尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究

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分类号论文编号密级海苹苹医太＃硕士学位论文尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究ＴｈｅＶａｌｕｅＯｆＵｒｉｎａｒｙＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒｓＩｎＴｈｅＤｉａｎｏｓｉｓ，ｇＰｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎＡｎｄＰｒｏｇｎｏｓｉｓＯｆＤｉａｂｅｔｉｃＫｉｄｎｅｙＤｉｓｅａｓｅ研究生姓名：薛昊学号：２０１５１２７６指导教师：梅长林教授海军军医大学附属长征医院学科、专业：内科学（肾病）学位类型：专业学位答辩日期：２０１８年５月二〇一八年五月 海军军医大学硕士学位论文尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究TheValueOfUrinaryProteinMarkersInTheDiagnosis,ProgressionAndPrognosisOfDiabeticKidneyDisease研究生姓名薛昊阮梦学科和专业内科学（肾病）指导教师梅长林教授指导小组郁胜强副教授戴兵副教授薛澄博士后培养单位海军军医大学附属长征医院二○一八年五月 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：日期年ｈ／／日学位论文版权使用授权声明本人完全了解海军军医大学有关保留、使用学位论文的规定，海军军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海军军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名？：导师签名？ｊ曰期年厂月Ｊ曰曰期：年厂月Ａ曰 目录中文摘要................................................................................................................................1英文摘要................................................................................................................................3缩略词表................................................................................................................................5一、引言................................................................................................................................6二、研究内容和方法............................................................................................................6三、结果..............................................................................................................................18四、讨论..............................................................................................................................25五、参考文献......................................................................................................................30六、文献综述......................................................................................................................32七、在读期间发表论文......................................................................................................42八、致谢..............................................................................................................................43 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究摘要研究目的：通过检测糖尿病肾病（DKD）患者尿液中小球损伤、小管损伤以及炎症的相关生物标志物，研究在DKD疾病进展各阶段这些生物标志物的变化规律，以及其与传统肾功能评价指标之间的相关性，探讨其在评价肾功能进展、评估DKD预后中的意义。研究方法：本研究为观察性横断面研究。选取自2014年4月至2017年6月期间住院或门诊随访的DKD患者。采集病史，记录一般情况及实验室检查结果。按照准入标准，符合准入条件的患者纳入该研究。收集其空腹清洁中段晨尿标本。应用酶联免疫吸附测定（ELISA）、散射比浊法、透射比浊法等，检测各尿生物标志物的浓度。从健康体检中心匹配相应的正常人作为对照。研究的尿生物标志物包括三类。小球损伤标志物：尿白蛋白、尿转铁蛋白（TRF）、尿免疫球蛋白G（IgG）；小管损伤标志物：尿肾脏损伤分子（KIM-1）、尿肝脏型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、尿视黄醇结合蛋白（RBP）、尿α1-微球蛋白（α1-MG）；炎症指标：尿单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）；补体指标：尿补体B因子（CFB）；统计分析时采用以尿肌酐值标化。标化即采用相关参数/尿肌酐。结果：在DKD患者中，尿TRF、IgG、KIM-1、L-FABP、NGAL、RBP、α1-MG、MCP-1、CFB的水平与传统肾脏评价指标eGFR、ACR之间存在显著的相关性，p值均小于0.001，有统计学意义。这些指标与eGFR呈现负相关，即随着eGFR的下降，其呈现升高趋势，其中以NGAL、α1-MG、标化α1-MG相关系数绝对值较大，分别为-0.707、-0.728、-0.707；与ACR呈现正相关，即随着ACR的升高，其呈现同向升高趋势，其中以IgG、TRF相关系数绝对值较大，分别为0.841、0.883、0.824、0.812。尿TRF、IgG、KIM-1、L-FABP、NGAL、RBP、α1-MG、MCP-1、CFB等指标与传统危险度分层之间存在显著相关性，p值均小于0.001，有统计学意义。其中以TRF、IgG、α1-MG、L-FABP、CFB相关性更为显著。这些没有在DKD组中升高最显著且与其它组有显著差异，故尚不足以用来疾病鉴别。结论：在DKD患者中，尿TRF、IgG、KIM-1、L-FABP、NGAL、RBP、α1-MG、MCP-1、CFB与传统肾脏评价指标eGFR、ACR有显著相关性；TRF、IgG、α1-MG、L-FABP、CFB与传统的危险度分层之间相关显著；因些，这些尿蛋白标志物在协助传统指标判断糖尿病进程中肾脏是否受累、肾脏病变程度的评估以及预后预测方面有应用价值。这些标志物没有在DKD组中升高最显著且与其它组有显著差异，故尚不足以用来进行肾脏损害的不同病因的鉴别。TRF对于MN、MCP-1对于LN组有病因-1- 海军军医大学硕士学位论文判断的价值。关键词：糖尿病肾病，尿液生物标记物，估算肾小球滤过率，尿微量白蛋白/肌酐，肾脏病预后-2- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究AbstractAimofthestudy:Throughthedetectionofbiomarkersinurineofdiabetickidneydisease(DKD)patients，whichreflectstheinjuriesineachnephronsegment,therenalinflammationandtheactivityofintra-renalcomplementsystem，westudyedthechangesofthesebiomarkersinvariousstagesofdiseaseprogressioninDKD,andthecorrelationbetweenitandtraditionalevaluationindexesofrenalfunctiontoexploretheprognosticsignificanceofthesemarkersinDKDprogressionandevaluationofrenalfunctionassessment.Methods:Thisstudyisanobservationalcross-sectionalstudy.DKDpatientswhowerehospitalizedoroutpatientfollow-upfromApril2014toJune2017wereselected.Themedicalhistorywascollected,thegeneralsituationandtheresultsoflaboratoryexaminationwererecorded.Accordingtotheadmittancestandard,thepatientswhomeettheaccessconditionsareincludedinthestudy.Themorningurinesamplesfromthemiddlesectionoftheemptystomachwerecollected.Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA),turbidimetryandturbidimetrywereusedtodetecttheconcentrationofvariousurinarybiomarkers.Thecorrespondingnormalpeoplewerematchedfromthehealthcheck-upcenterasthecontrol.Theurinebiomarkersincludedinthestudyincludethreetypes.Themarkersforglomerulardamage:urinaryalbumin,urinarytransferrin(TRF),urinaryimmunoglobulinG(IgG);tubularinjurybiomarkers:urinekidneyinjurymolecule-1(KIM-1),liverfattyacidbindingprotein(L-FABP),neutrophilgelatinase-associatedlipocalin(NGAL)andretinolbindingprotein(RBP),urinealpha1-microglobulin(alpha1-MG);inflammationindex:urinarymonocytechemoattractantprotein-1(MCP-1);complementindex:urinarycomplementfactorB(CFB).TheseresultswasusedinStatisticalanalysisisstandardizedbyurinarycreatininevalues（X/Cr）.Results:InDKDpatients,thereissignificantcorrelationbetweenurinaryTRF,IgG,KIM-1,L-FABP,NGAL,RBP,1-MG,MCP-1,CFBlevelandtraditionalkidneyevaluationindexeseGFRandACR,(P<0.001)。TheseindicatorsshowanegativecorrelationwitheGFR,withthedeclineintheeGFR,whichshowedanincreasingtrend,amongwhichNGAL,alpha1-MG,correlationcoefficientabsolutevalueislarger,respectively-0.707,-0.728,-0.707;positivecorrelationwithACR,namelywiththeincreaseofACR,whichshowedthesametrendtorise.TheIgGandurinaryTRFabsolutevalueofcorrelationcoefficientislarger,respectively0.841,0.883,0.824,0.812.UrineTRF,IgG,KIM-1,L-FABP,NGAL,RBP,alpha1-MG,MCP-1,CFBweresignificantlycorrelatedwith-3- 海军军医大学硕士学位论文traditionalriskstratification.(p<0.001),whichwasstatisticallysignificant.ThecorrelationofTRF,IgG,alpha1-MG,L-FABPandCFBwasmoresignificant.Conclusions:InpatientswithDKD,urineTRF,IgG,KIM-1,L-FABP,NGAL,RBP,alpha1-MG,MCP-1andCFBweresignificantlycorrelatedwithtraditionalkidneyevaluationindexeGFRandACR.ThecorrelationbetweenTRF,IgG,alpha1-MG,L-FABP,CFBandthetraditionalriskstratificationissignificant,whichishelpfultoevaluatetheprognosisofDKD.Asaresult,theseurinaryproteinmarkersareusefulinassistingtraditionalindicatorstodeterminewhetherthekidneyisinvolved,toevaluatethedegreeofrenaldisease,andtopredicttheprognosis.ThesemarkersdidnotincreasemostsignificantlyingroupDKD,andwerenotsignificantlydifferentfromthoseinothergroups.Sotheyhavenovalueofdifferentialdiagnosis.TRFisofvaluetodiagnosisMN,MCP-1isofvaluetodiagnosisLN.KeyWords:Diabetickidneydisease,urinebiomarkers(DKD),estimatedglomerularfiltrationrate(eGFR),microalbuminuria/creatinine(ACR),prognosisofkidneydisease-4- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究中英文缩略语缩略语英文全称中文全称DKDDiabetickidneydisease糖尿病肾病eGFREstimatedGlomerularFiltrationRate估算肾小球滤过率ELISAenzyme-linkedimmunesorbentassay酶联免疫吸附测定Neutrophilgelatinase-associated中性粒细胞明胶酶相关脂NGALlipocalin质运载蛋白MCP-1MonocyteChemoattractantProtein-1单核细胞趋化蛋白-1KIM-1KidneyInjuryMolecule-1肾脏损伤分子-1CFBComplementFactorB补体B因子α1-MGα1-microglobulinα1-微球蛋白RBPRetinolBindingProtein视黄醇结合蛋白ACRAlbuminCreatinineRatio尿白蛋白/肌酐比值IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GTRFTransferrin转铁蛋白CrCreatinine肌酐L-FABPLiver-typefattyacid-bindingprotein肝型脂肪酸结合蛋白MNmembranousnephropathy膜性肾病LNlupusnephritis狼疮性肾炎-5- 海军军医大学硕士学位论文尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究一、引言随着经济发展水平的提高，人们的生活方式发生了显著的变化。能量摄取过多和体力活动的减少等不良生活方式也改变了疾病谱。在我国，2013年，有10.9%的居民患糖尿病，糖尿病前期患病率为35.7%。与此同时2型糖尿病患者中DKD的发病率为10—40%，在终末期肾病中DKD占16.4%，且有逐年增加的趋势。因此早期诊断治疗DKD，避免终末期肾病的发生意义重大[1-4]。目前诊断评价DKD的临床指标主要是尿白蛋白和估算肾小球滤过率。自2002年起，KDOQI指南就推荐以24小时尿样本检测的白蛋白浓度做为评价糖尿病进程中肾脏受累的一个指标[5]。然而，做为一个重要的诊断指标，尿白蛋白存在一些不足。白蛋白尿既不是糖尿病肾损害所特有的标志物，也不是肾损害所特有的标志物。在已经发生肾功能衰竭的糖尿病患者中，有约30%并没有白蛋白尿[6]。在一部分糖尿病肾病患者中也观察到，在肾滤过功能持续下降的过程中，尿白蛋白消失了。而肾小球滤过率的估算主要是通过血肌酐浓度。但血肌酐浓度不仅取决于肾小球滤过率，同时与许多其它因素有关。比如肌肉含量、性别、年龄、饮食以及服药情况等。尿中肌酐亦不仅仅来自于肾小球的滤过，其中一部分是来自于肾小管的分泌。因此，相对于真实的情况，以肌酐清除水平估算得来的肾小球滤过率可能会被高估了[7]。寻找新的诊断、评价DKD的指标显得十分迫切。尿蛋白谱是受大家高度关注的一个方面。目前，在这个领域内，很有前途的生物标志物有以下这些：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾脏损伤分子-1(KIM-1)等。已有许多相关的研究，但大多采用的指标单一，或是样本量少。因此，我们开展此项研究，进一步研究尿蛋白标志物在DKD诊断、评估方面的意义。二、研究内容和方法（一）研究设计本研究为观察性、横断面研究。已获得上海长征医院生物医学研究伦理委员会批准（批件编号2016SL011）。（二）研究对象选取自2014年4月至2017年6月期间住院或门诊随访的DKD患者、IgA肾病患者、膜性肾病（MN）患者、狼疮性肾病（LN），本院体检中心健康体检的正常人。-6- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究1、DKD诊断标准有明确的糖尿病病史（≥5年），符合KDIGO慢性肾脏疾病诊断标准，排除了non-DKD(其它常见CKD病因，详见排除标准）或肾穿刺病理支持糖尿病性肾病组织学改变，有典型糖尿病性视网膜病变有利于诊断。备注：对于典型的糖尿病肾病病例，目前国际指南没有推荐行肾穿刺活检来明确诊断。因此临床中，以病理明确的糖尿病肾病病例较少。故入组及排除标准采用国际惯例办法。KDIGO慢性肾脏疾病诊断标准：（1）肾损伤标志（至少满足一条）：①白蛋白尿（AER≥3mg/24h；ACR≥3mg/mmol或30mg/g）；②尿沉渣异常；③肾小管相关病变；④组织学异常；⑤影像学所见结构异常；⑥肾移植病史。（2）GFR下降：GFR≤60ml/min/1.73m2（3）以上两项中，满足任一项指标持续超过3个月即可诊断慢性肾脏疾病。2、入组及排除标准：（1）入组标准①获取知情同意时，年龄、性别不限。②确诊为DKD的患者③签署知情同意书（2）排除标准（符合下列条件之一的患者将不得入选研究）①已行血液透析、腹膜透析、肾移植等肾脏替代治疗②近期有局部或全身感染（包括泌尿系及其它器官）③急性肾损伤，近期有显著红细胞尿④合并原发或继发性肾小球疾病、恶性高血压等，尿蛋白定量>3.5g/24h⑤合并恶性肿瘤或自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合症、血管炎等）⑥近期正在服用激素或免疫抑制剂，⑦近期有重大创伤史、手术史⑧存在肝功能损伤（和/或ALT、AST水平高于正常值上限），合并心功能不全（纽约心脏协会功能分类III级以上）、不稳定心绞痛、心肌梗死、心电图示左室肥厚、血管栓塞性疾病患者⑨怀孕或处于哺乳期，其它研究者判定不适合作为研究对象的患者3、健康对照的入选要求近期无全身或局部感染、无手术外伤史；无遗传性疾病；无心脑血管、肝肾、血液、肿瘤、代谢等系统重大疾病史。