免疫学实验讲义

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1、实验一凝集反应实验目的：1.掌握凝集反应的原理2.直接凝集反应3．间接凝集反应实验内容：1.直接凝集反应2．间接凝集反应实验原理：当颗粒性抗原与其相应的抗体特异结合时，在电解质存在下，两者比例合适时，可出现凝集颗粒，此现象称凝集反应。一、直接凝集反应一血型鉴定人类血型是以红细胞表面所带抗原的不同而命名。红细胞表面主要带A、B两种抗原，人类血清中主要含有两种抗体（抗A或抗B抗体），用抗A或抗B标准血清可以鉴定四种不同的血型，既A、B、AB、O表型。现介绍玻片直接凝集法。（一）材料：人抗A和抗B标准血清、被检者红细胞、采血针、试管、载玻片、

2、滴管、皮肤消毒剂。（二）方法1、取清洁载玻片，用记号笔划分两半，左角上注A字，右角上注B字2、用酒精棉球消毒指端皮肤，针刺受检者指端，取血分别滴在载玻片左右两端3、 于玻片A侧中央加抗A型标准血清一滴，于玻片B侧中央加抗B血清一滴，充分混匀。4、 5~10min后肉眼或低倍镜观察结果，以凝集现象的有无，按下表报告结果。血型凝集现象抗B标准血清抗A标准血清O－－A－＋B＋－AB＋＋ 二、间接凝集反应将可溶性抗原吸附在惰性颗粒载体上，与其相应抗体可发生凝集，称为间接凝集反应。本实验用猪乙型脑炎乳胶凝集实验抗体检测试剂盒进行验证试验。（一）材

3、料：阴性对照血清、阳性对照血清、乳胶抗原、载玻片等。（二）方法1、取洁净载玻片，用记号笔分为两格。2、分别取阴性对照血清和阳性对照血清于载玻片两端。4、然后各加一滴乳胶抗原，分别混匀。5、缓慢摇动2～5min，并观察结果。思考讨论1、直接凝集反应与间接凝集反应的区别。实验二免疫沉淀反应实验目的：1.掌握免疫沉淀反应的原理2.琼脂糖双向免疫扩散实验内容：1.琼脂糖双向免疫扩散实验原理：当可溶性抗原与其相应抗体相遇，在有电解质存在的条件下，二者比例合适可出现肉眼可见的白色沉淀，故名沉淀反应。一、琼脂糖双向免疫扩散在含有电解质的琼脂中，抗原抗

4、体分子互相弥漫扩散，当比例合适时可出现沉淀带。此法可用于分析抗原成分，以及鉴定抗体的纯度等。（一）材料：1％生理盐水琼脂糖、人IgG、抗人IgG、载玻片、打孔器等。（二）方法1、将1％盐水琼脂糖加热溶化。2、取一洁净载玻片，放水平台上，将已熔化的琼脂3～4ml趁热倾注在玻片上制成厚薄均匀的琼脂糖凝胶板。3、待琼脂凝固后，按图2．1打孔。4、在中心孔内加入人IgG。5、于周围各孔中分别加入不同稀释倍数的抗人IgG。6、将琼脂糖凝胶板放湿盒中，置37℃温箱中24h后，取出观察结果。图2.1实验三免疫酶技术ELISA实验目的：1.掌握免疫酶技

5、术ELISA的原理2.掌握免疫酶技术ELISA的技术实验内容：免疫酶技术ELISA之双抗夹心法实验原理：免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其原理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗原的特异性及免疫反应性，也不影响酶的催化效能。当存在相应酶底物时，酶能催化产生有颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的抗原或抗体是否存在及其量的多少。酶联免疫吸附试验（ELISA）是一类常用的免疫酶技术，可用于测定抗体，也可用于检测抗原。该实验常用的酶为辣根过氧化物酶，底物为邻苯二胺（OPD）。实验方法有间接法、双

6、抗体夹心法和抗原竞争法。本实验采用双抗夹心法（抗体-抗原-酶标抗体）一)材料和试剂：羊抗人IgG抗体、不同浓度的人IgG、辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG；包被液：pH9.60.05mol/L碳酸钠缓冲液；稀释液：1%BSA（PBS稀释）；洗涤液：pH7.40.01mol/LPBS-吐温20、底物溶液：OPD-H2O2、终止液：2mol/LH2SO4、96孔酶标反应板等。二)操作步骤1、包被：将羊抗人IgG抗体用包被液适当稀释，在96孔板的1-5孔中每孔加100微升，置37℃两小时后再移置4℃过夜2、 洗涤：倾去包被液，用洗涤液PBS-

7、吐温20加满各孔，振洗3min，倾去，如此反复3次。3、加样：将不同浓度的人IgG分别加入1-4孔（1；1:2；1:4；1:8），5号孔做阴性对照，人IgG用PBS-T20代替，6号孔做空白对照（第一步不用羊抗人IgG抗体包被，仅检测试剂）4、37℃孵育1h5、 洗涤3次（同上）6、 加辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG（其稀释度根据预试结果而定）每孔100ml，（PBS-T20稀释）7、 37℃孵育1h。8、 洗涤3次（同上）。8、 显色：加新鲜配制的底物溶液，每孔100ml，在室温下避光放置10min。9、 终止反应：每孔加2mol/

8、LH2S0450ml。10、用肉眼观察每孔颜色深浅。三）结果观察与分析空白对照及阴性对照应无色。参考蛋白各孔呈棕黄色，并呈明显的颜色深浅梯度。四）注意事项1、 在加已稀释的标准抗体时，注意更换枪头，避免将高