........................................12本研究的目的和意义......................................4第二章盘锦地区急性呼吸道感染病毒Real-timePCR检测方法的建立及流行病学调查..................................................................61材料与方法..............................................61.1实验材料...........................................61.2研究方法...........................................72实验结果...............................................103讨论...................................................20第三章盘锦地区流感病毒的分离...........................................211材料与方法.............................................211.1实验材料..........................................211.2研究方法..........................................222结果...................................................263讨论...................................................31第四章总结.................................................32参考文献....................................................33攻读硕士期间发表论文........................................37 致谢.......................................................38原创性声明..................................................39关于学位论文使用授权的声明..................................40 摘要急性呼吸道感染（AcuteRespiratoryInfections，ARI）是急性感染性疾病及其死亡病例的主要原因，是全球范围内的公共卫生问题。ARI可由多种病原微生物引起，其中，病毒是引起ARI的主要病原体。因此，开展ARI病原检测和分离，对于ARI流行趋势的监控以及预防、控制都具有重要的现实意义。本研究以2013年4月-2014年3月期间盘锦地区ARI患者咽拭子样品作为实验材料，进行病毒病原检测，分析其构成，对新发传染病流行征兆、重大传染源、早期病例等进行预判，以避免突发公共卫生事件的发生。研究结果如下：1、采用核酸提取、荧光定量PCR方法，对ARI患者咽拭子样品856份进行流感病毒(H1N1、H3N2、IVB)、合胞病毒（RSV）、副流感病毒(PIV1、PIV2、PIV3)、腺病毒(AdV)、偏肺病毒(MPV)、鼻病毒（HRV）检测，表明：（1）流感病毒、副流感病毒、鼻病毒和腺病毒是本地区引起ARI的主要病毒病原体，其阳性样品检出率分别为72.38%、5.71%、6.67%和10.48%；（2）在流感病毒阳性样品中，检出H1N1型67株、H3N2型9株，分别占阳性样品检出率的88.16%和11.84%，但未检出乙型流感病毒流感病毒；2、在2013-2014年，盘锦地区流感病毒的流行存在以下规律：冬季为高发期，夏季最低；发病年龄主要集中在5-14岁年龄组，而25-59岁组最低；以散发病例为主，未见流感爆发疫情，其中，新甲型H1为优势流行株，H3N2亚型少量出现。3、通过对盘锦地区流感病毒的MDCK细胞病毒分离和鸡胚病毒分离比较，发现流感病毒对鸡胚的敏感性仍然弱于MDCK细胞分离，但是在流感病毒疫苗生产中不能直接使用MDCK细胞分离病毒，因此需要将一次MDCK细胞分离和鸡胚分离要时进行，由此分离出的毒株可送国家流感中心用于试剂的制备和疫苗生产。综上所述，通过对盘锦地区2013年4月-2014年3月期间呼吸道感染病毒病原进行采样，利用分子生物学检测方法对病原微生物进行检测及分离，初步掌握本地区呼吸道感染病例样本中主要病毒种类及发病规律，并建立了MDCK细胞分离和鸡胚分离合并使用的流感病毒分离方法。本文研究结果为临床上医师用药、疫苗研制、突发公共卫生事件预警、指挥决策和现场处理提供一定科学依据。关键词:急性呼吸道感染；实时荧光定量PCR；病毒分离I ABSTRACTAcuterespiratoryinfections(ARI)iscurrentlythemaincauseofdeathofacuteinfectiousdiseasesinChinaandaroundtheworld.Ithasbecomeaglobalpublichealthproblem.ARIcanbecausedbyavarietyofpathogenicmicroorganisms,inwhichthevirusisthemaincauseofARIpathogens.Therefore,carryingoutARIpathogensdetectionandseparationhasimportantpracticalsignificanceforARIepidemicmonitoringandprevention.Inthisstudy,thepharyngealswabsamplesfromARIpatientsinPanjinareafromApril2013toMarch2014wereusedasexperimentalmaterialstoanalyzetheviruspathogens,andtheepidemiologicalsignsofnewinfectiousdiseases,majorinfectiousdiseasesandearlycaseswereanalyzedandprejudgedtoavoidsuddenpublichealthevents.Theresultsareasfollows:1.Byusingnucleicacidextractionandquantitativereal-timePCRmethods,856throatswabssamplesfromARIpatientsweredetectedforinfluenzavirus(H1N1,H3N2,IVB),syncytialvirus(RSV),parainfluenzavirus(PIV1,PIV2,PIV3),adenovirus(AdV),partialpulmonaryvirus(MPV)andRhinovirus(HRV).Theresultsindicatedthat:(1)Influenzavirus,parainfluenzavirus,rhinovirusandadenoviruswerethemainpathogenscausingARIinthisregion.Thepositiveratesofthemwere72.38%,5.71%,6.67%and10.48%respectively.