聚合酶链式反应技术课件.ppt

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1、实验二、聚合酶链式反应技术2011.10.29一、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR)：一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。二、实验原理PCR的原理：用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。基本反应步骤分三

2、步：1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA在高温下变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。2.退火(复性)(Annealling):使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合。3.延伸(Extension):溶液反应温度升至72℃，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下、利用4种dNTPs等，以引物的3′端开始，结合单核苷酸，按5′3′方向形成与模板链互补的新DNA链。上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106～109倍。72℃9

3、4℃55℃PCR循环费事、费力、易出错早期的PCR技术PCR的自动化：PCR仪快速、简便PCR技术的主要用途1、目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。3、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、DNA序列测定：PCR技术的引入使DNA测序工作大大简化，也提高了测

4、序的速度。5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。三、试剂、材料和仪器（1）材料：E.coliDH5alpha（pUCCARNAi+X）引物序列：NS4-zh-F:CCGCTCGAGATGGCAAACTTATTCTTNS4-zh-R:GAAGATCTTCATTCTAGAACACCTTG（2）仪器PCR仪（热循环仪）制冰机微型离心机移液器（3）试剂模板DNA:用量需在实验中摸索。TaqDNA聚合酶:0.5～5U/100μl1U/25～50μlPCR缓冲液（Tris-Cl，KCl，BSA）MgCl2：1.5～2.0mMdNTPs：0.0

5、2～0.2mM引物（Primer）：0.2～1μM水：补足整个反应体积。实验步骤（一）PCR扩增目的基因X的部分片段（500bp）1.在0.2mlPCR管内配制25ul反应体系。冰上进行。模板3LTaqDNA聚合酶0.5LdNTP（每种10mmol/L）0.5L10×PCR缓冲液2.5L25mmol/LMgCL21.5L5′端引物（10pmol/μL）1.5L3′端引物（10pmol/μL）1.5LD.D.W14L总体积25L2.反应条件：PCR扩增仪上进行。按下述程序进行扩增Step194℃3-5minStep294℃30sStep355℃30sSt

6、ep472℃45s235Step572℃10minStep68℃Forever3、检测：琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果思考题引物设计的原则有哪些？如何对PCR进行优化？