聚合酶链式反应

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1、聚合酶链式反应(PCR)一、实验目的 1、 了解PCR反应的基本原理。 2、 了解PCR反应的优化条件和PCR的应用。 3、 掌握PCR产物纯化的方法。 实验原理 PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的技术。1990年，Kary B.Mullis发明了PCR技术，并因此在1995年荣获诺贝尔化学奖。PCR技术使分子生物学研究一下子获得了突破，并且随着PCR技术的日趋完善，PCR技术在人类生活中的应用也越来越广泛。PCR、分子克隆和DNA序列分析构成了现代分子生物学实验工作的基础。PCR反应包括三个基本

2、步骤：①变性：目的双链DNA片段在94℃下解链；②退火：两中寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对；③Tap DNA聚合酶在最适温度下（72℃），以目的DNA合成。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍。这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25~35轮循环就可使目的DNA片段扩增达106倍。 二、器材与试剂1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪2.试剂：引物，模板，TaqDNA聚

3、合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H2O,2*PCRmix溶液，DNA染料三、实验步骤 1、 PCR反应 ⑴在EP管中依次下列试剂（50μl反应体系）      试剂                       用量/μl 灭菌H2O                         35.5 PCR反应缓冲液                    5 DNTP(4种，每种浓度10μmol/L)     2 上游引物                           2 下游引物        

4、                   2 模板DNA                          1 Taq                               0.5PCR引物设计PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补PCR缓冲液（PCrBuffer）用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH

5、值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2优于Mn2，而Ca2无任何作用。1．Mg2浓度Mg2的最佳浓度为1.5mmol/L（当各种dNTP浓度为200mmol/L时），但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。M