(2)67strainsofH1N1and9strainsofH3N2weredetectedfrompositivesamplesofinfluenzavirus,accountingfor88.16%and11.84%ofthepositivesamplesrespectively,butnoinfluenzaBviruswasdetected.2.In2013and2014,theprevalenceofinfluenzavirusinPanjinareawasthefollowing:winterwasthehighestincidenceandlowestinsummer.Theageofonsetwasmainlyintheagegroupof5-14yearsold,andthelowestinthe25-59agegroup.Mainlysporadiccases,noepidemicoutbreakofinfluenza,andthenewH1N1wasthepredominantstrain,whileH3N2subtypelessappeared.3.ThroughcomparingtheMDCKcellisolationandchickenembryoisolationoftheinfluenzavirusinPanjinarea,itwasfoundthattheviruseswerestilllesssensitivetochickenembryothantoMDCKcells.However,MDCKcellscannotbeuseddirectlyforvirusisolationininfluenzavirusvaccineproduction.So,MDCKandchickenembryoisolationneedtobeusedincombinationandtheisolatedstrainsbesubmittedtonationalinfluenzacenterforvaccineproduction.II Insummary,byusingmolecularbiologymethod,viruspathogensweredetectedandanalyzedforsamplesfromAIRpatientsinPanjinareafromApril2013toMarch2014,andthemainvirusesinsamplesandtheiroccurrenceregularitywerepreliminarilyunderstood.Also,aninfluenzavirusisolationmethodincombinationofMDCKandchickenembryowasdeveloped.Theresearchresultsprovidedsomescientificbasisforclinicdrugtreatment,vaccinepreparation,precautionofsuddenpublichealthevents,decisionandon-sitetreatment.Keywords:Acuterespiratoryinfections,quantitativereal-timePCR,virusisolationIII 第一章前言1国内外研究现状病毒性呼吸道感染是全世界主要的公共卫生问题，世界范围内流行，容易传播，具有相当大的发病率和死亡率，影响到所有年龄段的人群，其中急性期病毒性呼吸道[1]感染是儿童期最常见的感染。呼吸道病毒引起的疾病包括感冒、咽炎、咳嗽、细支气管炎、病毒性肺炎和中耳炎等。快速诊断不仅对于及时的治疗干预很重要，也有助[2]于鉴定初始流行性感冒和避免不必要的抗生素治疗。急性毒性呼吸道感染5岁以下儿童最常见的感染性疾病，占儿科医院入院率的30-50%，儿童住院率为20-40%，冬季和春季初期呼吸道感染群集中。主要的病毒包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人腺病毒、甲型和乙型流感病毒。此外，新呼吸道病毒持续增加，如最近确定的人类偏[3]肺病毒（HMPV）和人类博卡病毒（HBoV）。下毒性呼吸道感染已被归类为具有特定临床、放射学、病因学特征的大叶肺炎和[4]细支气管炎。病毒性感染是下毒性呼吸道感染的首要特征，常被误诊为细菌感染，[5]而被使用了不必要的抗生素进行治疗。1.1呼吸道合胞病毒（RSV）[6]60%-70%1岁以下的儿童感染RSV（2%-3%住院），RSV预计在全球5岁以下儿童中将会感染3380万例急性呼吸道疾病，2005年入院人数为2.8-430万人，死亡人[7]数为2000-66000人。大多数感染的婴儿都会产生上呼吸道症状，但20%-30%会出现[8]下毒性呼吸道感染（细支气管炎和/或肺炎）。细支气管炎经常与人类鼻病毒共感染。疾病的症状和体征包括呼吸急促、咳嗽和喘息；增加严重下毒性呼吸道感染风险合并因素包括早产儿、复杂性先天性心脏病、早产儿慢性肺疾病、免疫缺陷和免疫抑制治疗。RSV感染潜伏期为2-8天，4-6天最为常见。大约在二十年前，大量的RSV感染[9]患者出现，使得越来越多的人认识到RSV。有关老年人监测研究发现，约有5%-10%[10]的养老院每年均出现RSV感染；据估计，RSV在美国每年造成多达10000人死亡，[11]大多数在老年人群中。然而，RSV感染不能临床上与老年或高危患者的流行性感冒[12]或其他呼吸道病毒疾病区分开。1.2腺病毒（ADV）[13-14]腺病毒科有6个亚组（A到F）和51个感染人类的血清型。人腺病毒（HAdv）[15]的各种血清型可能引起广泛的呼吸道症状，如上呼吸道感染、细支气管炎或肺炎。此外，肺外症状如结膜炎、胃肠炎、脑膜炎、脑炎、急性出血性膀胱炎或肾小管间质[16-19][20]性肾炎也可能是其感染引起的。此外，载体状态可以携带病毒长达906天，续存在的常见部位包括腺样体和淋巴细胞，但是这种现象的意义目前是未知的。潜伏期[21]通常在4-8天之间，但已被证明最长可达10天。在医院、养老院中心和学校等人口1 密集地区，HAdv可以通过各种途径传播，包括液滴、不正确消毒的医疗设备、口服[22]和自动接种等。在美国，流行病学研究表明：1-5%的呼吸道感染是由HAdv引起的。[23]除了发烧外，呼吸道感染患者常常伴有咽炎、流涕和咳嗽。咽喉HAdv感染与细菌感染几乎无法区分，并且通常具有与链球菌性咽炎相关的特征，例如发烧、扁桃体渗[24]出物（多达52%的儿童）和白细胞增多症。除了上述呼吸道症状外，还可以观察到伴随的非呼吸道症状，如不适、肌痛、结膜炎和腹痛。1.3鼻病毒（RHV）鼻病毒是人类空气传播上呼吸道感染的最常见原因。研究发现遗传重组是鼻病毒物种多样化的重要原因之一。虽然已经报道了鼻病毒中的新兴谱系，但尚未研究其种群结构。完整基因组序列的测定有助于研究其种群结构、遗传多样性和潜在进化力，如：突变、重组和选择压力。使用基于群体遗传学方法分析鼻病毒的完整基因组，可将其分为七种基因亚群。其中鼻病毒-A和-C群分别分为四个和两个亚群。遗传上，发现鼻病毒B群体是稳定的。观察到种内重组在鼻病毒A和C物种中是多变的。突出的阳性选择似乎是导致新的谱系出现主要原因，特别是在鼻病毒A。总之，鼻病毒种群是七个不同谱系的整体。在鼻病毒A的情况下，种内重组和发作阳性选择有助于其进一步多样化；在鼻病毒C的情况下，种内和种间重组是其物种多样性的原因。群体遗传学方法有助于进一步分析与重组菌株相关的系统发育拓扑树，特别是当使用完整基因组衍生树时。了解人口结构是设计新疫苗和药物的基础，也有利于解释亚群之间抗药性的出现。鼻病毒感染上呼吸道和下呼吸道并引起人类感冒，虽然普通感冒本质上[25-26][27][28]相对温和，但却是全球性社会经济负担。鼻病毒也与肺炎、囊性纤维化、支[29][30][31][32]气管炎、慢性阻塞性肺病、哮喘和婴儿眩晕疾病等严重呼吸道疾病有关。鼻病毒的遗传多样性归因于高突变率，这是由于缺乏证据阅读活性的RNA依赖性RNA-3-4聚合酶的低保真度。在微小RNA病毒中，RNA聚合酶介导的错误率估计在10-10[33]个错误核苷酸复制循环之间。此外，遗传重组也被认为是鼻病毒物种多样性背后的[34-35]原因。重组可能通过共感染以及不同种类的鼻病毒的连续感染发，鼻病毒与其他[36]呼吸道病毒的共感染也可能导致重组。1.4副感病毒（PIV）已知人类副流感病毒（HPIV）引起ARI，包括下呼吸道感染，这是全球婴幼儿发[37]病率和死亡率的主要原因。HPIV属于副粘病毒科，副粘病毒亚科，分为四种血清型（HPIV-1，HPIV-2，HPIV-3和HPIV-4）。血清型可以进一步细分为两种抗原亚型，即HPIV-4A和HPIV-4B4。已知HIVIV在免疫缺陷儿童中的感染与一系列疾病有关，[38]从轻度上呼吸道症状到需要机械通气，甚至导致死亡的严重疾病。HPIV是仅次于呼吸道合胞病毒（RSV）的导致5岁以下儿童ARI住院的病原体；2-17％的住院治疗是[39]由于HPIV感染引起的。了解导致HPIV的遗传和抗原多样性的机制对于控制病原2 体是十分必要的。1.5流感病毒（IFV）平均而言，流感病毒每年感染人口的5%-10%，这些百分比在某些地理区域或年龄组以及当新型流感病毒遇到缺乏针对这种新型病毒的充分中和免疫应答的人群时可能会更高。一年一度的流感病毒流行期间，可造成大量死亡病例和社会经济压力，在全球爆发新型疫情（大流行）时，这种损失可能是巨大的。大流行也可能引起公众的高度担忧，导致日常生活中断。除了对人类健康的影响，流感病毒的爆发也可能对家禽、猪和马匹产业造成相当大的损失。正粘病毒科病毒包括五个属，但只有两个在人类中具有医学意义，甲型和乙型流感病毒。