-7- 海军军医大学硕士学位论文4、IgA肾病患者入选要求病理明确诊断为IgA肾病，且近期无全身或局部感染、无手术外伤史；无遗传性疾病；无心脑血管、肝肾、血液、肿瘤、代谢等系统重大疾病史。5、MN患者入选要求病理明确诊断为MN，且近期无全身或局部感染、无手术外伤史；无遗传性疾病；无心脑血管、肝肾、血液、肿瘤、代谢等系统重大疾病史。6、LN患者入选要求病理明确诊断为LN，且近期无全身或局部感染、无手术外伤史；无遗传性疾病；无心脑血管、肝肾、血液、肿瘤、代谢等系统重大疾病史。（三）研究步骤1、入组患者依本研究所制定的入选和排除标准，选择合适的入组患者和健康人对照，做到知情同意并签署知情同意书。2、信息及样本采集登记患者基本信息、一般情况包括身高、体重、血压等。记录病史材料及血常规、尿常规、肝肾功能电解质、血脂等实验室检查结果。收集患者次日空腹清洁中段晨尿20ml,3000rpm×10min离心，而后取上清液分装，保存于-80℃冰箱中。健康对照取自来我院体检中心体检人员，标本收集保存方法同前。3、样本检测测定的相关指标，包括肾小球损伤指标：尿免疫球蛋白IgG、尿白蛋白、尿转铁蛋白（TRF）；近端小管损伤指标：肾脏损伤分子（KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、肝型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、视黄醇结合蛋白（RBP）、α1-微球蛋白；炎症指标：单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）；体指标：补体B因子（CFB）。（四）实验方法1、尿IgG检测（1）检验原理：基于散射比浊法。标本中的IgG与特异性抗体发生免疫反应，形成免疫复合物，从而反应液的光束发生散射，散射光强度与标本IgG浓度成正比。通过与已知标准浓度对比得到标本的浓度值。-8- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究（2）需要用到的试剂及仪器：免疫球蛋白G测定试剂盒（散射比浊法），由德国西门子（SIEMENS）公司生产，产品编号OSAS15。其它材料包括：蛋白标准品(人用)，货号为OQIM；蛋白质控品低、中和高（人用），货号为OQIN、OQIO和OQIP；蛋白质控品（人用），货号为OQLW；反应缓冲液，货号为OUMS；稀释剂，货号为OUMT。BNIISystem全自动蛋白分析仪（西门子；德国）。2、尿白蛋白检测（1）检验原理：基于散射比浊法。标本中的白蛋白与特异性抗体发生免疫反应，形成免疫复合物，从而反应液的光束发生散射，散射光强度与标本白蛋白浓度成正比。通过与已知标准浓度对比得到标本的浓度值。（2）需要用到的试剂及仪器：试剂盒：白蛋白测定试剂盒（散射比浊法），系德国西门子公司生产，产品编号OSAL15。其它材料：多项蛋白定标品(人用)，货号OQIM；多项蛋白质控品，低、中、高（人用），货号OQIN、OQIO、OQIP；多项蛋白质控品（人用），货号OQLW；反应缓冲液，货号OUMS；反应稀释剂，货号OUMT。仪器：全自动蛋白分析仪（BNIISystem；西门子；德国）。3、尿转铁蛋白检测（1）检验原理：基于散射比浊法。标本中的转铁蛋白与特异性的抗体形成免疫复合物，使穿过标本的光束发生散射，散射光强度和标本中转铁蛋白浓度成正比，根据定标曲线得到标本的浓度。（2）需要用到的试剂及仪器：试剂盒：转铁蛋白测定试剂盒（散射比浊法）（产品编号OSAX15，西门子，德国）。其它材料:N蛋白标准品SL(人源性)，货号是OQIM；N/T蛋白质控SL/L(人源性)、M、H，货号是OQIN、OQIO、OQIP；N/T蛋白质控LC(人源性)，货号是OQLW；N反应缓冲液，货号OUMS；N稀释剂，货号OUMT。仪器：全自动蛋白分析仪（BNIISystem；西门子；德国）。4、尿KIM-1检测（1）检验原理：基于酶联免疫吸附测定（ELISA）。采用定量双抗体夹心酶联免疫检测技术。96孔微型板块中预先包被针对人KIM-1的特异性单克隆抗体，标准品和样品加入微孔后，其中的KIM-1会与KIM-1单抗相结合。而后将特异性针对人KIM-1的酶联多克隆抗体加入微孔中，通过洗涤去除所有未结合固定上的抗体-酶试剂，加入反应底物并显色。颜色深浅与第一步所加入的KIM-1的量成比例。酶标仪读取OD值，拟合标准曲线并换算成样品浓度。（2）需要用到的主要仪器及试剂：多功能酶标仪（SpectraMaxi3x;MolecularDevices;Austria)。ELISA试剂盒HumanTIM-1/KIM-1/HAVCR免疫检测试剂盒（货-9- 海军军医大学硕士学位论文号DKM100；R&Dsystems）。（3）检测流程试剂准备。试验前所有试剂拿至室温。①配制洗涤液：以1：25对试剂盒中洗涤液进行稀释，稀释液为去离子水；②配制底物：使用前15分钟内底物A和底物B以1：1混合，避光保存；③RD6Q稀释液:该稀释液使用前用去离子水以1：2稀释，涡旋器混匀；④KIM-1标准品：以1ml的去离子水溶解标准品作为标准品原液（KIM-1浓度为100ng/ml），用涡旋器混匀，室温下静置至少15分钟。取EP管8个，编号S1-S8。向S1中加入900ul已配制RD6Q稀释液，向S2-S8管中分别加入500ulRD6Q稀释液。混匀标准品原液，用移液枪吸取100ul的标准品原液加入S1中，用涡旋器混匀。此时S1的KIM-1浓度为10ng/ml。然后自S1管中取500ul至S2管，用涡旋器混匀，此时S2的KIM-1浓度为5ng/ml；以此类推至S7管，S8管中仅以所制配的RD6Q稀释液作为空白对照。最终标准品S1-S8的KIM-1浓度依次为10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0，单位为ng/ml。检测步骤：①取出12×8的孔板，记号笔在边缘依次标明序号，向各孔中加入AssayDiluentRD1-82溶液100ul；②各孔中依序号加入标准品（加做一行以对照）、待测样品，各50ul。贴上保护膜，室温孵育2小时。（若检测结果超出测量范围，复测时可稀释样品）；③弃去微孔中的液体并洗涤，共洗涤4次。每次洗涤时，加入400ul的稀释洗涤液，静置大于15秒，拍板；每一次洗涤应尽可能排尽微孔中液体；④向每孔中加入200ulKIM-1检测抗体，覆盖新的保护膜，室温下孵育2小时；⑤重复步骤③；⑥200ul的混合底物，在室温下避光孵育30分钟；⑦向每孔中加入反应终止液50ul,观察颜色，必要时轻拍检测板以保证充分混合。⑧使用酶标仪于450nm波长下读取OD值；⑨使用ELISACalc回归/拟合计算程序-v0.1取得拟合曲线并将OD值换算成浓度。5、尿NGAL检测（1）检验原理：基于酶联免疫吸附测定（ELISA）。采用定量双抗体夹心酶联免疫检测技术。96孔微型板块中预先包被针对人NGAL/Lipocalin-2的单克隆抗体，标准品和样品加入微孔后，其中的NGAL会与NGAL单抗相结合。检测抗体（Lipocalin-2Conjugate）是HRP标记的抗Lipocalin-2的单克隆抗体。反应显色后-10- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究酶标仪读取OD值，拟合标准曲线并换算成样品浓度。（2）需要用到的主要仪器及试剂：多功能酶标仪（SpectraMaxi3x;MolecularDevices;Austria)。HumanLipocalin-2/NGAL免疫检测试剂盒（货号DLCN20；R&Dsystems）。（3）检测流程试剂准备。检测抗体Lipocalin-2Conjugate使用期间需始终维持在2-8℃，除此之外的所有试剂拿至室温。①配制洗涤液：以1：25对试剂盒中洗涤液进行稀释，稀释液为去离子水；②配制底物：使用前15分钟内底物A和底物B以1：1混合，避光保存；③RD5-24稀释液:该稀释液使用前用去离子水以1：5稀释，涡旋器混匀；④NGAL标准品：以1ml的去离子水溶解标准品作为标准品原液（NGAL浓度为100ng/ml），用涡旋器混匀，室温下静置至少15分钟。取EP管8个，编号S1-S8。向S1中加入900ul已配制RD5-24稀释液，向S2-S8管中分别加入500ulRD5-24稀释液。混匀标准品原液，用移液枪吸取100ul的标准品原液加入S1中，用涡旋器混匀。此时S1的NGAL浓度为10ng/ml。然后自S1管中取500ul至S2管，用涡旋器混匀，此时S2的NGAL浓度为5ng/ml；以此类推S7管，S8管中仅以所制配的RD5-24稀释液作为空白对照。最终标准品S1-S8的NGAL浓度依次为10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0，单位为ng/ml。检测步骤：①取出12×8的孔板，记号笔在边缘依次标明序号，向各孔中加入AssayDiluentRD1-52溶液100ul；②待测样品以1：10进行稀释；各孔中依序号加入标准品（加做一行以对照）、稀释后待测样品，各50ul。贴上保护膜，2-8℃孵育2小时。（若检测结果超出或低于测量范围，复测时可视情况稀释样品）；③弃去微孔中的液体并洗涤，共洗涤4次。每次洗涤时，加入400ul的稀释洗涤液，静置大于15秒，拍板；每一次洗涤应尽可能排尽微孔中液体；④向每孔中加入200ulLipocalin-2Conjugate，覆盖新的保护膜，2-8℃孵育2小时；⑤重复步骤③；⑥200ul的混合底物，在室温下避光孵育30分钟；⑦向每孔中加入反应终止液50ul,观察颜色，必要时轻拍检测板以保证充分混合。⑧使用酶标仪于450nm波长下读取OD值；⑨使用ELISACalc回归/拟合计算程序-v0.1取得拟合曲线并将OD值换算成浓-11- 海军军医大学硕士学位论文度。6、尿L-FABP检测（1）检验原理：基于酶联免疫吸附测定（ELISA）。采用定量双抗体夹心酶联免疫检测技术。96孔微型板块中预先包被抗人L-FABP的抗体，标准品和样品加入微孔后，其中的L-FABP会与L-FABP单抗相结合。再加入生物素标记的检测抗体（Biotinylatedtracerantibody），孵育，实现双抗体夹心，再加入辣根过氧化物酶（HRP-Conjugate）与生物素标记的检测抗体相结合。加底物反应显色后酶标仪读取OD值，拟合标准曲线并换算成样品浓度。（2）需要用到的主要仪器及试剂：多功能酶标仪（SpectraMaxi3x;MolecularDevices;Austria)。试剂盒HumanL-FABPELISAkit（货号HK404；Hycultbiotech）。（3）检测流程试剂准备。所有试剂放至室温。