gbt 28096-2011 木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法

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1、ICS65．020．01B16囝圄中华人民共和国国家标准GB／T28096--2011木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法DetectionandidentificationofXanthomonasaxonopodispv．manihotis(Bondar)Vauterineta1．‘2011-12-30发布2012—06—01实施丰瞀鹳紫瓣警矬瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促19刖置GB／T28096--2011本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国海

2、南出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李伟东、封立平、刘福秀、韩玉春、周先超、粟寒、吴翠萍、王英超。1范围木薯细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法GB／T28096--2011本标准规定了植物检疫中木薯细菌性萎蔫病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于木薯种子、苗木、种茎和其他繁殖材料中木薯细菌性萎蔫病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB／T4789．28食

3、品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3木薯细菌性萎蔫病菌基本信息中文名：木薯细菌性萎蔫病菌(地毯草黄单胞杆菌木薯致病变种)。学名：Xanthomonasazonopodispv．manihotis(Bondar)VauterinJHoste，Kersters＆Swings1995。异名：BacillusmanihotisArthaud—BerthetandBondar1912，Phytomonasmanihotis(BerthetandBondar)Viegas，Xanthomonasmanihotis(BerthetandBondar)Starr1946，X

4、anthomonas．campestrispv．manihotis(ArthaudandBondar)Dye1978。病害英文名：bacterialblightofcassava，cassavabacterialblight。属原核生物界Procaryotes、变形细菌门Proteobacteria、y-变形细菌纲Gammaproteobacteria、黄色单胞菌目Xanthomonadales、黄色单胞菌科Xanthomonadaceae、黄色单胞菌属Xanthomonas、地毯草黄单胞杆菌Xanthomonasaxonopodis。病菌的远距离传播主要靠带菌

5、种子、苗木和种茎。绝大多数木薯病种子不表现任何症状，病菌以休眠状态存在于种子的胚部和种皮。木薯细菌性萎蔫病菌的其他信息参见附录A。4方法原理该病害症状、病菌生物学特性、生理生化特性、致病性测试和基因组DNA的特异性PCR检测是该病菌检测鉴定的依据。5仪器和用具5．1仪器电子天平、实体显微镜、超净工作台、温控培养箱、高压灭菌锅、微生物自动鉴定系统、PCR仪、电泳仪、紫外检测仪或凝胶成像系统、离心机、恒温水浴锅(30℃～95℃)、超低温冰箱、普通冰箱、纯水机、涡旋振荡器、可调微量加样器。1GB／T28096--20115．2用具解剖刀、裁纸刀、量筒、烧杯、培养皿、三

6、角瓶、离心管、放大镜、手术剪、镊子、接种环等。6化学试剂6．1试剂次氯酸钠(NaCiO)、磷酸二氢钠(NaH：PO。)、70％乙醇、吐温一60、吐温一80、淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖，PCR检测所需试剂(参见附录B)。6．2培养基CTA和LPG培养基及配制(见附录c)。7检测鉴定7．1症状检查首先观察植株是否萎蔫，接着仔细检查植株的嫩芽、茎、叶等各个部位，嫩芽、叶是否出现凋萎；叶片是否出现水渍状，暗绿色多角形的小斑，褐色或深褐色由黄晕围绕的不规则形的病斑，凋萎，干枯脱落；嫩茎和叶柄是否有水渍状，黑褐色下陷的病斑；横切茎干，检查其维管束组织是否变褐坏死、病部

7、受挤压后是否有菌脓溢出。7．2快速初筛对出现典型症状的植株直接进行病菌分离；对症状不典型或不明显的木薯种子、苗木和种茎应用PCR法进行快速初筛。从植物组织(种子或叶片或种茎)中抽提总核酸，用木薯细菌性萎蔫病菌标准菌株作阳性对照，用地毯草黄单胞杆菌其他致病变种的标准菌株和健康植株抽提总核酸作阴性对照，用超纯水作为空白对照，进行PCR(方法步骤见附录C)检测分析。若PCR检测结果为阳性，继续进行7．3；若PCR检测结果为阴性，则可判定为未检出。7．3病菌分离7．3．1种子带菌的分离称取木薯种子样品20g，置于1％次氯酸钠溶液浸泡消毒2min～4rain，无菌水洗涤三

8、次，然后将种子磨碎，装入