基于表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸[40]酶（NA）（两种主要病毒抗原）的抗原性质，甲型流感病毒进一步分为亚型。在人类中，只有H1N1、H2N2和H3N2亚型的病毒才能长时间传播；H5N1和H7N9亚型禽流感病毒自1997年和2013年分别出现以来感染了数百人，但未能在人类中有效传播。此外，有报道称，分离出几种其他亚型（即H9N2、H6N1、H7N7、H10N8、[41]H7N2和H7N3）亚型病毒的人类感染病例。我们尚未完全了解流感病毒传播所必需的因素和机制，导致流行病，并导致建立新型亚型。在最广泛的认识中，流感病毒进化是由两种机制驱动的：病毒基因组中的突变和重配，其是被至少两种不同病毒感染的细胞中的八种甲型流感病毒RNA（vRNA）区段的重排引起的。目前，全世界都受ARI的困扰，其已经成为急性感染性疾病的主要原因和死亡的重要原因，在社会不断进步的情况下，已知引起ARI的病毒持续流行，新的呼吸道病[42][43-45]毒也不断出现，数十万人因此死亡，严重影响了发展中国家人均寿命的预期值[46]。它可以小到临床症状表现不明显的隐形感染，也可以大到危机生命的合并并发症。从身心、经济上都给患者带来痛苦，也给社会经济带来负担。在我国政府提出大健康的环境下，其已经成为我国乃至全球范围内的公共卫生问题。免疫力低下老人、婴幼儿群体成为首要感染对象。有资料显示，全球5岁以下儿童感染呼吸道的概率高达每[47]年0.17次，转换为人数约为9000万人次。从2003年非典疫情爆发以来短短的十多年，我国先后出现了H5型高致病性禽流感、新甲1型流感、H7N9禽流感等多起疫情，政府投入了大量的人力、物力和财力，对我国人民健康、经济发展和国际形象上带来了严重影响。传染力、致病力强是ARI[48]的主要特征，在我国已经成为急性传染病的首要因素。细菌、病毒、衣原体、支原体等病原体都会引起ARI，除了单一病原体感染外还存在大量的多病原体合并感染、继发感染等。引起ARI的病原种类众多，包括细菌病毒等，常见的有流感病毒、肺炎链球菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、合胞病毒、金黄色葡萄球菌、副流感病毒、鼻病毒、肺炎克雷伯菌等，由于各种呼吸道病原所引起的感染临床症状、体征类3 [49]似，仅从临床表现很难区分，因此开展实验室检测，才能迅速准确地诊断出病原。近年来，新的病原体不断产生被发现，包括人新型冠状病毒、偏肺病毒和人博卡病毒，尤其是MERS-CoV和甲型H7N9。病原学诊断在有效快速控制ARI方面上起着至关重要的作用。由于各种呼吸道感染的临床症状相似，医生很难根据体征做出病原诊断。经过实验室病原诊断后，不同病原选择不同药物治疗，杜绝抗生素滥用，降低治疗费用，也可降低院内传播风险。[50-51]对呼吸道感染的病原学监测和研究，国际上已经开展数十年的历史，研究表[52-53]明，不同国家、地区以及时期和人群存在差异。已知在全球，每年有300万患者不同程度上感染流感病毒，其中20-50万的患者[54-55]死亡。在世界范围内常年流行的流感病毒被称为季节性流感病毒，目前的季节性流感病毒为甲型流感病毒和乙型流感病毒两个型别。其中甲型为亚型H1N1亚型和H3N2亚型，乙型为Victoria系和Yamagata系两个亚系。咳嗽、流涕、肌痛、乏力、急性发热等临床症状是季节性流感主要的表现，部分免疫力低下的儿童有可能出现腹泻和呕吐。该病为自愈性疾病，很大一部分患者在未进行药物治疗的情况下，症状可以完全消失，但是对于免疫力低下的患者来说尤其是婴幼儿、老年人和孕妇这类人群，很容易出现并发症，最终导致死亡。比如加重糖尿病、哮喘等慢性病、合并感染为细菌性肺炎、脱水及心脏病等。季节流感每年在全球范围内都会引起流行，这是由于其抗原的易变性导致，尤其在温带地区以秋冬春季为主要流行季，可致各年龄组人群发病，是危害全球的公共卫生问题。四季分明的温带地区是流感的高发地，已经被全世界广泛研究，但气候炎热的热[56-57]带地区和亚热带地区流感病毒的流行原因一直困扰国际科学界，其驱动因素至今[58-64]仍不明确，从半年的周期到全年周期都出现过。在我国，流感病毒的变异处在相[65]对高位状态，是泉流流感传播过程中的重要环节。自2003年非典疫情爆发以来，我国近十年先后出现了H5、H7N9引起的高致病性禽流感疫情，新H1流感疫情，对我国经济和国际影响了造成了一定的负面影响。在总结过去一年全球流感监测结果后，世卫组织会预测性推荐疫苗毒株，用于疫[66-67]苗生产和免疫接种，以前使用的疫苗均含有甲型和乙型毒株。但流行毒株和疫苗[68-70][71-75]株不匹配的现象时有发生。由于抗体滴度随时间衰减，所以在流行季到来之前接种才能得到有效保护。因此监测并判断流行季和流行株是保证疫苗发挥最大效果[76]的核心。2本研究的目的和意义盘锦地区为辽河油田所在地，出国务工人员相对较多，人口流动性比较大，且位于辽河入海口，在本地区内有亚洲最大的湿地，每年有大批的候鸟迁徙和大量游客涌4 入。本地区在2007年加入覆盖全国的国家流感监测网络，监测季节性流感，对暴发疫情进行预警。因此，建立一套快速的呼吸道感染病原检测体系可以有效的预防突发公共卫生事件，在临床上可以指导临床医师根据病原用药，有效避免抗生素滥用和节省患者的经济投入，在院内感染筛查上可以发挥快速准确的积极作用。同时，流感样病例病原学检测和流行病学监测的开展，可以有效地对本地区流感流行特征及呼吸道感染的病原学分布进行评价，也对临床诊断提供了重要的参考价值。本研究收集了盘锦市2013年4月至2014年3月患者咽拭子标本856份。对标本进行核酸提取，通过荧光定量PCR方法对样本进行流感病毒(H1N1、H3N2、IVB)、合胞病毒（RSV）、副流感病毒(PIV1、PIV2、PIV3)、腺病毒(ADV)、偏肺病毒(MPV)、鼻病毒（HRV）检测，对其构成进行分析，并基于全国流感监测网络开展的流感样病例哨点监测、流感病毒学监测数据，检测和整理本地区哨点医院上送的流感样品，对结果进行分析，为流行病学提供分析依据，制定相应防控措施。本研究还对流感病毒进行毒株分离，用于诊断试剂制备和疫苗生产等。病毒培养、分离和鉴定等工作的开展大大促进了流感监测工作，有力控制了流感疫情的发生和传播。本研究有助于对新发传染病流行征兆、重大传染源、早期病例等进行预判。临床医生在此基础上对不同病原感染的患者进行不同的药物治疗，减轻患者经济负担的前提下也避免了病原体耐药性产生、菌群失调和资源浪费。对本地区流感病毒病原学研究，可以指导本地区疫苗的有效合理使用。5 第二章盘锦地区急性呼吸道感染病毒Real-timePCR检测方法的建立及流行病学调查近几年，相继出现的冠状病毒、禽流感病毒所引起的公共卫生安全问题，已使急性呼吸道感染逐渐成为全球性的公共卫生问题。目前，发达国家对急性呼吸道病毒病原谱流行数据研究比较广泛和深入。近年来，北京、上海、武汉等一些国内大城市也相应的报道了一些急性呼吸道感染的病毒病原谱研究结果。由于地域、气候等自然因素对病原谱的构成有一定的影响，因此，各地区的病原谱构成不能完全参照以上地区的结果。盘锦地区拥有亚洲最大的湿地，是候鸟迁徙的必经之地，同时，又有辽河油田，每年大量工作人员出国务工，流动性非常大。因此，急需掌握本地区呼吸道感染病原谱的构成，不仅可以指导临床医生对症治疗，减轻患者经济负担，而且可以建立一套快速准确的检测体系，应对突发公共卫生事件发生。由于研究呼吸道感染病原谱是一项长期和复杂的工作，即要求全面的、大量的临床标本，又需要人力、物力和实验室方法的支持，因此，盘锦地区在呼吸道病原谱构成方面的研究一直处于空白。本文旨在构建盘锦地区急性呼吸道感染病毒real-timePCR检测体系，运用此方法对2013-2014年盘锦市中心医院、大洼县第一人民医院、盘山县人民医院的发热呼吸道症状患者的呼吸道样本856份进行检测，对结果进行分析，总结本地区在该时间段内呼吸道感染病毒病原的构成，并在此基础上对部分病毒病原进行分离。1材料与方法1.1实验材料1.1.1样品来源采集2013-2014年盘锦市中心医院、大洼县第一人民医院、盘山县人民医院的发热呼吸道症状患者的呼吸道样本856份。病例调查自2013年4月1日-2014年4月1日，共1年，调查了在监测科室就诊的患者和在住院部接受正规治疗的患者。1.1.2主要仪器设备表1.1实验所用主要仪器设备及型号序号仪器名称品牌型号1Real-timeqPCRBIORADIQ52BSL-2生物安全柜纽埃尔LabGard437-4003高速冷冻离心机贝克曼Allagra-64R4漩涡振荡器上海科华TZL-50095微量移液器Eppendorf6微孔板紫外可见分光光度计Bio-TekEON6 1.1.3主要化学试剂和耗材表1.2实验所用主要试剂耗材序号名称品牌（货号）1RNeasyMiniKitQIAGEN（Cat.