①配制洗涤液：以1：40对试剂盒中洗涤液进行稀释，稀释液为去离子水；②SampleDilutionBuffer：使用前以1：10混合，稀释液为去离子水；③DilutionBuffer:该稀释液使用前用去离子水以1：10稀释，稀释液为去离子水；④L-FABP标准品：加入520ulSampleDilutionBuffer的去离子水溶解标准品作为标准品原液（L-FABP浓度为25ng/ml），用涡旋器混匀，室温下静置至少30分钟。取EP管8个，编号S1-S8。标准品原液即为S1，向S2-S8管中分别加入450ulSampleDilutionBuffer。混匀标准品原液，用移液枪吸取300ul的标准品原液加入S2中，用涡旋器混匀。然后自S2管中取300ul至S3管，用涡旋器混匀，以此类推S7管，S8管中仅以SampleDilutionBuffer作为空白对照。最终标准品S1-S8的NGAL浓度依次为25000、10000、4000、1600、640、256、102、0，单位为pg/ml。⑤配制Tracersolution：先用1ml去离子水溶解，混匀，静置20分钟；而后于无菌管中，加入11ml的DilutionBuffer稀释。⑥HRP-Conjugate：以DilutionBuffer按1：100稀释。检测步骤：①取出12×8的孔板，记号笔在边缘依次标明序号；②待测样品以1：10进行稀释；各孔中依序号加入标准品（加做一行以对照）、稀释后待测样品，各100ul。贴上保护膜，室温孵育1小时。（若检测结果超出或低于测量范围，复测时可视情况稀释样品）；③弃去微孔中的液体并洗涤，共洗涤4次。每次洗涤时，加入400ul的稀释洗涤液，静置大于15秒，拍板；每一次洗涤应尽可能排尽微孔中液体；④加入Tracersolution，室温孵育1小时。-12- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究⑤重复步骤③；⑥加入稀释后的HRP-Conjugate（1：100）100ul，再次室温下孵育1h；⑦重复步骤③；⑧加底物（TMBSubstrate）100ul,避光显色约20min；使用酶标仪于450nm波长下读取OD值；⑨向每孔中加入反应终止液100ul,观察颜色，必要时轻拍检测板以保证充分混合。使用酶标仪于450nm波长下读取OD值；⑩使用ELISACalc回归/拟合计算程序-v0.1取得拟合曲线并将OD值换算成浓度。7、尿RBP检测（1）检验原理：基于免疫透射比浊法。抗原（RBP）与特异性的抗体（系羊抗人RBP抗血清）结合，形成免疫复合物（不溶性），导致反应液产生浑浊，浊度的高低即透光度减少、吸光度增加可以反映尿液样本中RBP含量，根据校准品所作出的剂量反应曲线来计算出相应浓度。（2）需要用到的试剂及仪器：尿视黄醇结合蛋白免疫透射比浊法测定试剂盒（批号；由上海北加生化试剂有限公司生产）。仪器：全自动生化仪（仪器型号AU5421;BECKMANCOULTER；美国）。尿RBP的检测在本院检验科完成。8、尿α1-微球蛋白测定（1）检测原理：标本中α1-微球蛋白与特异抗体发生抗原-抗体反应形成免疫复合物，使得穿过标本的光束发生了散射，散射光强度和标本中α1-微球蛋白浓度成正比，再根据定标曲线得到相应样本浓度。（2）需要用到的试剂及仪器：α1-微球蛋白测定试剂盒（散射比浊法）（产品编号OWLA11，西门子公司，德国）。其它材料:N蛋白标准品SL(人源性)，货号是OQLV；N/T蛋白质控LC(人源性)，货号为OQLW；N稀释剂，货号OUMT；N反应缓冲液，货号OUMS。仪器：全自动蛋白分析仪（BNIISystem；西门子SIEMENS；Germany）。9、尿MCP-1检测（1）检验原理：基于酶联免疫吸附测定（ELISA）。采用定量双抗体夹心酶联免疫检测技术。96孔微型板块中预先包被针对人MCP-1的特异性单克隆抗体，所用检测抗体为辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人MCP-1抗体，底物与HRP反应显色。颜色深浅与第一步所加入的MCP-1的量成比例。酶标仪读取OD值，拟合标准曲线并换算成样品浓度。-13- 海军军医大学硕士学位论文（2）需要用到的主要仪器及试剂：多功能酶标仪（SpectraMaxi3x;MolecularDevices;Austria)。ELISA试剂盒:HumanMCP-1检测试剂盒（货号BMS281/BMS281TEN；eBioscience）。（3）检测流程试剂准备。试验前所有试剂拿至室温。①配制洗涤液：以1：20对试剂盒中洗涤液进行稀释，稀释液为去离子水；②配制HRP-Conjugate：使用AssayBuffer按1：100稀释，配制好后在30分钟内使用；③配制AssayBuffer:该稀释液使用前用去离子水以1：20稀释。④MCP-1标准品：以350ul的去离子水溶解标准品作为标准品原液（MCP-1浓度为2ng/ml），用涡旋器混匀，室温下静置至少15分钟。取EP管8个，编号S1-S8。向S1-S8管中分别加入300ulAssayBuffer。混匀标准品原液，向S1中加入300ul标准品原液。此时S1的MCP-1浓度为1ng/ml，即1000pg/ml。用涡旋器混匀。然后自S1管中取300ul至S2管，用涡旋器混匀，此时S2的MCP-1浓度为500pg/ml；以此类推至S7管，S8管中仅以所制配的AssayBuffer作为空白对照。最终标准品S1-S8的MCP-1浓度依次为1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、0，单位为pg/ml。检测步骤：①取出12×8的孔板，记号笔在边缘依次标明序号。②洗板：共洗涤4次。每次洗涤时，加入400ul的稀释洗涤液，静置大于15秒，拍板；每一次洗涤应尽可能排尽微孔中液体；③各孔中依序号加入标准品（加做一行以对照）、待测样品，各100ul。（若检测结果超出测量范围，复测时可稀释样品）；④向每孔中加入50ul配制好的HRP-Conjugate，覆盖的保护膜，室温下孵育2小时；⑤依步骤②的方法，洗涤3次；⑥每孔加底物（TMBSubstrateSolution）100ul，在室温下避光孵育10分钟；⑦向每孔中加入反应终止液100ul,观察颜色，必要时轻拍检测板以保证充分混合。⑧使用酶标仪于450nm波长下读取OD值；⑨使用ELISACalc回归/拟合计算程序-v0.1取得拟合曲线并将OD值换算成浓度。10、尿CFB检测-14- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究（1）检验原理：基于酶联免疫吸附测定（ELISA）。采用定量双抗体夹心酶联免疫检测技术。96孔微型板块中预先包被针对人CFB的特异性单克隆抗体，所用检测抗体为辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人CFB抗体，底物与HRP反应显色。颜色深浅与第一步所加入的CFB的量成比例。酶标仪读取OD值，拟合标准曲线并换算成样品浓度。（2）需要用到的主要仪器及试剂：多功能酶标仪（SpectraMaxi3x;MolecularDevices;Austria)。ELISA试剂盒:CFB（Human）ELISAkit（货号KA3816；Abnova）。（3）检测流程试剂准备。试验前所有试剂拿至室温。①配制洗涤液：以1：20对试剂盒中洗涤液进行稀释，稀释液为去离子水；②配制EIADiluentConcentrate（10X）:该稀释液使用前用去离子水以1：10稀释。③配制生物素标记的检测抗体：使用EIADiluentConcentrate按1：50稀释；④SPConjugate（100X）:使用EIADiluentConcentrate按1：100稀释；⑤CFB标准品：以2ml的EIADiluentConcentrate溶解标准品作为标准品原液（CFB浓度为280ng/ml），用涡旋器混匀，室温下静置至少15分钟。取EP管8个，编号S1-S8。向S1中加入标准品原液,向S2-S8管中分别加入200ulEIADiluentConcentrate。然后自S1管中取200ul至S2管，用涡旋器混匀，此时S2的CFB浓度为140pg/ml；以此类推至S7管，S8管中仅以所制配的EIADiluentConcentrate作为空白对照。最终标准品S1-S8的CFB浓度依次为280、140、70、35、17.5、8.75、4.375、0，单位为ng/ml。检测步骤：①取出12×8的孔板，记号笔在边缘依次标明序号。②各孔中依序号加入标准品（加做一行以对照）、待测样品，各50ul。（若检测结果超出测量范围，复测时可稀释样品）；③洗板：共洗涤5次。每次洗涤时，加入400ul的稀释洗涤液，静置大于15秒，拍板；每一次洗涤应尽可能排尽微孔中液体；④向每孔中加入50ul配制好的生物素标记的检测抗体，覆盖的保护膜，室温下孵育1小时；⑤依步骤③的方法，洗涤5次；⑥每孔加SPConjugate50ul，在室温下孵育30分钟；⑦依步骤③的方法，洗涤5次；⑧向每孔中加入底物50,避光显色20分钟。然后加终止液50ul，终止反应。观察-15- 海军军医大学硕士学位论文颜色，必要时轻拍检测板以保证充分混合。⑨使用酶标仪于450nm波长下读取OD值；⑩使用ELISACalc回归/拟合计算程序-v0.1取得拟合曲线并将OD值换算成浓度。11、估算肾小球滤过率（eGFR）：采用CKD-EPI公式计算eGFR[11]。（五）统计分析连续性变量，首先进行正态性检验。因为所统计数据样本量小于5000，故采用Shapiro-Wilk(W检验)作为正态检验的工具。若符合正态分布，则用均数±标准差表示，若不符合正态分布，对原数据进行相应转换（如取对数等），转换后再进行正态性检验。若最终不符合正态分布，则用中位数[四分位数]表示。作相关性分析时，若两变量符合正态分布或经转换后符合正态分布，则采用Pearson相关，计算相关系数；若不符合且经转换后依然不符合正态分布时，采用Spearman秩相关，计算相关系数。多组间进行差异比较时，若变量不符合且转换后亦不符合正态分布，则采用Kruskal-Wallis检验。两组间进行差异比较时，若变量不符合且转换后亦不符合正态分布，则采用Mann-WhitneyU检验。三、结果（一）各组患者的基本情况及临床资料该研究属于观察性、横断面研究。依据上面所述纳入及排除标准，最终纳入研究对象共计390人，其中DKD患者160人，IgAN患者69人，LN患者52人，MN患者65人，健康人44人。纳入对象的基本情况及临床资料如下表。