细胞生物学实验课件

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1、细胞生物学实验课件实验一特殊光学显微镜的结构与使用【实验安排】3学时教师讲解演示，学生操作【目的要求】1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的特殊部件；2、掌握暗视野、相差和荧光显微镜的工作原理和使用方法；3、熟悉暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的基本结构。【实验用品】特殊显微镜、酵母、牙垢微生物、菠菜、离心机、匀浆机【实验内容】1、特殊光学显微镜特殊部件的构造及调节2、特殊光学显微镜的使用及注意事项一、暗视野显微镜：【实验原理及使用】１、特殊部件：暗视野聚光器——使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标

2、本进入物镜。从而使光改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。暗视野显微镜工作原理示意图2、用途：暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品。这些样品因为具有和周围环境相似的折射率，不易在一般明视野之下看的清楚，于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比。这种显微镜能见到小至4～200nm的微粒子，只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。3、使用方法：（1）从聚光器座架上卸下明视场聚光器，换装暗视场聚光器，安装到位并固紧。（2）把被检样品的玻片标本置于

3、载物台上，需用油浸的暗视场聚光器，要在聚光器上透镜与载片间滴加香柏油，使之密接。（3）聚光器光轴的调中。聚光器的光轴要与显微镜的光轴位于同一轴线上。其方法是，用低倍物镜对样品聚焦，随之用聚光器升降螺旋上下调节聚光器位置，当在暗视场中清晰地窥见一光环或圆形光点时，停止升降聚光器，用聚光器调中杆推动聚光器，使视场中的光环或光点，调至视场中心位置。（4）调节聚光器焦点，使之位于被校样品处，转动聚光器升降螺旋，使视场中光环调成一最小的圆形光点，此刻即为聚光器的焦点恰于样品处。（5）更换需用的高倍物镜进行镜检观察。4、注意事项：

4、（1）聚光器与物镜的数值孔径应合理匹配，物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径；否则会因物镜孔径角大于暗视场聚光器所形成的照明光束中心暗区的角度，致使部分照明光线射入物镜，破坏或降低了暗视场的照明。（2）使用高数值孔径的油浸暗视场聚光器时，在聚光器与载片之间要滴加香柏油进行油浸，使两者密接。否则，照明光线于聚光器的上透镜表面进行全反射，照明光线照射不到被检样品，呈现不出暗视场照明的效果。（3）载片厚度要适宜，照明光束经暗视场聚光器后，产生空心照明光锥，即中心为暗区，而反射光的焦点在聚光器上透镜表面之上很短的距离，因此，

5、载玻片的适宜厚度应在0.8一1.2mm。（4）载玻片和盖片应清洁无伤痕，否则照明光线会于其处发生漫反射而影响暗视场的照明。（5）照明光源的照明强度要高。因暗视场照明是通过反射光照亮被检样品，若照明强度过弱照明样品的反射光强度不够，会影响观察效果，目前多应用高功率的溴钨灯作为照明光源以提高其照明强度。二、相差显微镜：1、原理：在显微镜下镜检时，视场内的样品只有在反射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活的样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用

6、普通光学显微镜难以辨清活体的结构。必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化．即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。相差方法法应用于生物学的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。染色给活体以有害的影响，甚于失真。因此才使相差法显得异常重要。相差是指同—光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某—时间上光的波动所达到的位置。一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨这种差别的。只有当

7、变相差为振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。用肉眼看不到的相差．只要利用衍射和干涉现象．把相差变为明暗的振幅差，就可能看到。相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，在普通光学显微镜中增加了二个部件；在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此，可以用来观察无色透明活细胞中的细节。为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板，在圆形相板的平面上．有一圈与周围(里外)相板厚度不同的或凸或凹的圆环。相板分两

8、部分；（1）共轭面：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。(2)补偿面(comPIemQtagyare3)：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。在相板的共扼面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变．从而达到不同的目的与观察效果。利用相板把光波相位推迟，振幅改变