#DA-BN096）2β-羟基乙醇生工生物工程MB0338-100mL370%乙醇美华4EasyScriptOne-StepgDNARemovaland全式金cDNASynthesisSuperMix试剂盒TM5PremixExTaq(PerfectRealTime)Takara6无RNA酶带滤膜枪头RAININ1.2研究方法1.2.1样品采集病例采集标准：检查以后发现病例符合以下采样范围：（1）具有急性感染表现（至少符合下列任一项）：发热（从发病开始有报告和记录）；白细胞异常；寒颤；体温异常。（2）具有呼吸道临床表现（至少符合下列任一项）：咳痰；咳嗽；鼻塞、流涕、鼻咽喉明显充血；呼吸急促；呼吸音听诊异常；气短；胸痛。（3）肺炎症状：X线片中显示肺炎且与急性呼吸道感染病例定义一致。病例采集方法：根据《全国流感监测方案（2010年版）》，采集ARI患者的咽拭子标本（发病3天以上）。采集时要避免触及患者舌头和唾液，采样部位为咽后璧和侧壁（图1.1）。图1.1咽拭子采集示意图样品的储存与运送：样本在4-8℃环境下运送至实验室进行检测。若不能及时检测，样本需要在-80℃冰箱内保存，避免反复冻融。1.2.2核酸提取1.2.2.1样品提取前处理标本在旋窝振荡器震荡5s后用镊子反复挤压后取出。1.2.2.2RNA提取7 （1）在1.5mL离心管中依次加入450μLRLT、200μL经过处理的样品液、5μLβ-巯基乙醇和600μL70%乙醇，混匀。（2）取600μL混合液，加入到带滤柱的收集管中，12000rpm离心15s；重复上述操作，将所有混合液过滤。（3）加入WashBufferRW1700μL，12000rpm离心15s。（4）加入WashBufferRPE500μL，12000rpm离心15s，重复一次，14000rpm离心2min。（5）加入50μL去RNA酶水，静置2min，12000rpm离心1min，收集管中液体。1.2.2.3RNA浓度及纯度测定用微孔板紫外可见分光光度计测定RNA溶液浓度和纯度，检测其是否达到后续试验要求。1.2.2.4样品RNP验证采用qPCR方法对样品进行RNP验证。反应体系如下：RNP反应液20µL×n(n为样本数+3）+DNA聚合酶1µL×n+逆转录酶0.35µL×n，混合后瞬时离心进行扩增。（图1.2）表1.3RNP验证所用引物序列引物名称序列上游引物5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’下游引物5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’TaqMan探针5’-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3’1.2.2.5cDNA合成以提取的总RNA作为模板进行反转录，扩增样品的cDNA。反应体系见表1.4。表1.4样品cDNA合成反应体系序号反应物体积12×ESReactionMix10μl2Oligo(dT)(0.5wg/wl)1μl@3EasyScriptRT/RIEnzymeMix1μl4gDNARemover1μl6TotalRNA/mRNA5-500ng5RNase-freeWaterUpto20μl@轻轻混匀，42℃孵育15分钟，85℃加热5秒钟失活EasyScriptRT/RI与gDNARemover，-80℃保存备用。1.2.3Real-timePCR方法的建立及优化8 本研究从循环参数、引物/探针浓度比、Mg2+离子浓度以及DNA模板的浓度4个方面对Real-timePCR反应体系进行优化，以求建立稳定、可靠的Real-timePCR检测方法用于后续人呼吸道病毒的检测。1.2.3.1循环参数的优化不同的厂家生产的Real-timePCR仪器、试剂盒以及文献中对于Real-timePCR的循环参数的描述都有所不同，本实验以此作为变量来筛选最佳的循环参数。根据普通PCR的实验参数来设定反应条件，改变循环参数来进行Real-timePCR，通过分析荧光扩增曲线筛选出最适循环参数。循环参数主要有以下4种：1）95℃15min；95℃15s，60℃30s，40个循环；2）95℃15min；95℃15s，60℃45s，40个循环；3）95℃15min；95℃30s，60℃30s，40个循环；4）95℃15min；95℃30s，60℃45s，40个循环。1.2.3.2引物/探针浓度比的优化Mg2+离子浓度暂定为试剂盒中的参考浓度4.0mM，引物/探针浓度比依据表1.5中分别给出的4种浓度随机组合，共计16组，每个浓度比做3个重复。扩增结果中CT值最小（15-30范围内），且荧光强度较高时，说明该组在模板量相同时，用较少的循环次数就可达到其阈值，其扩增效率及检侧灵敏度比其它组高，即以该组作为最佳扩增条件。表1.5引物和探针的浓度序号引物浓度（μM）探针浓度（μM）10.250.2520.500.5030.750.7541.001.001.2.3.3Mg2+离子浓度的优化在已确定的最佳循环参数和引物/探针浓度比基础上，探讨Real-timePCR反应的最佳Mg2+离子浓度。依据文献的报道将其浓度设置为1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、6.0mM，根据荧光曲线扩增效率的高低判断反应的最佳Mg2+离子浓度。1.2.3.4DNA模板浓度的优化1234试验前测cDNA浓度，并进行梯度稀释，稀释倍数为10、10、10、10，加上原0液10共计5个浓度梯度。在循环参数、引物/探针浓度比以及Mg2+离子浓度均为最适条件下，分别加入不同浓度的DNA模板进行Real-timePCR反应。根据最终扩增的荧光曲线的形态、CT值以及特异性、稳定性等特征确定该反应的最适模板浓度。1.2.4Real-timePCR检测盘锦地区ARI病毒病原9 利用以上构建的Real-timePCR检测方法，对盘锦地区的合胞病毒、副流感病毒Ⅰ、副流感病毒Ⅱ、副流感病毒Ⅲ、偏肺病毒、鼻病毒、腺病毒、流感病毒A型、流感病毒B型8种病毒的荧光PCR检测。表1.6常见几种流感病毒的引物序列病毒名称上游引物序列下游引物序列TaqMan探针序列流感病毒A型5’-GACCRATCCTGTCACCTCTG5’-GGGCATTYTGGACAAAKCGTC5’-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACAC-3’TACG-3’G-3’流感病毒B型5’-TCCTCAACTCACTCTTCGAG5’-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG5’-CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCCG-3’-3’GGTG-3’流感病毒新5’-GGGTAGCCCCATTGCAT-35’-AGAGTGATTCACACTCTGGAT5’-TGGGTAAATGTAACATTGCTGGCH1N1’TTC-3’TGG-3’流感病毒H3N25’-ACCCTCAGTGTGATGGCTTC5’-TAAGGGAGGCATAATCCGGCA5’-ACGCAGCAAAGCCTACAGCAACTCAAA-3’CAT-3’GT-3’*因副流感病毒（Ⅰ、II、III）、偏肺病毒、鼻病毒和腺病毒的引物序列和探针序列涉及商业机密，在本表中未列出。1.2.5结果判断以RNasefreeddH2O作为阴性对照，以试剂盒自带缓冲液作为阳性对照。在阴性、阳性对照同时成立的情况下进行结果判断：当样品CT值＞35或无对数增长，视为阴性；当样品CT值≤35且有明显的对数增长期，视为阳性。2实验结果2.1总RNA的提取参照RNeasyMiniKit试剂盒说明书，对856份病样进行总RNA提取，部分结果如图2.1所示，呈现明显的2条带，微孔板紫外可见分光光度计测定所提取的总RNA浓度和纯度，结果表明所提样品均符合后续试验要求。28S18S图2.1病样总RNA提取电泳结果2.2样品RNP验证10 RNP用于检测人类细胞中RNaseP基因，用于证明样品来源于人体组织。本次试验扩增结果如图2.2所示，扩增曲线超过阈值线，表明样本来源于人体组织，且质量合格。图2.2样品RNP验证实验2.3Real-timePCR检测方法的建立及优化2.3.1循环参数的优化对4个不同循环参数下的Real-timePCR扩增曲线进行分析，结果表明在第2个循环参数下，扩增曲线呈现典型的“S”型（图2.3），CT值为16，可以明显分为基数期、稳定期、指数期和平台期4个阶段，其特异性、稳定性等都较好；而其余3个循环参数下的扩增曲线有的线型杂乱，有的CT值不在可信范围内（15-30）或者大于16，其稳定性、特异性相对较差，因此确定最优的循环参数为95℃15min；95℃15s，60℃45s，40个循环。