实验五 免疫学应用

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1、免疫学应用实验一、E-玫瑰花环形成实验掌握人T淋巴细胞形成E-花环的实验原理和操作方法；熟悉T淋巴细胞的功能检测方法。二、中性粒细胞吞噬功能测定掌握中性粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌实验的操作过程；瑞氏染色的基本步骤及吞噬百分率的计算。三、抗原抗体反应及免疫学标本片的观察掌握抗原抗体反应的特异性；熟悉凝集反应的原理、方法和分类。掌握胶乳凝集试验的原理，熟悉试验方法，了解其应用；熟悉沉淀反应的原理；熟悉双向琼脂扩散、单向琼脂扩散的操作方法和结果分析。（1）凝集反应类风湿因子的检测（2）观察琼脂中抗原与抗体反应的单扩和双扩的试验现象A单向琼脂扩散试验操作方法：制备含抗IgG抗体的琼脂板:溶化的3%琼脂、

2、待冷至56℃时吸取1.5ml琼脂与等量适当稀释的抗IgG抗体混合均匀。倾注于水平放置的塑料板上，制成厚薄均匀的琼脂板。凝固后用打孔器打孔二排，每排5孔、孔距8—10mm，孔要圆整光滑。图示单向琼脂扩散试验模式加样:用微量加样器加样。结果分析:标准曲线的绘制及血清标本中IgG含量的测定。以各稀释度标准抗原孔沉淀环直径为横座标，相应孔中IgG含量为纵座标在半对数座标纸上作图，画出标准曲线。依待检血清标本孔沉淀直径，查标准曲线，将查得的唾G含量乘以标本的稀释倍数，即为血清中IgG的含量。B双向琼脂扩散试验操作方法：将1%生理盐水琼脂加热溶化。制备琼脂板:取洁净载片一片，放一水平台上，将溶化的2·5m

3、1琼脂趁热用吸管注于玻片上，使其自然流成平面，琼脂凝固后用打孔器打孔，去掉孔中的琼脂。加样:中央孔中加入甲胎蛋白（AFP）诊断血清，1、4孔加肝癌病人阳性血清，2、3、5、6孔加待检血清。加血清至满勿外溢。不可有气泡。加样后，将掠脂板放入有一定湿度带盖容器中，置37℃温箱，24小时观察结果。结果分析:1、4孔为阳性对照孔(加已知阳性标本)，与中央孔间出现乳白色沉淀线。其余各孔与中央孔如出现沉淀线，且一端与阳性对照沉淀线相吻合者为阳性。证明该份血清含有甲胎蛋白。如两条沉淀线相交，表明二者抗原性不同，出现的沉淀线另一种抗原抗体反应，不能判定阳性。如待检孔与中央抗体孔间未出现沉淀线为阴性，证明待检血

4、清中没有甲胎蛋白。      图示　双向琼脂扩散试验结果2、6孔：吻合沉淀线（阳性）。5孔：交叉沉淀线（阴性）。3孔：无沉淀线（阴性）。四、巨噬细胞吞噬功能试验掌握巨噬细胞的生物学功能；熟悉巨噬细胞吞噬功能试验的原理和操作方法。实验原理：巨噬细胞具有吞噬大颗粒异物的特性，通常选用鸡红细胞作为吞噬颗粒，将其注入小鼠腹腔中，腹腔中巨噬细胞则将鸡红细胞吞入。取小鼠腹腔液涂片、染色后可见鸡红细胞被吞噬的现象，计数100个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞的细胞数可判断其吞噬功能。操作方法：1、于验前3天，小白鼠腹腔内注射6%可溶性淀粉肉汤1ml。2、试验当天于每只小鼠腹腔内注射0.5ml1%鸡红细胞悬液，并轻揉腹

5、部。3、注射后30min，将小鼠处死、取腹腔液涂片并行瑞氏染色。4、油镜观察涂片。实验现象与数据：镜下可见吞噬细胞细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞胞浆呈红色，而核则染成蓝色（鸡红细胞有细胞核）。计数100个吞噬细胞，并计算吞噬阳性细胞的百分率。五、淋巴细胞转化实验掌握分离的原理及操作方法，熟悉其意义及应用；掌握淋巴细胞转化现象的试验方法和原理；熟悉淋巴母细胞形态学观察方法。实验原理：T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性抗原（PHA、PWM和ConA）刺激均能使细胞发生转化。T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。淋巴细胞转化试验可从周围血中分离出淋巴细胞，也

6、可采用全血试验。操作方法：1、制备细胞悬液：用培养液将淋巴细胞稀释成2×l06/ml，细胞悬液。2、分装：向两个小瓶中各加2ml，细胞悬液,一瓶加PHA0.1ml(100单位)，另瓶不加作对照。3、37℃培养72小时。离心沉淀，用Hanks液洗两次。4、用沉淀推成血片,加姬姆萨染液染色,镜下观察计数200个以上淋巴细胞，算出转化率。实验现象与数据：1、成热的淋巴细胞:与外周血中小淋巴细胞形态一致、直径6～8微米，核染色质密集、无核仁、胞浆轻度嗜碱性。2、过度型淋巴细胞:直径10～20微米，核质密，但有明显核仁。3、淋巴母细胞，细胞增大，形态不规则，直径20～30微米，核也增大，染色质纤细，核仁

7、1～2个，胞浆扩大，强嗜碱性可见数个空泡及颗粒。4、网状细胞样母细胞：细胞增大，形态不规则，核淡染，有1～2个大小不规则的核仁，胞浆扩大、含空泡，嗜碱性不强，有透明感。用姬姆萨染色后，计算200个淋巴细胞中转化为母细胞的细胞数（包括过渡型、母细胞和分裂相淋巴细胞），依转化的百分率判定T淋巴细胞的功能。