利用solexa测序技术鉴定甜橙mirnas

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1、利用Solexa测序技术鉴定甜橙miRNAs　　摘要：【目的】预测鉴定甜橙miRNA及其作用机制和功能，为深入研究挖掘甜橙miRNA及其抗病相关miRNA的作用等提供翔实的基因信息。【方法】利用高通量测序技术、相关的生物信息学软件和数据库，构建甜橙小RNA文库，然后以甜橙基因组为参考基因组，进行甜橙miRNA鉴定和靶基因预测；利用GO和KEGG数据库对靶基因进行功能分析。【结果】成功构建了甜橙小RNA文库：获得12617944条小RNA序列分属于3065625种小RNA序列，获得序列中24nt长的序列最多，占到序列的49.3%。鉴定出2199561条miRNA，其中已知miRNA63872

2、2条，分属52种miRNA家族，候选miRNA1560839条，分属204种miRNA。已知的52种保守miRNA基因预测出927个靶基因位点，候选miRNA中有154种预测出1777个靶基因位点。GO数据库对靶基因分类显示，甜橙miRNA调控的靶基因主要参与多细胞互作、转录本调控和细胞组成等生物学途经和分子功能方面。KEGG数据库中病原物与寄主互作亚库分析结果显示，靶基因主要与抗性蛋白、转录因子和抗病酶等关联。【结论】预测鉴定出一批甜橙miRNA及其调控的靶基因，为进一步研究提供了参考信息。关键词：甜橙；miRNA；靶基因；高通量测序20中图分类号：S666.4文献标志码：A文章编号：1

3、009-9980？穴2013？雪04-0526-11甜橙是柑橘中栽培最多的一类品种，其种植面积占到柑橘总量的60%以上，对其研究具有重要意义。MicroRNA（miRNA）是一类大小约为22nt的内源小分子RNA，其主要由茎环结构的前体物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生，其在基因表达、基因组表观遗传修饰和抗病毒等方面起着重要的调控作用[1-5]。随着第二代测序技术的广泛应用，大量利用新一代测序技术研究miRNA的试验被报道[6-13]。在柑橘miRNA的研究中，前人[11-13]通过高通量测序技术参考柑橘EST序列对枳中的miRNA进行研究鉴定；Xu等[10]通过高通量测序技术研究野生柑橘

4、品种和普通品种间胡萝卜素合成相关的miRNA；Wu等[14]对茯苓甜橙体细胞胚胎发育期的特异miRNA进行研究，鉴定出与胚细胞发育调控紧密相关的10个miRNA；陈晓东[15]利用高通量测序技术对椪柑试管苗叶片中的miRNA进行鉴定，并对其进行分类注释，鉴定出一批miRNA。前期由于甜橙全基因组还没有被公布，研究者们以柑橘的ESTs序列为参考基因进行miRNA的预测鉴定[11-13]。2011年初甜橙（Citrussinensis）全基因组的首次公布为深入研究甜橙的基因功能提供了一个有力的平台，但还未见利用甜橙全基因组为参考基因组，深入全面的挖掘甜橙（C.20sinensis）实生苗miR

5、NA的报道，因此以甜橙全基因组作为参考基因组采用Solexa高通量测序技术研究甜橙miRNA具有重要的意义。我们的目的是挖掘出甜橙miRNA并预测其靶标位点，为深入研究甜橙miRNA的功能和作用机制等提供具有针对性的参考信息。1材料和方法1.1植物材料选取2a生西蒙斯甜橙（Citrussinensis）实生苗5株，采摘其顶端嫩叶等量混合后提取总RNA，目的使提取西蒙斯甜橙的叶片RNA具有一定的代表性。该材料由国家柑橘苗木脱毒中心提供。1.2试剂Trizol试剂购自Invitrogen公司，水饱和酚、氯仿、异戊醇、溴化乙锭（EB）、DEPC、琼脂糖等购自鼎国生物工程公司。核酸外切酶Ⅰ购自上海

6、生工生物有限公司。1.3仪器1.5文库构建及其数据分析1.6保守miRNA的鉴定20利用miRBase（18.0）和NCBI相关数据库进行比对，找出保守的miRNA。保守miRNA的鉴定标准为：（1）测序序列与数据库中的保守序列匹配碱基数不少于16个碱基。（2）全序列错配碱基数不多于3个碱基。（3）空缺不超过2个碱基等。（4）存在茎环的前体二级结构。对鉴定出的保守miRNA进行首位碱基、序列位点碱基偏好性分析。1.7候选miRNA的预测鉴定利用软件Mireap预测甜橙候选miRNA（novel-miRNA）。Mireap软件由华大基因公司开发，该软件根据miRNA前体的标志性发夹结构、前体

7、物的二级结构、剪切子（Dicer）酶切位点信息、能量值等条件预测鉴定候选miRNA，具体条件参照前人[8，16-17]已报道的条件。（1）miRNA前体能折叠为发夹型二级结构。（2）成熟miRNA的候选序列位于发夹结构的一条臂上，而对应的miRNA*位于另一条臂上。（3）成熟miRNA和miRNA*的非匹配碱基数不能超过6个，miRNA*区不能形成发夹环。（4）预测的miRNA前体二级结构的自由能小于-18kcal·mo