-16- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究表1纳入对象的基本情况及临床资料DKDIgANLNMN健康人数16069526544男性（%）7146216650年龄（岁）58±1040±1236±1459±1341±11吸烟（%）3523122927体质指数(Kg/m2)24±323±424±124±122±3收缩压(mmHg)130±17130±16125±19126±17116±12舒张压(mmHg)78±984±1281±1382±971±9血红蛋白(g/L)124±24118±24100±24123±22147±19白蛋白(g/L)37±736±527±923±650±3eGFR（ml/min*1.73m2）67±4460±4170±4573±32106±11胆固醇(mmol/L)5.0±1.44.8±1.35.3±1.67.3±2.25.0±0.7甘油三脂(mmol/L)2.4±1.52.0±1.42.6±1.32.6±1.51.1±0.4ALT(U/L)26±2019±1322±1629±1520±8AST(U/L)25±1618±725±1624±1519±5尿酸(umol/L)395±113460±150446±137390±116296±63注：数据符合正态分布时以均数±标准差表现，若不符合正态分布，则以中位数[四分位数]表示。eGFR为估算肾小球滤过率，采用公式为CKD-EPI。ALT为丙氨酸氨基转移酶，AST为门冬氨酸氯基转移酶。-17- 海军军医大学硕士学位论文表2各组的尿蛋白标志物的基本情况健康DKDIgANLNMNTRF（mg/g）2[1-3]4[2-44]47[13-112]97[34-242]143[50-357]IgG（mg/g）3[2-5]8[3-67]48[23-137]17[81-397]75[19-363]KIM-1（pg/g）455[381-656]979[432-2362]1847[838-3687]3134[1031-8107]4299[2210-7803]L-FABP（ng/g）4[3-5]24[9-142]22[10-66]42[15-139]64[23-131]NGAL（ng/g）4[2-8]15[4-176]4[0-55]25[0-211]17[2-99]RBP（mg/g）0.6[0.4-1.0]0.5[0.2-3.2]0.3[0.2-0.7]2.5[0.4-6.9]2.1[0.5-7.0]α1-MG（mg/g）6[4-10]18[7-91]18[7-59]25[13-102]40[17-74]MCP-1（pg/g）53[24-94]69[187-677]215[78-889]851[143-1550]414[214-735]CFB（ug/g）13[5-31]12[2-66]18[13-53]43[20-107]26[19-47]注：数据符合正态分布时以均数±标准差表现，若不符合正态分布，则以中位数[四分位数]表示。各组数据已经正态性检验，不符合正态分布，且经对数转换报依然不符合正态分布，故以中位数[四分位数]表示。各值均为经尿肌酐标化后的结果。-18- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究表1显示的是纳入的各组人群的基本情况和临床资料。在性别比例方面，DKD患者与MN患者中男性比例较高，LN患者中女性比例较高，这与流行病学中各病的发病率是一致的。年龄以DKD、MN组较高，LN组年龄较小。糖尿病中以2型糖尿病多见，当累及肾脏时，多有多年糖尿病病史，故其年龄较大；LN患者多发生于中青年女性，故其年龄较小。吸烟情况在各组中无显著差异。体质指数在各患病组较高，而健康人群较低。收缩压在全组比较时有差异，而各患病组比较时差异无显著性。这是因为肾病的患者常见的临床表现为高血压。因LN为系统性疾病的肾脏表现，亦常累及造血系统，故其血红蛋白水平较其它组较低。肝酶的指标在各组中差异不显著。各患病组的eGFR无显著差异。表2显示的是各组尿蛋白标志物的基本情况。（二）DKD患者标化尿蛋白标志物与eGFR、ACR的相关性分析因为经检验各标化尿蛋白指标均不符合正态分布，故采用Spearman相关分析。具体分析结果见下表、图：表3各标志物与传统评价指标之间的相关性分析eGFRACR变量相关系数p相关系数pTRF（mg/g）-0.592＜0.0010.812＜0.001IgG（mg/g）-0.594＜0.0010.824＜0.001KIM-1（pg/g）-0.421＜0.0010.643＜0.001L-FABP（ng/g）-0.641＜0.0010.744＜0.001NGAL（ng/g）-0.634＜0.0010.627＜0.001RBP（mg/L）-0.418＜0.0010.526＜0.001α1-MG（mg/g）-0.707＜0.0010.783＜0.001MCP-1（pg/g）-0.562＜0.0010.682＜0.001CFB（ug/g）-0.524＜0.0010.690＜0.001注：各标志物均经尿肌酐标化，统计采用的是Spearman相关分析。-19- 海军军医大学硕士学位论文-20- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究-21- 海军军医大学硕士学位论文注：图1.1-1.18显示的是各尿蛋白标志物与传统指标之间相关关系的散点图。因为采用的方法是秩相关，故未在图中添加趋势线。图中注释显示的是相关系统及p值。如上表、图所示，各尿蛋白标志物与经肾脏疾病的评价指标eGFR、ACR存在显著相关关系，p值均小于0.05。其中，与eGFR均呈现负相关性，即随着eGFR的下降，这些尿蛋白标志物是呈上升趋势的。与ACR均呈现正相关性，即随着ACR的下降，这些尿蛋白标志物是呈上升趋势的。在这些标志物中，以α1-MG、NGAL、L-FABP-22- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究与eGFR相关性较高，相关系数分别为-0.707、-0.634、-0.641；IgG、TRF、α1-MG与ACR相关性较高，相关系数分别为0.824、0.812、0.783。这种与经典指标之间的显著相关关系赋予了这些标志物用来辅助诊断、评价肾脏疾病的可能性，是其有辅助诊断、评价意义的必要条件。（三）DKD患者尿蛋白标志物与预后的差异和相关分析依据上海慢性肾脏病早发现及规范化诊治与示范项目专家组编写的慢性肾脏病筛查、诊断及防治指南，将DKD患者依eGFR和ACR两个维度进行危险分层，共分为低危、中危、高危、极高危四层。对各危险度亚组间的尿蛋白标志物进行差异分析，若存在差异，则进行相关性分析。因为经检验各尿蛋白指标均不符合正态分布，故采用Kruskal-Wallis检验。详细结果见下表、图。表4DKD各危险度分层间的Kruskal-Wallis检验变量KWpTRF（mg/g）76.699＜0.001IgG（mg/g）79.921＜0.001KIM-1（pg/g）51.029＜0.001L-FABP（ng/g）79.051＜0.001NGAL（ng/g）69.748＜0.001RBP（mg/g）47.674＜0.001α1-MG（mg/g）91.800＜0.001MCP-1（pg/g）63.616＜0.001CFB（ug/g）73.854＜0.001KIM-1（pg/g）51.029＜0.001注：KW为检验统计量，p为显著性。因为多组间的K-W检验，两两比较时校正的p为<0.005。-23- 海军军医大学硕士学位论文-24- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究注：图1.01-1.09显示是各危险度亚组间尿蛋白标志物的比较。p值见上表。进一步对各标志物与危险度分层变量进行相关性分析，结合变量分布特征，采用spearman相关检验。结果如下表。表5DKD尿蛋白标志物与危险度变量的相关性检验危险度变量相关系数pTRF（mg/g）0.805＜0.001IgG（mg/g）0.833＜0.001KIM-1（pg/g）0.589＜0.001L-FABP（ng/g）0.739＜0.001NGAL（ng/g）0.644＜0.001-25- 海军军医大学硕士学位论文RBP（mg/g）0.557＜0.001α1-MG（mg/g）0.803＜0.001MCP-1（pg/g）0.653＜0.001CFB（ug/g）0.715＜0.001IgG（mg/g）0.833＜0.001如上表所示，尿蛋白标志物与DKD的危险度分层变量呈显著的正相关关系，p＜0.05。随着危险度分层的升高，各尿蛋白指标亦呈现上升趋势。其中，以IgG、TRF、α1-MG与危险度变量相关性更为密切，可以用来辅助进行预后评估。（四）DKD组分别与对照组进行尿蛋白标志物的差异分析将DKD组分别与正常人对照组及其它CKD组进行尿蛋白标志物的差异分析，观察各尿蛋白标志物在DKD患者中的特异性。因为比较的变量不符合正态分布，采用Mann-WhitneyU检验。检验统计结果如下：-26- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究注：图2.1-2.9显示的是各组之间尿蛋白标志物的比较，p值为各组分别与DKD组进行差异比较时所得。图中星号及圆圈表示数据中的极端值。由上图可见，在健康和疾病人群之间以及不同疾病组之间，尿蛋白标志物是有明-27- 海军军医大学硕士学位论文显差异的。具体而言，对于DKD组，KIM-1、IgG、TRF这三个指标与其它各组之间均存在显著差异。但这种差异只是统计学上，从图上可以看出，它们并不是在DKD组升高最明显，不足以用来进行疾病之间的鉴别。其它标志物也不是在DKD组升高最明显、且与其它疾病组有显著差异的，因此这些标志物还不能作为DKD的诊断依据。有意思的是，可以看出，TRF在MN组升高最明显且与其它组之间差异明显，MCP-1在LN组升高最明显且与其它组之间差异明显，提示这两种标志物在这两种疾病有提供诊断支持的价值。四、讨论本研究选择了9个尿蛋白标志物作为研究对象，分别为IgG、TRF、α1-MG、RBP、NGAL、KIM-1、L-FABP、MCP-1、CFB。以上指标涉及的生理病理损害包括小球损害、小管损害、炎症反应、补体系统反应等，是比较全面的。IgG和TRF都属于大分子量蛋白，其分子量分别为146kD和80kD。在生理状态下，它们是不能通过肾小球滤过屏障的。因此它们在尿液里出现预示着肾小球滤过屏障的破坏，是肾小球损伤的标志物[12-14]。α1-MG的是一种小分子糖蛋白，分子量约为33kD。RBP也是一种小分子蛋白，分子量约为21kD。它们可以自由从肾小球滤过，绝大部分在近端小管被重吸收。故在正常情况下，尿液中只有微量的α1-MG和RBP。而当肾小管受到损害，重吸收能力下降时，尿液中α1-MG和RBP会增加[13-15]。NGAL，也即载脂蛋白2，是一种可以在中性粒细胞颗粒检测到的分子量大约25KD的分泌蛋白，属于载脂蛋白家族的成员。当肾脏缺血或中毒时，NGAL在髓袢升支的表达是显著增加的。KIM-1是一种1型跨膜糖蛋白，其胞外部分含有免疫球蛋白和粘液结构域。当缺氧或损伤时表达在近端肾小管，健康人未发现其表达[16-18]。L-FABP是一种同时表达在肝细胞和肾脏的近段小管的，肾小管损伤时它会出现在尿液[18-20]。因此，α1-MG、RBP、NGAL、KIM-1、L-FABP主要代表肾小管的损伤。MCP-1是趋化因子家族成员，主要功能是招募单核-巨噬细胞，诱发炎症反应[21-22]。CFB，即补体B因子，属于补体旁路系统的重要组分。传统的DKD评价指标主要是eGFR和ACR[23]。