图2.3循环参数2条件下的Real-timePCR扩增结果2.3.2引物/探针浓度比的优化根据表2.1分组情况分别统计相应的荧光扩增曲线的CT值，利用统计学软件SPSS12.0进行分析。结果表明，引物/探针浓度比为0.50μM/0.50μM时，扩增的荧光曲线CT值可信，且相对最小，说明其对应的扩增效率较高，因此确定0.50μM/0.50μM为最适引物/探针浓度比。11 表2.1引物/探针浓度比的分组情况组别引物/探针浓度比(μM/μM)平行对照CT值10.25/0.25331.11±0.4620.25/0.50327.35±0.37*30.25/0.75326.94±0.24*40.25/1.00326.50±0.35*50.50/0.25321.04±0.17*60.50/0.50319.08±0.4370.50/0.75319.89±0.28*80.50/1.00320.30±0.44*90.75/0.25320.07±0.36*100.75/0.50321.41±0.11*110.75/0.75320.98±0.51*120.75/1.00322.05±0.33*131.00/0.25325.29±0.58*141.00/0.50326.37±0.49*151.00/0.75328.80±0.24161.00/1.00328.74±0.65注：*表示与0.50/0.50组相比，P<0.05。2.3.3Mg2+浓度的优化本实验依据文献报道对Mg2+离子浓度设为1.0mM、2.0mM、3.0mM、4.0mM、5.0mM、6.0mM，每个浓度重复3次，在循环参数、引物/探针浓度比最优条件下进行Real-timePCR，结果显示，Mg2+离子浓度在2.0mM时，有相对较高的扩增效率，因此确定2.0mM为Mg2+离子最佳浓度(见表2.2)。表2.2Mg2+浓度分组情况组别Mg2+离子浓度平行对照CT值11.0mM321.71±0.41*22.0mM318.64±0.2833.0mM319.67±0.12*44.0mM322.96±0.39*55.0mM328.51±0.5766.0mM331.22±0.69注：*表示与2.0mM组相比，P<0.05。2.3.4DNA模板浓度的优化经检测cDNA浓度为1821.4ng/μL，在5个浓度梯度下，其扩增的荧光曲线如图12.4所示，当其在10稀释倍数下，也即浓度为182.14ng/μL时，CT值为16，处于可信区间内，且相对最小，扩增曲线呈现典型的“S”型，而其余几个梯度扩增结果或是不1可信，或是可信但CT值相对较大，因此确定10稀释倍数下的DNA浓度为最适模板浓度。12 图2.4不同DNA模板浓度下的Real-timePCR扩增结果综上所述，本次试验成功构建Real-timePCR检测方法。2.4Real-timePCR法对盘锦地区ARI病毒病原流行病学调查利用建立的Real-timePCR方法对2013年4月-2014年3月期间盘锦地区ARI患者咽拭子样品进行了病毒病原检测，共检测出流感病毒(H1N1、H3N2、IVB)、合胞病毒（RSV）、副流感病毒(PIV1、PIV2、PIV3)、腺病毒(ADV)、偏肺病毒(MPV)、鼻病毒（HRV）等10种病毒病原。2.4.1合胞病毒的检测结果检测结果如图2.5所示，其中a表示合胞病毒（RSV）检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，说明b图阴性结果并非由PCR失败造成。a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增期，说明本次检测结果可信，Real-timePCR检测方法切实可行。abIPCIPC图2.5Real-timePCR检测结果a:合胞病毒阳性;b:阴性对照;IPC:阳性内对照2.4.2流感病毒H1N1的检测结果检测结果如图2.6所示，其中a表示流感病毒H1N1检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增期，说明本次检测结果可信。13 abIPCIPC图2.6Real-timePCR检测结果a:流感病毒H1N1阳性;b:阴性对照;IPC:阳性内对照2.4.3流感病毒H3N2的检测结果检测结果如图2.7所示，其中a表示流感病毒H3N2检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增期，说明本次检测结果可信。abIPCIPC图2.7Real-timePCR检测结果a:流感病毒H3N2阳性;b:阴性对照;IPC:阳性内对照2.4.4流感病毒IVB的检测结果检测结果如图2.8所示，其中a表示流感病毒IVB检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增期，说明本次检测结果可信。abIPCIPC图2.8Real-timePCR检测结果a:流感病毒IVB阳性;b:阴性对照;IPC:阳性内对照14 2.4.5副流感病毒PIV1的检测结果检测结果如图2.9所示，其中a表示副流感病毒PIV1检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增期，说明本次检测结果可信。abIPCIPC图2.9Real-timePCR检测结果a:副流感病毒PIV1阳性;b:阴性对照;IPC:阳性内对照2.4.6副流感病毒PIV2的检测结果检测结果如图2.10所示，其中a表示副流感病毒PIV2检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增期，说明本次检测结果可信。abIPCIPC图2.10Real-timePCR检测结果a:副流感病毒PIV2阳性;b:阴性对照；IPC:阳性内对照2.4.7副流感病毒PIV3的检测结果检测结果如图2.11所示，其中a表示副流感病毒PIV3检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增期，说明本次检测结果可信。15 abIPCIPC图2.11Real-timePCR检测结果a:副流感病毒PIV3阳性;b:阴性对照；IPC:阳性内对照2.4.8腺病毒的检测结果检测结果如图2.12所示，其中a表示腺病毒检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增期，说明本次检测结果可信。abIPCIPC图2.12Real-timePCR检测结果a:腺病毒阳性;b:阴性对照;IPC:阳性内对照2.4.9偏肺病毒的检测结果检测结果如图2.13所示，其中a表示偏肺病毒检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增ab期，说明本次检测结果可信。IPCIPC图2.13Real-timePCR检测结果a:偏肺病毒阳性;b:阴性对照;IPC:阳性内对照16 2.4.10鼻病毒的检测结果检测结果如图2.14所示，其中a表示鼻病毒检测结果为阳性，b为阴性对照。阳性内对照（IPC）稳定，a、b两图的CT值均位于15-35之间，且有明显的指数扩增期，说明本次检测结果可信。abIPCIPC图2.14Real-timePCR检测结果a:鼻病毒阳性;b:阴性对照;IPC:阳性内对照对检测结果进行判断，发现共检出7类病原105份，占全部检测量的12.17%（表2.3）。由于本次研究只针对引起呼吸道感染的病毒病原进行检测，未检出的病原的样本有可能含有引起呼吸道感染的细菌病原或其他病原体。在105份检出样本中，各种病毒病原的比例存在较大差异（表2.3）。其中，合胞病毒3例，占样品数比例的0.35%，占阳性样品比例的2.86%；副流感病毒6例，占样品数比例的0.70%，占阳性样品比例的5.71%；偏肺病毒2例，占样品数比例的0.23%，占阳性样品比例的1.90%；鼻病毒7例，占样品数比例的0.82%，占阳性样品比例的6.67%；腺病毒11例，占样品数比例的1.29%，占阳性样品比例的10.48%；流感病毒76例，其中H1N1型67例，H3N2型9例（表2.3），占样品数比例的8.88%，占阳性样品比例的72.38%；未检出乙型流感病毒。