聚合酶链式反应课件.ppt

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1、第三章聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）王晓华聚合酶链反应又称体外DNA扩增技术。是利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸循环操作，在体外特异地扩增所需要的DNA片段的一种技术。它能快速将皮克(pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右，达到微克(g)水平。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等。在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，便于对目

2、的基因进行分析、鉴定。目的基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位素探针等方法进行筛选；经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂,一般需要数周时间。70年代的初期由Dr.H.Klenow发现了较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli；1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的Taqpolymerase，它的特性能耐高温。80年代之后它被广泛运用

3、；1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法；1985年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值的PCR技术；1987年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使PCR成为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。1993年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。PCR技术的发现KaryBMullis(1944-)1983年提出PCR方法1993年度诺贝尔化学奖一、PCR基本原理PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。依据DNA半保留复制的机理。PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。第一节PC

4、R技术的原理和特点细胞内复制的过程1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链，各自作为模板。2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，引物提供3’-OH末端。3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从引物的3’端，循5’→3’方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的DNA双链。Denaturing95˚CAnnealingTm-5˚CExtension72˚CPCR的原理PCR的基本过程1.变性：将反应体系升温至95℃左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为模板

5、（待拷贝的DNA称为模板）。2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55℃左右)，5’端和3’端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合。5’5’3’3’模板链3’端引物5’端引物3’3’3.延伸：将温度升到75℃左右，耐热的TaqDNA聚合酶催化四种dNTP，从引物3’-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链。5’5’3’3’5’DNA聚合酶5’Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。PC

6、R的扩增效应理论上，每增加1个循环，双链DNA片段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n)增加。实际上，扩增效应低于指数增加，约为(1+X)n。一般进行30个左右的循环，特定区域的DNA量可至少增加106倍。PCR产物的积累规律PCR反应初期，目的DNA片段的增加呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出现“平台效应”。到达平台期所需要的循环次数一般在30次循环之后。琼脂糖凝胶电泳PCR产物的鉴定、提取PCRDNA复制部位：DNA体外合成放大过程生物体内DNA

7、合成引物：DNA片段RNA片段（作为新链的一部分）（复制终止时被切除）催化酶：TaqDNA聚合酶DNA聚合酶有5’→3’核酸外切酶有5’→3’核酸外切酶无3’→5’核酸外切酶有3’→5’核酸外切酶基本过程：每循环一次包括复制起始、链延伸和变性、退火、延伸终止三阶段反应实质：扩增靶DNA合成子代DNAPCR仪聚合酶链反应中的变性、退火、延伸的温度和时间，以及循环次数，是由具有程控的快速升温和快速降温装置的PCR仪控制。PCR仪越快，越精确，越昂贵ABI7500实时荧光定量PCR仪普通梯度PCR仪二、PCR技术的特点1.

8、高度的敏感性：可将极微量(pg)DNA，扩增到紫外光可见的水平(ug)，这是最主要的特点，PCR产物的生成量以指数方式增加，它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。2.高度的特异性：PCR扩增的特异性由两个引物的序列决定，因此引物设计至关重要。①引物与模板DNA特异正确的结合；②遵循碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