端粒酶活性检测方法的研究进展

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1、端粒酶活性检测方法的研究进展　　摘要:近几年研究表明端粒酶与肿瘤的发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，TRAP扩增技术，四种结果分析方法（同位素法、染色法、荧光法和ELISA法）以及如何进行质量控制与半定量测定进行综述。　　端粒酶（Telomerase）是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA组分（hTR）于1995年被克隆，其中含有端粒重复序列的模板（5′-CUAACCCUAAC-3′）；蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性，结构尚不清楚。端粒酶能以自身RNA的模板区为模板复制合成

2、端粒序列。在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物[1]。因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。本文对其检测方法综述如下。　　1基本原理　　端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法（telomericrepeata

3、mplificationprotocol,TRAP）。TRAP反应原理见下图。　　首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。　　2基本技术方法　　2.1标本来源手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液（尚有争议）等。　　2.2端粒酶的提取方法早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大，此后采用去污剂（如CHAPS）裂

4、解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液。现详述如下：40～100mg冷冻（-70％℃）组织或104～106沉淀细胞用冰预冷的洗液[10mMhepes-KOH(pH7.5),1.5mMMgCl2,10mMKCI,1MmDTT]洗1次，10000g4℃离心1min，沉淀加200μl冷裂解液[10mMtris-HCI(Ph7.5),1mMMgC12,1mMEGTA,0.1mMPMSF,5mMβ-巯基乙醇，0.5％CHAPS，10％甘油]，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm,25min,16000g4℃离心20min，移取上清160μl，部分样品用于蛋白定量，其余迅

5、速冷冻，-70℃保存。端粒酶经小于10次冻融可保持活性稳定。部分学者对某些标本用0.5％TMtris-HCI(pH8.3)，1.5mMMgCI，63mM,KCI,0.005％TMEGTA,50μMdNTP，0.1μgtS，1μgT4基因32蛋白，0.1mg/ml牛血清白蛋白，1～2μlCHAPS细胞提取液（含6μg）蛋白，0.2～0.4μl[α-32P]dGIP或[α-32P]dGIP(10μCi/μl,3000Ci/mmol)，这一反应体系可同时满足端粒酶Tap聚合酶的活性需要，23℃10min合成端粒酶延伸产物后，94℃3s灭活端粒酶，加入0.1μgcX和2U

6、Taq酶，94℃30s，50℃30s，72℃1.5min扩增27个循环，25μl产物进行15％PAGE凝胶电泳。　　2.4引物设计为了防止上、下游引物之间的结合，在CX引物上设计了3个不匹配碱基（见图1*处），单链结合蛋白T4基因32蛋白可进一步避免引物之间的结合，TS和CX引物被广为采用，在上述条件下，只有延伸了三至更多的GGTTAG片断才有特异扩增，即得到从40bp开始的6bp差异的梯带。Broccoli等以5′-GGCGCG(ACCCTA)3-3′代替CX引物，由于增加了G-C含量，可提高退火温度，进一步避免引物间的结合，增加特异性[3]。Oncor公司设计

7、RP引物代替CX引物，得到从50bp开始的6bp差异的梯带[4]。　　3扩增片断的检测　　3.1同位素法Kim建立的方法即为同位素法，其应用最多。采用[α-32P]dGTP或dCTP掺入的报道很多，但部分学者用[γ-32P]dATP和T4激酶标记TS引物的5′端，发现更易于检出低水平的端粒酶，同时更易定量[3,5]。PAGE凝胶电泳后在X-光片上放射自显影或用Phosphoimager仪扫描测定3h。同位素法的优点是灵敏度高，100个永生化细胞27个循环即可检出，缺点是存在放射性污染，且放射自显影需8h至两天以上时间，时间较长。　　3.2染色法电泳后用SYBRgr

8、een或E