高效快速的点突变方法

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高效快速的点突变方法陈严姜明汤敏谦宝生物工程（大连）有限公司,116600 目的：1.在目的基因中的特定位点导入突变，包括：●碱基缺失●碱基置换●碱基插入2.通过突变基因的表达，可以为蛋白质结构及功能的分析和改造提供有效途径。 TaKaRa用于定点突变的试剂盒■Mutan-ExpressKmKit■Mutan-SuperExpressKmKit■Mutan-KKit■TaKaRaMutanBESTKit Mutan-ExpressKm 原理：ODA法 E.coliBMH71-18mutS、MV1184CompetentCellorElectroCell导入变异Primer材料与方法Materials ProtocolReactionMixtureAnnealing/ExtensionDNASampleTransformation（1）E.coliBMH71-18mutSPlasmidMiniprepDNATransformation（2）MV1184ColonySequencing Mutan-SuperExpressKm 原理：ODA-LAPCR法 E.coliMV1184CompetentCellorElectroCellpKF18k/pKF19kDNA导入变异用寡聚核苷酸（5′-P）材料与方法Materials ReactionMixturePCR反应DNA精制Transformationsup0菌株（MV1184）SequencingColonyProtocol Mutan-K 原理：Kunkel法 材料与方法E.coliBMH71-18mutS、CJ236、MV1184CompetentCellorElectroCell导入变异用寡聚核苷酸M13mp18RForM13mp19RForpUC118/119Materials ProtocolClonedDNA（M13）TransfectionCJ236ssDNASample变异用寡聚核苷酸5′磷酸化AnnealingExtensionDNASampleTransfectionBMH71-18mutSPhageTransfectionMV1184（ung+Cell）噬菌斑 TaKaRaMutanBEST 原理：PCR法 材料与方法导入变异用PrimerE.coliJM109CompetentcellMaterials ProtocolReactionMixturePCR反应电泳回收PCRFragmentBKL反应DNASampleTransformation（JM109）SequencingColony TaKaRaMutanBESTKit使用实例5′GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTG3′3′CTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGAC5′pUC118引入点变异区域碱基序列GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCPrimer1Primer2 StepI.PCR反应10×PyrobestBufferdNTPMixtrue（各2.5mM）Primer1Primer2TemplatePyrobestDNAPolymerase(5U/ml)灭菌蒸馏水upto5μl4μl0.2～1.0μM(finalconc.)0.2～1.0μM(finalconc.)<1μg0.25μl50μl94℃30sec55℃30sec72℃5min30Cycles PCRFragment10×BluntingKinationBufferBluntingKinationEnzymeMix.ddH2Oupto2μl1μl20μl0.2-20pmolStepⅡ.BluntingKinationReaction37℃，10min. StepⅢ.LigationReactionDNAFragment5μlLigationSolutionI5μl16℃,1hrTransformationJM109ColonySequencing 结果：1.Transformation2.Sequencing挑取10个蓝色菌落进行测序，证明完全回复pUC118正常碱基序列，且在其它位置未发现有变异出现。 TaKaRaSite-DirectedMutagenesisSystem比较 谢谢大家！