细胞破碎与分离设备

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第六章细胞破碎与料液分离设备 细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。细胞破碎定义 为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种生物细胞壁的组成和结构。生物类型G+细菌G-细菌酵母菌霉菌植物细胞主要组成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白质脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白质葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6-8%）脂类（8.5-13.5%）多聚糖（几丁质）（80-90%）脂类蛋白质初生壁次生壁细胞壁的组成和结构 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高；植物细胞次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 常用破碎方法分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 机械法 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。1.珠磨法（Beadmill）原理： 实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。 胶体磨德国进口珠磨机 2.高压匀浆法（High-pressurehomogenization）利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。原理：——大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用 高压匀浆器的排出阀 易造成堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包含体的基因工程菌不宜采用高压匀浆法的细胞类型。影响匀浆破碎的主要因素：压力、温度、通过匀浆器阀的次数 大、中、小型高压匀浆器 利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。3.超声破碎法（Ultrasonication） 影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温度和粘度、处理时间等。超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 非机械法 1.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶等 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。 酶溶法的优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。酶溶法的缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。 诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。（2）自溶法（Autolysis） 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。2.化学渗透法（Chemicalpermeation） TritonX-100牛黄胆酸钠十二烷基磺酸钠（1）表面活性剂表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 主要是处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。（2）EDTA螯合剂 能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。（3）有机溶剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。盐酸胍和脲是常用的变性剂。 通用性差；时间长，效率低；有些化学试剂有毒。化学渗透法优点：缺点：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。其他方法1.X-press法 将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。2.渗透压法（Osmoticpressure） 将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次。3.反复冻结-融化法 此法使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。4.干燥法气流干燥真空干燥喷雾干燥冷冻干燥 破碎率的测定与破碎技术的研究方向1.