报告1：solexa测序原理、实验流程课件

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1、Solexa测序原理、实验流程以及现在常用的微生物群落功能基因检测的方法第一部分Solexa测序原理、实验流程Solexa简介Illmina公司包含有HiSeq和MiSeq测序平台，基于Solexa技术，其基本原理是单分子簇边合成边测序(SequencingbySynthesis，SBS)和dNTP可逆终止化学反应。Solexa测序技术利用单分子阵列实现在小型芯片（Flowcell）上进行桥式PCR反应。测序时加入的dNTP带有特殊的荧光基团，通过可逆阻断技术实现每次只合成一个碱基，再利用相应的激

2、光激发荧光基团，捕获激发光，从而读取碱基信息，最终达到测序的目的。Solexa测序的基本原理和流程1、PreparegenomicDNAsample利用物理方法将待测样品DNA随机打断成100-200bp的片段，在打断后的DNA片段的两端加上接头，解开双链。2、AttachDNAtosurfaceSolexa在测序时利用微注射系统将已经加过接头的单链待测片段随机结合到FlowCell的内表面，每一个FlowCell又被分成８条Lane，每条Lane的内表面上能通过共价键的形式随机固定单链接头序列和

3、带接头的单链待测DNA片段。3、Bridgeamplification在Flowcell内加入未标记的dNTP和酶，起始固相桥扩增。4、Fragmentsbecomedouble-stranded所有的单链桥型待测片段通过酶的作用，被扩增成双链桥片段。5、Denaturethedouble-satandedmolecules通过变性，释放出互补的单链，固定到附近的固相表面。6、Completeamplification通过不断的循环，就会在Flowcell的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测

4、片段。7、Determinefirstbase加入DNA聚合酶、被荧光标记的dNTP和接头引物，开始第一轮测序。8、Imagefirstbase利用激光激发之后，每一簇DNA发出的荧光就会被捕获，然后确定碱基。在每一个测序列簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP，就能释放出相应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。该测序方法的主要优点：通量高，Hiseq2000平台能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到1

5、50bp左右。准确率高，边合成边测序的方法，可以减少由于二级结构所造成的片段缺失，该测序平台的错误率一般在0.26%-0.80%，尤其是在连续碱基测序的准确率很高。该测序方法的主要缺点：测序长度短，随着读长的增加，荧光信号会有所衰弱，所以越“靠后”的碱基准确性会逐渐降低，这也是Solexa测序读长受限的一个主要因素。Solexa平台的应用Solexa平台的应用范围极广，几乎囊括了目前基因组学研究的所有方面，例如基因组从头测序（denovo）、重测序（re-sequencing）、基因组结构分析、转

6、录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究等等。