《聚合酶链式反应》ppt课件

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1、第四章聚合酶链式反应聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。1971年，Khorana提出：DNA经过变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…4.1PCR技术简史4.1PCR技术简史1985年，美国PE-Cetus公司Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA

2、复制最初采用E-coliDNA聚合酶I的Klenow片段进行PCR，4.1PCR技术简史1988年Saiki等从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热-TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪。1993年，Mullis因此项技术获诺贝尔化学奖72℃94℃55℃PCR循环PCR仪PCR反应4.2PCR反应原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸PCR双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC

3、3’5’5’3’3’5’5’3’TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板变性模板模板（template）95oCTGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。（2）DNA模板与引物复性模板模板ATCTTGAAC5’3’ACGTACGTA5’3’引物引物引物（primer）:40-65oCDNA聚合酶按碱基配对原则延伸DNA链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板模板ATCTTGA

4、AC5’ACGTACGTA5’TaqTaq72oC理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。变性—复性—延伸。（5）1个循环的结果（4）新一轮循环开始PCR反应曲线4.3PCR的过程（1）第一步变性（denature）94-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物与模板复性。①引物的浓度高，②引物的链短。94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（4）第四步变性（denature）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步延伸（extend）（5）第五步重复（re

5、peat）第二步——第三步——第四步复性延伸变性95oC5min50oC1min72oC2min94oC1min温度循环需要的模板量极低。4.4PCR的特点（1）特异性强①PCR使用专门合成的DNA引物。②延伸过程是在高温下进行。（2）敏感性高这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！RT-PCR：对模板的纯度要求低。（5）可以扩增mRNA（4）简便先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。（3）快速整个PCR过程约4小时即可完成。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也

6、可以直接用于作模板。4.5标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul自从H.A.Erilish分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。（1）TaqDNA聚合酶4.6影响PCR的因素TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。①热稳定性最适温度：72-78oC延伸速度：约1000nt/min酶分子最长延伸长度：6.7

7、kb②最适温度高③Taq酶的功能缺点具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3‘5’外切酶活性。合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。金属离子敏感（尤其是Mg2+）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合