表2.3盘锦地区（2013年4月-2014年3月）ARI病毒病原的分布H1N1H3N2IVBADVHRVPIV-1PIV-2PIV-3RSVMPV阳性数679011721332阳性率7.831.0501.290.820.230.120.350.350.232.5盘锦地区ARI病毒病原流行的特点本文对2013年4月-2014年3月期间ARI的流行规律进行了研究，分析其构成，对新发传染病流行征兆、重大传染源、早期病例等进行预判，以期为避免突发公共卫生事件的发生提供基础资料和数据。2.5.1盘锦地区ARI病毒感染与气候的关系17 本研究样本为2013年4月-2014年3月期间的全年样本。在105份阳性样本中，冬季是ARI高发期，病毒感染总数最高，为70份，夏季最低，为0份。各季节病毒感染阳性率（表2.4）。表2.4盘锦地区（2013年4月-2014年3月）ARI病毒阳性率的季节分布（%）H1N1H3N2IVBADVHRVPIV-1PIV-2PIV-3RSVMPV春季6.252.0802.082.08001.041.040夏季0000000000秋季1.130.3802.260.3800000冬季13.981.45000.720.960.480.240.240.242.5.2盘锦地区ARI病毒感染与年龄的关系5-14岁年龄组病毒感染阳性例数最多为45例，0-4岁年龄组次之，为34例。流感病毒5-14岁年龄组病毒感染阳性例数最多为34例，0-4岁年龄组次之，为17例。腺病毒0-4岁年龄组病毒感染阳性例数最多为7例，5-14岁年龄组次之，为4例。鼻病毒0-4岁年龄组病毒感染阳性例数最多为4例，5-14岁年龄组次之，为3例。副流感病毒0-4岁年龄组病毒感染阳性例数最多为5例，5-14岁年龄组次之，为1例（表2.5）。表2.5盘锦地区（2013年4月-2014年3月）ARI病毒感染人群的年龄分布年龄组样本总数阳性数H1N1H3N2IVBADVHRVPIV-1PIV-2PIV-3RSVMPV（岁）（例）0-422534152074212105-14298453040430011215-241018710000000025-59843210000000060-1481513100000010此外，对各年龄组流感病毒阳性率进行统计分析，结果表明：本地区ARI病毒感染阳性率最高的年龄组主要集中在0-4岁年龄组和5-14岁年龄组，并随年龄的增大而减少；0-4岁年龄组和5-14岁年龄组均感染8种病毒，其它三个年龄组则只感染2-3种病毒且以感染A型流感病毒为主（表2.6）。表2.6盘锦地区（2013年4月-2014年3月）ARI病毒阳性率的年龄分布年龄组阳性率H1N1H3N2IVBADVHRVPIV-1PIV-2PIV-3RSVMPV（岁）（%）0-415.116.670.890.003.111.780.890.390.890.390.005-1415.1010.071.340.001.341.010.000.000.390.340.6715-247.926.930.990.000.000.000.000.000.000.000.0025-593.572.381.190.000.000.000.000.000.000.000.0060-1.018.780.680.000.000.000.000.000.000.680.0018 2.5.3盘锦地区甲型流感病毒感染的特点由于甲型流感病毒是盘锦地区ARI感染的主要病毒（表2.3），因此，本论文进一步研究了甲型流感病毒的感染特点。结果表明：A型流感病毒感染存在较大的季节差异（表2.7、2.8）。由表5可知，甲型流感病毒一般从11月份开始出现，其检出阳性率逐月升高，并在2月份达到最高值19.09%，随后逐月下降，5月至10月期间均未检测到阳性样本。由表6可知，A型流感病毒检测的阳性率顺序为：冬季＞春季＞秋季＞夏季，其阳性率依次为15.42%、8.33%、1.50%和0.00%。由此可以推断，甲型流感病毒的流行与气温的降低密切有关。表2.7盘锦市2013-2014年A型流感病毒的时间分布年月检测数（份）阳性数（份）阳性率（%）2013.0451815.692013.052000.002013.062500.002013.072700.002013.082500.002013.092700.002013.108000.002013.118011.252013.1210632.832014.0111198.112014.021102119.092014.031943417.53表2.8盘锦市2013-2014年A型流感病毒的季节分布发病季节检测数（份）阳性数（份）阳性率（%）春季9688.33夏季7900.00秋季26641.50冬季4156415.42此外，甲型流感病毒感染与人群年龄存在一定相关性（表2.9）。本论文将盘锦地区人群分为5个年龄组，其检出阳性率顺序依次为：5-14年龄组＞60以上年龄组＞15-24年龄组、0-4年龄组＞25-59年龄组。其中，以5-14年龄组的阳性率最高，为11.41%；以25-59年龄组的阳性率最低，为3.57%。表明老人和儿童是甲型流感病毒的主要易感人群。表2.9盘锦市20132014年A型流感病毒年龄分布年龄组（岁）样本数（份）阳性数（份）阳性率（%）0-4225177.5619 5-142983411.4115-2410187.9225-598433.5760-148149.463讨论[77]在我国，有资料有资料表明呼吸道系统疾病是导致居民致残的第三大疾病，严重影响了居民的平均寿命水平。在对856份呼吸道感染患者样本核酸检测中，阳性数为105份，总感染率为12.17%，这比之前研究的结果（感染率在36%-58%之间）有[78-81]一定出入，主要因为本次研究只将引起呼吸道感染的病毒类病原纳入检测范围，而肺炎支原体、衣原体、链球菌、军团群等其他细菌类病原未纳入检测范围，所以导致阳性率偏低，在后续的工作中，逐步将其他种类病原纳入检测中。初步确定本地区的以流感病毒中H1N1亚型、腺病毒以及鼻病毒为引起ARI的主要病毒病原，与其他[82-84]文献报道相似。研究发现鼻病毒常见于轻度上呼吸道感染，与其他报道一致。此[85]外，南京的研究在夏季感染率最低，冬季病毒感染率最高，也与本地区研究结果一致。[86]腺病毒可以诱导炎症基因转录，其纤维分子可以激活ERK和NF-κB信号，其本身可以诱导先天免疫反应和特异诱导宿主细胞分泌IL-8。腺病毒感染在免疫功能[87]低下的儿童造血干细胞移植患者可引发为严重的多器官疾病，是严重和致命的呼吸道疾病，也是引起的重要病毒病原之一。本次研究发现本地区主要集中在0-4岁年龄组，在检出的11例患者中，有7例为此年龄段。以秋季为主要发病期，在检出的11例患者中，有7例为此季节检出（结果未列入）。此外，本次研究成功构建了Real-timePCR检测方法，并用于检测盘锦地区ARI患者呼吸道病原。检测结果表明副流感病毒也是引起婴幼儿呼吸道感染的主要病原之一，[88-89]以0-4岁年龄组为主，冬季为感染流行季，与国内相关研究相符。[90]呼吸道合胞病毒主要集中在15岁以下儿童，与相关文献报道相符。由于其具有[91]诱导肥大细胞分泌白介素和炎症因子，进而对巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞[92-93]进行招募和激活，降低宿主的防御功能，所有这些都是参与病毒肺炎。20 第三章盘锦地区流感病毒的分离为了掌握本地区流感病毒毒株的亚型变化，及时发现流感病毒是否发生变异，并采取科学的防疫措施，需要对流感病毒核酸进行测序并制备流感病毒疫苗。通常，需将流感病毒核酸阳性的样本进行MDCK细胞病毒分离，对于分离滴度达到标准的MDCK细胞毒株，方可进行测序，同时，还要对流感病毒核酸阳性的样本进行鸡胚病毒分离，只有分离滴度达到标准的鸡胚毒株，才能用于流感病毒疫苗的制备。本论文首次开展了盘锦地区流感病毒的MDCK细胞病毒分离和鸡胚病毒分离，旨在为进一步开展该地区流感病毒的深入研究提供稳定的实验材料，为该地区公共卫生防疫体系的完善奠定基础。1材料与方法1.1实验材料1.1.1流感病毒样本取自第二章已确证的76份流感病毒核酸阳性样本。1.1.2主要仪器设备表1.1实验所用主要仪器设备仪器名称品牌型号BSL-2生物安全柜纽埃尔LabGard437-400倒置显微镜奥林帕斯CK40-F-200恒温培养箱ZBDP-2080电动移液器Eppendorf1.2.3主要试剂及耗材表1.2实验所用主要试剂耗材实验目的试剂耗材品牌型号70%-90%MDCK细胞双抗母液（PS）BI7.5%牛血清白蛋白组分V溶液BIMDCK细胞分离TPCK-胰酶BIEDTA胰酶BI细胞培养瓶ThermoT-25无菌移液管Thermo9日龄鸡胚本地养殖场照蛋灯山东龙发孵化器械厂70%-75%酒精天龙药业一次性注射器天龙药业鸡胚细胞分离鸡蛋开孔器天龙药业医用胶布天龙药业无菌移液管天龙药业无菌镊子天龙药业21 1.2研究方法1.2.1流感病毒的MDCK细胞病毒分离MDCK细胞制备：将MDCK母代细胞用DPBS清洗3次，加入3mLEDTA胰酶，37℃10min，观察细胞流沙状脱落后取出。