聚合酶链式反应技术(pcr)

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1、关键词：核酸标记通过核酸标记技术可将细胞因子cDNA作为基因探钊检测细胞内细胞因子基因组DNA或mRNA。主要有以下几种方法：　　1.应用同位素（或非同位素）标记的cDNA探针，检测经Northernblot后细胞因子mRNA水平或采用打点杂交法。　　2.应用标记cDNA探钊与细胞或组织切片进行原位杂交，然后进行放射自显影。　　3.细胞因子mRNA经反转录为cDNA，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应（PCR）扩增细胞因子cDNA,Southernblot后用标记探针检测特异细胞因子DNA水平。核酸扩增检测技术的研究进展(作者  傅占江  

2、来源  摘自：《国外医学临床生化学与检验学分册》)  聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、

3、侵染(Invader)和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。这些方法的区别见表1。表1  不同核酸扩增技术的特性fig2058BDNA：枝状DNA,LCR：连接酶链式反应；NASBA：依赖性核酸序列的扩增；PCR：聚合酶链式反应；RCA：滚环扩增：RT-PCR：逆转录PCR;SDA:链替代扩增；SNP：单核苷酸多态性：TMA：转录依赖的扩增；Invader:侵染检测技术  1反应（PCR）  在DNA扩增方面,PCR一直是应用最广泛的方法。美国食品与与药品管理局（FDA

4、）已经批准一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒（Roche）,如HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等。研究报道这些试剂盒的应用结果优于bDNA、NASBA扩增技术。  最近，PCR技术的最大突破就是对单管PCR产物进行实时荧光定量检测，该方法提高了灵敏度与特异性，并且易于操作。如TaqMan就是采用这种技术，两端分标记有荧光与淬灭基团的寡核苷酸探针结合到PCR产物上后，其淬灭基团被具有5´-3´外切酶活性的TaqDNA聚合酶切掉，从而产生荧光，通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进生定性和定量。  TaqMan技术另一种应用就是分子灯标（m

5、olecularbeacon）。分子灯标为一茎环状结构的寡核苷酸探针，其环状区核苷酸序列与靶核酸互补，靠近两端的部分序列互补构成分子灯标的茎部，两末端分别标记荧光基团与淬灭基团。没有靶核酸存在时，分子标保持茎环结构，荧光工团与淬灭基因距离较近，产生的荧光能量根据荧光共振能量转移原理转移到淬灭基团，并以热能的形式散发出去，从而检测不到或仅有微弱荧光本底。当靶核酸存在时，茎部结构由于环状部分结合靶序列而被打开，荧光基团与淬灭基团分开，荧光产生。此技术已经应用于结核及大肠肝菌O：157的检测。  Amplifluor是分子灯标的另一种形式，以引物

6、的形式用于PCR，其5´端为茎环状结构并标记有荧光基团与淬灭基团，当Amplifluor被掺入到扩增产物中后，其茎环状结构被打开，产生荧光。Jordens等人将其应用于HPV的分型检测。同TaqMan中的分子灯标相比，Amplifluor技术不足之处是不能区分特异性与非特异性的PCR产物。Scorpion为一修饰的Amplifluor，可以降低本底而优于TaqMan和分子灯。三种形式的分子灯标在应用方面的不足之处就制备较困难，成本较高。2连接酶链式反应（LCR）  在LCR中，一对寡核苷酸探针杂交到靶DNA的相邻序列上，之间形成的缺口被连接

7、酶所连接，再由连接产物的引物进行温度循环扩增。此方法的最大优点就是可用检测基因突变。FDA已批准该类试剂盒用于检测沙眼衣原体，具有与PCR一致的检测灵敏度。  LCR最近也被应用于微阵列芯片。靶核酸被杂交捕获后，等位基因特异性的探针被连接到一荧光标记的探针，等位基因特异的探针在5´端有一段外加序列用来捕获DNA微阵列上的LCR产物，从而对带有荧光的产物进行测定。这种技术结合了液相LCR的特异性与通用型阵列的多重性，进一步拓宽了LCR的应用。3链替代扩增反应（SDA）  littleM等人结合SDA与实时荧光发了新一代DNA探针系统，即BDP

8、robeTecET。采用标记两种不同荧光基团的探针，在SDA过程中，该探针被掺入到双链扩增产物中，由限制内切酶的酶沏使淬灭基团与荧光基团分开，从而释放荧光。此系统用于病原体的检测