生物分离-细胞破碎

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1、细胞破碎《生化分离工程》胞内产物：胞内酶、大部分重组蛋白等。细胞破碎：破坏细胞壁或细胞膜一、细胞壁的结构和化学组成1.细菌的细胞壁15~50nm40~90%肽聚糖1.5~2nm8~10nm2.酵母的细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质构成，比G+更难破碎。其他真菌细胞壁：主要由多糖组成(几丁质、纤维素…)酵母细胞壁结构示意图M——甘露聚糖；P——磷酸二酯碱；G——葡聚糖酵母细胞3.植物细胞和动物细胞植物细胞：纤维素动物细胞：无细胞壁原核和真核细胞膜：脂质和蛋白构成二、细胞破碎方法物理方法高压匀浆、珠磨、超声波破碎、喷雾撞击破碎、研磨、旋刀式匀浆等（机械破碎）冻融、低渗裂解1、高压匀浆法高压匀浆器

2、针型阀结构简图高压匀浆器各种阀型设计50~70MPa450m/s在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞悬液，常采用多次循环的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合下式，破碎的动力学方程可表示为：（3）式中R——细胞破碎率K——与温度等有关的破碎常数N——悬浮液通过匀浆器的次数P——操作压力a——与微生物种类有关的常数。高压匀浆法适合于酵母和细菌的大规模破碎不适于团状或丝状菌破碎2.珠磨法玻璃(2.5g/mL)氧化锆(6.0g/mL)粒径(0.1~1.0mm)填充率(80~85%)ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机S破碎率；t为破碎操作时间或平均停留时间;k破碎

3、速度常数，与搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠直径以及温度等操作因素相关微珠直径:目标细胞直径30～100细菌浓度60~120g/L酵母浓度140~180g/L优点：容易操作，破碎率可控制，易放大；实验室和工业规模均可用；绝大多数微生物细胞均适用缺点：产生大量热能，能量利用率仅1%；影响破碎率的操作参数较多，操作过程优化较复杂搅拌设计要能够给予研磨剂以最佳推动力，一般设计为搅拌盘。搅拌盘与驱动轴有同心的，也有偏心的；有垂直的，也有倾斜的。有的搅拌盘上有凹槽或是开度口以帮助搅拌。珠磨机搅拌盘设计图珠磨机搅拌盘与驱动轴方位示意图3、超声波破碎空穴作用：在超声作用下液体发生空化作

4、用，空穴的形成、增大、闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎优点：适合于多种细胞的破碎处理少量样品操作方便，液体损失少，破碎率高钛合金缺点：有效能量的利用率低，产热大，需控温（冰水或通冷却剂）；不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎；影响因素多，细胞种类、浓度、超声波的声频等4.低渗裂解（渗透压冲击）高渗溶液（如20%蔗糖、高浓度盐或甘油）中转到冷水中适合细胞壁脆弱的细胞（动物细胞、革兰氏阴性菌）。可分离细胞间质蛋白5.冻融急冻后室温缓慢融化，反复多次破坏细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性；胞内结晶引起细胞内外浓度变化，细胞膨胀破裂。破碎率低其他物理方法：研磨（细菌、植物细胞）旋刀式匀浆

5、（大多数动植物组织）化学方法1.酸碱处理破坏细胞壁和细胞膜，适用于酸碱稳定的产品如：细菌L-天门冬酰胺酶的提取，将菌体悬浮在pH11~12.5的碱溶液中，振荡20min即可。2.有机溶剂处理甲苯、丙酮等溶解脂类物质，增加细胞壁和细胞膜通透性，可实现选择性释放。3.表面活性剂处理十二烷基硫酸钠SDS、TritonX-100等溶解脂蛋白和脂类，作用细胞壁和细胞膜，增加通透性动物细胞完全破碎有机溶剂和表面活性剂处理特点：胞内产物总释放率低，核酸留在胞内，料液黏度低，避免大量细胞碎片，有利于后处理破碎率低，加入试剂会形成新的污染生物方法1.酶法革兰氏阳性菌:溶菌酶(水解肽聚糖层)；革兰氏阴性菌：溶菌

6、酶＋EDTA二价阳离子特别是Mg2＋对细胞壁外层具有稳定作用酵母：溶壁酶(Zymolyase)、葡聚糖酶、甘露糖酶等；植物细胞：纤维素酶特点：操作条件温和，产物破坏小，费用高肽聚糖溶菌酶(lysozyme):作用于NAM的G1和NAG的C1-C4之间的糖苷键，所以又称乙酰胞壁质酶。对G-菌，在EDTA存在下，受溶菌酶作用。溶菌酶处理后的菌细胞应保存在弱高渗（0.1～0.2M）蔗糖液中。图中箭头为溶菌酶的水解点。溶菌酶的作用过程：http://ns2.auts.edu.cn/jwc/jpkc/shengji/2007/tangbinweishengwuxue/webpage/epage1.ht

7、ml2.自溶一定pH和温度下诱使细胞产生溶解自身的酶；一般采用加热法，自溶时间较长，必要时加甲苯、氯仿等防止微生物生长；酵母45~50℃20h发生自溶。可将多种破碎方法联合使用提高破碎效果。青霉素(penicillin):作用于肽聚糖肽桥的联结，即抑制肽聚糖的合成，故仅对生长着的菌有效，主要是G+菌。菌体细胞壁合成受抑制，可促使胞内产物的分泌http://ns2.auts.edu.cn/jwc/jpkc/sh