蛋白酶的检测方法

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1、解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展1定义1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和PH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。2福林法(第一法)2、1原理蛋白酶在一珲的温度与PH条件下，水解底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光度法测定，计算其酶活力。2、2试剂和溶液2、2、1福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2Wo4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g、

2、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，水火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50g、水50mL和数滴浓溴水(99%)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后人有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却，见水定溶至1000ml。混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。2、2、2碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定容至1000mL。2、2、3三氯乙酸c(CCl3·COO

3、H)=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000mL。2、2、4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按GB601配制。2、2、5盐酸溶液c(HCI)=1mol/L及0.1mol/L按GB601配制。2、2、6缓冲溶液a、磷酸缓冲液 (PH=7.5)适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)6.02g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)0.5g，加水溶解并定容至1000mL。b、乳酸缓冲液(PH=3.0)适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸(80%～90%)10.6g，加水溶解并定容至

4、1000mL。乙液称取乳酸钠(70%)16g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液8mL，加乙液1mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。c、硼酸缓冲溶液(PH=10.5)适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠(硼砂)19.08g，加水溶解并定容至1000mL。乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。上述各种缓冲溶液，均须用PH计校正。2、2、710g/L酪素3)溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol

5、/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴)湿润后，加入适量的各种适宜PH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的PH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。注：3)酪素采用上海化学试剂采购供应站经销的试剂。2、2.8100ug/mLL-酪氨酸4)标准溶液a、称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。注：4)L-酪氨酸采用上海长江生化

6、制药厂产品。b、吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100ug/mLL-酪氨酸标准溶液。2、3仪器和设备2、3、1恒温水浴40±0.2℃。2、3、2 分光光度计 应符合GB9721的规定。2、4分析步骤4、1标准曲线的绘制a、L-酪氨酸标准溶液按表3配制表3管号酪氨酸标准溶液的浓度ug/mL取100ug/mL酪氨酸标准溶液的体积mL取水的体积mL000101101922028330374404655055b、分别取上述溶液各1.00mL(须做平等试验)，各加0.4mol/L

7、碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用溶液1.00mL，置于40±0.2℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。4、2测定(1)待测酶液的制备a、称取酶粉1～2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00mL)，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小

8、心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲如此溶解、捣研3～4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用(稀释至被测试液吸光值在0.25～0.40范围内)。b、酶粉测定时，稀释倍数参考表