加入用DMEM+10%胎牛血清+1%PS配置的生长液（根据需要传代的细胞数加入生长液，每传代一瓶加入8mL），用加样枪反复吹打，使细胞均匀分散于液体内。将分散均匀的细胞母液分装至新的细胞瓶中，每瓶8mL，于37℃保存。病毒分离流程：先用DPBS清洗3次MDCK细胞，然后将1mL咽拭子液作为临床标本接种到MDCK细胞，于35℃温箱吸附1-2h，再用DPBS清洗吸附后的细胞3次，最后，加入病毒维持液（DMEN+2%PS溶液+1%TPCK胰酶），置于35℃培养箱，每天观察细胞病变。当成片细胞中有四分之三至全部出现病变时，进行收获。对于没有出现病变的细胞，也要在第7天收获，经反复冻融两次后进行2次传代。1.2.2流感病毒的鸡胚分离鸡胚处理：将9日龄的鸡胚（受精卵在孵化器孵育9天）进行检查，对有效鸡胚进行标记，确定气室和尿囊的界限、胚胎的眼睛位置。鸡胚接种：对鸡胚用酒精棉球擦拭消毒，在气室与尿囊界限处用开孔器进行开孔，每个样品接种3个鸡胚。用注射器向鸡胚眼睛偏上部位注射100μL样本，在退出注射器的过程中逐步注射100μL样本（如图1.1所示）。在接种完另外两枚鸡胚后酒精棉球消毒鸡胚，用胶布封口。病毒培养：35℃培养3天。病毒液收获：将鸡胚4℃冰箱过夜，去掉气室上方蛋壳，吸取尿囊液和羊水。图1.1样本接种示意图22 1.2.3流感病毒的鉴定对细胞收集液和鸡胚收集液进行红细胞凝集实验（HA）和红细胞凝集抑制实验（HI）。1.2.3.1红细胞凝集实验图1.2红细胞凝集示意图实验原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）结合红细胞表面蛋白或脂蛋白结构，产生凝集现象（如图1.2所示）。表1.3实验所用试剂耗材设备耗材品牌待鉴定病毒标准流感病毒参照抗原和抗血清红细胞悬液生理盐水天龙药业多道移液器Eppendorf96孔U形板Thermo红细胞凝集实验过程：稀释待检毒株↓加入红细胞悬液（红细胞悬液1200rpm5min洗涤3次，将红细胞稀释至1.5%）↓充分混匀，置室温孵育30min↓观察并记录结果（1）U形96孔板横向放置。（2）除第一列各孔外，其余每孔加50μL生理盐水（3）A1-F1各加100μL待检病毒，H1加100μL生理盐水作为阴性对照，（4）用多道移液器从第一列各孔分别取50μL病毒液，由第一列至第二列做二倍系列稀释。最后一列每孔弃去50μL。（5）每孔加入50μL红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合（如图1.3所示）。（6）静止30min后观察结果。23 图1.3红细胞凝集实验过程示意图1.2.3.1.4红细胞凝集实验结果判定红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。如图1.4所示，A、B、C、D四个样本的滴度分别为1：64、1：32、1：4和1：128检测结果，如果HA滴度≥8者，进行HI实验；HA滴度＜8者，继续在敏感的NDCK细胞系或者鸡胚上培养1-2代。图1.4红细胞凝集实验结果判定示意图1.2.3.2红细胞凝集抑制实验1.2.3.2.1实验原理当血清中有流感病毒特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以产生抑制凝集现象。1.2.3.2.2标准参照血清的处理标准参照血清由国家流感中心提供，分别加入抗A（H1N1）亚型血清、抗A（H3N2）亚型血清、抗B型Yamagata系病毒血清、抗B型Victoria系病毒血清1.2.3.2.3步骤（1）除A行外，每孔加25μL生理盐水。A5、A6各加50μL生理盐水作为阴性对照。24 （2）A1至A4及A7至A10分别加入抗A（H1N1）亚型血清、抗A（H3N2）亚型血清、抗B型Yamagata系病毒血清、抗B型Victoria系病毒血清，每孔加入50μL。（3）用多道移液器从A行分别取25μL血清，由A至H做2倍系列稀释，弃去H行25μL。（4）A1至H4每孔加入25μL待检病毒液。（5）A7至H10每孔加入25μL待检病毒液。（6）对照孔不加抗原，有25μL生理盐水代替（如图1.5所示）。图1.5红细胞凝集抑制实验过程示意图（7）混匀，室温孵育60min，观察结果。1.2.3.2.4结果判定（1）标准参照血清对待检抗原的抑制效价≥20才可以算阳性。（2）一个待检抗原不能同时被两种或者两种以上的标准血清抑制。（3）待检病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于图1.6红细胞凝集抑制实验结果判定示意图25 其他参照血清4倍以上时，可以判定为此种流感病毒。如图1.6所示，病毒液1为H1N1，病毒液2为By正常细胞（见图1.7）。病变细胞（见图1.8）。图1.7正常MDCK显微镜图片图1.8病变MDCK显微镜图片2结果对这76份样本进行流感病毒分离，67例新甲型H1N1分离出60株新甲型H1N1MDCK细胞毒株(见图2.1)，分离率为89.55%；10株鸡胚株（见图2.2），分离率为14.93%；9例H3N2分离出5株H3N2毒株（见图2.3），分离率为55.56%，0株鸡胚株（表2.1）。图2.1新甲型H1N1MDCK病变显微镜图片26 图2.2新甲型H1N1鸡胚收获图片图2.3甲型H3N2MDCK病变显微镜图片表2.1盘锦市2014年4月-2015年3月流感病毒分离HA、HI结果HI滴度(鸡胚)HA滴度MDCK病鸡胚分HI滴度(MDCK)编号核酸型毒分离型离型MDC鸡胚H1N1H3N2ByBvK新甲型新甲型11:64H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型新甲型新甲型1:1601:201:101:1021:641:32H1N1H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型新甲型31:128H1N1H1N11;3201;201;101;104新甲型新甲型1:6427 H1N1H1N11;1601;101;101;10新甲型新甲型新甲型1:1601:101:101:1051:1281:64H1N1H1N1H1N11;3201;101;101;10新甲型新甲型61:64H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型7\\H1N1新甲型新甲型81:64H1N1H1N11;1601;201;201;20新甲型新甲型91:128H1N1H1N11;1601;201;101;10新甲型新甲型101:128H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型新甲型111:64H1N1H1N11;801;101;101;10新甲型新甲型121:128H1N1H1N11;1601;201;101;10新甲型新甲型131:64H1N1H1N11;1601;101;101;10新甲型新甲型141:128H1N1H1N11;801;201;101;10新甲型新甲型151:64H1N1H1N11;6401;201;201;20新甲型新甲型0161:128H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型新甲型171:64H1N1H1N11;1601;201;101;10新甲型新甲型新甲型1:1601:101:101:10181:1281:64H1N1H1N1H1N11;6401;201;101;10新甲型新甲型191:32H1N1H1N11;6401;201;201;20新甲型新甲型201:64H1N1H1N11;1601;101;101;10新甲型新甲型211:128H1N1H1N11;801;201;101;10新甲型新甲型新甲型1:1601:101:101:10221:641:64H1N1H1N1H1N11;3201;101;101;10新甲型新甲型231:64H1N1H1N11;1601;201;101;10新甲型新甲型241:128H1N1H1N11;801;201;101;10新甲型新甲型251:64H1N1H1N11;6401;201;201;2026新甲型新甲型1:12828 