最新聚丙烯酰胺凝胶电泳.教学讲义PPT课件.ppt

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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳.作用聚丙烯电泳是生物学科的1项基本技术，被广泛运用到氨基酸、多肽、蛋白质(活性蛋白或同工酶)、核酸的分离和鉴定。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。此外，聚丙烯酰胺凝胶电泳还具有浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为垂直平

2、板电泳和圆盘电泳，两者的原理完全相同。由于垂直板形凝胶具有板薄、易冷却，分辨率高、操作简单、便于比较与扫描等优点，因而为大多数实验室采用。聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率比纸电泳高得多，能检出10-9～10-12g样品，特别适合于分离和测定蛋白质、核酸等生物大分子化合物。它除了能对生物大分子物质进行定性、定量分析外，还可用以测定分子量，且是一种较先进的测定分子量的方法。实验原理(2)强还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。SDS和还原剂的作用：（1）分子被解聚成组成它们的多肽链（2）氨基

3、酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。连续电泳不连续电泳电荷效应分子筛效应PAGE电荷效应分子筛效应浓缩效应：不连续性所致电泳体系中所用的缓冲液成分、pH、凝胶浓度相同缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度呈不连续性不连续SDS-PAGE原理凝胶的不连续性缓冲离子的不连续性pH的不连续性电位梯度的不连续性①凝胶的不连续性：浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。分离胶：小孔径。蛋

4、白质分子在大孔胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。②缓冲离子的不连续性③pH的不连续性④电位梯度的不连续性操作步骤制板制分离胶制浓缩胶电泳槽安装加样电泳剥胶固定染色脱色结果观察（1）在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。（2）浓缩胶聚合完成后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。4

5、.样品制备取0.5ml稀释血清（血清用H2O2稀释一倍）加入0.5ml2×SDS凝胶加样缓冲液混匀，在100℃水浴中加热3分钟使蛋白质变性。10,000rpm离心1分钟，取上清加样。5.加样及电泳用长皮头吸嘴吸取处样品50μl，从加样孔底部缓慢加样。注意：加样时不得插伤凝胶孔胶面，不得产生气泡、样品不得溢出加样孔。6.接电源与电泳上槽接负极，下槽接正极。调节电压至80V电泳至样品前沿刚好进入分离胶后，把电压提高到120V（凝胶上所加电压约为8V/cm），继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm（约2—3小时），然后关闭电源，取出插头。7.

6、剥胶从电泳装置上御下玻璃，用水果刀撬开玻璃板。并用刀在紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。8.染色与脱色用考马斯亮蓝染液对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行室温染色1～2小时后，用脱色液在脱色摇床上脱色3～4次，每次20～30分钟。血清蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离可以产生十多条色带。实验注意事项1.丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，操作时应免避沾在脸、手等皮肤上。最好戴一次性塑料手套操作。2.过硫酸铵的主要作用是提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应，故一定要新鲜，贮存过久的过硫酸铵商品不能使用。此外，10%过硫

7、酸铵必须现用现配，4OC冰箱贮存不超过48小时。3.灌制凝胶时，应避免产生汽泡，因为汽泡会影响电泳分离效果。4.刚灌注分离胶混合溶液后，应在分离胶液面上加1～2cm高的水层，以阻隔空气。胶液面上加水层时要特别小心，缓缓叠加，以免冲坏凝胶的胶面。5.聚丙烯酰胺凝胶电泳耗时长，电泳过程中产热多，特别是夏天产热更多。故电泳过程中应安装循环冷却水以带走热量，或在4OC冰箱中电泳。谢谢观看第六章细菌的分类与命名一、生物的分类六界：动物界、植物界、真菌界、原生生物界、原核生物界、病毒界。细菌分类层次与其他生物相同，即：界、门、纲、目、科(Family)、

8、属(Genus)、种(Species)。二、细菌分类的指征1.形态学特性2.培养特性3.生活方式4.生理生化特性5.抗原构造6.对噬菌体的敏感性7．对抗生素及其他化