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1、低温胁迫所要测的指标一、束缚水和可溶性糖1.1自由水和束缚水测量按照刘向莉等人【1】的称重法来测，将测定糖液的浓度改为直接测定叶片的质量。1.1.1器材茶叶，称量瓶3只，天平，蔗糖，纯净水，摇床，湿纱布，滤纸1.1.2步骤根据上述试验结果,归纳称重法的测定步骤如下:①取称量瓶3只,编号。②取完整叶片去其主脉,剪成几片面积相当的叶片,尽量保持叶片完整性,不破坏叶片的结构。立即称重后装入称量瓶中。③3个称量瓶加入植物组织质量6倍的60%～65%糖液。④各称量瓶置于暗处6h,其间不时轻轻摇动。⑤将叶片取出,用湿纱布
2、和滤纸吸去表面糖液,立即称重。植物组织中自由水含量(%)=〔(浸泡前叶片质量-浸泡后叶片质量)/浸泡前叶片质量〕×100%植物组织中束缚水含量(%)=总含水量-自由水含量1.2电解质渗透率测定按照佘文琴的方法来进行测定【2】。1.2.1器材茶叶，直径0.6cm打孔器，天平，有盖的三角锥形瓶，无离子水，量筒，恒温箱，DDS-11型电导仪，水浴锅1.2.2步骤①把各叶片置于室温，0℃和4℃处理6h后取出,用直径0.6cm打孔器打孔,各处理称叶样3g;重复3次.②叶样置于有盖的三角锥形瓶中,加无离子水30ml,静置
3、于20℃恒温箱中浸提12h,取出用DDS-11型电导仪测定浸提液的电导率。③测毕将其放入已沸的水浴锅中煮沸30min;再在20℃的恒温中静置12h,测定电导率。每处理测10个数据,测定结果按下列公式计算：电解质渗出率(%)=(低温处理电导率/煮沸后电导率)×100%1.3可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法【3】：1.3.1材料、仪器设备以及试剂1.3.1.1材料茶叶1.3.1.2仪器设备①分光光度计；②水浴锅；③刻度试管；④刻度吸管1.3.1.3试剂1蒽酮乙酸乙酯试剂取分析纯蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，贮于
4、棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。2浓硫酸（相对密度1.84）1.3.2实验步骤1保准曲线的制作（1）1%蔗糖标准液将分析纯蔗糖在80℃烘至恒质量，精确称取1.000g。加少量水溶解，转入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。（2）100µg/L蔗糖标准液精确吸取1%蔗糖标准液1mL，加入100mL容量瓶中，加水至刻度。取20mL刻度试管11支，从0~10分别编号，按表加入溶液和水。然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将
5、试管放入沸水中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其吸光度，以糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并求出标准线方程。表蒽酮法测可溶性糖标准曲线试剂试剂量管号01、23、45、67、89、10100µg/L蔗糖液/mL00.20.40.60.81.0蒸馏水量/ml2.01.81.61.41.21.0蔗糖量/µg0204060801002可溶性糖的提取取茶树叶片，擦干净表面污物，剪碎混匀，称取0.10~0.30g共3份。分别放入3支刻度试管中，加入5~10
6、mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，用蒸馏水反复漂洗试管及残渣并定容至刻度。3显色测定吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中（重复3次），加蒸馏水1.5mL,以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的吸光度，计算可溶性糖的含量。4结果计算由标准曲线方程求出糖的量（µg），按下式计算测试样品的糖含量。可溶性糖含量（%）=〔(C×VT×N)/(W×VS×106)〕×100C：从标准曲线查得的糖量（µg）；VT：提取液总体积（mL）；VS：测定时取用的样品提
7、取液体积（mL）；N：稀释倍数；W：样品质量（g）。2茶树叶片的酶活性测定2.1粗酶液的制备取上述待测样品一份，加入3.0mL0.05mol/LpH7.0磷酸缓冲液（内含1%不可溶聚乙烯吡咯烷酮）和少量石英砂，冰浴下研磨至匀桨。10,000g低温离心15min，取上清液，冰冻保存备用。此粗酶液可用于POD活性、SOD活性、CAT活性、PAL活性的测定。取上述待测样品一份，加入2.0mL0.05mol/LpH5.0乙酸钠缓冲液和少许石英砂，冰浴下研磨至匀浆。10,000g低温离心15min，取上清液，冰冻保存备
8、用。此粗酶液可用于β-1,3-葡聚糖酶的活性测定。取上述待测样品一份，加入5.0mL0.1mol/LpH5.0柠檬酸钠缓冲液和少许石英砂，冰浴下研磨至匀浆。10,000g低温离心15min，取上清液，冰冻保存备用。此粗酶液可用于外切几丁质酶的活性测定。2.2粗酶液的活性测定2.2.1超氧物歧化酶（SOD）的活力测定采用氮蓝四唑（NBT）光还原法。取3支试管标号，各管均加入反应液3.9mL（加入待测酶