破碎率的测定直接测定法（革兰氏染色法）目的产物测定法导电率测定法 2.破碎技术的研究方向多种破碎方法相结合与上游过程相结合与下游工程相结合 定义：在一定的压力差下，利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。一、过滤固液分离设备 过滤介质无定形颗粒：无烟煤、砂、颗粒活性炭、铁矿砂等成形颗粒：烧结金属、烧结塑料以及用合成树脂粘结的硅砂、塑料颗粒等，做成圆筒形或板状。非金属织补棉：化学纤维、玻璃纤维织品、长纤维滤布、短纤维滤布。金属织布：不锈钢丝或铁丝等的织布。无纺品：纸、毡、石棉板、合成纤维无纺布等。 过滤设备的分类根据推动力的不同可分为四类重力过滤自然过滤加压过滤板框过滤真空过滤真空过滤器离心过滤离心过滤器 过滤设备板框过滤机板框压滤机由压滤机滤板、液压系统、压滤机框、滤板传输系统和电气系统等五大部分组成。板框压滤机工作运行的原理：先由液压施力压紧板框组，料液由中间进入，分布到各滤布之间，通过过滤介质而实现固、液分离的脱液方法。 广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌（需预处理）等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。 滤板与滤框的工作情况 优点：结构简单、装配紧凑、过滤面积大、允许采用较大的操作压力，辅助设备少，动力消耗小，过滤和洗涤质量好，对固形物含量要求低，材料选择范围广。缺点：设备笨重、占地面积多、辅助时间长、生产效率低。 板框过滤机 在滤板的外缘有一个钮的称为过滤板，三个钮的称为洗涤板，在滤框的外缘铸有两个钮。从图8-2可以看出，1是过滤板，2是滤框，3是洗涤板。板和框是按照钮的记号1-2-3-2-1····的顺序排列的。滤板和滤框的构造如图所示。滤板表面上有棱状沟槽，其边缘略微突起。在板、框和滤布的两个角都有小孔，它们组合并压紧后即构成了供滤液和洗涤水流通的孔道。框的两侧覆以滤布，空框和滤布围成了容纳滤浆和滤饼的空间。滤板的作用有二：一是支撑滤布；二是滤液流出的通道。 操作前，应将板、框和滤布按前述顺序排列，并转动机头，将板、框和滤布压紧。操作时，悬浮液在压力下经悬浮液通道和滤框的暗孔进入框内。滤液分别穿过两侧滤布，沿板上沟槽流下，汇集于下端，经滤液出口阀流出。然后将滤框和滤布洗净，重新装合，准备下一次过滤操作。但是，多数情况滤饼装满后还需洗涤，有时还需压缩空气吹干。所以，板框式过滤机的一个工作周期包括装合，过滤，洗涤（吹干），去饼，洗净等过程。过滤和洗涤过程的情况见图。 真空转鼓过滤机 （1）过滤区Ⅰ当浸在悬浮液内的各扇形格同真空管路接通时，格内为真空。在转筒外压力差的作用下，滤液透过滤布，被压入扇形格内，经分配头被吸出。而固体颗粒在滤布上则形成一层逐渐增厚的滤渣。（2）洗涤吸干区域Ⅱ当扇形格离开悬浮液进入此区时，格内仍与真空管路相通。滤饼在此格内将被洗涤并吸干，以进一步降低滤饼中溶质的含量。有些特殊设计的转鼓过滤机上还设有绳索（或布）压紧滤饼或用滚筒压紧装置，用以压榨滤饼、降低液体含量并使滤饼厚薄均匀防止龟裂。 （3）卸渣区Ⅲ这个区与分配头的Ⅲ室相接通，在Ⅲ室通入压缩空气，压缩空气促使滤饼与滤布分离，然后将滤饼清除。（4）滤布复原区Ⅳ滤渣被刮落后，为了除去堵塞在滤布孔隙中的细微颗粒，压缩空气通过分配头的Ⅳ室进入复原区的滤室，吹落这些颗粒使滤布复原，重新开始下一循环的操作。因为转鼓不断旋转，每个滤室相继通过各区即构成了连续操作的工作循环。而且在各操作区域之间，都有不大的休止区域。 优点：真空转鼓过滤机具有自动化程度高、操作连续、处理量大。特别适合固体含量大（>10％）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。缺点：由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。 真空转鼓过滤机 二、离心定义：基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。 离心分离方法1.差速离心—工业上最常用的离心分离方法定义：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。对象：混合样品中各沉降系数差别较大的组分。 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 原理：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。分类：1）移动区带离心2）等密度离心常用密度梯度物质：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr2.密度梯度离心—多用于生化研究 1）移动区带离心用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。此法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 2）等密度离心细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在该层达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。 