在该研究，我们所研究的9种尿蛋白标志物与eGFR和ACR都有显著的相关性。其中与eGFR是负相关，与ACR是正相关。随着疾病的进展，eGFR逐步下降，肾脏损害日渐严重，代表肾小球、肾小管损害、炎症反应和补体系统的活动的标志物呈上升趋势。在这些标志物中，以α1-MG、NGAL、L-FABP与eGFR相关性较高，相关系数分别为-0.707、-0.634、-0.641；IgG、TRF、α1-MG与ACR相关性较高，相关系数分别为0.824、0.812、0.783。因为IgG、TRF与白蛋白同为肾小球损伤的标志物，故其存在较高的相关性亦在情理之-28- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究中。这种密切的相关性为我们协同使用新型尿蛋白指标作为肾脏功能评价的辅助工具提价了支持。DKD患者依eGFR和ACR两个维度进行危险分层，共分为低危、中危、高危、极高危四层[23]。对各危险度亚组间的尿蛋白标志物进行差异分析，结果提示不同预后的尿蛋白标志物是有差异的，且尿蛋白标志物的水平与预后层级之间有显著的相关关系，提示以上尿蛋白标志物在DKD预后的评估中有潜在的应用价值。DKD组分别同健康组、IgAN组、LN组、MN组进行了差异分析。比较结果说明在各种病因的慢性肾脏病中，各种损害机制在肾脏损害有均有参与，各自所起的作用所占比重不同。这种不同病因所致慢性肾脏病在尿蛋白标志物上的差异有助于我们进行肾脏损害的病因鉴别提供线索。具体而方，对于DKD，KIM-1、IgG、TRF是相对较为特异的尿蛋白指标，同其它各组均存在显著差异。但这种差异只是统计学上，从图上可以看出，它们并不是在DKD组升高最明显，不足以用来进行疾病之间的鉴别。其它标志物也不是在DKD组升高最明显、且与其它疾病组有显著差异的，因此这些标志物还不能作为DKD的诊断依据。有意思的是，可以看出，TRF在MN组升高最明显且与其它组之间差异明显，MCP-1在LN组升高最明显且与其它组之间差异明显，提示这两种标志物在这两种疾病有提供诊断支持的价值。有意思的是，可以看出，TRF在MN组升高最明显且与其它组之间差异明显，MCP-1在LN组升高最明显且与其它组之间差异明显，提示这两种标志物在这两种疾病有提供诊断支持的价值。因为变量不符合正态分布特征，在选择统计学方法时采用了非参数检验的相关方法。这些统计方法计算的变量为转换后的秩变量，舍弃了原始数据的部分信息，其对数据的利用是不充分的，检验效能相对于参数检验差[24]。再者，研究只是进行了相关和差异分析，定性地研究了指标之间的关系，没有给出可供临床参考的具体标准和使用方案。因此，我们应当设计更为精密的临床实验方法，扩大样本量，采用合适的统计方法取得可供临床应用的模型或公式，以指导临床实践。-29- 海军军医大学硕士学位论文参考文献[1]WangL,GaoP,ZhangM,etal.PrevalenceandEthnicPatternofDiabetesandPrediabetesinChinain2013[J].Jama,2017,317(24):2515.[2]YangW,LuJ,WengJ,etal.PrevalenceofdiabetesamongmenandwomeninChina.[J].NewEnglandJournalofMedicine,2010,362(25):2425[3]谢席胜,艾娜,王宝福,等.糖尿病肾病流行病学研究进展[J].中国中西医结合肾病杂志,2013,14(10):937-940[4]许嵘,钟一红,陈波,等.上海市郊区2型糖尿病患者肾脏疾病及其危险因素研究[J].中华内科杂志,2012,51(1):18-23.[5]DiseaseK.ImprovingGlobalOutcomes(KDIGO)CKDWorkGroup.KDIGO2012clinicalpracticeguidelinefortheevaluationandmanagementofchronickidneydisease[J].PolskieArchiwumMedycynyWewnȩtrznej,2013,120(7-8):300-306.[6]KimSS,SongSH,KimIJ,etal.Nonalbuminuricproteinuriaasabiomarkerfortubulardamageinearlydevelopmentofnephropathywithtype2diabeticpatients[J].Diabetes/metabolismResearch&Reviews,2014,30(8):736-741.[7]HansenL.Biomarkeryuszkodzenianerek[J].BiomarkersBiochemicalIndicatorsofExposureResponse&SusceptibilitytoChemicals,2008,16Suppl1(supplement1):S22-30.[8]CarvalhoJAMD,TatschE,HausenBS,etal.Urinarykidneyinjurymolecule-1andneutrophilgelatinase-associatedlipocalinasindicatorsoftubulardamageinnormoalbuminuricpatientswithtype2diabetes[J].ClinicalBiochemistry,2016,49(3):232-236.[9]ŻyłkaA,Gala-BłądzińskaA,RybakK,etal.Roleofnewbiomarkersforthediagnosisofnephropathyassociatedwithdiabetestype2[J].FoliaMedCracov,2015,55(4):21-33.[10]NautaFL,BoertienWE,BakkerSJL,etal.GlomerularandTubularDamageMarkersAreElevatedinPatientsWithDiabetes[J].DiabetesCare,2011,34(4):975.[11]LeveyAS,StevensLA,SchmidCH,etal.ANewEquationtoEstimateGlomerularFiltrationRate[J].AnnalsofInternalMedicine,2009,150(9):604-12.[12]陈忠城,罗敏琪,朱远航.肾脏疾病患者尿TRF,MA和IgG及轻链的检测及其临床意义[J].中国卫生检验杂志,2010(1):132-134.[13]JiangX,ZhangQ,WangHB,etal.Associationsofurinary,glomerular,andtubularmarkerswiththedevelopmentofdiabetickidneydiseaseintype2diabetespatients[J].JournalofClinicalLaboratoryAnalysis,2017:e22191.[14]WangL,ChengJF,SunLP,etal.UseofContrast-EnhancedUltrasoundtoStudyRelationshipbetweenSerumUricAcidandRenalMicrovascularPerfusioninDiabeticKidneyDisease[J].Biomed-30- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究ResearchInternational,2015,2015:732317.[15]MaoXN,GaoGS,ShenJQ,etal.Thecombineddetectionvalueofurineproteinandurineenzymeintheearlydiagnosisofdiabetickidneydisease[J].ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,2017.[16]HwangS,ParkJ,KimJ,etal.Tissueexpressionoftubularinjurymarkersisassociatedwithrenalfunctiondeclineindiabeticnephropathy.[J].JournalofDiabetes&ItsComplications,2017,31(12):1704.[17]WuC,WangQ,LvC,etal.ThechangesofserumsKlothoandNGALlevelsandtheircorrelationintype2diabetesmellituspatientswithdifferentstagesofurinaryalbumin[J].DiabetesResearch&ClinicalPractice,2014,106(2):343-50.[18]NielsenSE,RossingK,HessG,etal.TheeffectofRAASblockadeonmarkersofrenaltubulardamageindiabeticnephropathy:u-NGAL,u-KIM1andu-LFABP[J].ScandinavianJournalofClinical&LaboratoryInvestigation,2012,72(2):137-42.[19]ErcoleB,TorkkoK,HiltonW,etal.Aprospectivetrialassessingtheeffectsofclampischemiaduringpartialnephrectomyonrenalfunction,biomarkers,andstructure.[J].JournalofClinicalOncologyOfficialJournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology,2012,30(5_suppl):367.[20]NielsenSE,PerssonF,FrandsenE,etal.Spironolactonediminishesurinaryalbuminexcretioninpatientswithtype1diabetesandmicroalbuminuria:arandomizedplacebo-controlledcrossoverstudy.[J].DiabeticMedicineAJournaloftheBritishDiabeticAssociation,2012,29(8):e184.[21]KarakuşS,OktarT,KucukgerginC,etal.UrinaryIP-10,MCP-1,NGAL,Cystatin-CandKIM-1LevelsinPrenatally-DiagnosedUnilateralHydronephrosis:theSearchforanIdealBiomarker.