酶的改造方法进展.ppt

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1、酶的改造方法研究进展为什么要进行酶改造？温和的自然体系：常温、常压、中性pH、水环境极端的工业体系：高温、高压、酸、碱、有机溶剂酶不适应酶的改造方法酶的化学修饰-分子修饰酶的物理修饰-固定化酶的生物改造-定向进化酶的人工模拟-抗体酶一、酶的化学修饰B通过制备酶单分子纳米凝胶，大大提高了酶的稳定性酶分子修饰主要方法金属离子置换修饰大分子结合修饰侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰1）金属离子置换修饰实例SOD的金属离子置换：天然SOD中的铁原子被锰原子取代后，重组酶对H2O2的稳定性显著增强，对NaH

2、3的抑制作用的敏感型显著降低。氨基酸酰化酶的金属离子置换：氨基酰化酶的锌被钴取代后，底物专一性和最适pH都有改变，锌酶对N-乙酰丙氨酸的最适pH是8.5,而钴酶是7.0.2）酶大分子修饰的实例每分子核糖核酸酶和6.5分子的右旋糖酐结合，酶的催化效率提高2.25倍；用琥珀酸酐法活化的聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行修饰，在55℃的稳定性比未修饰的提高38%；尿激酶采用聚乙二醇5000修饰，在兔体内的半衰期延长9~13倍；超氧化歧化酶采用聚乙二醇修饰后半衰期延长70~350倍；L-天冬酰胺酶经聚乙二醇修饰后，抗原性显

3、著降低，1994年经美国FDA批准成为治疗急性白血病的药物使用3）侧链基团修饰的实例用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使氨基末端的Leu和肽链中的Lys残基上的-NH2脱氨变成-OH，酶的半衰期延长2倍；葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰酚基后，最适pH下降0.5，稳定性增加，更有利于果葡糖浆生产；用O-甲基异脲修饰溶菌酶，使酶分子中的Lys残基上的-氨基结合屏蔽，稳定性显著增强；枯草杆菌蛋白酶的第104位Tyr上的酚羟基经四硝基甲烷修饰后，生成3-硝基酪氨酸残基，使酶对带正电荷的底物结合能力显著增强；胰蛋白酶原（try

4、psinogen）的激活4）肽链有限水解修饰实例5）氨基酸置换修饰实例Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。评价：化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个修饰，操作复杂，难以工业化生产；发展趋势：定点突变通过定点突变技术把农杆菌-葡萄糖苷酶催化中心的第358位L-GluL-Ala，使亲核的羧基甲基，结果使该酶失去了水解活性，而可以催化糖苷合成酶分子修饰的发展趋势大

5、分子修饰研究最为成功，尤其是聚乙二醇修饰；酶的侧链基团修饰已经成为酶结构研究的重要手段；更为精细的酶侧链修饰往往和结构生物学紧密相关；二、酶的物理改造-固定化载体固定化：纳米材料、树脂、水凝胶、壳聚糖等无载体固定化：细胞表面自固定化、酶聚集体等10mL淀粉葡萄糖苷酶(350μg/mL)与30mg壳聚糖混合，在室温放置1h，不时搅拌，在4℃过夜，过滤，用600mL蒸馏水洗涤,过滤即得壳聚糖固定化淀粉葡萄糖苷酶；海藻酸钠先加热配成溶液，取一定量碱性蛋白酶溶液和海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后用蠕动泵将混合液滴入2

6、%的CaCl2中形成凝胶珠，放入4℃冰箱硬化4h，得到海藻酸钠微球。卡拉胶加热配成一定的浓度,50℃水浴保温,加入乳糖酶溶液，均匀搅拌后冷却，4℃冰箱中硬化，得到块状固定化酶；酶与1.5%的海藻酸钠溶液充分混和，通过针头滴入1.1%氯化钙溶液中，形成珠状的海藻酸胶颗粒。凝胶珠用0.5%的聚赖氨酸处理，再经0.1%的2-N-环已胺乙基磺酸处理，用生理盐水洗涤，再以0.05mol/L的柠檬酸钠水溶液液化微囊内海藻酸钙，得到近乎透明的微囊化的固定化酶。DEAE-纤维素固定虫漆酶CM-纤维素酶固定虫漆酶吸附交联法

7、：先将酶吸附在硅胶或树脂等载体上，再用戊二醛等双功能试剂交联，所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。交联包埋法：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。制得的固定化酶稳定性好；泵储罐反应产物离心机消旋反应器固定化酶柱子晶体L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化氨基酰化酶制备L-丙氨酸世界上第一种工业化生产的固定化酶酶固定化的发展趋势载体新材料层出不穷介孔材料、纳米材料，磁性材料，大孔材料等；固定化方法日新月异定向固定，微囊化固

8、定，酶聚集体，静电纺丝等；酶的结构与性能研究是热点结构模拟与计算等；三、酶的生物改造-定向进化自然界酶的进化是极其缓慢的，无法适应工业过程的需要。随着分子生物学技术快速发展，人们可以在试管内利用几周时间完成自然界几万年的进化过程自然进化诱变育种定向进化上万年几年到十多年几个月酶的定向进化技术发展历程生物催化剂进化方法发展历程随机和定点突变定向进化计算机辅助设计基于序列-功能关系与统计模型的理性进化蛋白质稳定性活性有机溶液中的活