H1N1H1N11;1601;101;101;10新甲型新甲型271:64H1N1H1N11;3201;101;101;10新甲型新甲型281:256H1N1H1N11;801;101;101;10新甲型新甲型291:64H1N1H1N11;3201;101;201;20新甲型新甲型301:64H1N1H1N11;1601;201;101;10新甲型新甲型311:64H1N1H1N11;801;201;201;10新甲型32\\H1N1新甲型新甲型新甲型1:1601:201:201:20331:641:32H1N1H1N1H1N11;6401;201;101;10新甲型新甲型341:128H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型新甲型351:64H1N1H1N11;1601;201;201;20新甲型新甲型361:128H1N1H1N11;801;201;201;10新甲型新甲型371:64H1N1H1N11;1601;201;101;10新甲型新甲型381:64H1N1H1N11;6401;201;201;20新甲型新甲型391:64H1N1H1N11;801;101;101;10新甲型新甲型401:128H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型41\\H1N1新甲型新甲型421:64H1N1H1N11;6401;201;201;20新甲型新甲型新甲型1:1601:101:101:10431:641:32H1N1H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型新甲型441:32H1N1H1N11;1601;101;101;10新甲型新甲型451:64H1N1H1N11;1601;201;101;10新甲型46\\H1N1新甲型新甲型471:64H1N1H1N11;801;101;101;1048新甲型新甲型1:12829 H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型新甲型491:64H1N1H1N11;1601;201;101;10新甲型50\\H1N1新甲型新甲型新甲型1:1601:101:101:10511:641:16H1N1H1N1H1N11;6401;201;101;10新甲型新甲型新甲型1:801:101:101:10521:641:32H1N1H1N1H1N11;3201;201;101;10新甲型新甲型531:128H1N1H1N11;3401;201;201;20新甲型新甲型541:64H1N1H1N11;1601;101;101;10新甲型55\\H1N1新甲型新甲型561:128H1N1H1N11;801;201;101;10新甲型新甲型571:64H1N1H1N11;1601;201;201;20新甲型新甲型581:64H1N1H1N11;1601;101;101;10新甲型新甲型新甲型1:1601:101:101:10591:641:32H1N1H1N1H1N11;6401;201;101;10新甲型新甲型601:64H1N1H1N11;1601;201;201;20新甲型新甲型611:128H1N1H1N11;3201;101;101;10新甲型新甲型新甲型1:3201:101:101:10621:1281:64H1N1H1N1H1N11;6401;201;101;10新甲型新甲型631:64H1N1H1N11;1601;201;201;20新甲型64\\H1N1新甲型新甲型651:64H1N1H1N11;6401;101;101;10新甲型新甲型661:128H1N1H1N11;801;101;101;10新甲型新甲型671:64H1N1H1N11;1601;201;201;2068H3N2H3N21:641;201;3201;101;1069H3N2H3N21:321;101;1601;101;1070H3N2\\30 71H3N2\\72H3N2H3N21:161;201;1601;101;1073H3N2\\74H3N2H3N21:321;201;6401;201;2075H3N2\\76H3N2H3N21:161;201;1601;101;10在对核酸阳性的样本进行病毒分离发现，MDCK细胞分离中新甲型H1N1的分离率为89.55%，H3N2分离率为55.56%，新甲型H1N1的分离率明显高于H3N2。鸡胚分离中，H3N2未分离出鸡胚株，目前，H3N2的“O”相变异导致其仅对MDCK细胞敏感，对鸡胚不敏感。3讨论核酸阳性的样品进行MDCK细胞病毒分离和鸡胚分离。分离出的毒株将上送国家流感中心用于试剂的制备和疫苗生产。由于MDCK细胞敏感性远高于鸡胚的敏感性，但又不适合生产疫苗，一次MDCK细胞分离和鸡胚分离要同时进行。由于MDCK细胞为永生化细胞，不能用于流感疫苗的制备，所以。上送国家流感中心，用于盘锦地区2013-2014年流感流行季中优势流行株为新甲型H1N1型。在2013-2014年流感流行季中，盘锦市流行性感冒以散发病例为主，无流感疫情爆发，其中少量存在甲型H3N2，优势流行株为新甲型H1N1。根据过往几年监测数据显示，本地区每年流感流行的月份和亚型可能不同，但是每年流感流行的年龄分布基本无差异。因此加强学校和老年人的预防知识普及和疫苗接种工作。目前，流感检测的金标准是病毒分离培养，但该方法耗时长，不适合突发公共卫生事件检测。另外一种方法为PCR检测，与病毒分离相比，该法更敏感，且耗时少，但该法成本高，不适合大批样本监测。通过本次研究发现，现阶段病毒分离仍以MDCK细胞分离为主，流感病毒对鸡胚的敏感性仍然弱于MDCK细胞分离。31 第四章总结1、流感病毒、腺病毒和鼻病毒是本地区引起ARI的主要病毒病原。2、冬季检出率最高，夏季最低。3、0-4岁的婴幼年龄组与5-14岁的儿童组病毒检出率基本相同，25-59年龄组检出率最低。4、2013-2014年流感流行季中，优势流行株为新甲型H1N1。5、ARI重点防治对象是婴幼儿和幼托小学儿童。6、现阶段病毒分离仍以MDCK细胞分离为主，流感病毒对鸡胚的敏感性仍然弱于MDCK细胞分离。7、结合临床，将有助于大夫对患者的指导用药，避免了资源浪费和抗生素的滥用，掌握了流感病毒现阶段在本地区的流行趋势，有助于本地区疫苗接种过程中正确选择有效疫苗。8、在以后的工作中完善引起ARI的细菌病原。32 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攻读硕士期间发表论文1.那永东,乙引.诺如病毒GⅡ.17型在盘锦地区的检出和鉴定[J].中国卫生检验,2015,25（22）:3861-3862.2.那永东,乙引.盘锦市2013-2014年呼吸道症候群病原学分析[J].中国公共卫生,2016,3（32）:385-387.3.那永东,崔伟,乙引.辽宁省2010年-2014年腹泻症候群病毒病原学研究分析[J].中国卫生检验,2016,26（7）:1030-1031.37 致谢光阴易逝，荏苒三载，研究生阶段随着论文的结束也即将接近尾声。即将结束研究生阶段的学习离开校园，心中充满无尽的感激，感谢那些陪我一路走来的老师、学长和同学们，再次向你们表示最衷心的感谢！本课题的完成离不开老师、同学和家人的关心和鼓励，正是源于他们的支持和帮助，我才能顺利完成硕士论文的研究。首先，特别感谢我的导师乙引老师对我的谆谆教导和帮助，无论在工作、学习、生活等各个方面都给了我莫大的帮助，我才得以顺利完成学业。在学业、论文指导之余，老师严谨细致、实事求是的治学态度，敏锐的思维，渊博的学识，认真勤奋、不知疲倦的工作作风，对事业的执着追求，开拓了我的学术视野，完善了我的知识结构。宽广的胸襟，朴实无华，让我学到了很多的软技能，这些都将使我终生难忘，并时时鞭策我努力工作，在科学研究的道路上奋发向上；感谢龚记熠老师、汤晓辛老师、洪鲲老师等生科院的老师们，你们对我的帮助和包容，使我在研究生的道路上走的更加顺畅；感谢唐明老师对我修改论文上的指导和帮助。感谢周斌、高阳、郭丽、丁超等我的同学们，谢谢你们在学业上帮助。最后，我要向百忙之中参与审阅、评议本论文各位老师、向参与本人论文答辩的各位老师表示由衷的感谢！人生的每个阶段都值得好好珍惜，这段美好岁月，因为有你们的关心和帮助，我很幸福。到了要离开的日子，真心的祝福我的母校、我的导师、我亲爱的同学们在以后的日子里一帆风顺，前程似锦。38 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人或集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：2017年6月8日39 关于学位论文使用授权的声明本人完全了解贵州师范大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：导师签名：40
