聚合酶链式反应polymerasechainreaction

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1、聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction上海第二医科大学检验系樊绮诗PCR技术由美国Cetus公司K.Mullis于1983年建立能在体外复制已知序列的DNA片段具有扩增效率高和特异性强的特点为生命科学领域的研究开创了崭新时代PCR原理5’5’3’3’d.NTPs耐热DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’添加反应混合液及样本变性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入试管中延伸5’3’5’3’5’3’5’3’继续延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循环PCR原理5’3’5’3’5

2、’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二个循环4个拷贝第三个循环8个拷贝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n个循环2n个拷贝PCR原理PCR的反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和缓冲液等。PCR的反应条件反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）变性温度和时间模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前提。在PCR扩增开始的第一次变性时，应给予足够的时间和温度，使基因组DNA充分变性。一般在940C变性5～10

3、min。进入循环反应后以94℃变性30～40s,足以使模板DNA双链变性。退火温度和时间PCR反应的特异性取决于退火时引物模板的特异结合。退火温度一般低于引物Tm50C左右，退火温度越高，产物的特异性也越高；被扩增片段越大，退火所需时间也相应延长。延伸温度与时间延伸温度设为72℃，因为TaqDNA聚合酶在72℃时具较高的酶促活性，有利于DNA的复制。延伸时间视产物长度而异，时间过长易导致非特异性扩增。模板(template)模板就是将要被复制的核酸片段（包括基因组DNA和RNA、质粒DNA和线粒体DNA等）模板DNA须有较高的纯度模板加入量影响PCR效率和产物的特异性引物（Primers)化

4、学合成的寡核苷酸能与模板特异地结合引物决定产物的特异性和长度引物设计时必须遵循一些原则引物设计基本原则PCR反应的引物需要二条，分别设在被扩增目的片段的二端，并分别与模板正负链序列互补引物的长度一般以18~25个核苷酸为宜二条引物之间（尤其在3’端）的序列不可有互补，以免形成引物二聚体引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积引物设计基本原则引物的3’端尤其要避免重复的CG碱基序列二条引物的Tm值不能差别太大℃Tm=2（A+T）+4（C+G）合成引物时在其5’端可以加修饰成份设计引物最好用电脑软件进行分析脱氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷

5、酸的混合物反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加DNA聚合酶从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermusaquaticus,Taq）中提取，有很高的耐热稳定性Taq酶的作用:催化DNA合成。即在模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’,5’-磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq酶的活性十分重要虽然Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg

6、2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。配制PCR反应体系（例）PCR反应体系(25ml)试剂浓度体积(ml)终浓度去离子水15.8正向引物10mmol/L1.00.4mmol/L反向引物10mmol/L1.00.4mmol/L10×PCR反应缓冲液10×2.51×镁离子25mmol/L2.52.5mmol/LdNTP25mmol/L0.2200mmol/LTaqDNA聚合酶1U/ml1.00.04U/ml模板DNA100ng/ml1.04.0ng/ml其它反应因素pH应保持在酶反应所需的最适pH盐浓度（引物与模板杂交率、杂交体稳定性及聚合酶的活性）二甲亚砜（DMSO）能破坏模板的

7、二级结构牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq酶的活性循环次数重复次数一般设为25～35个循环35个循环以后由于反应体系中各种反应组分的消耗和反应副产物的产生，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长，即反应已处于平台期指数增长期线形增长期平台期循环数#理论值实际值Log产物DNAPCR过程的实时监测相对定量PCR设计相对定量PCR实验方案时须注意：预先确定最佳模板量和PCR循环数，使所采用的各反应参数