[J].Urology,2016,87(10):185-192.[22]HaniSusianti,VincentiaM.Iriane,SuriyaDharmanata,等.AnalysisofurinaryTGF-β1,MCP-1,NGAL,andIL-17asbiomarkersforlupusnephritis[J].Pathophysiology,2015,22(1):65-71.[23]上海慢性肾脏病早发现及规范化诊治与示范项目专家组,高翔,梅长林.慢性肾脏病筛查诊断及防治指南[J].中国实用内科杂志,2017(1)：28-34.[24]贺佳,尹平.医学统计学[M].高等教育出版社,2012.-31- 海军军医大学硕士学位论文文献综述糖尿病患者中肾小球高滤过的发生机制及治疗新进展随着物质生活的日益丰富，糖尿病在世界范围内日益流行。糖尿病也已经成为最常见的导致慢性肾脏病（CKD）的病因，进一步引起终末期肾脏病（ESRD）、心血管事件以及过早死亡[1]。在过去5年里，尽管加强了干预力度，因糖尿病所致的糖尿病肾病（DKD）患者的数量还在不断增加[2]。因此，进一步改善防控策略是很有必要的。在糖尿病人群中，除蛋白尿外，肾小球滤过率（GFR）的下降也是一个关键的ESRD和肾脏失功的风险预测因子，而GFR的增加其作用是不确定的。在蛋白尿途径DKD经典病程的五个阶段中，整个肾脏的GFR在初始阶段的特点是超出生理水平的增高。这种临床现象被称做肾小球高滤过。它是由肥胖、糖尿病引起的肾脏结构和血流动力学因素变化的结果。目前流行的假说是，在糖尿病患者中，高滤过发生在蛋白尿和/或肾功能下降之前，通过增加肾小球静水压（PGLO）、超滤液和大分子[包括白蛋白（Alb）]的跨毛细血管对流，使肾脏更易于发生进行性肾损害。有研究表明，在随访过程中，证实存在肾小球高滤过的糖尿病患者其GFR下降速度更快[3]。这篇综述总结了糖尿病患者中可能引起肾小球高滤过的原因，以及高滤过可以作为DKD预测因子、病理生理因素的证据。我们还讨论了可能减轻肾小球高滤过的生活方式以及新兴的药物治疗。一、糖尿病患者肾小球高滤过的发病机制糖尿病患者肾小球高滤过的发病机制是复杂的，包括了多种机制和介质。高血糖和胰岛素水平紊乱有突出的作用[4]，尤其是在早期糖尿病或糖尿病前期。因此，通过严格的血糖控制和其它因素的控制（如通过RAS阻断剂控制血管紧张素Ⅱ）可能会降低糖尿病相关的肾小球高滤过发生率。例如，一群1型糖尿病患者通过胰岛素泵治疗，其糖化血红蛋白（HbA1c）从10%下降至7%，这是一个合理的控制水平[5]。与此同时，他们的GFR经过统一测定也由149ml·min-1·(1.73m2)-1下降至129ml•min-1•(1.73m2)-1。而对照组，继续使用传统的胰岛素治疗，其HbA1c没有改善，测得的GFR也没有变化[6]。体重也会增加GFR，且独立于糖尿病和血糖水平。在无糖尿病的肥胖人群中存在GFR增高的比例占15%，在严重肥胖人群中GFR增高的比例达56%。因此，尤其是2型糖尿病，高滤过可能是发生在肥胖引起的GFR增加之后或是在此基础上[7]。肾小球高滤过的众多机制互相重叠，相互作用，我们主要在-32- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究超微结构、血管、小管水平进行讨论。（一）超微结构的改变从患者患上糖尿病开始，肾脏因为肾单位体积的扩张而逐渐变大，特别是近端小管肥大[4，8]。这种现象最有可能是由机体对高血糖的反应而产生的细胞因子和生长因子所致。肥胖对肾脏的增大也有独立的贡献。肾脏体积和每个小球滤过膜面积的增大与高滤过有关，但很难区分两者的因果关系[8]。一些人认为，肥大是由于肾小球高滤过。然而，在动物试验中，肥大发生在肾小球高滤过之前。在糖尿病小鼠中，通过抑制鸟氨酸脱羧酶这一限速酶，抑制早期的糖尿病性小管肥大及近端小管过度的钠重吸收，从而减弱了肾小球高滤过，并且肾脏体积亦成正比变化[9]。因为小管的肥大扩张逆转缓慢，在糖尿病患者中，难以通过严格的血糖控制使肾脏体积正常化。肾小球高滤过会因为持续存在的小管扩张和功能改变而持续存在。（二）血管理论血管活性体液因子控制着出、入球小动脉的张力。依据血管理论，肾小球高滤过是由血管活性体液因子的不平衡所致。滤过分数（FF）的下降通常与出球小动脉的扩张或是入球小动脉的收缩有关。出球小动脉阻力下降引起FF下降的程度大于入球小动脉阻力下降引起FF增加的程度。这意味着FF的改变并不必然说明节段血管阻力的选择性改变。在餐后，多种血管活性介质被释放或激活，它们可能正是餐后高滤过的效应器[10]。除此之外，蛋白消化之后吸收的氨基酸直接和间接地增加了小管对钠的重吸收，进而阻制了管球反馈[11]。（三）小管理论肾小球高滤过的小管理论着重强调糖尿病引起的小球小管之间相互作用的异常。它认为，近端小管对钠、葡萄糖重吸收的增加与小管的增殖、Na+-葡萄糖共转运载体和钠氢交换体（NHE）的表达上调是同步存在的。通过抑制管球反馈引起入球小动脉阻力的下降，提高了单个肾小球的GFR[4,12-13]。肥胖人群，由于腹腔内压力增加和肾周脂肪的堆积，挤压了髓袢，从而增加了小管钠的重吸收[14-15]。最终，糖尿病相关的小管增生和肥大减低了小管内压力、肾小囊内静水压，这增加了净压力梯度从而进一步导致肾小球高滤过的持续存在。二、肾小球高滤过与DKD的关系糖尿病中肾小球高滤过是一个独立的肾脏危险因子，然而阐述其临床意义是很复-33- 海军军医大学硕士学位论文杂的。DKD是一个复杂的多病因疾病，同时缺乏专门的研究评价肾小球高滤过和FF对肾脏长期预后的影响。肾小球高滤过本身并不能充分解释不良的肾脏预后，肾移植捐献者单肾的GFR经常会增加60%～70%[16]，但其发展到ESRD的风险却是很低的[17]。人们认为糖尿病或是其它刺激与肾小球高滤过所致的肾脏损害病理过程有关。在对52997例活体供肾的捐赠者15年的随访中发现，非胰岛素依赖的糖尿病是最强的ESRD的预测因子之一（风险比为3.01，95%可信区间为1.91-4.74）[18]。迄今为止，关于糖尿病患者全肾水平高滤过的临床意义的相关研究都是自然观察研究。单个肾单位的高滤过在DKD各个时期的临床意义最好是通过RAS阻断试验来推导。最后，餐后高滤过的潜在病理生理意义在一些小规模的研究中进行探讨。（一）全肾水平的高滤过一些糖尿病的流行病研究报道了糖尿病中高GFR与全因死亡率之间的关系[19]。此外，一些纵向的3-18年队列研究表明，基线GFR水平处于高滤过状态的1型、2型糖尿病患者比基线GFR水平在正常范围的患者GFR下降的更快[3，20-21]。除此之外，许多研究报道了高滤过与替代性肾脏终点蛋白尿的发生和发展有关。在一项涉及十个队列研究包含780例T1DM患者的Meta分析和综述中（平均随访时间为11.2年），在基线水平，测量肾小球滤过率处于全肾水平高滤过的患者发展为蛋白尿的合并比值为2.71（95%可信区间，1.20-6.11）[22]。此外，一些研究表明，在T1DM中，无全肾水平高滤过有负向预测价值。在含600例T2DM患者的事后分析中，存在持续高滤过（测量GFR）的患者，与那些在入组时或是经过控制代谢和血压改善6个月后滤过水平在正常范围的患者相比，在随访超过4年后，更有可能发展为微量白蛋白尿或大量蛋白尿（危险比2.23；95%可信区间，1.1-4.3）[20]。即使在校正了多种风险因子之后，如HbA1c、血压、糖尿病病程等，这种情况依然存在。然而，另有一些关于T2DM的报道和这个结果不符。这可能与这些研究规模较小或是采用估算的GFR有关。尽管有证据表明肾脏高滤过可能促进DKD的进展，但对这些数据的理解受多种变量的影响，比如代谢控制、血压、糖尿病病程及其它混杂因素，以及潜在的发表偏倚。到目前为止，没有足够的有可测量的硬终点的前瞻性研究来调查控制早期高滤过的潜在肾保护作用。（二）单个肾单位的高滤过血管紧张素Ⅱ可以诱导肾小球后阻力的净增加，血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂（ARB）通过降低其作用从而降低了FF和PGLO。因此，如大家所知，RAS阻断剂可增加血清肌酐，CKD患者在第一个月的治疗后肌酐水平可提高-34- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究达30%，这种作用在停药后一般是可逆的。此外，无并发症的、肾脏高滤过青少年T1DM患者在3周的依那普利治疗可以降低肾小球滤过率和FF。关于T1DM和T2DM患者的关键性试验表明：独立于降压，RAS阻断剂可降低患蛋白尿、肾脏终点的发生率。这些试验把此类药物放在肾脏保护管理的基石位置。值得注意的是，给予ARB氯沙坦的T2DM患者，若初期eGFR下跌的较多则预示着其随后肾功能下降的更慢。这也支持以下概念：减少单个肾单位的高滤过会降低DKD风险。然而，PGLO与尿白蛋白排泄率有密切的关系（UAE）[23]，RAS阻断同时有益于这两个肾脏危险因素，对于长期肾功能的保护作用这两者独立的贡献尚不清楚。（三）餐后高滤过由进食引起的(单个肾单位)GFR升高，即我们所说的餐后高滤过。它在CKD发病或进展的病理生理过程中的角色，是新兴的研究领域。在肥胖和2型糖尿病患者为减肥而采取高蛋白饮食时，这一现象更值得重视。在一项关于健康青年男性的7天的交叉研究中，与正常蛋白质摄入量相比（1.2克/公斤/天），高蛋白饮食（2.4克/公斤/天）增加GFR（测量）、FF和24小时UAE[24]。因为人类大部分时间处于餐后状态，这种发生在进食后的过度的、延长的代谢和激素紊乱状态理论上会影响肾功能，从而易于发生肾损害。同时，高蛋白饮食亦会增加肾脏的酸负荷。有趣的是，有一个被广泛描述的现象，在有RAS抑制剂存在时，输注氨基酸或给予蛋白负荷后GFR的上升被减弱。这也提示这类药物有这么一个额外的肾脏保护效益。然而，对于糖尿病患者，饮食引起的肾血流动力学改变（及其改善），对肾功能的长期独立影响仍不清楚。三、现有的和新兴的治疗方法降血糖本身可能缓解肾小球高滤过，特别是在早发型糖尿病。然而一些降糖药物仍表现出独立于血糖之外的改善肾小球高滤过的性能。在这里，我们简要地讨论了一些目前常用的和新兴的降糖及其他干预措施，这些措施可能对糖尿病人的肾血流动力学有利。（一）降糖药物1、钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT-2）抑制剂2型糖尿病患者近端小管的SGLT-2是上调的，90%以上的钠和葡萄糖是通过SGLT-2吸收的。SGLT-2抑制剂同时阻断了葡萄糖和钠在近端小管的重吸收，以诱-35- 海军军医大学硕士学位论文导糖尿的方式改善血糖控制，增加尿钠的排泄。这使致密斑处氯化钠浓度升高，从而通过管球反馈引起入球小动脉收缩，降低了肾小球滤过率[25]。另一方面，糖和钠重吸收的减少使肾小管内液体容量增加，引起小管内压力升高，逆行造成肾小囊内压的增加，从而减小了滤过压力，进一步降低了肾小球滤过率。此外，SGLT-2抑制剂不断降低体重，改善血压控制和胰岛素抵抗，并可能会影响在空腹和餐后状态下一些与肾血流动力学有关的血管介质，比如，心房钠尿肽和胰岛素的减少，胰高血糖素的增加等，这些因素均有利于肾脏及心血管的保护。