PCR(聚合酶链式反应)原理.docx

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1、PCR(聚合酶链式反应)原理PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，

2、每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。1971年Kleppe等人在Journalofmolecularbiology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法，1976年一种从嗜热水生菌(Thermusaquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由S

3、aiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于PerkinElmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被AppliedBiosystemsInc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR的专利目前

4、依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子挎贝。在体外实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复

5、性，并设计与模板DNA的5’端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复“变性解链—退火—合成延伸”的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。从PCR原理可以看出，PCR仪的关键是升降温的步骤。现在偶尔还能听到一些前辈们笑谈早年的PCR实验如何在3个水浴锅中完成的趣闻。经过不断改进，今天的PCR已

6、经越来越完善和智能化。出于市场推广的战略需要，各厂家的PCR仪型号不同，着力宣传的技术指标和参数也不尽统一，编者在这里简单列出选购时我们认为应该考虑的常用指标，希望有助于大家选购PCR仪的选购技巧。PCR仪介绍及其选购PCR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量PCR仪，此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推

7、出不同款式的定量PCR仪。一、温度控制对普通PCR仪来说，温度控制指标主要是指温度的准确性、均匀性、以及升降温速度，对梯度PCR仪来说，除了温度的准确性和均匀性、升降温速度以外，还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性，它直接关系到实验的成败。如果排除样品加入过程中的问题，对于PCR反应而言最重要的莫过于温度控制的准确性，由于PCR是一个几何级数扩增的过程，扩增过程中退火温度的细微变化会被放大而直接影响结果，不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度，对退火温度而言温控

8、显的尤为重要，有时1度甚至0.5度的差异也能决定实验的成功与失败，所谓差之毫厘，谬之千里。因而对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。温度的均匀性是指样品孔间的温度差异，它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。我们在实验中发现有时用