两个马铃薯y病毒株系全基因组序列及侵染烟草植株后solexa转录组测序分析

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1、2．1．2植物材料．132．1．3质粒132．1．4酶与各种生化试剂．132．1．5引物142．2实验方案．152．2．1病毒的纯化．152．2．2生物学检测．152．2．3马铃薯Y病毒两个分离物全基因组序列测定及序列分析172．2．4Solexa高通量测序．242．2．5Real．TimePCR验证测序结果．．253．结果与分析273．1马铃薯Y病毒两个分离物的分离纯化与全序列测定273．1．1PVY分离纯化与检测273．1．2PVY分离物基因组的分段扩增283．1．3筛选重组质粒．303．1．4PVY分离物序列测定303．1．5全基因组序列分析．3

2、03．1．6系统进化分析一323．2Solexa高通量测序结果343．2．1测序数据统计分析及参照注释．343．2．2部分差异表达基因分析．343．2．3GO富集显著性分析413．2．4Pathway富集显著性分析413．2．5qRT．PCR对测序结果的验证434．讨论445．结论47参考文献一48豸[谢60攻读学位期间发表论文情况．．61Ⅱ万方数据山东农业大学硕士学位论文中文摘要烟草是国家财税收入的重要来源之一，烟草行业是影响中国经济最广泛的行业。马铃薯Y病毒(PotatovirusLPVY)是烟草上危害最为严重的病毒之一。根据生物学症状、血清学反应

3、特性和核苷酸序列，可将PVY分为不同的株系：普通型(CommonorOrdinarystrain，PVYo)，烟草叶脉坏死型(Tobaccoveinalnecrosisstrain，PVY’N)，点条斑型(stipplestreakstrain，PVYc)以及PvYZ和PVYE。病毒株系和品种的不同，表现出的症状特点也有明显的差异。较为普遍的pvvo侵染烟草，在发病初期，叶片会出现“明脉”，后网脉的脉间则颜色变浅，表现为花叶症状；pvys侵染烟草，病株叶脉则变成暗褐色至黑色坏死，叶片呈现污黄褐色，有时候坏死部分则延伸至主脉和茎的韧皮部，表现为脉坏死症状

4、。二者在致病症状上有明显差异，目前对马铃薯Y病毒普通株系和致死株系致病差异性的机理尚不明确。从山东感病的烟草中分离得到两个PVY分离物，分别命名为PVY．T和PVY．G。5’RACE(Rapid-amplificationofcDNAends，RACE)及RT-PCR(ReversetranscriptionPCR,RT．PCR)克隆两个PVY分离物的基因组全序列。比对PVY．T、PVY．G全基因组序列发现，全基因组序列都为9665个核苷酸，PVY．T的全基因组序列的5’．非翻译区由170个核苷酸组成，ORF含有9183个核苷酸，编码3061个氨基酸，

5、3’．非翻译区包含312个核苷酸。而PVY．G的全基因组序列的5’．非翻译区由164个核苷酸组成，ORF含有9171个核苷酸，编码3057个氨基酸，3’．非翻译区包含330个核苷酸。二者的全基因组核苷酸序列一致率为88．96％，氨基酸序列一致率94．35％。一致率差异较大部分为P1、HC—Pro、NIa．VPg、NIa、NIb5个蛋白。氨基酸序列的进化树分析表明，PvY_T分离物属于pVyN株系，PVY．G分离物属于pvyo株系。利用Solexa高通量测序技术，对两个马铃薯Y病毒分离物侵染后的烟草叶片和健康的叶片的cDNA文库进行差异基因表达谱分析，结

6、果显示，在三个数据库中分别测出了9,923，807、8,749，219、6，805，228个序列。PVY．T侵染的烟草植株相比对照植株(T．CK)有2221个上调和432个下调的基因；PVY．G侵染的烟草植株相比对照植株(G．CK)有2118个上调和716个下调的基因，进一步比较PVY—T处理组与PVY．G处理组(T．G)的测序结果，发现有241个上调和33个下调的基因，其中未知基因约占14．6％。通过比较T．CK与G．CK，我们发现，有5个基因在高通量测序结果中表现为异向调控：过氧化物酶、新薄荷还原酶、假设蛋白POPTRDRAFT一783792、CP

7、l2、万方数据两个马铃薯Y病毒株系全基因组序列的克隆及侵染烟草植株后Solexa转录组钡9序分析LTPl前体。它们的异向调控表明PVY．T、PVY．G侵染植株后导致了寄主部分基因的异向表达，这些基因的异向表达可能是N株系与O株系侵染植株后产生不同症状的原因。通过基因功能分析表明，差异表达基因广泛涉及新陈代谢、次生代谢、RNA运输等过程。利用qRT．PCR技术检测了6个差异显著基因的相对表达量，结果显示6个基因表达水平的差异性与高通量测序结果一致。这些基因的表达水平发生明显变化，表明病毒侵染植株后导致了植株基因的表达差异，这些基因的上调或下调影响植株的抗

8、病表现。关键词：烟草；马铃薯Y病毒；差异表达；基因组；高通量测序；基因表达谱Ⅱ万方数据山东农业