在依帕列净预后试验中[26]，7020例高危的糖尿病患者，48个月的艾帕列净与安慰剂治疗相比，诱导的eGFR变化曲线与RAS阻断相似，混合终点减少了46%（血清肌酐加倍并eGFR小于等于45ml•min-1•(1.73m2)-1、ESRD、肾失功）。在没有使用RAS阻断剂的T1DM患者中，循环中RAS的升高可能减弱依帕列净对肾脏血流动力学的影响。因此可推测，联合使用SGLT-2抑制剂和血管紧张素转换酶抑制剂或ARB，通过同时阻断神经激素和肾小管的因素会产生协同肾保护作用[27]。虽然会增加尿路感染的机会，整体上这一类药物耐受性良好[25]。2、以GLP-1为基础的治疗可能在血糖控制之外，GLP-1受体激动剂（GLP-1RA）和二肽基肽酶（DPP）–4抑制剂对肾小球滤过率的影响还与肾血流动力学有关。在一个涉及31位T2DM患者的开放标签研究中，长效GLP-1RA利拉鲁肽可逆性降低测定的GFR和UAE[28]。目前认为可能是因为GLP-1介导的NHE3（钠氢交换体）（在近端肾小管刷状缘与DPP-4组装在一起）抑制，从而通过激活管球反馈降低近端小管重吸收钠和GFR。而在肾功能正常的2型糖尿病患者，给予GLP-1RA并不影响患者GFR。在正常白蛋白尿的T2DM患者（平均肾小球滤过率为83ml•min-1•(1.73m2)-1和FF23.7%）给予利拉鲁肽或DPP-4抑制剂西他列汀，与安慰剂治疗对比，2周后eGFR没有变化，12周后用菊粉和对氨基马尿酸测定的肾血流动力学也没有变化[29]。理论上短效GLP-1RA（对胃排空率和胰高血糖素水平的持续抑制作用）或DPP-4抑制剂对餐后肾血流动力学的应有显著影响。然而，有研究表明，相比胰岛素，短效GLP-1受体激动剂并没有影响肾脏的滤过率、EGFR等，但减低了体重，增加了尿钠的排泻[30]。3、噻唑烷二酮类药物在使用噻唑烷类药物罗格列酮治疗十二周后，T2DM患者肾小球滤过率和FF下降。这一结果的可能解释是：通过增加一氧化氮的生物利用度从而使出球小动脉血管扩张。糖尿病大鼠的研究表明，管球反馈的恢复可能也发挥了一定作用[31]。-36- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究4、胰岛素有报告称，在空腹状态下胰岛素增加GFR和肾有效血浆流量（ERPF），或呈中性的影响，这似乎依赖病人对胰岛素的敏感性。有趣的是，在合并大量白蛋白尿的T2DM，与正规胰岛素相比，速效赖脯胰岛素减弱了餐后GFR和肾血浆流量（RPF）升高，可能是由于胰岛素样生长因子1依赖性的肾血管舒张。然而，另有研究发现，胰岛素治疗可改善HGFR，但没能改善肾小球的肥大，且加速了系膜基质的扩张[32]。5、胰高血糖素受体拮抗剂胰高血糖素在空腹和餐后状态的升高是糖尿病患者高血糖和肾小球高滤过的一个原因。糖尿病胰高血糖素受体的选择性阻断作为一种新型降糖靶点，对肾脏血流动力学有有益的影响[10]。（二）非降糖药物干预1、营养疗法改善糖尿病的饮食可以改善糖尿病肾病的风险。但是，对于什么是最佳饮食仍然有很多争议。因为混杂因素众多，独立地测定饮食对（餐后）高滤过及随之的肾脏影响几乎是不可能的。一般认为，营养素的极端摄入，特别是蛋白质，是应避免的，以减少肾小球高滤过和肾脏风险。有研究表明，与用碳水化合物或脂肪取代蛋白质的饮食相比，高蛋白饮食（来自蛋白质的能量占比+10%）增加空腹eGFR约4ml•min-1•(1.73m2)-1[33]。另有研究表明，合理的热量控制颇为有益。相对于标准饮食组，25%的能量限制耐受良好，改善了肾小球高滤过、改善胰岛素抵抗、血压、心率、糖化、BMI等，这些都是肾和心血管的危险因素，长期来看有肾及心血管保护效果。在原本存在肾小球高滤过的患者中这一效果更为明显[34]。这一措施简单易行，易于在病人的日常管理中进行推广，故值得重视。此外，指南建议钠摄入量小于2000mg/d。然而，临床医生可能不愿意提倡限制糖尿病患者的钠。这一方面是由糖尿病中的“盐悖论”假说引发的，（即由于盐限制，近端肾小管再吸收钠的敏感性增强及随后的对管球反馈的抑制作用使单个肾小球滤过率升高。）另一方面，顾虑低盐饮食激活交感神经系统和RAS系统[35]。2、减重超重和肥胖与增加GFR、ERPF和FF有独立相关性。在肥胖或超重的病人中，-37- 海军军医大学硕士学位论文用基于肌酐的eGFR来评估肾脏滤过状态准确度较差，尤其是在存在肾小球高滤过的人群中。采用测量的GFR可以更准确的判断肾小球滤过状态[36]。在许多但不是全部研究中，在肥胖的非糖尿病人群里，当GFR、RPF以单位体表面积来计算时并没有出现肾小球高滤过。人一生下来就有一个固定数量的肾小球，这个数量不随体重的增加而增加。考虑到这一点，用体表面积（BSA）来标准化肾小球滤过率就不合适了。一些做胃成形术的非糖尿病患者体质量从145kg减肥减到97kg，其（没有经过BSA标化）GFR、ERPF、FF和蛋白尿都减少了[7]。另外，最近已被证明，与匹配的非手术组比较，严重肥胖者（其中38%有糖尿病）的减肥手术，在4年间使患者的eGFR下降风险减少30%，血清肌酐倍增风险减少58%，ESRD的风险减少57%[24]。三、总结糖尿病引起的CKD呈持续上升的趋势，现有的DKD管理策略尚不足以阻止这一人群的肾脏进展风险。越来越多的证据表明肾小球高滤过对DKD的发生发展有预测和致病作用。然而，由于DKD病因的复杂性，特别是肾小球高滤过和蛋白尿与肾血流动力学之间的密切联系，需要专门的前瞻性研究来确认改善肾小球高滤过是否可改善临床相关终点。目前一些降糖药物和非降糖的干预措施显示有改善肾小球高滤过的作用。然而尚需要专门设计的有阳性对照的（肾保护作用）试验进行研究，以验证这些方法是否能降低糖尿病的肾脏风险，特别是对于在基线水平已经存在肾小球高滤过的患者。-38- 尿蛋白标志物在糖尿病肾病诊断、进展及预后评价中的价值研究参考文献[1]TuttleKR,BakrisGL,BilousRW,etal.Diabetickidneydisease:AreportfromanADAConsensusConference[J].DiabetesCare,2014,37(10):2864-2883.[2]中华医学会内分泌学分会.中国成人糖尿病肾脏病临床诊断的专家共识[J].中华内分泌代谢杂志,2015,31(5):379-385.[3]MoriyaT,TanakaS,SoneH,etal.Patientswithtype2diabeteshavinghigherglomerularfiltrationrateshowedrapidrenalfunctiondeclinefollowedbyimpairedglomerularfiltrationrate:JapanDiabetesComplicationsStudy[J].DiabetesComplications.2017Feb;31(2):473-478.[4]VallonV,KomersR:Pathophysiologyofthediabetickidney.ComprPhysiol2011,1:1175–1232.[5]AmericanDiabetesAssociation.5.Glycemictargets[J].DiabetesCare,2016,39Suppl1:S39-S46.[6]WisemanMJ,SaundersAJ,KeenH,etal.Effectofbloodglucosecontrolonincreasedglomerularfiltrationrateandkidneysizeininsulin-dependentdiabetes[J].NEnglJMed,1985,312(10):617-621.[7]ChagnacA,WeinsteinT,HermanM,etal.Theeffectsofweightlossonrenalfunctioninpatientswithsevereobesity[J].JAmSocNephrol,2003,14(6):1480-1486.[8]HostetterTH.Hypertrophyandhyperfunctionofthediabetickidney[J].JClinInvest,2001,107(2):161-162.[9]ThomsonSC,DengA,BaoD,etal.Ornithinedecarboxylase,kidneysize,andthetubularhypothesisofglomerularhyperfiltrationinexperimentaldiabetes.JClinInvest2001,107:217–224.[10]BankirL,RousselR,BoubyN.Protein-anddiabetes-inducedglomerularhyperltration:Roleofglucagon,vasopressin,andurea[J].AmJPhysiolRenalPhysiol,2015,309(1):F2-F23.[11]GonskaT,HirschJR,SchlatterE.Aminoacidtransportintherenalproximaltubule[J].AminoAcids,2000,19(2):395-407.[12]ChagnacA,HermanM,ZingermanB,etal.Obesity-inducedglomerularhyperfiltration:Itsinvolvementinthepathogenesisoftubularsodiumreabsorption[J].NephrolDialTransplant,2008,23(12):3946-3952.[13]MuskietMH,SmitsMM,MorsinkLM,etal.Thegut-renalaxis:Doincretinbasedagentsconferrenoprotectionindiabetes?[J].NatRevNephrol,2014,10(2):88-103.[14]HallME,doCarmoJM,daSilvaAA,etal.Obesity,hypertension,andchronickidneydisease[J].IntJNephrolRenovascDis,2014,7:75-88.[15]HenegarJR,BiglerSA,HenegarLK,etal.Functionalandstructuralchangesinthekidneyintheearlystagesofobesity[J].JAmSocNephrol,2001,12(6):1211-1217.[16]MuellerTF,LuyckxVA.Thenaturalhistoryofresidualrenalfunctionintransplantdonors[J].J-39- 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