A移动区带离心B等密度离心 离心机分类制备性离心机分析性离心机：超速离心机普通离心机高速冷冻离心机超速离心机实验型离心机工业型离心机 碟片式离心机是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。分离因数可达1000-20000，最大处理量达到300m3/h，常用于大规模的分离过程。适用范围细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片 管式离心机管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在15000-50000的高转速下工作，分离因数可达104-6×105。它设备简单、操作稳定。适用范围细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。特别适合一般分离机难以分离的固形物含量<1%发酵液的分离。 影响固液分离的因素微生物种类真菌的菌体大，固液分离容易，可采用真空转鼓式过滤或板框过滤；细菌和细胞碎片小，固液分离较难，固液分离前要进行预处理。发酵液黏度固液分离速度与黏度成反比。其它因素培养基组成、发酵周期、发酵液的pH值、温度和加热时间等 利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂（通常是水）而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。操作压差一般为1.5～10.5MPa，截留组分为小分子物质。反渗透 反渗透法分离的溶剂分子往往很小，不能忽略渗透压的作用，为反渗透；渗透和反渗透 反渗透法对分子量>300的电解质、非电解质都可有效的除去，其中分子量在100～300之间的去除率为90％以上。反渗透工业应用包括：海水和苦咸水脱盐制饮用水；制备医药、化学工业中所需的超纯水；用于处理重金属废水用于浓缩过程，不会破坏生物活性，不会改变风味、香味。包括：食品工业中果汁、糖、咖啡的浓缩；电镀和印染工业中废水的浓缩；奶品工业中牛奶的浓缩。反渗透法 反渗透的分离机理反渗透中溶剂和溶质是如何透过膜的，在膜中的迁移方式如何？溶解扩散模型优先吸附模型溶解扩散模型适用于均匀的膜，能适合无机盐的反渗透过程，对有机物优先吸附－毛细孔流动模型比较优越。 膜过滤装置目前生产的膜过滤装置都由膜件(Module)构成，膜组件：有膜、固定膜的支撑体、间隔物以及容纳这些部件的容器构成的一个单元。一个良好的模件应具备下列条件：1.膜面切线方向速度快，有高剪切率，以减少浓差极化2.膜的装载密度，即单位体积中所含膜面积比较大；3.拆洗和膜的更换比较方便，4.保留体积小，且无死角。5.具有可靠的膜支撑装置 膜过滤装置的型式及其适用范围常见的膜过滤装置有四种类型：①管式②中空纤维式③平板式④卷式（螺旋式） 1)平板式膜组件这类膜器件的结构与常用的板框压滤机类似，由膜、支承板、隔板交替重叠组成。滤膜复合在刚性多孔支撑板上，料液从膜面流过时，透过液从支撑板的下部孔道中汇集排出。为减小浓差极化，滤板的表面为凸凹形，以形成湍动。浓缩液从另一孔道流出收集。优点:组装方便，膜的清洗更换容易，料液流通截面较大，不易堵塞，同一设备可视生产需要组装不同数量的膜。缺点:需密封的边界线长 截留液透过液料液膜支撑板隔板平板式膜组件 平板式构造 板式膜实验室设备图(millipore公司)： 板式反渗透(纳滤)膜装置(生产型) 板式膜超滤工业设备图: 2)卷式膜组件将膜、支撑材料、膜间隔材料依次叠好，围绕一中心管卷紧即成一个膜组。料液在膜表面通过间隔材料沿轴向流动，透过液沿螺旋形流向中心管。优点:目前卷式膜组件应用比较广泛、与板框式相比，卷式组件的设备比较紧凑、单位体积内的膜面积大，湍流状况好，适用于反渗透；缺点:清洗不方便，尤其是易堵塞，因而限制了其发展。 2)卷式膜组件 透析液浓缩液料液膜组件与外壳之间的密封多孔收集管膜的保护层隔离网透析液的收集系统膜螺旋卷式膜的内部结构 卷式纳滤膜浓缩设备(生产型) 卷式膜反渗透工业设备图: 3)管式膜组件管式膜组件由管式膜制成，管内与管外分别走料液与透过液，管式膜的排列形式有列管、排管或盘管等。优点：结构简单，适应性强，清洗方便，耐高压，适宜于处理高黏度及固体含量较高的料液。缺点:管式膜组件的缺点是单位体积膜组件的膜面积少,一般仅为33～330，保留体积大，压力降大，除特殊场合外，一般不被使用。 内压管式：多孔管膜料液外压管式：料液内压式：膜涂在管内，料液由管内走；外压式：膜涂在管外，料液由管外间隙走。管式膜组件 组件的进出料示意图多通道组件组件外壳渗透液原料液渗透液渗余液渗透液垫圈 管式膜结构图管式 管式膜工业设备图: 4)中空纤维膜组件有数百上万根中空纤维膜固定在圆形容器内构成，内径为40-80um膜称中空纤维膜，0.25-2.5mm膜称毛细管膜。前者耐压，常用于反渗透。后者用于微、超滤料液流向：采用内压式时为防止堵塞，需对料液预处理去固形微粒，采用外压式时，凝胶层控制较困难。优点:设备紧凑，单位设备体积内的膜面积大(高达16000～30000)缺点:中空纤维内径小，阻力大，易堵塞，膜污染难除去，因此对料液处理要求高。 中空纤维构造中空纤维式膜组件 中空纤维膜管中空纤维超滤膜无菌水装置(生产型)